Introduction
現在、培養空間内に個別に単一細胞を配置することは、一般に、限界希釈または蛍光活性化セルソーティング（FACS）を使用することによって達成されます。それだけで容易に入手可能であるピペット組織培養プレートを、必要とする多くの研究室は、希釈を制限することは、便利な方法です。この場合には、細胞懸濁液を直列適切な細胞密度に希釈し、その後手動のピペットを使用して培養ウェルに入れました。これらの区画の単一の細胞は、次いで、1コロニー形成2のスクリーニング遺伝的異質性として、細胞分析のために使用されます。限界希釈法のポアソン分布の性質は37％3の最大確率に単一細胞事象を制限するため、この方法は、支援のためにロボットアームを利用することなく、低スループット、労働集約的です。統合されたロボットアームとFACSマシンは正確にPLACによってポアソン分布の限界を克服することができます時間4で培養ウェル内の1つの単一細胞をる。しかし、高い機械的剪断応力5（従って、細胞生存率を低下させ）、機械購入および運用コストは、多くの研究室での使用が制限されています。
上記の制限を克服するために、マイクロスケールデバイスは、高効率マイクロウェル6に単一細胞をロードするために開発されてきました。しかし、マイクロウェルは、ロードされた細胞が原因で、単一セルの負荷の確率を最大化するために単一のセルのそれに近いマイクロウェルそれぞれのサイズを作る必要があるため、増殖するために十分なスペースを提供していません。培養アッセイは、多くの細胞ベースのアプリケーション（ 例えば、クローン原性アッセイ7）で必要とされるように、（90から-直径又は一辺の長さ650ミクロン）より大きいマイクロウェルは、拡張、細胞培養を可能にするために利用されています。しかし、限界希釈法のように、彼らはまた、10に至るまで、低い単セル負荷効率を有している- 。30％8、9
以前、我々は個々のマイクロウェル内の単一細胞を単離し、単離された細胞のクローン原性アッセイにおけるその適用を実証するためにハイスループットマイクロ流体プラットフォームを開発しました。10デバイスは、ポリジメチルシロキサン（PDMS）で作られた、およびマイクロウェルアレイの2組を備えました主としてそのサイズのマイクロウェルに1つのセルを負荷の効率を向上させることができる別のマイクロウェルのサイズと細胞よりも有意に大きいです。注目すべきことに、この「二重井戸」の概念は、培養領域の大きさを柔軟それは簡単な異なる細胞型およびアプリケーションに合わせて装置の設計を調整すること、単一細胞捕獲効率に影響を与えることなく調整することができます。この高効率の方法は、細胞の不均一性の研究およびモノクローナル細胞株の確立のための長期の細胞培養実験のために有用です。
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Protocol
注：私達のマイクロ流体デバイス製造用のフォトマスクの設計は、コンピュータ支援設計（CAD）ソフトウェアを使用して描かれました。設計は、その後の商業サービスを使用してクロムフォトマスクを作製するために利用されました。 PDMSデバイスは、ソフトリソグラフィ技術を用いて製造した。11
リソグラフィによりマスター金型の1製作
- フォトリソグラフィ工程12の前に、基質として4インチのシリコンウエハを使用し、10分間120℃で、従来のオーブン内でウェーハを脱水します。
- プラズマクリーナーで30秒間、100ワットで酸素プラズマ処理を使用して脱水したシリコンウェーハをクリーニング。
- 次の焼成工程のために、それぞれ65℃、95℃、2つのホットプレートを予熱。
- スピンコーターを用いて洗浄されたシリコンウェハ上にネガ型フォトレジスト（PR）のコート5 gであり30秒間1,200rpmで（SU-8 50）における回転は、マイクロチャネル層を作製しました。
- PRを配置12分間65℃で予熱したホットプレート上のウエハをコーティングし、ソフトベーク処理を行う（厚さ100μmのパターンについて）33分間、95℃でさらに予熱したホットプレートに移します。
- 焼成後、半自動マスクアライナのホルダーにPRコーティングされたシリコンウェハを配置し、25400 dpiの解像度透明度のフォトマスクに合わせます。
- シリコンウェハ上のフォトレジストパターンを作成するために500ミリジュール/ cm 2の線量でUV光（365 nm）にPRコーティングされたシリコンウェハを露出させます。
- アライナからウエハを取り外し、12分間95℃でポストベーク用のホットプレートの上に置きます。
- アライメントマークを露出させるために12分間、窒素ガスを穏やかに乾燥するための未架橋PRを洗浄するためにSU-8現像液（プロピレングリコールモノメチルエーテルアセテート、PGMEA）溶液中にウェーハを浸します。
- 再び、スピンコーターによりウェハ上のネガ型フォトレジストのコート5グラム。 300＆30秒30秒、1,200rpmで（SU-8 10）のために700回転（SU-8 100）におけるスピン＃181;メートルの厚さのパターンと27ミクロンの厚さのパターンは、それぞれのマイクロウェル層を作製しました。
- （27ミクロンの深キャプチャウェル層のための）8分間、4分間65℃でホットプレート上で95℃でPR塗布されたウエハを配置。そして40分間65℃と（300μmの深い文化ウェル層用）110分間95℃で。
- 冷却した後、UV光を備えたマスクアライナ上にPRコーティングされたシリコンウェハを置きます。
- （27ミクロンの厚さのパターン用）を250mJ / cm 2であり、（厚さ300μmのパターン用）700ミリジュール/ cm 2の線量でUV光（365nm）にPRコーティングされたシリコンウェハを公開します。
- それぞれ5分（27μmの厚さのパターン）、30分（厚さ300μmのパターン）、95℃でのウェハ焼きます。
- それぞれ、6分（27μmの厚さのパターン）のためにPGMEAおよび25分（厚さ300μmのパターン）により未架橋PRを洗い流し、その後、窒素ガスでそれらを乾燥させます。
- パターンの高さを測定上の特徴走査型レーザプロフィルメータのXYステージ上にウエハを配置することによって走査レーザープロフィルを有するウェーハ。
- 焦点面を調整し、明らかにパターンが20X対物レンズの下に「カメラビュー」観察モードを使用することにより、ウエハ上に備えて表示します。
- 「レーザービュー」に「カメラビュー」から観察モードを切り替えて、特徴の上下位置を設定します。
- それぞれの測定モード、エリア、品質、および透明（上部）までのz-ピッチ、1ライン（1024×1）、高精度かつ0.5μmで、設定し、測定を開始するスタート底を押してください。
単一細胞の単離のためのPDMSデバイスの作製
- PDMS鋳造する前に、それが簡単にマスターモールドからPDMSのレプリカをはがしすることができ、疎水性の表面を、作成するために、トリクロロシランとマスター金型をsilanize。
- マスター金型と重み入りのボートを配置200デシケーター中のトリクロロシランのμlの、そして15分間真空（-85キロパスカル）を適用します。
- 真空を停止し、その後、少なくとも1時間室温でマスター金型をsilanizeデシケーターでマスター金型を残します。
- デシケーターからマスターモールドを取り外し、10センチメートルペトリ皿に各マスターモールドを配置します。
- 10の割合で塩基及び硬化剤を含有する17.6グラムのPDMSポリマーキットの総量ミックス：1、次いでペトリ皿にマスターモールド上にPDMSを注ぎます。
- デシケーター中でペトリ皿を置き、PDMS中の気泡を除去するために、1時間真空（-85キロパスカル）を適用します。
- デシケーターからペトリ皿を取り外し、3、65℃で通常のオーブンに入れてください - PDMSを硬化させるために6時間。
- マスター金型から硬化PDMSのレプリカを削除し、0の内径とパンチャーによって捕獲ウェルアレイPDMSのレプリカでマイクロチャネルの両端に入口と出口のように2つの穴をパンチ。流体チャネル（ 図2A）のための75ミリメートル。
- PDMSレプリカの表面をきれいにしてから、短時間の酸素プラズマ処理（14秒間100ワット）のためのプラズマクリーナーにPDMSのレプリカを配置するためにテープを使用してください。
- 酸素プラズママシンからPDMSのレプリカを削除します。
- 実体顕微鏡下で手で（キャプチャマイクロウェルを含む）上部と下部のPDMS（培養マイクロウェルを含む）レプリカを合わせ、接触にそれらをもたらします。
- 最終的なデバイスを形成するために、PDMSレプリカとの間の永久的な結合を達成するために24時間65℃のオーブンに整列PDMSレプリカを置きます。
- PDMSデバイスのマイクロ流路から空気を除去するために15分間（-85キロパスカル）を、脱イオン（DI）でPDMSデバイスを浸し - 水充填された容器と、真空下でデシケーター中でコンテナを配置します。
- 組織培養フードにDI水で満たされたPDMSデバイスを配置し、UV光（光の波長：254 nm）を使用して30マイルのためにデバイスを滅菌しますn個。
- 1×PBS溶液中の5％ウシ血清アルブミン（BSA）とPDMS装置にDI水を交換し、PDMSの表面に付着する細胞を防ぐために、37℃で30分間インキュベートします。
注：BSAコーティングは、培養ウェルにキャプチャーウェルから単離された細胞の転送効率を向上することが重要です。 - 滅菌1×PBS溶液でPDMSデバイス中の5％BSA溶液を交換してください。
単一細胞懸濁液の調製
- 培養神経細胞のKT98、およびヒト癌細胞A549およびMDA-MB-435、我々幹PDMSデバイス細胞実験のために細胞を調製するための従来の細胞培養インキュベーター（37℃、5％CO 2、95％湿度）でペトリ皿中。
- 80％のコンフルエンス - 70まで増殖させた細胞で培養皿から除去し、廃棄する使用済みの培養培地（10％ウシ胎児血清および1％抗生物質を与えDMEM基礎培地）。
- 静かに滅菌PBSで3回細胞を洗浄します。</李>
- （詳しい情報については、物質一覧をご参照ください）を取り外し、PBSを捨て、およびタンパク質分解、コラーゲン、およびDNアーゼ活性を有する組換え酵素混合物の2ミリリットルを追加します。
- 5分間、室温で培養皿をインキュベートし、その後細胞の剥離を容易にするために培養皿をタップします。
- 細胞を分散させるために滅菌PBSの4ミリリットルを追加し、15ミリリットルコニカルチューブに細胞懸濁液を転送します。
- 3分間300×gでチューブを遠心し、上清を除去します。
- 静かにPBS滅菌1ミリリットル中に細胞ペレットを再懸濁し、標準的なトリパンブルー排除法13を用いて、生細胞数をカウントします。
注：この再懸濁手順は、単一細胞分離効率を向上させるために十分に解離し、単一細胞懸濁液を調製するのに重要です。
4.単一細胞の単離およびクローン培養
- 2.5×10 - 2.2の濃度の負荷50μlの細胞懸濁液を
- 均等に細胞と全体のマイクロチャネルを埋めるために、入口孔を通して細胞懸濁液の別の50μLをロードします。
- 入口と出口の穴上の液滴からの静水圧によって誘発される流れを回避するために、プラグ（長い3ミリメートル、直径1mmカットナイロン釣り糸）と出口穴を塞ぎます。
注：プラグは使用前に、組織培養フードの内部に滅菌UVました。 - 、培地で1ミリリットルの無菌注射器を埋めることから気泡を排出し、シリンジポンプにそれを設定。
- 23 G鈍針とポリテトラフルオロエチレン（PTFE）チューブを経由してPDMSデバイスの入口孔への媒体ロード注射器を接続します。
- コンセントの穴からプラグを外し、すべてのOW 2分間の時間間隔は、細胞が重力によって単一細胞捕捉ウェルに落ち着くことを可能にします。
- シリンジポンプによって駆動を600μl/分の流速で培地300μlで捕捉されていない細胞を洗い流します。
- デバイスを安定させるために2分間待って、閉じた培養システムを形成するためのプラグと、入口と出口の穴をシールします。
- 培養マイクロウェルに捕捉され、単一細胞を転送するために、手でデバイスを反転します。
- 100-mm組織培養皿にPDMSデバイスを配置し、マイクロチャネルからの培養培地の蒸発を避けるために、デバイスの周りに滅菌PBSの10ミリリットルを追加します。
- 単一細胞のクローン培養物のための従来の細胞培養インキュベーター（37℃、5％CO 2、95％湿度）で培養皿を動かします。
5.培養培地補充
- 培養の1日後、細胞PRを改善するために、新鮮な培地でPDMSデバイスに培地を交換しoliferation。
- 次のステップを実行している間、マイクロチャネル内に気泡を導入することを避けるために、入口および出口孔領域の近くにPDMS装置の上に培地二の液滴を置き。
- 入口とマイクロチャネルのための出口としてマイクロ流路の両端近くにPDMSデバイスの上から2穴パンチ。
注：PDMSデバイスの全体的な二層パンチスルーしないでください。代わりに、ちょうどPDMSの最上部層を介してパンチ。 - 23 G鈍針とPTFEチューブを経由して入口に新鮮な培地を含有する1ミリリットルのプラスチックシリンジを接続します。
- 古い培地を交換するために5分間のデバイスに120μlの新鮮な培地を流します。
- 入口と出口の穴を密閉し、細胞培養インキュベーターにデバイスを戻すために2つのプラグを挿入します。
- 5.5に手順5.4を繰り返し、続いて、シールプラグを、除去することにより、培養期間中に培地ごとに2日間を更新します。
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Representative Results
単一細胞の単離および培養のためのマイクロ流体プラットフォームは、マイクロウェルアレイ（ 図2A）の2組のマイクロチャネル（高さ200μm）を備えています。マイクロウェルアレイの2セットは、キャプチャウェル（直径25ミクロン、深さ27μm）とし、それぞれ単一細胞の単離および培養用の培養ウェル（直径285ミクロン、深さ300μm）であり、それぞれと呼ばれています上面図（ 図2B）から見たときに捕捉ウェル培養ウェルの中央に位置しています。デバイス動作について（概略動作フローを図1に示されている）、必要な装置（シリンジポンプ、組織培養インキュベーター、および顕微鏡）や消耗品（シリンジ、ピペット、およびチューブ）は、生物学的実験室で一般に入手可能です。また、プラットフォームの移植性及び透明性は、細胞が容易にConvenとを備えた装置で観察し、分析することが許さ細胞培養実験中的な顕微鏡。
洗浄工程の後にキャプチャ・ウェル中の細胞の捕獲効率は67.80±11.38パーセントから（細胞の種類に応じて）85.16±1.91パーセント（ 図3A）の範囲です。文化ウェルにロードされた細胞（ 図3B）の数を分析することによって確認された、 -また、キャプチャウェルのほとんどは、すべての3つの細胞型（92.98パーセント89.89パーセント）のための単一のセルのみが含まれています。培養ウェル中の最終の単セル分離効率がKT98およびMDA-MB-435細胞のために76％以上であったが、試験した細胞型のうち、セルサイズの違いに起因するA549細胞についてのみ61％。
がん研究のために、単一細胞のクローン原性アッセイは、薬物耐性及び個々の細胞コロニーの増殖速度をテストするために利用することができます。私たちのpにおける単離単一細胞の細胞培養およびクローン原性アッセイlatformを培地ごとに2日間をリフレッシュすることによって行いました。このデモでは、個々の細胞の細胞生存および増殖速度の差を測定することによって、単一細胞レベルでの細胞の不均質性を研究するため、このデバイスの適用性を強調しています。
単離された細胞の細胞異質と増殖率がdaily-取得した画像から解析しました。結果は、単離された単一細胞を7日間培養し、異なる成長パターンを発揮することができることを示しました。細胞の17.5％が15以上の細胞培養の間に形成された細胞コロニー（ 図4A）に分割しているが、例えば、単離された細胞の13％には、細胞分裂がなく、1つの単一細胞（ 図4B）として残りました。 14細胞 - 増殖細胞間の細胞の不均一性は、2つの細胞（4.3％）、三つのセル（2.5％）、及び4を形成し、それらの異なる成長パターンによって証明されました細胞培養実験（ 図4C）で（15％）。
これらの結果は、プラットフォームは、長期細胞培養、クローン原性アッセイ、及び細胞の異質性研究のために使用することができることを示しました。小さな設置面積で成長した個々の細胞コロニーの数が大きくても、また、細胞の顕微鏡分析が容易になります。
マイクロ流体プラットフォームでのハイスループット単一細胞の単離および培養のための動作フロー図1.模式図単一細胞の単離およびクローン培養するための操作手順は、4ステップを含む：プラスチックチップによってマイクロチャネルにⅰ）ロードセルをと手動ピペット; II）シリンジポンプによって駆動される、新鮮な培養培地で捕捉されていない細胞を洗い流します。 III）プラグを入口および出口開口部を密封した後に、ありますolated細胞は、デバイスを反転することによって、培養ウェルへのキャプチャウェルから移しました。およびiv）培養ウェル中のクローン培養（クローン原性アッセイ）を行う。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2. 写真およびマイクロ流体単一細胞の単離と文化プラットフォームのSEM像。（A）単一細胞培養のためのマイクロチャネルおよびマイクロ構造を示している赤い色素でロードされたマイクロ流体プラットフォーム。 （B）切断デバイスから採取代表画像は、マイクロ流体プラットホームにおける3つの単一細胞の単離およびクローン培養装置の側面図を示します。スケールバー：100μmです。単一細胞培養のSEM画像（C）およびD（キャプチャーこの図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3 KT98、A549およびMDA-MB-435、マイクロ流体プラットホームにおける単一細胞分離効率（A）捕捉されていない細胞を洗い流した後、捕捉ウェルに捕捉KT98、A549およびMDA-MB-435細胞の効率。細胞の捕捉効率は3つの細胞型で67.80重量％から85.16％でした。 （B）の合計文化ウェル（スラッシュバー）における単一細胞比はKT98およびMDA-MB-435用の76％以上が、A549のための61.63パーセントでした。 （C）個々のKT98シングルセルの代表画像クローン培養用の大型培養ウェルで単離された（セルトラッカーで染色した赤、）。スケールバー：300μmの。 （D）KT98セルモデルのセル占有培養ウェル中の細胞数。文化ウェルの割合は、単一細胞で77.3パーセント、16.31パーセント細胞なしで、2細胞と5.96パーセント、以上3細胞と0.43パーセントでした。エラーバーは平均値±SDとして表されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4.細胞培養、クローン原性アッセイ、および7日間のマイクロ流体プラットフォームで孤立したA549細胞の細胞異質の研究。（A） は 、単離された単一細胞が成長し、培養ウェルに細胞コロニーに増殖しました。 （B）、単離された単一細胞は、7日後、生き残ったが、分裂していませんでした文化の。スケールバー：100μmです。 （C）、単離された単一細胞は、7日間培養した後、不均質な成長パターンを示しました。エラーバーは平均値±SDとして表されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
マイクロウェルベースのデバイスシステム6,14は 、6を捕捉する大型単セル及び単一造血幹細胞の増殖を15として、単一細胞操作及び分析のために利用されています。ウェルのサイズ、数、及び形状は、特定の用途のために調整可能であるがウェルのサイズを大きくすると、単一細胞分離効率が常に損なわれる。9,15
マイクロサイズは細胞拡散と成長を可能にするために拡大している間に、この制限を克服するために、パークらは 、高単一細胞捕捉率（58.34パーセント）を持つ三角形のマイクロウェルを持つマイクロ流体チップを報告しました。ただし、（サイド〜50μmの長さ）マイクロウェルは最大2日間細胞の増殖をサポートすることができました。16私たちのデュアルウェル戦略は、大規模なマイクロウェル内の単一セルの負荷はポアソン確率によって限定されるものではないことができますDILUを制限する際に遭遇分布ション方法とサイズ、少なくとも7日間（ 図4A）のために、細胞増殖のために十分であった大規模なマイクロウェルの高い単一細胞分離効率（75％以上）を提供することによって実証されるように、オープンウェルシステム3、。高効率簡単な装置と操作手順で、単一細胞の単離およびクローン培養を実行する能力のために、我々は、マイクロ流体プラットフォームは、クローン原性アッセイ17によって、がん幹細胞の選択など、幅広いアプリケーションのための便利なツールを、構成することができることを想像します薬18,19及びハイスループット心毒性スクリーニング。
我々の単一細胞の単離および培養プラットフォームの主要な制限は、培養ウェルで培養した細胞間のクロストークを防止するために、個別に閉じた培養ウェルを形成しないことです。したがって、細胞の挙動は、マイクロ流体デバイス内の他の単離された単一細胞のパラクリン分泌によって影響され得ます。オト我々のプラットフォームの彼女の制限は、高効率単一細胞単離のために、比較的高濃度の細胞懸濁液を調製する必要があることです。この高いセルの消費量は、房水の細胞などの希少細胞の単離と文化の用途を制限することができます。
デバイス操作の前に、マイクロチャネルを充填し、慎重に結合PDMSデバイスから任意の流体の漏れを観察するために、入口孔からDI水を噴射することが重要です。流体漏れが悪影響細胞捕捉と転送結果に影響を与える可能性があり、したがって、マイクロチャネル内の流れの状態に影響を与えます。私たちの単一セルの積載効率の研究結果は、デバイスをひっくり返すことで、ほとんどの細胞が効率的に転送することができたことを示す、培養ウェルへの捕獲ウェルから単離された細胞を転写した後、非常に低いセル損失を示しているがまた、転写効率は、次の場合に低下しますBSAブロッキング工程（2.12）が適切に行われていません。ユーザーは、BSAブロッキングプロトコルを変更したり、アルを使用してもよいですそれらの特異的な細胞実験のニーズにternative表面改質方法は、（ 例えば 、より多くの接着細胞タイプが使用されるBSAの濃度や塗布時間を増加させます）。細胞捕捉ウェルの寸法は、関心対象の特定の細胞型のサイズに応じて、捕捉ウェルで最高の単セルの負荷効率を最適化する必要が支配的な要因です。キャプチャウェル中の低細胞積載効率がキャプチャの大きさの指標で幸福であるのに対し高い複数のセル・イン・キャプチャウェルイベントは、目的の細胞型には大きすぎるキャプチャウェルサイズを有することに起因しています小さすぎる。細胞クラスターを捕捉ウェルに単細胞ローディングの効率を低下させることができるように、準備された単一細胞懸濁液中の細胞塊を最小化するためにも重要です。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AutoCAD software | Autodesk | AutoCAD LT 2011 | Part No. 057C1-74A111-1001 |
| Silicon wafer | Eltech corperation | SPE0039 | |
| Conventional oven | YEONG-SHIN company | ovp45 | |
| Plasma cleaner | Nordson | AP-300 | Bench-Top Plasma Treatment System |
| SU-8 50 negative photoresist | MicroChem | Y131269 | |
| SU-8 100 negative photoresist | MicroChem | Y131273 | |
| Spin coater | Synrex Co., Ltd. | SC-HMI 2" ~ 6" | |
| Hotplate | YOTEC company | YS-300S | |
| Msak aligner | Deya Optronic CO. | A1K-5-MDA | |
| SU-8 developer | Grand Chemical Companies | GP5002-000000-72GC | Propylene glycol monomethyl ether acetate |
| Scanning laser profilometer | KEYENCE | VK-X 100 | |
| Trichlorosilane | Gelest, Inc | SIT8174.0 | Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl. Hazardous. Corrosive to the respiratory tract, reacts violently with water. |
| Desiccator | Bel-Art Products | F42020-0000 | Space saver vacuum desiccator 190 mm white base |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) kit | Dow corning | Sylgard 184 | |
| Harris Uni-Core puncher | Ted Pella Inc. | 15072 | with 0.75 mm inner-diameter |
| Removable tape | 3M Company | Scotch Removable Tape 811 | |
| Stereomicroscope | Leica Microsystems | Leica E24 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Bersing Technology | ALB001.500 | |
| DMEM basal medium | Gibco | 12800-017 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Hyclone | SH30071.03HI | |
| Antibiotics | Biowest | L0014-100 | Glutamine-Penicillin-Streptomycin |
| Recombinant enzyme mixture | Innovative cell technology | AM-105 | Accumax |
| DiIC12(3) cell membrane dye | BD Biosciences | 354218 | Used as a cell tracker |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 703007 | |
| Plastic syringe (1 ml) | BD Biosciences | 309659 | |
| 23 gauge blunt needles | Ever Sharp Technology, Inc. | TD21 | |
| Poly-tetrafluoroethene (PTFE) tubing | Ever Sharp Technology, Inc. | TFT-23T | inner diameter, 0.51 mm; outer diameter, 0.82 mm |
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