Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

एचपीएलसी आधारित परख मानव पुरानी लिम्फोसाईटिक ल्यूकेमिया कोशिकाओं में कोशिकी Nucleotide / nucleoside चयापचय नजर रखने के लिए

Published: July 20, 2016 doi: 10.3791/54124
Automatic Translation
1, 1
1Department of Medical Sciences, Human Genetics Foundation (HuGeF), University of Turin

Abstract

इस पद्धति का एक संवेदनशील, विशेष, विश्वसनीय और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य रिवर्स चरण उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (आरपी-एचपीएलसी) परख विकसित की है और अलग संस्कृति की शर्तों के तहत बाह्य प्यूरीन न्यूक्लियोटाइड और न्यूक्लियोसाइड शुद्ध पुरानी लिम्फोसाईटिक ल्यूकेमिया द्वारा उत्पादित (CLL) कोशिकाओं की मात्रा का ठहराव के लिए मान्य का वर्णन । (एएमपी), एडेनोसाइन (हलचल) एडेनोसाइन 5'-मोनोफास्फेट की chromatographic जुदाई और आइनोसीन (आईएनओ) एक सिलिका आधारित, उलट चरण स्तंभ है कि ध्रुवीय यौगिक बनाए रखने के लिए प्रयोग किया जाता है पर आरटी पर किया जाता है। विधि 7 मिमी अमोनियम एसीटेट और 1.00 मिलीग्राम / मिनट के प्रवाह की दर के साथ acetonitrile के होते हैं जो एक द्विआधारी मोबाइल चरण शामिल हैं। eluates एक photodiode सरणी यूवी डिटेक्टर 260 एनएम पर सेट का उपयोग कर निगरानी कर रहे हैं। एक मानक अंशांकन वक्र प्रत्येक प्यूरीन परिसर के विश्लेषणात्मक मात्रा का ठहराव के लिए समीकरण गणना करने के लिए उत्पन्न होता है। प्रणाली नियंत्रण, डाटा अधिग्रहण और विश्लेषण तो प्रदर्शन कर रहे हैं। इस प्रोटोकॉल को लागू करने, एएमपी, आईएनओ और हलचल, 7, 11 और 11.9 मिनट पर elute क्रमशः, और प्रत्येक नमूना के लिए कुल चलाते समय 20 मिनट है। इस प्रोटोकॉल मैट्रिक्स के रूप में संस्कृति मीडिया का उपयोग कर विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं और सेल लाइनों (दोनों निलंबन और पक्षपाती) को लागू किया जा सकता है। फायदे का आसान और तेजी से नमूना तैयार करने और विश्लेषण के लिए सतह पर तैरनेवाला की एक छोटी राशि की आवश्यकता है। इसके अलावा, एक सीरम मुक्त माध्यम का उपयोग acetonitrile के साथ प्रोटीन वर्षा कदम लंघन की अनुमति देता है कि प्रभावों प्यूरीन यौगिकों के अंतिम एकाग्रता। विधि की सीमाओं में से एक प्रत्येक एकल नमूना रन से पहले चलाने संतुलन स्तंभ की आवश्यकता है, लंबे समय तक प्रयोग के कुल चलाते समय बना रही है और उच्च throughput स्क्रीनिंग अनुप्रयोगों को रोकने के लिए है।

Introduction

Adenosine (हलचल) एक adenine एक glycosidic बांड के माध्यम से एक राइबोज़ चीनी अणु आधा भाग से जुड़ी अणु के साथ एक प्यूरीन nucleoside है। जब बाह्य वातावरण में मौजूद है, यह प्रतिरक्षा प्रणाली की कार्रवाई से अत्यधिक नुकसान से कोशिकाओं की रक्षा करता है। इस भूमिका में इस तरह के कोलाइटिस 1, 2 मधुमेह, अस्थमा 3, पूति 4, और इस्कीमिक चोट 5 के रूप में विभिन्न रोग मॉडल, का उपयोग पर प्रकाश डाला गया है। मुख्य हलचल कार्यों में से एक ट्यूमर microenvironment में प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के निषेध, ट्यूमर प्रतिरक्षा चोरी के 6 के लिए योगदान दे रहा है। इस कारण से, तंत्र हलचल गठन और संकेतन में शामिल काफी चिकित्सीय ब्याज 7 के हैं।

ऊतक microenvironment में हलचल का स्तर सामान्य शारीरिक शर्तों के तहत और निश्चित रूप से प्रतिरक्षा कोशिकाओं की संवेदनशीलता सीमा से नीचे अपेक्षाकृत कम हैं। हालांकि, हाइपोक्सिया के दौरान, ischemia, सूजन, संक्रमण, चयापचयतनाव और ट्यूमर परिवर्तन वे तेजी से 8 वृद्धि हुई है। एक ऑटोक्राइन और पैराक्राइन तरह से ऊतक चोट रिपोर्ट करने के लिए और ऊतक प्रतिक्रिया है कि आम तौर पर cytoprotective के रूप में देखी जा सकती है उत्पन्न करने के लिए: ऊतक perturbing संकेतों के जवाब में ऊंचा बाह्य हलचल स्तरों एक दोहरी समारोह है।

कोशिकी हलचल तंत्र है, जो एडेनोसाइन deaminase द्वारा संचालित बिगड़ा गिरावट की वजह से nucleoside ट्रांसपोर्टरों 9 या संचय द्वारा मध्यस्थता intracellular डिब्बों से रिहाई शामिल की एक किस्म के माध्यम से बनाई जा सकती है। मुख्य मार्ग में वृद्धि हुई बाह्य हलचल स्तर के लिए अग्रणी ectonucleotidases, जो झिल्ली जुड़े मृत या मर कोशिकाओं से जारी न्यूक्लियोटाइड की phosphohydrolysis से हलचल पैदा करने ectoenzymes रहे हैं की एक झरना की कार्रवाई शामिल है। इस मार्ग में CD39 के अनुक्रमिक कार्रवाई के माध्यम से आय (ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase -1) कि बाह्य एडेनोसाइन 5'-triphosphate धर्मान्तरित (एटीपी) या एडेनोसाइन 5'-मोनोफास्फेट (एएमपी) के लिए और CD73 (5'-nucleotidase) के एडेनोसाइन 5'-diphosphate (ADP) है, जो एएमपी 10 हलचल को बदल देता है।

कोशिकी हलचल चार transmembrane हलचल रिसेप्टर्स, अर्थात् A1, A2A, A2B और A3 के बंधन से अपनी शारीरिक प्रतिक्रियाओं elicits। प्रत्येक रिसेप्टर हलचल और विशिष्ट ऊतक वितरण के लिए विभिन्न समानताएं है। सभी रिसेप्टर्स सात transmembrane डोमेन है और जी-प्रोटीन intracellular जीटीपी बाध्यकारी प्रोटीन (जी प्रोटीन) के लिए युग्मित, कि पैदा कर सकते हैं (जी एस प्रोटीन) या बाधित (सैनिक प्रोटीन) adenylate साइक्लेज गतिविधि और, बाद में, intracellular शिविर का उत्पादन कर रहे हैं। इसलिए, शारीरिक प्रतिक्रियाओं 11 के दौरान intracellular प्रोटीन काइनेज गतिविधि पर cytoplasmic शिविर का स्तर प्रभाव में बदल जाता है। शारीरिक शर्तों के तहत बाह्य हलचल 1 माइक्रोन, जो अंधाधुंध A1, A2A और A3 रिसेप्टर्स सक्रिय कर सकते हैं नीचे है। हालांकि, A2B उप प्रकार की सक्रियता के काफी अधिक आवश्यकता हैऐसे pathophysiological शर्तों के तहत उत्पन्न उन के रूप में nucleoside की सांद्रता। वैकल्पिक रूप से, बाह्य हलचल आइनोसीन (आईएनओ) एडेनोसाइन deaminase (एडीए) और CD26, एक एडीए complexing प्रोटीन कोशिका की सतह पर एडीए स्थानीयकृत द्वारा को अपमानित किया जा सकता है। एक और संभावना है कि हलचल हलचल काइनेज प्रोटीन 12,13 द्वारा equilibrative nucleoside ट्रांसपोर्टरों (ईएनटी) और एएमपी के लिए फॉस्फोरिलेटेड के माध्यम से सेल से भली भाँति होता है।

इस प्रोटोकॉल के उद्देश्य के रूप में मानव लिम्फोसाइट द्वारा उत्पन्न एक ही समय में, सब्सट्रेट एएमपी और उत्पादों हलचल और आईएनओ यों तो रिवर्स चरण उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (आरपी-एचपीएलसी) के एक विश्लेषणात्मक विधि का वर्णन करने के लिए है। हमारा अनुभव शुरू में पुरानी लिम्फोसाईटिक ल्यूकेमिया (CLL) रोगियों, जो अनिवार्यता से CD39 14,15 व्यक्त CD19 + / CD5 + बी लिम्फोसाइटों के एक परिपक्व आबादी के विस्तार की विशेषता है से कोशिकाओं का उपयोग कर प्राप्त किया गया था। हम लगभग 30% से पता चलाCLL के रोगियों CD73 ectoenzyme व्यक्त करने और है कि इस phenotype एक गरीब रोग का निदान 16 के साथ संबद्ध। leukemic कोशिकाओं सह व्यक्त CD39 और CD73 के इस उप-जनसंख्या सक्रिय रूप से ADP और / या एएमपी से बाह्य हलचल उत्पादन कर सकते हैं। Α साथ CD73 + CLL कोशिकाओं के preincubation, β-methylene-ADP (APCP), CD73 enzymatic गतिविधि का एक ज्ञात अवरोध, पूरी तरह से ब्लॉक बाह्य हलचल संश्लेषण की पुष्टि है कि CD73 कि झरना 16 वर्ष की बोतल गर्दन एंजाइम का प्रतिनिधित्व करता है।

CLL कोशिकाओं को भी एडीए और एडीए complexing प्रोटीन CD26, जो हलचल के रूपांतरण आईएनओ में के लिए जिम्मेदार हैं व्यक्त करते हैं। ऐसे erythro-9 के रूप में विशिष्ट एडीए निरोधक, का उपयोग करके (2 हाइड्रोक्सी 3-Nonyl) मैं wiadenine (ehna) हाइड्रोक्लोराइड और deoxycoformycin (डीसीएफ), यह आईएनओ में बाह्य हलचल गिरावट ब्लॉक करने के लिए संभव है। इसके अलावा, dipyridamole के साथ संयोजन में एक एडीए अवरोध करनेवाला के साथ pretreatment, कि ब्लॉक nucleoside ट्रांसपोर्टरों, सेल में हलचल संचय को बढ़ाता हैsupernatants।

हम तो टी lymphocytes और माइलॉयड कोशिकाओं, CD73 निर्भर हलचल उत्पादन की पुष्टि सहित अन्य प्रजातियों से ली गई कोशिकाओं के लिए इस प्रोटोकॉल का विस्तार किया है। ये निष्कर्ष बताते हैं कि इस एचपीएलसी प्रोटोकॉल अत्यधिक बहुमुखी है और यह अलग सेल प्रजातियों के लिए और (चित्रा 1) अलग-अलग संस्कृति की स्थिति के लिए लागू किया जा सकता है।

आकृति 1
बाह्य हलचल उत्पादन के लिए जिम्मेदार एंजाइमी मशीनरी की चित्रा 1. योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। Adenosine 5'-triphosphate (एटीपी) और / या एडेनोसाइन 5'-diphosphate (ADP) एडेनोसाइन 5'-मोनोफास्फेट (एएमपी), के लिए CD39 द्वारा अपमानित किया जा सकता है, जो बदले में nucleoside एडेनोसाइन (हलचल) में CD73 से बदल जाती है। एक बार हलचल बाह्य अंतरिक्ष में उत्पादन किया है, यह nucleoside ट्रांसपोर्टरों (ईएनटी) के माध्यम से सेल फिर से दर्ज हो सकता है, आइनोसीन में परिवर्तित हो (आईएनओ) याP1 बतंगड़ रिसेप्टर्स के विभिन्न प्रकारों के लिए बाध्य। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

CLL रक्त के नमूनों संस्थागत दिशा निर्देशों और हेलसिंकी की घोषणा के अनुसार प्राप्त कर रहे हैं।

CLL मरीजों के रक्त के नमूने से लयूकेमिक लिम्फोसाइटों के 1. अलगाव

  1. सोडियम हेपरिन (हरा-ऊपर) ट्यूब 17 में खून का नमूना ले लीजिए।
  2. आरटी 1x फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के साथ पूरे रक्त के 3 घोला: 1 बनाओ।
  3. घनत्व ढाल centrifugation द्वारा रक्त के नमूनों से परिधीय रक्त कोशिकाओं mononuclear (PBMC) शुद्ध।
    1. बुनियाद 5 एक 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में घनत्व centrifugation मीडिया (जैसे, Ficoll) की मिलीलीटर और ध्यान से पतला रक्त के 10 मिलीलीटर हस्तांतरण। इसके तत्काल बाद आरटी पर 20 मिनट के लिए 1,500 XG पर अपकेंद्रित्र।
  4. एक गिलास पाश्चर एक वैक्यूम पंप से जुड़ा विंदुक के साथ सतह पर तैरनेवाला के महाप्राण हिस्सा है और एक 5 मिलीलीटर विंदुक के साथ घनत्व centrifugation मीडिया और पतला प्लाज्मा के बीच interphase पर PBMC अंगूठी इकट्ठा। एक 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब पर स्थानांतरण और पीबीएस के साथ धोने (50 मीटरएल अंतिम मात्रा)। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 500 XG पर अपकेंद्रित्र।
  5. महाप्राण एक गिलास पाश्चर विंदुक के साथ सतह पर तैरनेवाला, पीबीएस के 50 मिलीलीटर में गोली resuspend और एक hemocytometer का उपयोग कोशिकाओं की गिनती।
  6. और विरोधी CD19 के साथ दाग PBMCs प्रवाह के लिए -CD5 एंटीबॉडी cytometry immunostaining के लिए एक मानक प्रोटोकॉल के बाद और PBMC उप-जनसंख्या संरचना 18 के लिए जाँच करें।
    नोट: CLL लिम्फोसाइट CD19 + / CD5 + हैं।
  7. 18 कोशिकामापी एक प्रवाह का उपयोग CD19 + / CD5 + कोशिकाओं की% की जाँच करें। CD19 + / CD5 + निर्देश बी कोशिकाओं 19 के नकारात्मक अलगाव के लिए चरण 2 में विस्तृत निम्नलिखित leukemic कोशिकाओं का एक ≥95% के साथ रोगियों से बी लिम्फोसाइट शुद्ध।

नकारात्मक अलगाव द्वारा लयूकेमिक बी कोशिकाओं की 2. शोधन

  1. Resuspend 10 पीबीएस 0.1% गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) 2 मिमी EDTA, 7.4 पीएच (अलगाव बफर) में 7 PBMCs / एमएल।
  2. 10 जोड़े1; माउस मोनोक्लोनल विरोधी CD3, -CD14 और 10 7 कोशिकाओं के लिए -CD16 प्राथमिक एंटीबॉडी की जी और 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए सेते हैं।
  3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 500 XG पर अलगाव बफर और सेंट्रीफ्यूज के साथ कोशिकाओं को धो लें।
  4. 10 7 PBMCs / मिलीलीटर में अलगाव बफर में कोशिकाओं resuspend।
  5. कोशिकाओं के साथ incubating से पहले, भेड़ विरोधी माउस आईजीजी शीशी में चुंबकीय मोती resuspend। एक ट्यूब के लिए 10 7 कोशिकाओं प्रति मोतियों की 100 μl स्थानांतरण।
  6. अलगाव बफर के 1 एमएल जोड़ें और 1 मिनट के लिए एक चुंबक धारक में ट्यूब जगह। एक 5 मिलीलीटर विंदुक के साथ सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
  7. चुंबक से ट्यूब निकालें और अलगाव बफर के 100 μl में धोया मोती resuspend।
  8. कोमल झुकने और रोटेशन के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए चुंबकीय मोतियों की 100 μl के साथ 10 7 कोशिकाओं को सेते हैं।
  9. 2 मिनट के लिए चुंबक धारक में ट्यूब प्लेस और CD19 + / CD5 + अनबाउंड कोशिकाओं के साथ सतह पर तैरनेवाला हस्तांतरणएक 5 मिलीलीटर विंदुक के साथ एक ताजा ट्यूब।
  10. अलगाव प्रोटोकॉल के अंत में, cytometry विरोधी CD19 के साथ कोशिकाओं के 100 μl और प्रवाह के लिए -CD5 एंटीबॉडी दाग ​​और 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट सेते हैं। , प्रवाह से फिर बी सेल शुद्धता की जांच 19 cytometry पीबीएस 1% बीएसए के 3 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को धो लें सतह पर तैरनेवाला के अतिरिक्त त्यागने और।
    नोट: यदि बी सेल पवित्रता 95% से कम है एक अतिरिक्त नकारात्मक अलगाव कदम प्रदर्शन।

3. मानक और inhibitors स्टॉक समाधान की तैयारी

  1. एएमपी तैयार करते हैं, एएमपी के 0.00345 ग्राम वजन और सीरम मुक्त माध्यम के 5 मिलीलीटर में इसे भंग एएमपी के एक 2 मिमी मानक समाधान है।
  2. बतंगड़ तैयार करने के लिए, हलचल से बाहर 0.00265 ग्राम वजन और सीरम मुक्त माध्यम के 5 मिलीलीटर में इसे भंग हलचल की एक 2 मिमी मानक समाधान है।
  3. आईएनओ तैयार करते हैं, आईएनओ के बाहर 0.00268 ग्राम वजन और सीरम मुक्त माध्यम के 5 मिलीलीटर में इसे भंग आईएनओ के एक 2 मिमी मानक समाधान है।
  4. एएमपी, हलचल की एक 400 माइक्रोन के समाधान तैयार है औरआईएनओ सीरम मुक्त मध्यम (5 मिलीलीटर अंतिम मात्रा) के 4 मिलीलीटर में 2 मिमी शेयर समाधान के 1 मिलीलीटर के मिश्रण से।
    1. सीरम मुक्त मध्यम (2 मिलीलीटर अंतिम मात्रा) के 1,500 μl में 400 माइक्रोन के समाधान के 500 μl pipetting द्वारा एक 100 सुक्ष्ममापी एकाग्रता प्राप्त करने के लिए प्रत्येक 400 माइक्रोन के मानक समाधान के 4 कमजोर पड़ने: 1 बनाओ।
    2. निम्नलिखित सांद्रता प्राप्त करने के लिए सीरम मुक्त माध्यम में प्रत्येक परिसर के धारावाहिक dilutions तैयार: 100 सुक्ष्ममापी - 50 माइक्रोन के - 25 माइक्रोन के - 10 माइक्रोन - 5 सुक्ष्ममापी - 2.5 सुक्ष्ममापी - 1 माइक्रोन - 0.5 सुक्ष्ममापी - 0.25 माइक्रोन।
      नोट: उदाहरण के लिए, पिपेट 1 सीरम मुक्त माध्यम से 1 मिलीलीटर में 100 माइक्रोन के समाधान के मिलीलीटर (1: 2 कमजोर पड़ने) 50 माइक्रोन के एकाग्रता प्राप्त और शेष dilutions के साथ आगे बढ़ने के लिए।
  5. APCP पीबीएस में भंग की एक 10 मिमी स्टॉक समाधान तैयार है; विभाज्य और कम से शेयर - 30 डिग्री सेल्सियस।
  6. Ehna हाइड्रोक्लोराइड, डीसीएफ और dipyridamole डाइमिथाइल sulfoxide में भंग 10 मिमी स्टॉक समाधान (DMSO) तैयार करें; विभाज्य है और शेयर में -30सी।

4. कार्यक्रम एचपीएलसी विधि

  1. डबल deionised पानी के 2 एल (बफर) में अमोनियम एसीटेट के 0.770 ग्राम भंग करके एक 7 मिमी अमोनियम एसीटेट बफर तैयार करें। हाइड्रोक्लोरिक एसिड के साथ 3.0 पीएच को समायोजित करें।
  2. एक गिलास युक्त एचपीएलसी (बफर बी) के लिए ultrapure acetonitrile के कम से कम 2 एल बोतल तैयार है और गार्ड स्तंभ और एचपीएलसी करने के लिए स्तंभ कनेक्ट।
    नोट: कॉलम और buffers आरटी पर हैं उपयोग में है।
  3. एचपीएलसी सॉफ्टवेयर में प्रवेश करें और "ब्राउज परियोजना" बटन का चयन करें। "फाइल" मेनू पर जाएँ और "नई विधि" और फिर "साधन विधि" का चयन करें।
  4. कार्यक्रम के अनुसार 1 टेबल के रूप में संतुलन स्तंभ विधि। 1.00 मिलीग्राम / मिनट के प्रवाह की दर निर्धारित करें और यूवी डिटेक्टर कार्यक्रम 260 एनएम पर पढ़ने के लिए। साधन विधि बचाने के लिए और फिर "नई विधि" "फाइल" मेनू से "विधि सेट" का चयन करें और उसके बाद। पहले से बचाया साधन विधि चुनेंऔर वर्तमान विधि में एक ही नाम के साथ सेट बचाने के लिए।
पहर प्रवाह की दर (मिलीग्राम / मिनट) %ए % बी
1.00 100 0
1.24 1.00 100 0
6.22 1.00 2 98
18.65 1.00 2 98

तालिका 1: संतुलन स्तंभ विधि स्तंभ के संतुलन के लिए विलायक परिवर्तन की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व।। एक बफर: 7 मिमी अमोनियम एसीटेट, पीएच 3.0। बफर बी: acetonitrile।

  1. 4.3 चरण दोहराएँ रन नमूना विधि तालिका 2 में संकेत कार्यक्रम के लिए सेट 1.00 मीटर के प्रवाह की दरएल / मिनट और कार्यक्रम यूवी डिटेक्टर 260 एनएम पर पढ़ने के लिए। साधन विधि बचाने के लिए और कदम 4.4 में वर्णित के रूप में विधि सेट को बचाने के लिए एक ही प्रक्रिया दोहराएँ ..
पहर प्रवाह की दर (मिलीग्राम / मिनट) %ए % बी
1.00 0 100
3.74 1.00 0 100
13.71 1.00 15 85
17.00 1.00 100 0
20.00 1.00 100 0

तालिका 2: भागो नमूना विधि। प्यूरीन यौगिकों के एचपीएलसी माप के लिए विलायक परिवर्तन की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। चमड़ाer a: 7 मिमी अमोनियम एसीटेट, पीएच 3.0। बफर बी: acetonitrile।

  1. "चलाने के नमूने" बटन का चयन करें, "फाइल" मेनू से "नया नमूना सेट विधि" चुनें।
  2. "खाली" विकल्प का चयन करें और शीशी (autosampler में) की संख्या, नमूना नाम, इंजेक्शन की मात्रा (50 μl) दर्ज करें। विधि "विधि सेट" स्तंभ के लिए पहले बचाया सेट का चयन करें और कुल चलाते समय (मिनट) दर्ज करें।
    नोट: प्रत्येक नमूना रन से पहले "विधि सेट" कॉलम में संतुलन स्तंभ विधि (तालिका 1) दर्ज करें और कुल चलाते समय (मिनट) दर्ज करें।

5. प्रत्येक परिसर के लिए एक मानक अंशांकन वक्र की पीढ़ी

  1. खाली (विशिष्ट सीरम मुक्त माध्यम है, जो एडेनोसाइन deaminase शामिल नहीं है) के लिए और प्रत्येक मानक नमूना तालिका 1 और 2 टेबल में वर्णित विधि निम्न में से 50 μl इंजेक्षन।
    1. संतुलन स्तंभ का प्रयोग करेंविधि (तालिका 1) प्रत्येक नमूना रन से पहले और पर्याप्त चोटी जुदाई प्राप्त करने के लिए ढाल की स्थिति तालिका 2 में वर्णित निर्धारित किया है। इन शर्तों के तहत एचपीएलसी एएमपी, हलचल और आईएनओ की सूचना प्रतिधारण समय के लिए 3 टेबल को देखें।
अवधारण समय λ अधिकतम
एएमपी 8.00 मिनट 260
मैं नहीं 11.00 मिनट 260
बतंगड़ 11.90 मिनट 260

तालिका 3: प्यूरीन यौगिकों की अवधारण बार विशिष्ट प्रतिधारण बार एएमपी, हलचल और आईएनओ के लिए मनाया।। यूवी डिटेक्टर 260 एनएम पर पढ़ने के लिए प्रोग्राम किया जाता है।

  1. प्रत्येक मानक के नाममात्र एकाग्रता के खिलाफ शिखर क्षेत्रों प्लॉट नौ सूत्री अंशांकन वक्र प्राप्त करने के लिए (100, 50, 25, 10, 5, 2.5, 1, 0.5, 0.25 माइक्रोन) के।
  2. एएमपी, हलचल और आईएनओ के लिए एक सीधी रेखा का समीकरण की गणना: y = mx + बी,
    जहां एक्स सुक्ष्ममापी एकाग्रता और y है शिखर क्षेत्र के अनुरूप हैं।

चित्र 2
चित्रा 2. एक आंतरिक मानक वक्र का सृजन। बतंगड़ के लिए प्रतिनिधि अंशांकन मानक वक्र और रिश्तेदार समीकरण प्राप्त की। उसकी क्लिक करेंई यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए।

6. Inhibitors और ऊष्मायन सब्सट्रेट के साथ साथ pretreatment (एएमपी)

  1. और CD73, एडीए के निषेध nucleoside ट्रांसपोर्टरों, resuspend बिना एएमपी खपत, हलचल और आईएनओ पीढ़ी परीक्षण करने के लिए 2 एक्स 10 6 CD19 + / CD5 + CLL कोशिकाओं (पृथक और चरण 1 में शुद्ध और 2) सीरम मुक्त माध्यम के 250 μl में और एक 48 अच्छी तरह से थाली में थाली कोशिकाओं (या एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में)।
  2. एक 10 माइक्रोन के अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए संस्कृति के माध्यम में 1,000 APCP (10 मिमी) के शेयर समाधान: CD73 enzymatic गतिविधि को ब्लॉक करने के लिए, पतला 1। APCP युक्त संस्कृति के माध्यम से 250 μl में 2 एक्स 10 6 CLL कोशिकाओं resuspend और एक सेल कल्चर इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 60 मिनट के pretreat।
  3. आईएनओ में हलचल के रूपांतरण को ब्लॉक करने के लिए, पतला 1: 1,000 सीरम मुक्त माध्यम में ehna हाइड्रोक्लोराइड और / या डीसीएफ के शेयर समाधान (दोनों 10 मिमी) एक 10 माइक्रोन के अंतिम एकाग्रता है।Ehna और / या डीसीएफ युक्त संस्कृति के माध्यम से 250 μl में 2 एक्स 10 6 CLL कोशिकाओं Resuspend। सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए सेते हैं।
  4. सीरम मुक्त माध्यम में dipyridamole के 1,000 शेयर समाधान (10 मिमी) एक 10 माइक्रोन के अंतिम एकाग्रता के लिए है: nucleoside ट्रांसपोर्टरों के माध्यम से हलचल के तेज को ब्लॉक करने के लिए, 1 पतला। संस्कृति के माध्यम से युक्त dipyridamole के 250 μl में 2 एक्स 10 6 CLL कोशिकाओं resuspend और सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए सेते हैं।
  5. APCP, ehna, डीसीएफ के एकल समाधान तैयार है और dipyridamole पतला 1: 400 में 1,000 माइक्रोन के एएमपी।
  6. 200 माइक्रोन के एएमपी के अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए 400 माइक्रोन के एएमपी या एएमपी प्लस अवरोधकों के 250 μl जोड़ें। शामिल सब्सट्रेट के अभाव में एक शर्त खाली नमूना के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा।
  7. 30 से 37 डिग्री सेल्सियस पर 60 मिनट के लिए सेते हैं।
    नोट: एएमपी और ऊष्मायन समय का इष्टतम एकाग्रता प्रयोगात्मक निर्धारित किया गया है।
  8. टी मेंवह ऊष्मायन समय के अंत में, ठंड microcentrifuge ट्यूब में (बर्फ पर) supernatants के 500 μl इकट्ठा करने और तुरंत 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 17,000 XG पर अपकेंद्रित्र।
  9. नई 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में supernatants स्थानांतरण और तुरंत -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर या तैयारी करने के लिए नमूना एचपीएलसी के लिए चलाता है आगे बढ़ना।

7. नमूने एचपीएलसी के लिए तैयारी

  1. 0.2 माइक्रोन सिरिंज फिल्टर के साथ नया 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में supernatants फ़िल्टर। छानने के लिए 1 मिलीलीटर सीरिंज का प्रयोग करें।
  2. एचपीएलसी प्रणाली एक autosampler के साथ प्रदान की जाती है, तो एचपीएलसी के लिए कांच की शीशियों को तैयार करने और नमूना की छोटी मात्रा के लिए 0.1 मिलीलीटर सूक्ष्म सम्मिलित करता है का उपयोग करें।
  3. स्थानांतरण एक micropipette या एक गिलास पाश्चर विंदुक के साथ कांच की शीशी में नमूने के कम से कम 100 μl। बुलबुले के बिना हस्तांतरण और पेंच टोपी के साथ शीशी बंद करने के लिए सावधान रहें।
  4. नमूने अब आरपी-एचपीएलसी द्वारा विश्लेषण के लिए तैयार हैं।

8. एचपीएलसी measuPurines के rements

  1. "रन नमूने" बटन का चयन करें; "फाइल" मेनू से "नया नमूना सेट विधि" चुनें।
  2. "खाली" विकल्प का चयन करें और संकेत मिलता है: शीशी (autosampler में) की संख्या, नमूना नाम, इंजेक्शन की मात्रा (50 μl)।
  3. संतुलन स्तंभ विधि और रन नमूना विधि में 1 टेबल और 2 टेबल वर्णित का चयन करें, क्रमशः, सभी रिक्त और नमूना रन का पालन करें कि के लिए।
    नोट: प्रत्येक नमूना रन से पहले संतुलन स्तंभ विधि (तालिका 1) सेट करें।
  4. रिक्त (सीरम मुक्त मध्यम) की है और प्रत्येक नमूना के 50 μl इंजेक्षन।
  5. प्रत्येक नमूने में purines की एकाग्रता का निर्धारण, 3 टेबल में वर्णित प्रतिधारण समय पर शिखर क्षेत्रों प्राप्त करने के द्वारा एएमपी, हलचल और आईएनओ यों।
    1. "प्रक्रिया" बटन और अगले "एकीकृत" विकल्प का चयन करें। वैकल्पिक रूप से मैन्युअल रूप से चयन एक शुरूप्रत्येक एकल चोटी के एन डी अंत अंक क्षेत्र माप प्राप्त करने के लिए। इस शिखर की शुरुआत और अंत अंक के बीच एक लाइन ट्रेसिंग द्वारा किया जाता है।
    2. सुक्ष्ममापी एकाग्रता समीकरण मानक वक्र के लिए प्राप्त आवेदन करने का निर्धारण करते हैं: y = mx + बी, जहां एक्स सुक्ष्ममापी एकाग्रता का प्रतिनिधित्व करता है और वाई चोटी अज्ञात नमूना से मापा का क्षेत्र है।
      नोट: बतंगड़ अंशांकन मानक वक्र का एक उदाहरण चित्रा 2, जहां में सूचना दी है: एक्स = (y क्षेत्र - 981.02) / 40026
  6. यह देखते हुए कि 2 x 10 6 कोशिकाओं माध्यम की 0.500 मिलीग्राम में resuspended थे, एएमपी के μmoles गणना, हलचल और आईएनओ का सेवन किया और / या निम्न अनुपात लागू करने के 10 6 CLL कोशिकाओं द्वारा निर्मित:
    μmoles: 1000 मिलीलीटर = एक्स μmoles: 0.250 मिलीग्राम
    नोट: 1,000 मिलीलीटर में μmoles (संख्या 1 एल में μmoles) सुक्ष्ममापी एकाग्रता के बराबर हैं और एक्स परमाणु के μmoles हैं कीcleotide या nucleoside 10 6 कोशिकाओं द्वारा निर्मित है।
    1. अन्त में, भस्म और / या 10 6 CLL कोशिकाओं द्वारा उत्पादित nmoles में μmoles परिवर्तित:
      nmoles = μmoles x 1000

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

एक प्रतिनिधि CLL रोगी से हौसले शुद्ध PBMCs में leukemic कोशिकाओं का प्रतिशत (%) का मूल्यांकन करने के लिए, कोशिकाओं विरोधी CD19 और विरोधी CD5 एंटीबॉडी के साथ चिह्नित कर रहे हैं। चित्रा 3 के बाएं पैनल जीवित कोशिकाओं पर एक चयनात्मक गेट के साथ एक cytofluorimetric डॉट साजिश का प्रतिनिधित्व करता है। चित्रा 3 से पहले (मध्यम पैनल) एक CLL रोगी से PBMC का एक उदाहरण दिखाता है और बाद में (सही पैनल) बी सेल शुद्धि।

CD73 + CLL कोशिकाओं में प्यूरीन यौगिकों की मात्रा का ठहराव एचपीएलसी का एक उदाहरण चित्रा -4 ए में प्रतिनिधित्व किया है। 260 एनएम पर एएमपी, आईएनओ और हलचल के विभिन्न प्रतिधारण बार यौगिकों का एक साथ मात्रा का ठहराव अनुमति देते हैं। जब परख सही ढंग से चलाया जाता है, सभी न्यूक्लियोटाइड और न्यूक्लियोसाइड एक पर्याप्त चोटी जुदाई है। सब्सट्रेट के रूप में 200 माइक्रोन के एएमपी के एक एकाग्रता से शुरू, चोटियों हलचल और आईएनओ के लिए प्राप्त स्पष्ट रूप से कर रहे हैंदिखाई और सांद्रता मानक अंशांकन वक्र की रेंज में हैं। हालांकि, सब्सट्रेट की भी कम सांद्रता (जैसे, 100 सुक्ष्ममापी) का उपयोग करते हुए अच्छा परिणाम दे देंगे। चोटी के एकीकरण के बाद, प्रत्येक चोटी के क्षेत्रों सुक्ष्ममापी एकाग्रता में और अंत में परिसर के nmoles मानक घटता के उपयोग के माध्यम से 10 6 CLL लिम्फोसाइट द्वारा उत्पादित में परिवर्तित कर रहे हैं।

बतंगड़ की एचपीएलसी वर्णलेख 10 माइक्रोन APCP साथ pretreatment के 60 मिनट के बाद CD73 + कोशिकाओं द्वारा उत्पादित बाह्य हलचल संश्लेषण (चित्रा -4 ए) की एक पूरी नाकाबंदी इंगित करता है। एडीए / CD26 जटिल द्वारा संचालित आईएनओ में हलचल का तेजी से enzymatic रूपांतरण की वजह से, 10 माइक्रोन ehna हाइड्रोक्लोराइड या 10 माइक्रोन के डीसीएफ के साथ CLL कोशिकाओं की pretreatment एडीए गिरावट को बाधित करने के लिए आवश्यक है। इन शर्तों के तहत बाह्य हलचल सांद्रता काफी बढ़ जाता है। फाई के प्रतिनिधि chromatogramsआंकड़ा 4 पर प्रकाश डाला गया है कि कैसे ehna हाइड्रोक्लोराइड और / या डीसीएफ (चित्रा 4 बी - सी) के साथ पूरी तरह से pretreatment आईएनओ में हलचल रूपांतरण को रोकता है।

चित्र तीन
चित्रा 3. Cytofluorimetric एक प्रतिनिधि CLL रोगी के हौसले शुद्ध PBMCs में CD19 + / CD5 + leukemic कोशिकाओं का% का विश्लेषण। जीवित कोशिकाओं (बाएं पैनल) पर gating के बाद, CD19 + / CD5 + CLL कोशिकाओं के% मूल्यांकन किया है। बी कोशिकाओं (मध्यम पैनल) के नकारात्मक अलगाव से पहले, leukemic कोशिकाओं के% 75% से मेल खाती है। शुद्धि (सही पैनल) CLL बी लिम्फोसाइटों के% से 95% तक पहुँच जाता है के बाद। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4. कोशिकी प्यूरीन न्यूक्लियोटाइड और न्यूक्लियोसाइड एएमपी और विभिन्न अवरोधकों के लिए जोखिम के बाद का सेवन किया और leukemic कोशिकाओं द्वारा उत्पादित की मात्रा। (ए) बतंगड़ के प्रतिनिधि chromatograms और आईएनओ के साथ या α, β-methylene- साथ pretreatment के बिना CD73 + लयूकेमिक लिम्फोसाइट द्वारा उत्पन्न ADP (APCP, 10 माइक्रोन, 60 मिनट), CD73 enzymatic गतिविधि का एक विशिष्ट अवरोध करनेवाला। (बी) के प्रतिनिधि एचपीएलसी वर्णलेख CD73 + CLL कोशिकाओं के supernatants से प्राप्त pretreated या नहीं एडेनोसाइन deaminase साथ (एडीए) अवरोध erythro-9 (2 हाइड्रोक्सी 3-Nonyl) एडिनाइन (ehna) हाइड्रोक्लोराइड (10 माइक्रोन, 30 मिनट) सब्सट्रेट के रूप में एएमपी (200 सुक्ष्ममापी, 30 मिनट) के साथ ऊष्मायन से पहले। (सी) प्रतिनिधि वर्णलेख CD73 के supernatants से प्राप्त यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

यहां वर्णित प्रोटोकॉल CD39 / CD73 adenosinergic सेल संस्कृति मीडिया में शुद्ध मानव leukemic कोशिकाओं से मशीनरी की गतिविधियों का मूल्यांकन करने के लिए अनुमति देता है। इस एचपीएलसी विधि के माध्यम से हम का पालन करें और मात्रात्मक हलचल (CD73 पर निर्भर) और आईएनओ के लिए इसके बाद गिरावट (CD26 / एडीए निर्भर) के enzymatic पीढ़ी उपाय कर सकते हैं। एंजाइम inhibitors का उपयोग प्रोटोकॉल को नियंत्रित करने और आंतरिक नियंत्रण की अनुमति देता है। फायदे और इस प्रोटोकॉल का सस्ता माल मैं उस) यह है कि संस्कृति में बढ़ रहे हैं कोशिकाओं को लागू किया जा सकता है, कि द्वितीय) यह संस्कृति मीडिया की एक छोटी राशि की आवश्यकता है और उस iii) नमूना तैयार करने के लिए बेहद आसान है।

हमारी प्रणाली एक जुदाई एक autosampler के साथ एक चतुर्धातुक कम दबाव के मिश्रण पंप और इनलाइन वैक्यूम degassing के साथ सुसज्जित मॉड्यूल के होते हैं। एएमपी, हलचल और आईएनओ के chromatographic जुदाई एक सिलिका आधारित, उलट चरण स्तंभ है कि ध्रुवीय यौगिक बनाए रखने के लिए प्रयोग किया जाता है पर हासिल की है। गुई बाइनरी मोबाइल चरण प्रणाली एक बफर के होते हैं (डबल deionised पानी में 7 मिमी अमोनियम एसीटेट, पीएच 3.0 हाइड्रोक्लोरिक एसिड के साथ समायोजित) और बफर बी (acetonitrile)।

इस एचपीएलसी विधि, संवेदनशील विश्वसनीय और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है और अलग-अलग सेल संस्कृति मॉडल, दोनों पक्षपाती और निलंबन की कोशिकाओं के लिए लागू किया जा सकता है। यह भी ऐसी normoxia के रूप में विभिन्न संस्कृति की स्थिति, और हाइपोक्सिया (1-3% ओ 2) (ओ 2 के 21%) की तुलना करने के लिए या कोशिकाओं के विभिन्न सक्रियण राज्यों की तुलना करने के लिए लागू किया जा सकता है। यहाँ हम सेल संस्कृति प्लेटों में प्यूरीन यौगिकों के साथ कोशिकाओं के इलाज के लिए प्रदर्शन, लेकिन थोड़े समय के उपचार के लिए भी इस्तेमाल किया microcentrifuge ट्यूबों हो सकता है।

विधि यहाँ वर्णित बाह्य प्यूरीन न्यूक्लियोटाइड और न्यूक्लियोसाइड ऐसी पतली परत क्रोमैटोग्राफी (टीएलसी) assays 10 में कार्यरत लोगों के रूप में सेवन और प्रतिक्रिया radiolabeled यौगिकों के उपयोग से बचने में उत्पादन की मात्रा का ठहराव की अनुमति देता है। इसके अलावा, एचपीएलसी प्रणाली भी अधिक संवेदनशील और चयनात्मक टीएलसी विधि की तुलना में है। हालांकि, के साथ मिलकर बड़े पैमाने पर spectrometric (एमएस / एमएस) का पता लगाने के लिए एक आरपी-एचपीएलसी प्रणाली अब न्यूक्लियोटाइड और न्यूक्लियोसाइड के मात्रात्मक मापन के लिए सबसे अच्छा विकल्प माना जाता है। इस एचपीएलसी विधि की एक सीमा है, प्रत्येक एकल नमूना रन से पहले चलाने के लिए एक संतुलन स्तंभ की आवश्यकता है अब प्रयोग की कुल रन बनाने का समय है और काफी उच्च throughput स्क्रीनिंग के लिए संभावनाओं को सीमित। तेजी से वैकल्पिक तरीकों मैलाकाइट ग्रीन फास्फेट परख, एक वर्णमिति तरीका है कि हलचल में एएमपी रूपांतरण के अप्रत्यक्ष माप की अनुमति देता है, और bythe luciferase आधारित पद्धति 20 से प्रतिनिधित्व कर रहे हैं। हालांकि, इन दोनों तरीकों एडेनोसाइन का एक सीधा माप प्रस्ताव नहीं है।

इस परख के लिए नमूना प्रसंस्करण न्यूनतम क्योंकि प्रोटोकॉल एक सीरम मुक्त माध्यम के उपयोग पर आधारित है और acetonitrile के साथ प्रोटीन वर्षा की आवश्यकता नहीं है। एक विकल्पसीरम मुक्त मध्यम करने के लिए सब्सट्रेट के साथ ऊष्मायन से पहले पीबीएस 5 मिमी ग्लूकोज में कोशिकाओं resuspend करने के लिए हो सकता है।

प्रोटोकॉल के भीतर मुख्य महत्वपूर्ण कदम बी कोशिकाओं का एक शुद्ध आबादी प्राप्त करने के लिए है। दरअसल, एएमपी, हलचल और आईएनओ के मापन इस झरना (जैसे, टी lymphocytes) में शामिल ectoenzymes व्यक्त अन्य सेल आबादी की उपस्थिति के कारण झूठा हो सकता है। एक दूसरा महत्वपूर्ण बिंदु किसी भी सेल संदूषण है कि ईमानदारी और स्तंभ के जीवन को प्रभावित कर सकते हैं बिना एचपीएलसी प्रणाली में फ़िल्टर संस्कृति मीडिया इंजेक्षन है।

अंत में, इस परख अलग सेल आबादी में न्यूक्लियोटाइड की खपत और nucleoside पीढ़ी की वास्तविक समय की निगरानी की अनुमति के लिए अपेक्षाकृत तेजी से और अत्यंत विश्वसनीय है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

इस काम के लिए खोज Associazione Italiana cancro (आईजी # 12754) द्वारा समर्थित है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Human blood
Milli-Q water Millipore double deionised water
Ficoll-Paque Plus GE-Healthcare 17-1440-03
purified anti-CD3, -CD14, -CD16 made in-house mouse monoclonal
PE-labeled anti-CD19 Miltenyi Biotec 120-014-229
FITC-labeled anti-CD5 Miltenyi Biotec 130-096-574
Dynabeads sheep anti-mouse IgG Invitrogen 11031
Phosphate-buffered saline (PBS) Amresco E404-200TABS tablets
bovine serum albumin (BSA) ID bio 1000-70 standard grade
isolation buffer PBS 0.1% BSA 2 mM EDTA, pH 7.4
AIM V serum free medium GIBCO 12055-091 liquid (research grade)
adenosine 5’-diphosphate (ADP) Sigma-Aldrich A2754
adenosine 5’-monosphate (AMP) Sigma-Aldrich A1752
adenosine (ADO) Sigma-Aldrich A9251
inosine (INO) Sigma-Aldrich I4125
α,β-methylene-ADP (APCP) Sigma-Aldrich M8386 CD73 inhibitor
EHNA hydrochloride Sigma-Aldrich E114 adenosine deaminase inhibitor
Deoxycoformycin (dCF) Tocris 2033 adenosine deaminase inhibitor
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D2650
Dipyridamole Sigma-Aldrich D9766 nucleoside transporter inhibitor
acetonitrile (CHROMASOLV Plus) Sigma-Aldrich 34998 HPLC-grade
ammonium acetate Sigma-Aldrich 9688 7 mM, pH 3.0
hydrochloric acid Sigma-Aldrich 30721-1L min. 37%
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Bürker cell counter VWR 631-0920 hemocytometer
DynaMag-15 Magnet Invitrogen 12301D Dynal magnetic bead separator
microcentrifuge safe-lock tubes Eppendorf 030-120-0086 1.5 ml
PET centrifuge tubes Corning 430053/430304 15 – 50 ml
Minisart RC4 syringe filters Sartorius Stedim Biotech 17821 membrane 0.2 µm
short thread vials VWR 548-0029 1.5 ml/glass
micro-inserts VWR 548-0006 0.1 ml/glass
screw caps VWR 548-0085 9 mm/PP blue
Atlantis dC18 Column Waters 186001344 5 µm, 4.6 mm x 150 mm
Atlantis dC18 Guard Column Waters 186001323 5 µm, 4.6 mm x 20 mm
Waters Alliance 2965 Separations Module Waters HPLC separation module
Waters 2998 Photodiode Array (PDA) Detector Waters UV detector
Waters Empower2 software Waters

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Naganuma, M., Wiznerowicz, E. B., Lappas, C. M., Linden, J., Worthington, M. T., Ernst, P. B. Cutting edge: Critical role for A2A adenosine receptors in the T cell-mediated regulation of colitis. J Immunology. 177 (5), 2765-2769 (2006).
  2. Nemeth, Z. H., et al. Adenosine receptor activation ameliorates type 1 diabetes. FASEB J. 21 (10), 2379-2388 (2007).
  3. Fan, M., Jamal Mustafa, S. Role of adenosine in airway inflammation in an allergic mouse model of asthma. Int Immunopharmacol. 6 (1), 36-45 (2006).
  4. Csoka, B., et al. A2B adenosine receptors protect against sepsis-induced mortality by dampening excessive inflammation. J Immunol. 185 (1), 542-550 (2010).
  5. Peart, J. N., Headrick, J. P. Adenosinergic cardioprotection: multiple receptors, multiple pathways. Pharmacol Ther. 114 (2), 208-221 (2007).
  6. Ohta, A., et al. A2A adenosine receptor protects tumors from antitumor T cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (35), 13132-13137 (2006).
  7. Hasko, G., Linden, J., Cronstein, B., Pacher, P. Adenosine receptors: therapeutic aspects for inflammatory and immune diseases. Nat Rev Drug Discov. 7 (9), 759-770 (2008).
  8. Cronstein, B. N. Adenosine, an endogenous anti-inflammatory agent. J Appl Physiol (1985). 76 (1), 5-13 (1994).
  9. Molina-Arcas, M., Casado, F. J., Pastor-Anglada, M. Nucleoside transporter proteins. Curr Vasc Pharmacol. 7 (4), 426-434 (2009).
  10. Deaglio, S., et al. Adenosine generation catalyzed by CD39 and CD73 expressed on regulatory T cells mediates immune suppression. J Exp Med. 204 (6), 1257-1265 (2007).
  11. Linden, J. Regulation of leukocyte function by adenosine receptors. Adv Pharmacol. 61, 95-114 (2011).
  12. Antonioli, L., Blandizzi, C., Pacher, P., Hasko, G. Immunity, inflammation and cancer: a leading role for adenosine. Nat Rev Cancer. 13 (12), 842-857 (2013).
  13. Antonioli, L., Csoka, B., Fornai, M., et al. Adenosine and inflammation: what's new on the horizon. Drug Discov Today. 19 (8), 1051-1068 (1051).
  14. Chiorazzi, N., Rai, K. R., Ferrarini, M. Chronic lymphocytic leukemia. N Engl J Med. 352 (8), 804-815 (2005).
  15. Abousamra, N. K., Salah El-Din, M., Hamza Elzahaf, E., Esmael, M. E. Ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase-1 (E-NTPDase1/CD39) as a new prognostic marker in chronic lymphocytic leukemia. Leuk Lymphoma. 56 (1), 113-119 (2015).
  16. Serra, S., et al. CD73-generated extracellular adenosine in chronic lymphocytic leukemia creates local conditions counteracting drug-induced cell death. Blood. 118 (23), 6141-6152 (2011).
  17. Chen, L. S., Keating, M. J., Gandhi, V. Blood collection methods affect cellular protein integrity: implications for clinical trial biomarkers and ZAP-70 inn CLL. Blood. 124 (7), 1192-1195 (2014).
  18. Kalina, T., et al. EuroFlow standardization of flow cytometer instrument settings and immunophenotyping protocols. Leukemia. 26 (9), 1986-2010 (2012).
  19. Deaglio, S., et al. CD38 and ZAP-70 are functionally linked and mark CLL cells with high migratory potential. Blood. 110 (12), 4012-4021 (2007).
  20. Sachsenmeier, K. F., et al. Development of a novel ectonucleotidase assay suitable for high-throughput screening. J Biomol Screen. 17 (7), 993-998 (2012).

Tags

रसायन विज्ञान अंक 113 कैंसर जीव विज्ञान ectoenzymes CD39 CD73 एडेनोसाइन प्यूरीन चयापचय रिवर्स चरण उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी CLL कोशिकाओं
एचपीएलसी आधारित परख मानव पुरानी लिम्फोसाईटिक ल्यूकेमिया कोशिकाओं में कोशिकी Nucleotide / nucleoside चयापचय नजर रखने के लिए
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Serra, S., Deaglio, S. HPLC-based… More

Serra, S., Deaglio, S. HPLC-based Assay to Monitor Extracellular Nucleotide/Nucleoside Metabolism in Human Chronic Lymphocytic Leukemia Cells. J. Vis. Exp. (113), e54124, doi:10.3791/54124 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter