Introduction
For tiden å lage en enkeltceller hver for seg i et kulturområder som vanligvis oppnås ved hjelp av begrensende fortynning eller fluorescens-aktivert cellesortering (FACS). For mange laboratorier, begrensende fortynning er en praktisk metode, da den bare krever en pipette og vevskulturplater, som er lett tilgjengelige. I dette tilfellet blir en cellesuspensjon fortynnet i serie til en passende celletetthet, og deretter plassert inn i kulturbrønnene ved hjelp av en manuell pipette. Disse kammere enkeltceller blir så brukt for celleanalyse, for eksempel genetisk screening heterogenitet 1 og 2 kolonidannelse. Imidlertid er denne metoden lav gjennomstrømming og arbeidskrevende, uten anvendelse av en robotarm for å få hjelp, fordi Poissonfordelingen arten av den begrensende fortynningsmetode begrenser encellede hendelser til et maksimum sannsynlighet på 37% 3. FACS maskiner med integrert robotarm kan overvinne begrensning av Poisson-fordelingen av nøyaktig placing en enkelt-celle i et dyrknings godt om gangen 4. Men høy mekanisk skjærspenning (og dermed senket celleviabilitet) 5 og maskin kjøp og driftskostnader har begrenset bruken i mange laboratorier.
For å overvinne de ovennevnte begrensninger, har mikroskala anordninger blitt utviklet for å høyt effektivt laste enkeltceller inn i mikrobrønner 6. Imidlertid ikke mikrobrønnene ikke gir tilstrekkelig plass for de lastede celler til å proliferere, på grunn av behovet for å gjøre størrelsen på hver mikrobrønn nær den for en enkelt celle for å maksimere den encellede lasting sannsynlighet. Som kultur analysene er nødvendig i mange cellebaserte programmer (for eksempel klonogene analyse 7), større mikrobrønner (90-650 mikrometer i diameter eller i sidelengde) er også blitt anvendt for å gi rom for utvidet cellekulturer. Men, som den begrensende fortynning metoden, de også har lave enkeltcelle lasting effektivitet, alt fra 10 -. 30% 8, 9
Tidligere har vi utviklet en high-throughput mikrofluid plattform for å isolere enkeltceller i enkelte mikrobrønner og demonstrere dens anvendelse i klonogene analyse av de isolerte celler. 10 Anordningen ble gjort med poly-dimetylsiloksan (PDMS), og omfatter to sett av mikro matriser med forskjellige mikro størrelser, som i stor grad kan forbedre effektiviteten i lasting av en enkelt celle i et mikro hvis størrelse er betydelig større enn cellen. Spesielt, kan denne "dual-well" -konseptet størrelsen av kulturen området som skal fleksibelt justeres uten å påvirke den encellede fangsteffektivitet, noe som gjør det enkelt å justere utformingen av enheten for å passe til forskjellige celletyper og anvendelser. Dette høyeffektive metoden skal være nyttig for langsiktig cellekultur eksperimenter for celle heterogenitet studier og monoklonale cellelinje etablering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Merk: fotomaske design for våre microfluidic enheten fabrikasjon ble trukket ved hjelp av en datastyrt design (CAD) programvare. Designene ble deretter brukt til å dikte krom fotomasker med en kommersiell tjeneste. PDMS enhetene ble gjort ved hjelp av myke litografi teknikker. 11
1. Fabrikasjon av Master Molds av Litografi
- Før fotolitografisk prosess 12 ved å bruke 4-tommers silisiumskiver som et substrat og tørke waferne i en konvensjonell ovn ved 120 ° C i 10 min.
- Rengjør dehydrert silisiumskiver ved hjelp av oksygen plasma behandling på 100 watt i 30 sekunder i en plasma renere.
- Forvarm to kokeplater ved 65 ° C og 95 ° C, henholdsvis, for den følgende bakeprosessen.
- Coat 5 g negativ fotoresist (PR) på de rensede silisiumskiver med en spin coater; sentrifugering ved 1200 rpm (SU-8 50) i 30 sekunder for å frembringe microchannel lag.
- Plasser PRbelagt skive på en forhåndsoppvarmet kokeplate ved 65 ° C i 12 min og overføre den til en annen forhåndsoppvarmet kokeplate ved 95 ° C i 33 min (for 100 um tykke mønster) for å utføre en myk bake prosess.
- Etter baking, plasserer PR belagt silisium wafer på innehaveren av et semi-automatisert maske aligner og justere den til en 25 400 dpi oppløsning åpenhet fotomaske.
- Eksponer PR belagte silikonplaten for UV-lys (365 nm) ved en dose på 500 mJ / cm 2 for å skape PR mønster på silikonplaten.
- Fjern wafer fra aligner og plassere den på en kokeplate for post-baking ved 95 ° C i 12 min.
- Bløt wafere i SU-8 utvikler (propylenglykol-monometyleter-acetat, PGMEA) oppløsning for å vaske ut ikke-tverrbundet PR i 12 minutter og forsiktig tørke med nitrogengass for å eksponere justeringsmerkene.
- Igjen, frakk 5 g negativ fotoresist på wafere av en spin coater; sentrifugering ved 700 rpm (SU-8 100) i 30 sek og 1200 rpm (SU-8 10) i 30 sek ved 300 &# 181; m tykt mønster og 27 um tykt mønster henholdsvis for å gjøre mikrosjikt.
- Plasser PR belagt skive på en varmeplate ved 65 ° C i 4 minutter og ved 95 ° C i 8 min (for 27 pm dyp fangst-brønn lag); og ved 65 ° C i 40 min og ved 95 ° C i 110 min (for 300 pm dyp kultur vel lag).
- Etter avkjøling plassere PR belagt silisium wafer på masken aligner utstyrt med UV-lys.
- Eksponer PR belagte silikonplaten for UV-lys (365 nm) ved en dose på 250 mJ / cm 2 (for 27 um tykt mønster) og 700 mJ / cm 2 (for 300 um tykt mønster).
- Bake skivene ved 95 ° C i 5 minutter (27 um tykt mønster) og 30 min (300 um tykt mønster), respektivt.
- Vask av den ikke-tverrbundet PR ved den PGMEA i 6 minutter (27 um tykt mønster) og 25 min (300 um tykt mønster), henholdsvis, og deretter tørke dem med nitrogengass.
- Mål høyden på mønsteret har påwafer med en avsøkende laser profilometer ved å plassere skiven på xy-fasen av en avsøkende laser profilometer.
- Juster fokusplanet for å tydelig vise mønsteret har på wafer ved å bruke "camera view" observasjon modus under en 20X objektiv.
- Slå observasjon modus fra "kamera view" til "laser view", og angi øvre og nedre posisjoner av funksjoner.
- Sett målemodus, område, kvalitet, og z-banen opp til gjennomsiktig (øverst), 1 linje (1024 x 1), høy nøyaktighet og 0,5 mikrometer, henholdsvis, og deretter trykke på start bunnen for å starte målingen.
2. Utarbeidelse av PDMS Enheter for Single-celle Isolation
- Før PDMS casting, silanize master formene med trichlorosilane å skape en hydrofob overflate, noe som gjør det lettere å skrelle av PDMS kopier fra master formene.
- Plasser master muggsopp og en vekting båt som inneholder200 ul av triklorsilan i en eksikator, og anvend vakuum (-85 kPa) i 15 min.
- Stopp vakuum og deretter forlate master muggsopp i tørkekammer for silanize master formene ved romtemperatur i minst en time.
- Fjern master formene fra eksikator og plasser hver master mold i en 10 cm petriskål.
- Bland et samlet beløp på 17,6 g PDMS polymer kit som inneholder en base og en herder i forholdet 10: 1, og deretter helle PDMS på master mold i petriskål.
- Sett petriskål i et tørke og bruke vakuum (-85 kPa) for en time for å fjerne luftbobler i PDMS.
- Fjern petriskål fra eksikkator og legg den i en konvensjonell ovn ved 65 ° C i 3-6 timer for å kurere PDMS.
- Ta av herdet PDMS kopier fra master formene og punch to hull som et innløp og et utløp ved de to endene av microchannel på fangst-godt utvalg PDMS replika av en puncher med indre diameter fra 0.75 mm for den fluidkanalen (figur 2A).
- Bruk tape til å rengjøre overflaten av PDMS kopier, og deretter plassere PDMS kopier i en plasma renere for kort oksygen plasma behandling (100 watt for 14 sek).
- Fjern det PDMS kopier fra oksygenplasma maskinen.
- Juster en topp (som inneholder fangst mikro) og en bunn PDMS (inneholder kulturmikro) kopi av hånden under et stereomikroskop og bringe dem i kontakt.
- Plasser de flukt PDMS kopier i en ovn ved 65 ° C i 24 timer for å oppnå permanent binding mellom PDMS replikaer for å danne den endelige enheten.
- Bløt PDMS anordningen i et avionisert (DI) -vann fylte beholder og plassere beholderen i en eksikator under vakuum (-85 kPa) i 15 minutter for å fjerne luft fra microchannel av PDMS-enheten.
- Plasser DI vannfylte PDMS enhet i en vev kultur hette og bruke UV-lys (bølgelengde av lys: 254 nm) for å sterilisere av enheten for 30 min.
- Erstatte DI vann i PDMS-enhet med en 5% bovint serumalbumin (BSA) i 1 x PBS-løsning og inkuberes ved 37 ° C i 30 minutter for å hindre at cellene fester seg til overflaten PDMS.
Merk: BSA belegget er avgjørende for å bedre overføringseffektivitet av isolerte celler fra fangst-godt til kultur-brønnen. - Sett på 5% BSA-oppløsning i PDMS-enhet med sterilisert 1 x PBS-oppløsning.
3. Utarbeidelse av Single-celle Suspension
- Kultur Neural stamcelle KT98, og human karsinomcellelinje A549 og MDA-MB-435 vi i petriskål på vanlig cellekultur inkubator (37 ° C, 5% CO2 og 95% fuktighet) for å fremstille celler som for enheten celle PDMS eksperiment .
- Fjern og kast det anvendte kulturmedium (DMEM basal medium som følger med 10% føtalt bovint serum og 1% antibiotika) fra kulturskål med celler dyrket til 70 - 80% konfluens.
- Vask forsiktig cellene med steriliserte PBS tre ganger. </ Li>
- Fjern og kast PBS, og tilsett 2 ml av en rekombinant enzym blanding med proteolytiske, kollagenolytisk og DNase aktiviteter (se materialliste for detaljert informasjon).
- Inkuber kultur fatet ved romtemperatur i 5 minutter, og deretter trykke på kultur fatet for å lette celle avløsning.
- Tilsett 4 ml sterilisert PBS for å dispergere cellene, og deretter overføre cellesuspensjonen i et 15 ml konisk rør.
- Sentrifuger røret ved 300 xg i 3 minutter og fjerne supernatanten.
- Forsiktig resuspender cellepelleten i 1 ml sterilt PBS og telle levende celle nummer ved hjelp av standard trypanblått eksklusjon metode 13.
Merk: Dette gjenoppløsningstrinn er kritisk for fremstilling av godt dissosiert enkeltcellesuspensjonen for å forbedre den enkeltcelleisolasjon effektivitet.
4. Single-celle isolasjon og Klonal Kultur
- Belastning 50 ul av cellesuspensjonen i en konsentrasjon på 2.2 til 2.5 x10
- Laste ytterligere 50 ul av cellesuspensjonen gjennom innløpet hull jevnt fylle opp hele microchannel med celler.
- Tett utløpshull med en plugg (en 3 mm lang, 1 mm diameter snitt nylon fiskeline) for å unngå strømning indusert av hydrostatisk trykk fra dråpene på innløps- og utløpshull.
Merk: Pluggene var UV sterilisert inne i en vev kultur hette før bruk. - Fyll opp en 1 ml steril sprøyte med kulturmedium, ta ut luftbobler fra den, og sette den opp på en sprøytepumpe.
- Koble mediet lastet sprøyten til innløpet hullet av PDMS-enhet via en 23 G stump nål og en poly-tetrafluoroethene (PTFE) tubing.
- Fjern pluggen fra uttaket hullet og altow en 2-minutters tidsintervall for å la cellene til å bosette seg i de encellede capture-brønner av gravitasjonskraft.
- Vaske bort uoppfangede cellene med 300 ul kulturmedium ved en strømningshastighet på 600 mL / min drives av sprøytepumpen.
- Vent i 2 min for å stabilisere enheten, og forsegle innløps- og utløpshull med plugger for å danne et lukket system kultur.
- Vend apparatet for hånd for å overføre de fangede single-celler til kulturen mikro.
- Plasser PDMS enhet i en 100-mm vev kultur tallerken, og tilsett 10 ml sterilisert PBS rundt enheten for å unngå kulturmedium fordampning fra microchannel.
- Flytt kulturskålen til en konvensjonell cellekulturinkubator (37 ° C, 5% CO2 og 95% fuktighet) for klonal kultur av enkelt-celler.
5. Kultur Medium Fylling
- Etter en d av kultur, erstatte kultur medium i PDMS enhet med frisk medium å forbedre celle proliferation.
- Plasser to dråper av dyrkingsmedium på toppen av PDMS enheten nær innløps- og utløps hull områder for å unngå å introdusere luftbobler inn i microchannel mens du utfører neste trinn.
- Punch to hull fra toppen av PDMS enheten nær de to endene av microchannel som et innløp og et utløp for microchannel.
Merk: Ikke slå gjennom hele to lag av PDMS enhet; i stedet, bare slå gjennom det øverste laget av PDMS. - Koble en 1 ml plastsprøyte inneholdende friskt medium med innløpet via en 23 G stump nål og PTFE-rør.
- Strømnings 120 ul friskt medium inn i anordningen i 5 minutter for å erstatte den gamle mediet.
- Sett to plugger til å tette innløpet og utløpet hull, og returnere enheten til cellekulturinkubator.
- Oppdater kulturmediet hver to d i løpet av kulturen ved å fjerne proppene, etterfulgt av å gjenta trinn 5.4 til 5.5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den mikrofluid plattform for enkeltcelleisolering og kultur omfatter en microchannel (200 mikrometer i høyde) med to sett av mikro arrays (figur 2A). De to settene med mikro matriser blir betegnet som fangst-brønns (25 mikrometer i diameter og 27 mikrometer i dybde) og kultur-brønn (285 pm i diameter og 300 mikrometer i dybden) for enkeltcelleisolering og kultur, henholdsvis, og hver capture-brønnen er plassert i sentrum av en kultur-godt når sett ovenfra-view (figur 2B). For drift av enheten (den skjematiske drift strømningen er illustrert i figur 1), det nødvendige utstyr (sprøytepumpe, vevskulturinkubator, og mikroskoper) og materialer (sprøyte, pipette, og tubing) er allment tilgjengelig i biologiske laboratorier. Videre er bærbarhet og gjennomsiktigheten av plattformen tillates cellene å bli lett observeres og analyseres i en anordning med en konvensjonsjonal mikroskop under cellekultur eksperimentet.
Fangst effektivitet av celler i capture-brønner Etter vasketrinnet varierer fra 67,80 ± 11,38% til 85,16 ± 1,91% (avhengig av celletype) (figur 3A). Videre har de fleste av de fangst-brønnene inneholder bare en enkelt celle for alle tre celletyper (89,89% - 92,98%), som ble bekreftet ved å analysere antallet lastede celler i kultur-brønner (figur 3B). Den endelige enkeltcelleisolasjon effektivitet i dyrknings-brønner var mer enn 76% for KT98 og MDA-MB-435-celler, men bare 61% av A549-celler på grunn av cellestørrelsesforskjeller mellom de testede celletyper.
For kreftforskning, kan klonogene analysen av enkeltceller brukes til å teste narkotika motstand og spredning forekomst av enkelte cellekolonier. Cellekulturen og klonogene analyse av de isolerte enkelt-celler i våre platform ble utført ved å oppdatere kulturmediet hver 2 d. Denne demonstrasjonen fremhever anvendelsen av denne enheten for å studere cellulære heterogenitet på celle-nivå ved å måle forskjellene i celle overlevelse og spredning forekomst av individuelle celler.
Den cellulære heterogenitet og spredning rate av de isolerte celler ble analysert fra daglig ervervet bilder. Resultatene viste at de isolerte enkeltceller kan bli dyrket i 7 d og oppviste forskjellige vekstmønstre. For eksempel, 13% av de isolerte celler hadde ingen celledeling og forble som en enkelt celle (figur 4B), mens 17,5% av cellene delt opp i mer enn 15 celler og som dannes cellekolonier (figur 4a) under kulturen. Cellulær heterogenitet blant de prolifererende celler, ble også bevist ved deres forskjellige vekstmønstre for å danne to celler (4,3%), tre celler (2,5%), og 4 - 14 celler(15%) i cellekulturen eksperimentet (figur 4C).
Disse resultatene indikerte at plattformen kan benyttes for langvarig cellekultur, klonogene analyser, og cellulære heterogenitet studier. Å ha et stort antall enkeltcellekolonier dyrket i et lite fotavtrykk området gjør også mikroskopisk analyse av cellene enklere.
. Figur 1. Skjematisk illustrasjon av drift flyt for høy gjennomstrømming encellet isolasjon og kultur i microfluidic plattform Operasjonen prosedyre for encellet isolasjon og klonal kultur omfatter 4 trinn: i) veieceller inn i microchannel av en plastspiss og manual pipette; ii) vaske bort uoppfangede cellene med friskt kulturmedium drevet av en sprøytepumpe; iii) etter forsegling innløps- og utløpsåpninger med plugger, den erolated celler ble overført fra fangst-brønner til kultur-brønner ved å vippe enheten; og iv) utføre klonal kultur (klonogene analyse) i kultur-brønner. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Foto og SEM bilder av den mikrofluidenkeltcelleisolering og kultur plattformen. (A) mikrofluid plattform lastet med rødt fargestoff som viser microchannel og mikrostrukturer for enkeltcellekultur. (B) Et representativt bilde som er tatt fra en snitt-enhet, som viser sideriss av tre enkeltcelleisolering og klonal kultur enheter i mikrofluid plattformen. Skala: 100 mikrometer. SEM bilder av enkeltcellekultur (C) og (D fange Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. KT98, A549, og MDA-MB-435 encellet isolasjon effektivitet i microfluidic plattform. (A) Effektivitet av KT98, A549, og MDA-MB-435 celler fanget i capture-brønner etter vask bort uoppfangede celler . Fangst effektivitet av celler var fra 67,80% til 85,16% i de tre celletyper. (B) Den encellede forholdet totalt kultur-brønner (slash bar) var mer enn 76% for KT98 og MDA-MB-435, men 61,63% for A549. (C) En representant bilde av individuelle KT98 enkeltceller(Rød, farget med celle tracker) isoleres i store kultur-brønner for klonal kultur. Skala: 300 mikrometer. (D) Cell nummer i celle okkuperte kultur-brønnene i KT98 celle modell. Forholdet mellom kultur-brønner var 77,3% med en enkelt celle, 16,31% med ingen celler, 5,96% med to celler, og 0,43% med mer enn tre celler. Feilfelt er representert som ± SD. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Cellekultur, klonogene analysen, og cellulær heterogenitet studium av isolerte A549 celler i mikrofluid plattform for 7 d. (A) En isolert encellet vokste og proliferert til en cellekoloni i kultur-brønnen. (B) En isolert enkeltcelle overlevde, men ikke dele, etter 7 dav kultur. Skala: 100 mikrometer. (C) De isolerte enkeltceller utstilt heterogene vekstmønstre etter å ha vært dyrket i 7 dager. Feilfelt er representert som ± SD. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mikrobaserte enhetssystemer 6,14 har blitt benyttet for encellede manipulasjon og analyse, for eksempel i stor skala enkelt celle fangst 6 og enkelt stamcelle spredning 15. Selv om vel størrelse, antall og form kan bli justert for spesielle anvendelser, enkeltcelleisolasjon effektivitet er alltid utsatt når størrelsen av brønnen økes. 9,15
For å overvinne denne begrensningen, Park et al., Rapporterte et mikrofluid brikke med trekantede mikrobrønner som har et høyt encellet fangfrekvens (58,34%), mens den mikro størrelsen er forstørret for å tillate celle spredning og vekst. Imidlertid kan mikrobrønnene (med lengden av en side ~ 50 mikrometer) støtter bare celleproliferasjon i opp til 2 d. 16 Våre dual-brønns strategi gir enkelt-celle lasting i store mikrobrønner for å ikke være begrenset av sannsynligheten for Poisson distribusjon oppstått i å begrense Dilumetode og åpne brønnsystemer 3, som demonstrert ved å tilveiebringe høy enkeltcelleisolasjon effektivitet (mer enn 75%) i store mikrobrønner hvis størrelse var tilstrekkelig for celle-proliferasjon i minst 7 dager (figur 4A). På grunn av sin evne til svært effektivt utføre encellet isolasjon og klonal kultur med en enkel enhet og drift prosedyre, ser vi for oss at vår microfluidic plattform kan utgjøre et nyttig verktøy for et bredt spekter av applikasjoner, inkludert kreft stamcelle utvalg av klonogene analyse 17 og høy gjennomstrømming kardio screening av narkotika 18,19.
En vesentlig begrensning av vår enkeltcelleisolering og kultur plattform er at det ikke danner individuelt lukkede kultur-brønner for å forhindre krysstale mellom celler dyrket i kultur-brønner. Derfor kan oppførselen til cellene bli påvirket av den parakrine sekresjon av andre isolerte enkelt-celler i mikrofluid enheten. den othennes begrensning av vår plattform er behovet for å fremstille forholdsvis høy tetthet cellesuspensjonen for høy effektivitet enkeltcelleisolasjon. Denne høye celle forbruk kan begrense anvendelser av sjeldne celle isolasjon og kultur, som ble kammer celler.
Før drift av enheten, er det viktig å injisere DI vann fra innløpshullet for å fylle microchannel og nøye observere enhver fluidlekkasje fra den bundne PDMS-enheten. Væskelekkasje påvirker flyten tilstanden i microchannel dermed kunne påvirke celle fangst og overføring av utfallet. I tillegg, selv om våre encellede lasting effektivitet Resultatene fra denne undersøkelsen viser svært lav celle tap etter å ha overført de isolerte celler fra capture-brønner til kultur-brønner, noe som indikerer at de fleste cellene kan være effektivt overføres ved å bla enheten, er overføring effektivitet redusert hvis BSA blokkeringstrinn (2,12) er ikke riktig utført. Brukere kan endre BSA blokkerings protokollen eller bruke alternative overflatemodifikasjonsfremgangsmåter for deres spesifikke celleeksperiment behov (f.eks økende BSA-konsentrasjon eller belegg tid da en mer vedheftende celletype som er brukt). Dimensjonene av cellefangst-brønner er de dominerende faktorer som må optimaliseres for den beste enkeltcelle lasting effektivitet i fangst-brønner, avhengig av størrelsen av den spesifikke celletype av interesse. Høye flere-celler-in-a-capture-brønn hendelser er grunn til å ha fangst vel størrelse for stor for celletype av interesse, mens lav celle lasteeffektivitet i fangst vel er en indikasjon på størrelsen av fangst velvære for liten. Det er også viktig å minimalisere cellegrupper i den fremstilte enkeltcellesuspensjon, som cellegrupper kan redusere effektiviteten av enkelt-celle lasting i fangst-brønner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AutoCAD software | Autodesk | AutoCAD LT 2011 | Part No. 057C1-74A111-1001 |
| Silicon wafer | Eltech corperation | SPE0039 | |
| Conventional oven | YEONG-SHIN company | ovp45 | |
| Plasma cleaner | Nordson | AP-300 | Bench-Top Plasma Treatment System |
| SU-8 50 negative photoresist | MicroChem | Y131269 | |
| SU-8 100 negative photoresist | MicroChem | Y131273 | |
| Spin coater | Synrex Co., Ltd. | SC-HMI 2" ~ 6" | |
| Hotplate | YOTEC company | YS-300S | |
| Msak aligner | Deya Optronic CO. | A1K-5-MDA | |
| SU-8 developer | Grand Chemical Companies | GP5002-000000-72GC | Propylene glycol monomethyl ether acetate |
| Scanning laser profilometer | KEYENCE | VK-X 100 | |
| Trichlorosilane | Gelest, Inc | SIT8174.0 | Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl. Hazardous. Corrosive to the respiratory tract, reacts violently with water. |
| Desiccator | Bel-Art Products | F42020-0000 | Space saver vacuum desiccator 190 mm white base |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) kit | Dow corning | Sylgard 184 | |
| Harris Uni-Core puncher | Ted Pella Inc. | 15072 | with 0.75 mm inner-diameter |
| Removable tape | 3M Company | Scotch Removable Tape 811 | |
| Stereomicroscope | Leica Microsystems | Leica E24 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Bersing Technology | ALB001.500 | |
| DMEM basal medium | Gibco | 12800-017 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Hyclone | SH30071.03HI | |
| Antibiotics | Biowest | L0014-100 | Glutamine-Penicillin-Streptomycin |
| Recombinant enzyme mixture | Innovative cell technology | AM-105 | Accumax |
| DiIC12(3) cell membrane dye | BD Biosciences | 354218 | Used as a cell tracker |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 703007 | |
| Plastic syringe (1 ml) | BD Biosciences | 309659 | |
| 23 gauge blunt needles | Ever Sharp Technology, Inc. | TD21 | |
| Poly-tetrafluoroethene (PTFE) tubing | Ever Sharp Technology, Inc. | TFT-23T | inner diameter, 0.51 mm; outer diameter, 0.82 mm |
References
- Meacham, C. E., Morrison, S. J. Tumour heterogeneity and cancer cell plasticity. Nature. 501 (7467), 328-337 (2013).
- Vermeulen, L., et al. Single-cell cloning of colon cancer stem cells reveals a multi-lineage differentiation capacity. P Natl Acad Sci USA. 105 (36), 13427-13432 (2008).
- Shapiro, H. M. Practical flow cytometry. , John Wiley & Sons. (2005).
- Leong, K. G., Wang, B. E., Johnson, L., Gao, W. Q. Generation of a prostate from a single adult stem cell. Nature. 456 (7223), 804-808 (2008).
- Shapiro, E., Biezuner, T., Linnarsson, S. Single-cell sequencing-based technologies will revolutionize whole-organism science. Nat Rev Genet. 14 (9), 618-630 (2013).
- Rettig, J. R., Folch, A. Large-scale single-cell trapping and imaging using microwell arrays. Anal. Chem. 77 (17), 5628-5634 (2005).
- Liu, J., et al. Soft fibrin gels promote selection and growth of tumorigenic cells. Nat Mater. 11 (8), 734-741 (2012).
- Charnley, M., Textor, M., Khademhosseini, A., Lutolf, M. P. Integration column: microwell arrays for mammalian cell culture. Integr. Biol. 1 (11-12), 11-12 (2009).
- Lindstrom, S., et al. High-density microwell chip for culture and analysis of stem cells. PloS one. 4 (9), e6997 (2009).
- Lin, C. H., et al. A microfluidic dual-well device for high-throughput single-cell capture and culture. Lab Chip. 15 (14), 2928-2938 (2015).
- Xia, Y. N., Whitesides, G. M. Soft lithography. Angew Chem Int Edit. 37 (5), 550-575 (1998).
- Shin, Y., et al. Microfluidic assay for simultaneous culture of multiple cell types on surfaces or within hydrogels. Nat Protoc. 7 (7), 1247-1259 (2012).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr. Protoc. Immunol. Appendix 3 (Appendix 3B), (2001).
- Lindstrom, S., Andersson-Svahn, H. Miniaturization of biological assays - Overview on microwell devices for single-cell analyses. Bba-Gen Subjects. 1810 (3), 308-316 (2011).
- Lecault, V., et al. High-throughput analysis of single hematopoietic stem cell proliferation in microfluidic cell culture arrays. Nat Methods. 8 (7), 581-593 (2011).
- Park, J. Y., et al. Single cell trapping in larger microwells capable of supporting cell spreading and proliferation. Microfluid Nanofluid. 8 (2), 263-268 (2010).
- Tirino, V., et al. Cancer stem cells in solid tumors: an overview and new approaches for their isolation and characterization. FASEB J. 27 (1), 13-24 (2013).
- Chen, P. C., Huang, Y. Y., Juang, J. L. MEMS microwell and microcolumn arrays: novel methods for high-throughput cell-based assays. Lab Chip. 11 (21), 3619-3625 (2011).
- Liang, P., et al. Drug Screening Using a Library of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes Reveals Disease-Specific Patterns of Cardiotoxicity. Circulation. 127 (16), 1677-1691 (2013).
