Metoder for Akutt og subakutt Murine bakben iskemi

Summary

Surgical induction of hindlimb ischemia in the mouse is useful to examine angiogenesis, however this is compromised in certain inbred mouse strains that display marked ischemia-induced tissue necrosis. Methods are described to induce subacute limb ischemia using ameroid constrictors to circumvent this problem through the induction of gradual arterial occlusion.

Abstract

Perifer arteriell sykdom (PAD) er en ledende årsak til kardiovaskulær morbiditet og mortalitet i utviklede land, og dyremodeller som pålitelig reprodusere menneskelig sykdom er nødvendig å utvikle nye behandlingsformer for denne sykdommen. Musen bakben ischemi-modellen har vært mye brukt for dette formål, men det standard praksis å indusere akutt iskemi i bena ved ligering av arteria femoralis kan resultere i betydelig vevsnekrose, noe som påvirker undersøkere evne til å studere de vaskulære og skjelettmuskelvevet respons på ischemi . En alternativ tilnærming til lårarterien ligering er den gradvise induksjon av lårarterie okklusjon ved bruk av ameroid constrictors. Når den plasseres rundt lårarterien i samme eller forskjellige steder som områder av lårarterie ligering, disse enhetene okkluderer arterien i løpet av 1 – 3 dager, noe som resulterer i mer gradvis, subakutt iskemi. Dette resulterer i mindre betydelig skjelettmuskulatur vevsnekrose, wjør kan nærmere etterligne svarene sett i menneskelig PAD. Fordi genetisk bakgrunn påvirker utfall i både akutte og subakutte ischemi modeller, vurdering av musestamme som studeres er viktig i å velge den beste modellen. Dette notatet beskriver riktig prosedyre og anatomisk plassering av ligaturer eller ameroid slanger på musen lårarterie å indusere subakutt eller akutt bakben iskemi i mus.

Introduction

Perifer arteriell sykdom (PAD) er en ledende årsak til kardiovaskulær morbiditet og mortalitet i utviklede land ^1. PAD resultater fra aterosklerotisk obstruksjon av perifere arterier som fører til lem iskemi med påfølgende anstrengelse eller hvilesmerter og av og til ikke-healing sår og koldbrann som nødvendig lem amputasjon. Terapi rettet mot PAD er først og fremst rettet mot endovaskulær ^to eller kirurgisk revaskularisering ^3, som i hovedsak ingen effektive medisinske behandlingsformer finnes ^fire.

Dessverre er revaskularisering ofte av begrenset nytte, som bypass grafts har høye feilrater (opp til 50% innen 5 år) ⁵ som er verre i enkelte populasjoner (f.eks røykere, kvinner, ikke-saphenous vene grafts) ^6,7. Endovaskulær tilnærminger, slik som angioplastikk og stenting, blir også svekket av høye restenose priser (i overkant av 50% i løpet av ett år), Igen jegn femoropoplitiale sykdom ^8, selv om bruken av medikamentavgi ballonger og stenter har bedret resultatene noe ^9-11. For å kunne utvikle nye behandlinger for PAD er det viktig å utvikle dyremodeller som pålitelig reprodusere sykdom hos mennesker.

Til dags dato, den vanligste modellen av PAD er bakben iskemi modell (HLI), som oftest utført på mus ^12,13. I sin mest vanlige manifestering, innebærer modellen kirurgiske ligering av den proksimale og distale femorale arterien og dens mellomliggende sidegrener, etterfulgt av fjerning av beholderen, noe som resulterer i tilstopping av blodstrøm og induksjon av akutt ischemi. HLI har blitt brukt primært for å studere angiogene og arteriogenisk responser i perifert lem muskelvev og effekten av ulike behandlingsformer (for eksempel narkotika, genet levering, stamceller) på disse svarene. Mer nylig har vår gruppe brukt denne modellen for å undersøke hvilken rolle skjelettmuskelceller in responsen på lem iskemi og effekter av genetiske forskjeller på resultatene ^14.

Den HLI Modellen har mulig vår nåværende forståelse at de vaskulære og muskel respons på ischemi er avhengig av genetikk (dvs. innavlet stamme) ^15, alder ^16, og nærvær eller fravær av andre sykdommer eller tilstander som er relevante for aterosklerose, inkludert diabetes mellitus ¹⁷ og hyperkolesterolemi ^18. Men en viktig svakhet ved tradisjonelle HLI modellen er at det er en modell av akutt ischemi ^12,13, mens human PAD fører til kronisk iskemi som et resultat av den gradvise utvikling av okklusive aterosklerotiske lesjoner i perifere arterier.

I et forsøk på å omgå denne svakheten, Tang og kolleger opprinnelig utviklet en rottemodell med gradvis femoral arteriell okklusjon hjelp ameroid constrictors ^19, og den samme gruppen senere developed en lignende mus modell ^20. Ameroid constrictors ble beskrevet innledningsvis i 1950 i en hundemodell av kronisk myokardiskemi ^21,22. Disse enhetene har en ytre metallhylse som omslutter et indre lag av et hygroskopisk materiale, vanligvis kasein, og når den er plassert rundt en arterie de induserer gradvis kar okklusjon etter hvert som de absorberer fuktighet fra det omgivende vev. I deres modifisering av modellen, Yang et al., Som er lagt inn slanger på både den proksimale og distale femorale arterien på steder som er analoge med de kirurgiske ligerings-områder, og de ​​ligert sidegrenene av den femorale arterie, som i den tradisjonelle modellen. Sammenlignet med akutt HLI, ameroid constrictor iskemi resulterte i lavere uttrykk av inflammatoriske og skjærspenningsavhengig gener, lavere blodstrøm utvinning 4 – 5 uker postoperativt, og mindre muskel nekrose ^20. Basert på disse observasjonene ble det følt at gradvis arteriell okklusjon kan gi en modell av PAD mer relevant for sykdom hos mennesker.

Spesielt, i den opprinnelige meldingen, effekter av ameroid konstriktor-indusert ischemi ble undersøkt bare i C57BL / 6-mus ^19, som er forholdsvis resistente overfor ischemi-indusert muskelnekrose ^15. Vi har nylig modifisert gradvis ischemi-modellen videre utforsket og dens virkninger på mer iskemi-følsomme BALB / c musestamme ^23. I den første manifestasjon av modellen som er lagt vi slanger på både proksimale og distale lårarterie men forlot alle sidegrener intakt. I en andre, mildere modifikasjon som er lagt vi en enkelt konstriktor bare på den proksimale lårarterie og igjen venstre alle side greiner av arterien intakt. I begge modifikasjoner av denne modellen, har vi funnet at BALB / c-mus, men ikke C57BL / 6 mus, viste signifikant muskelnekrose tross for å ha lignende blodstrøm og vaskulær tetthet. I likhet med vår tidligere studie ^14, disse funnene viste at lem muskelskaden ikke utelukkende påvirkes av blodstrøm, men er delvis avhengig av genetisk bakgrunn. Videre fant vi at lem blodstrømmen falt til sitt laveste nivå innen 3 dager, og dermed modellen ser ut til å være mer en av "subakutt" snarere enn gradvis lem iskemi.

Basert på disse tidligere studier synes det klart at en enkelt metode for å indusere bakben iskemi ikke kan være egnet i alle tilfeller. Fordi en rekke forhold (for eksempel genetiske forskjeller og nærvær eller fravær av ko-morbide tilstander) påvirker både vaskulære og skjelettmuskel-spesifikke responser, kan forskere det være nødvendig å modifisere den kroniske karakter og / eller alvorligheten av bakben iskemi å best passer deres formål. Videre er tidligere beskrivelser av modellen vanligvis manglet egnede anatomiske landemerker for å lette pålitelig inter-undersøker reproduserbarhet av teknikken. I denne utredningen, metoder for å indusere enten akutt eller subakutt bakben iskemi i muser beskrevet, og presise anatomiske landemerker er gitt.

Protocol

Alle dyreforsøk ble utført i henhold til protokoll godkjent av Duke Institutional Animal Care og bruk komité. Hannmus ble anvendt i denne studien, selv om begge kjønn kan anvendes som indikert for den vitenskapelige formål med studien. 1. Hårfjerning Forut for induksjon av anestesi, setter opp et område pre-kirurgisk preparat som består av en overdekket varmepute innstilt på 37 ° C og en nosecone port er koblet til kontinuerlig strøm av isofluran. Plasser muse…

Representative Results

Riktig identifisering av musen bakben blodkar er avgjørende for å sikre reproduserbarhet av teknikkene for å indusere både subakutt og akutt bakben iskemi, som beskrevet her. I tillegg til den iboende variasjon i dyrestudier, kan andre faktorer introdusere variasjoner i laser Doppler perfusjonsbilleddannelse (LDPI), inkludert type anestesi, posisjonen til dyret (liggende vs. tilbøyelige), og kroppstemperatur (se figur 3). I tillegg subakutt bakben ischemi-m…

Discussion

Kanskje den mest utfordrende trinnet i denne fremgangsmåten er separering av lårarterien fra den femorale vene. Jo større diameter og tynnere vegger fra den femorale vene i forhold til de av arterien øke dens mottakelighet for punktering og river under kirurgisk manipulasjon. Sannsynligheten for å forstyrre venen kan reduseres ved å holde såret fuktig ved hjelp av en steril vattpinne fuktet med PBS. Det er også viktig å sikre at alle tang er skjerpet, justert, og uten pauser for å tillate nøyaktig manipulerin…

Materials

Dumont #5/45 Forceps	Fine Science Tools	11251-35	Dumoxel
Dumont Style 5 Mini Forceps	Fine Science Tools	11200-14	Inox
Extra Fine Bonn Scissors	Fine Science Tools	14084-08
7-0 Silk Suture	Sharpoint	DA-2527N
5-0 Coated Vicryl Suture	Ethicon	J463G
Graefe Forceps	Fine Science Tools	11053-10
Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	15000-03
Artifical Tears Ointment	Rugby Laboratories	0536-6550-91
Surgical Tape	3M	1530-0
Fine Cotton Swabs	Contec	SC-4
Temperature Controller	Physitemp	TCAT-2DF
Ameroid Constrictors	Research Instruments SW	MMC-0.25 x 1.00-SS
Hot Bead Sterilizer
Deltaphase Isothermal Pad	Braintree Scientific	39DP
Needle Driver	Fine Science Tools
Phosphate Buffered Saline	Gibco	10010-023
Moor LDPI	Moor Instruments	moorLDI2
moorLDI Measurement software	Moor Instruments	v. 6.0
Hair Removal Cream	Nair