Abstract
不同的遗传背景的两种动物的手术间生态创建了一个独特的场景来研究细胞内在与感兴趣的候选基因，细胞的迁徙行为，并在不同的遗传设置分泌信号，细胞外源性的角色。由于联体动物有着共同的循环，从一个动物的血液或血源性因素将与其合作伙伴，反之亦然交换。因此，从一个遗传背景的细胞和分子因素可在第二遗传背景的情况下进行研究。成年小鼠的联体已被广泛用于研究衰老，癌症，糖尿病，肥胖，和大脑的发育。最近，斑马鱼胚胎的联体已被用于研究造血发育生物学。与此相反的小鼠，斑马鱼胚胎的透明特性允许细胞的直接可视化的背景下连体，使其成为调查为f的独特而强大的方法undamental细胞和分子机制。这种技术的效用，但是，通过用于产生连体斑马鱼胚胎陡峭的学习曲线限定。这个协议提供了关于如何手术融合不同的遗传背景两个斑马鱼胚胎的囊胚调查感兴趣的候选基因的作用的工序一步方法。此外，联体斑马鱼的胚胎是耐受热冲击，使得基因表达可能的时间控制。该方法不需要复杂的设置和对胚胎发育过程中研究体内细胞迁移，命运说明书中，并分化广阔的应用领域。
Introduction
野生型和转基因动物的遗传马赛克（嵌合体）的创建是调查细胞内在与候选基因1-6的细胞外功能的完善和经典的策略。在斑马鱼囊胚移植已被广泛使用，以产生用于细胞自治7-9的研究嵌合胚胎。取决于感兴趣的组织，但是，它可以是具有挑战性的供体细胞可预测定位到期望的组织（ 例如，血液）1-3，7-9。鼠标遗传学家早就采用连体手术的方法来产生连体生物与共享循环10-14。由于联体动物都有一个共同的血液，即来自一种动物具有不同遗传背景的其他动物的细胞的细胞之间的相互作用，可以研究10-16。近日，Karima Kissa小组优雅证明CRE的能力连体吃斑马鱼胚胎，然后用这个系统来研究造血干祖细胞（HSPC）的迁移15。此外，斑马鱼联体最近用于研究内皮钙5的造血干细胞（HSC）的出现和迁移，16的作用和斑马鱼发育17中，研究中的HSPC利基基质细胞的作用。
不像小鼠，斑马鱼的胚胎是透明的，允许联体发育过程中的细胞的直接可视化，使得系统唯一地强大。斑马鱼中的联体的效用，然而，由一个陡峭的学习曲线，并在胚胎细腻手术连体限制可以没有详细的说明和视觉示范技术上的挑战。该协议的目标是提供一套明确的，一步一步的指示陪如何产生连体斑马鱼胚胎为研究基于视频的教程颞，细胞 - 本征的，或者一个候选基因（s）的显影囊胚的手术融合的细胞外功能。重要的改进和提高parabiont生存和新的实验性应用程序的其他建议包括在内。
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Protocol
该协议被批准波士顿儿童医院的动物护理和使用委员会。这个协议是从以 前出版的方法15进行修改。
1.试剂的制备（提前几天或几周）
- 准备1.5％琼脂糖涂层的菜肴。 添加1.5克琼脂糖至100ml斑马鱼的E3介质中的Erlenmeyer烧瓶中。热火，琼脂糖溶解，再倒入约5mL成直径100毫米×20毫米深的培养皿中。
注意：这些都是用于胚胎dechorionation（步骤3.1），并为联体手术（步骤3.3）。在4℃保存琼脂糖涂层菜的几个星期;带他们出去了冰箱和联体手术当天早晨温至室温。 - 制备4％的甲基纤维素。 将4-在100ml的E3的甲基纤维素粉末在锥形瓶中搅拌棒。将在4℃的搅拌盘烧瓶中，设置为最低速度，让它搭配为2天。
- 间歇用刮刀分手甲基纤维素的白色团块。甲基纤维素的结晶不充分溶解在该浓度。当该溶液变得清晰并出现均匀，没有白色团块残留，等分试样在-20℃下长期贮存溶液进入1.5毫升离心管并冷冻。
注意：甲基纤维素的较低浓度都可以使用;然而，这种较高的百分比，更粘稠甲基纤维素已取得了最好的结果。
- 间歇用刮刀分手甲基纤维素的白色团块。甲基纤维素的结晶不充分溶解在该浓度。当该溶液变得清晰并出现均匀，没有白色团块残留，等分试样在-20℃下长期贮存溶液进入1.5毫升离心管并冷冻。
- 准备高钙林格（HCR）解决方案。 让400毫升HCR溶液，混合8毫升的5M NaCl（116毫最终），400微升3M氯化钾（2.9毫最终），800微升5M的CaCl 2（10mM的终浓度），以及1M HEPES的2毫升（5毫米最终出）与390毫升E3媒体。
注：在4℃下保存HCR解决了几个星期;温至室温连体手术当天的早上。 - 准备5 - 6传输修改巴斯德移液器环囊胚对。简要地加热该吸管在本生灯的结束。然后，使用大钳，弯曲吸管至约45℃的端，而它仍然是热的。
- 为了确保有可能损坏胚胎，简要地握住吸管尖在火焰周边3秒没有锋利的边缘。这将平滑/抛光移液器的结束。此改性的玻璃巴斯德移液管一起使用，在下面的步骤3.5 10毫升吸管泵（ 图1）。
- 准备玻璃针工具囊胚对手术缝合。作为斑马鱼胚胎显微注射完成3针玻璃 - 拉2。使用实验室膜各玻璃针固定到木杆或塑料处理取笑针（ 图1A）的末尾。使用镊子，断绝了针的末端处直径约20 - 30微米。使用一个阶段微米到引导该步骤（图1B）。
注：网元的大小edle前端是重要的。如果前端是太大，难以精确地控制，并且可以引起过度的破坏。如果尖端太小则难以充分地缠绕在胚胎。
2.胚胎斑马鱼和收集繁殖对设置（-1天0天）
- 建立成年斑马鱼的繁殖对。设置鱼夜联体手术前要进行的。使用分隔分离男性和女性。为了增加期望的胚胎，将获得，设置若干对每一行的可能性。我们发现，一般为20 - 在对50％的产卵。
- 第二天早上，拉分频器，允许交配。收集用细网滤茶任何胚胎，然后将它们转移到含有E3胚胎介质18培养皿。
- 根据需要微注射胚胎（ 例如，用25 PG质粒DNA，200 PG的mRNA，或用1 - 6纳克啉）收集的1小时之内。让他们生长，直到256细胞阶段。如果DNA表达构建体放置在热休克启动子的控制下（ 例如，热休克蛋白70， 图4B），由热震惊parabionts在37℃下控制的基因表达的定时在后一阶段（ 例如 ，在36高倍视野）。
注：对于荧光转基因的替代，荧光葡聚糖可以加入到DNA，RNA或吗啉代喷射混合（ 例如，葡聚糖，级联蓝在2毫克/毫升）。葡聚糖染料不会正常发展干扰和将允许适当的荧光联体融合后下被识别的注入胚。可替代地，着色菌株的联体（ 例如，AB）与非着色的应变（ 例如，卡斯帕）可以用来在稍后阶段，以确定所注入的胚胎。 - 孵育胚胎在28.5°C.Use一个立体镜定期监测其发展，因为他们256细胞附近开发elopmental阶段（约2.5 HPF）。
注意：如果需要，转移胚胎到不同的温度，以确保联体伙伴（ 例如，吗啉代注射的胚胎往往发展比其未注射的同行慢移的未注射的胚胎至RT之间阶段匹配而啉注射的胚胎放置。在28.5℃，将导致其阶段几个小时的发展）调整后。
3.联体斑马鱼胚胎的产生通过发展囊胚的手术融合
- 作为胚胎接近256细胞阶段（约2.5 HPF），从每一个遗传背景（ 即，遗传突变，转基因系和/或基因操作）转移胚胎成单独的琼脂糖包被的培养皿（ 例如，一个盘用于吗啉代注射胚胎和对照胚胎第二盘）。另外，胚胎转移到清洁，无划痕的玻璃烧杯或玻璃培养皿。
注意：避免使用无涂层的塑料菜肴胚胎会坚持到塑料和被他们的绒毛膜一旦损坏。 - 倒出E3媒体直到刚好足够的液体仍然覆盖胚胎（约7 - 10ml）中。加入200微升50毫克/从灰色链霉菌 （蛋白酶）的细胞外液中分离蛋白酶毫升混合物中。摇动轻轻胚胎每隔几分钟。
- 当胚胎的50％已经走出自己的绒毛膜，这通常需要5 - 新鲜的E3胚胎中期的 - （20毫升约15）10分钟，丰盛的体积冲洗一下三次。
- 轻轻拉起来到改性玻璃巴斯德吸管，然后轻轻地消除他们Dechorionate留在他们的绒毛膜任何胚胎。一旦胚胎已dechorionated和清洗，更换HCR解决方案的E3媒体。作为替代蛋白酶，用细镊子手动删除绒毛膜。目标是在60 - 100 dechor可用于每个实验条件ionated胚胎。
注意：这是几倍大于最终将使用更多的，但许多胚胎有可能处理或手术联体期间被损坏。一旦胚dechorionated，保持它们浸没，并且不使它们接触水的表面上，作为表面张力将导致他们被破坏。请记住，使用高剂量的蛋白酶使胚胎走出自己的绒毛膜更快，更同步的时尚。当使用蛋白酶的较低剂量，将胚需要更长的时间从绒毛膜出现并在一个不太同步方式，其可导致胚胎的一部分通过长时间暴露于蛋白酶被损坏这样做。
- 轻轻拉起来到改性玻璃巴斯德吸管，然后轻轻地消除他们Dechorionate留在他们的绒毛膜任何胚胎。一旦胚胎已dechorionated和清洗，更换HCR解决方案的E3媒体。作为替代蛋白酶，用细镊子手动删除绒毛膜。目标是在60 - 100 dechor可用于每个实验条件ionated胚胎。
- 当胚胎的50％已经走出自己的绒毛膜，这通常需要5 - 新鲜的E3胚胎中期的 - （20毫升约15）10分钟，丰盛的体积冲洗一下三次。
- 解冻在最大速度台式离心机的甲基纤维素（在上面的步骤1.2。制造），离心10分钟以沉淀不溶的结晶，这将损坏胚胎或破裂的蛋黄秒。
- 离心后，用明确的上限比例（体积约75％）。转让1 - 甲基纤维素的1.5厘米直径的滴成被覆琼脂糖1.5％培养皿。小心避免从管的底部起草任何丸状晶体。
- 使用一个标记，以预先在盘的底侧每个液滴的位置。将12 - 每100毫米直径的培养皿甲基纤维素 - （3等分的价值2）15滴。准备根据需要每个实验尽可能多的板块。
注：使用每个液滴为单囊胚对的融合。该标记将指定每个液滴一旦介质被添加-在该点液滴变得几乎不可见的位置。
- 准备每个步骤3.3以上制备琼脂糖涂层菜抗生素的补充解决方案，HCR 1个40毫升一份。以各40毫升等分试样的HCR中的50单位/毫升，氨苄青霉素，50单位/毫升，和卡那霉素加青霉素 - 链霉素，在0.5微克/毫升。
- 当准备进行囊胚融合，认真填写每个含甲基纤维素滴用40毫升抗生素补充HCR解决方案的菜肴。如果HCR溶液中加入太快，它可以破坏液滴。
- 附加改性的玻璃巴斯德吸管（将在上面步骤1.4制），以10毫升吸管泵。在一个立体镜收集来自各个背景（ 例如，一个吗啉注射胚胎和一个野生型胚胎）一dechorionated胚胎。
- 分配的两个胚胎之前，使用巴斯德吸管，使在甲基纤维素降的中间小凹陷，然后轻轻既胚胎存入抑郁症。
注意：在传送过程中，转动巴斯德吸管略微向上，使胚胎沉入巴斯德移液管的弯曲，以便避免与在移液管的顶部或底部的液体的表面的制造接触（这可能会导致到兵卫- [R破裂）。
- 分配的两个胚胎之前，使用巴斯德吸管，使在甲基纤维素降的中间小凹陷，然后轻轻既胚胎存入抑郁症。
- 沉积胚胎成甲基纤维素后，立即用木杆或塑料处理取笑针上的端部（ 图1A）的凝胶加载吸管尖小心重新定位甲基纤维素中的胚胎，使得它们的动物极点是直接抚摸对方。
- 利用通过甲基纤维素接近胚胎斯文扫地的动作对其重新定位，而不直接接触他们。让胚胎坐5分钟，使甲基纤维素会沉淀在他们身边。在此期间，装载下一对成另一种降。
注意事项：避免让与胚胎直接接触，特别注意不要触摸卵黄囊，这将容易破裂的任何部分。
- 利用通过甲基纤维素接近胚胎斯文扫地的动作对其重新定位，而不直接接触他们。让胚胎坐5分钟，使甲基纤维素会沉淀在他们身边。在此期间，装载下一对成另一种降。
- 使用玻璃针的工具，小心翼翼地绕每个胚胎在其接触点。用温和的缝制动作中，从第一胚胎细胞可以再次被拉入第二胚胎，然后。在这个运动结束，举行的地方针2 - 3秒，然后绘制它拿走非常缓慢。
注：有一个周期约2 - 3秒后的胚受伤其中两种组织似乎更粘合剂，更可能连接到彼此。因此，我们认为，保持到位针伤人后简要地有助于保持每个胚的伤员组织中的时间的初期接触伤人之后。 - 允许这些胚胎坐10 - 在室温下15分钟。在此期间，不断地缝合在甲基纤维素的其他滴新对。 10后- 15分钟，评估所述第一对是否保持附着（ 图2A）。
注意：如果胚胎更长附着，重复缝合过程只要胚胎大约30％的外包阶段比年轻。这通常允许最多三次尝试胚胎缝合在一起。如果胚胎似乎一直保持附件但Connection并不是实质性的，在以加强它的连接的边缘执行附加缝合。避免摇动或在连体手术和潜伏期移动菜肴。
注意：尽管他们的早期发育阶段和感知的脆弱性，胚胎细胞块可以容忍操纵的大量（ 即，伤人和缝合），仍然正常发育。蛋黄，但是，可以只用轻轻一碰破裂，杀死胚胎。当拼接两个囊胚的玻璃针，不要使每个胚胎的细胞质量和蛋黄之间的界面接触。 - 在同样的菜和媒体（不改变媒体）孵育胚胎O / N为28.5℃。到了第二天早上，胚胎将有大部分溶解甲基纤维素液滴搬出去了。删除未成功融合的胚胎。倒出培养基，并用新鲜25毫升E3替换。
注意：如果使用工作着色应变，加入500μl0.15％（50倍）苯基硫脲（PTU）至终浓度0.003％到方框色素沉着。胚胎需要在PTU仍然持续保持色素沉着的抑制。
4.显微镜装置，图像采集，处理及分析
- 制备0.8％的低熔点（LMP）琼脂糖：添加琼脂糖至100毫升的E30.8克LMP和热，直到完全溶解。趁热等分试样1毫升LMP琼脂糖成在37℃加热块1.5毫升离心管。在LMP琼脂糖将保持在37℃熔融。添加40微升4毫克/毫升（25倍），pH 7.0的三卡因以每次1毫升等分试样的LMP琼脂糖在37℃。注意：如果使用色素应变工作，加入20微升0.15％（50倍）PTU至每1ml等分。
- 存储剩余的LMP琼脂糖在密封50ml试管数月，在4℃。
- 麻醉联体胚胎加入1毫升4毫克/毫升（25倍），pH 7.0的三卡因被成像到25毫的E3的胚胎已经英寸
- 轻轻地摇晃培养皿，使胚胎会在中间池。然后，用宽嘴塑料移液管吸取了在少液尽可能胚胎。转动吸管直立并使得它们沉淀在吸移管的最底部轻轻弹起胚胎。
- 与胚胎在移液管的底部，由移液管尖轻轻触摸到琼脂糖的表面将它们转移到LMP琼脂糖1毫升等分试样。避免转移多余的液体，因为这会稀释琼脂糖。
- 从吸管排出多余液体后，用吸管琼脂糖内轻轻混合胚胎，然后用吸管给所有的琼脂糖和胚胎转移到一个玻璃底的井（1.5号盖玻片），6-孔板中。
注意：确保胚胎转移到成像板后丢弃移液器。残余琼脂糖将设置吸移管内部，renderin克它无效的进一步使用。相反，使用新的移液管各一次。 - 下一个立体镜，可以使用固定在木材处理取笑针的端部的凝胶加载枪头胚胎向下朝向护罩玻璃定位（以确保它们是显微镜物镜的工作距离内），并在所需的取向成像。
注：不断重新定位，直到琼脂糖完全建立。照顾根据该一对胚胎装入联体胚胎是将被成像。鉴于联体胚胎的随机取向，对于一些对可能难以对图像两者胚胎。在这种情况下，回收利用镊子和宽嘴塑料移液管从琼脂糖胚胎，然后从不同的角度重新装入成像。 - 一旦琼脂糖已设置，覆盖2 - 3毫升E3的补充有三卡因（和PTU如有必要）。
- 图像用倒置的宽视场落射荧光，拉斯胚胎ER-扫描共聚焦，或旋转盘共聚焦显微镜。选择最适合于期望的成像目标。换一个全胚胎区，使用4倍的目标。选择较高的倍率，比如20倍的目标，将图像特定组织16，19。
注意：如果使用正置显微镜，安装在盖玻片LMP琼脂糖（类似于上文）。倒置玻璃盖玻片上具有真空润滑脂填充有相同的E3-三卡因-PTU 16,19的环的玻璃显微镜载片。 - 过程中获得自由使用图像分析软件包，如NIH图像的J / FIJI 16，19的图像。
注：计数细胞的数量和量化动态，如细 胞迁移和细胞分裂使用分割和跟踪算法16，19。
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Representative Results
与先前发表的研究15一致，斑马鱼胚胎的成功联体融合取决于两个胚胎的分期和取向和甲基纤维素的浓度。只需几个简单的，廉价的工具，产生了手术融合发展囊胚，增长到连体胚胎共享的循环。这些工具包括一个修改巴斯德吸管，10毫升吸管泵，以及其中使用单独的或与一种凝胶装载尖端或玻璃微注射针通过实验室膜固定到端（ 图1）木材处理取笑针。
放置两个囊胚在4％的甲基纤维素，并使用凝胶加载提示他们彼此面对（ 图2A）动物磁极定向他们后，胚被仔细受伤在其与玻璃注射N的接触点eedle（ 图2B）。伤人（比较图2B到图2C），并重新审视胚胎成对，以加强与其他受伤的初始连接的更大程度，增加了胚胎发生的可能性保持，导致成功融合的连接（ 图3A-C，电影1） ，并没有额外的形态缺陷或发育迟缓。当仔细完成，几乎100％的胚胎对进行融合，虽然这些胚胎（约25％）的一小部分从未建立在两半健康循环。通过定向两个囊胚与他们的动物磁极直接对齐，用共享循环产生的可靠的头 - 头或卵黄囊到卵黄囊融合。在大多数情况下，胚胎有两个心泵送共享公共循环（ 图3D）。
要确认胚胎确实分享了他们的循环，荧光葡聚糖注射ected进入流通，这可能是后来看到通过两个胚胎（ 电影2）循环。此外，有GFP +红细胞（LCR：EGFP）转基因胚胎进行融合到胚胎有mCherry +血管内皮细胞（flk1的：HRAS-mCherry）。 48 HPF，观察通过flk1的循环GFP +红细胞：HRAS-mCherry伙伴胚胎（ 图4A和Movie 3）。以展开联体系统的实用性，加入基因表达的时空控制。在此之前的融合，这两个胚胎的一种注射用HSP70：绿色荧光蛋白的DNA构建20。而融合的胚胎在28.5℃下生长，没有观察到荧光。与此相反，在37℃的简要30分钟热激后，明确GFP信号中的两个胚胎（ 图4B）中的一个是可见的。在某些情况下的GFP +细胞观察到未注射胚胎合作伙伴循环。因此，将所关注的基因的热休克启动子的控制下，提供了额外的时间控制，以研究调查候选基因的细胞内在或细胞外的功能。
图1.工具生成连体斑马鱼胚胎。
（A）附加说明的图像显示了用于开发囊胚的手术融合的工具。工具包括改性巴斯德吸管（顶端），其结合使用，用10毫升吸管泵（绿色）。木材处理挑逗针用来单独或与一个塑料凝胶加载枪头或拉玻璃微注射针剌固定到实验室底膜。（B）中的图像示出了三个玻璃显微注射需要的端部莱已经打破了在不同直径的镊子。该针躺在微米的顶部;最小的线隔开10微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2.开发囊胚的手术融合。
高倍率图像显示，之前的手术缝合（A），最小伤人（B）后，经过较大幅度的伤人（C）在发展高第二阶段斑马鱼的胚胎，他们面临的另一个动物极导向。 20分钟后，它是显而易见的是，胚胎已根据两个囊胚（D）之间的细胞的不间断桥被成功融合。规模条表示250微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3.开发联体斑马鱼胚胎。
（AC）影像显示的早期发展的全parabiont观点只是伤人（A）后的胚胎继续发展并进行外包（B和C），这些图像对应电影1（D）图片显示了一个连体胚胎对在36高倍视野。胚胎在其卵黄囊相连，有两个心，都有一个共同的循环。比例尺代表250微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4.可视化与联体共生基因编码荧光蛋白。
（A）图片（单独荧光，右;叠加透射光，左）显示在48 HPF连体胚胎的头部区域。这对中的底部胚胎为LCR转基因：eGFP的 （erythroctyes，绿色），而其伙伴（顶部）是转基因的Flk1：HRAS-mCherry，哪些标签血管内皮细胞（红色）。绿色红细胞可以看出通过合作伙伴胚胎循环。这个图像对应于电影3（B）的在这对左边的胚胎用HSP70注射：eGFP的构建在单细胞阶段，然后稠合到一个未注射的伙伴（右）。当动物被热在37℃下在36高倍视野休克30分钟，在文件中观察到的GFP的绿色荧光英尺胚胎在60高倍视野。比例尺代表500微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
电影1。手术融合的斑马鱼囊胚的早期发展。 （右键点击下载）。
电影显示了一对手术融合的斑马鱼囊胚的早期发展。外包可以看出，在每个胚同时发生。这部电影是有关图3A-C。
2.JPG“/>
电影2荧光右旋糖酐注射照亮一个共享的循环。 （右键点击下载）。
影片中展示了荧光葡聚糖被注入连体胚胎对的共同主静脉在60高倍视野。荧光染料可以看出随后通过两个胚胎循环。
电影3.绿色的血液流过血管的红色。MOV“>（点击下载）。
电影显示了在48 HPF连体胚胎的头部区域。这对中的底部胚胎为LCR转基因：eGFP的 （erythroctyes，绿色），而其伙伴（顶部）是转基因的Flk1：HRAS-mCherry，哪些标签血管内皮细胞（红色）。绿色的红细胞被视为通过合作伙伴胚胎循环。这部电影是有关图4a。
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Discussion
联体融合已调查在成年鼠模型和鸡胚10-14候选基因的细胞功能的有力工具。最近，囊胚融合方法已用于产生连体斑马鱼胚胎15所述。在本协议中，基于视频的教程用于演示和更好地描述的方法为，以研究在造血发育感兴趣的候选基因的时空，细胞 - 本征的，和细胞外的角色创建不同遗传背景的连体斑马鱼的胚胎超越。
本文中所描述的方法，最近被用于跟踪的HSC出现在一个胚胎，通过血液循环的迁移到不同遗传背景的胚胎，和随后的移植和分化16。在与Kissa小组的研究结果，分期和胚胎定位协议被发现，以确定成功率和联体融合的解剖性质。有几个关键的修改协议，用一个显著较高的生存率产生parabionts。这些包括伤人囊胚在更大程度上，固定到位针2 - 伤人后3秒，然后再重新访问后15分钟囊胚成对如果必要加强用另外伤人的初始连接。有了这些额外的建议，几乎100％的parabionts的存活和保持附有，其中75％拥有共同的循环。
掺入 实验对照的方法的一个附加元件，连体胚这里证明是耐热冲击，从而允许联体上下文20内的基因表达的时空控制。该技术的一个限制是，在一些情况下，连体伙伴胚胎不在联体融合后的同一平面上。这可以使它难以安装在LMP胚胎琼脂糖同时使用时间推移显微镜追踪细胞在两个胚胎。为了避免这个潜在的问题，应该计划生成多个连体的胚胎，以确保所期望的取向得以实现。可替代地，胚胎可以从LMP用细镊子和巴斯德吸管和重新安装用于成像从不同的角度回收。该协议的目标是提供一套简洁明了的指示陪如何手术保险发展囊胚产生连体斑马鱼胚胎的基于视频的教程。
随着越来越多parabiont生存的关键修改和补充建议，该协议将有望赋予谁希望利用胚胎连体调查调节细胞迁移，命运规格和分化在各种组织和细胞环境因素调查。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Methyl cellulose | Sigma | M0387 | |
| Individual components for E3/HCR: | For 1L: 14,61g NaCl, 0,63g KCl, 2,43g CaCl2-2H2O, 1,99g MgSO4 | ||
| NaCl (Sodium chloride) | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| KCl (Potassium chloride) | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| CaCl2 (Calcium chloride dihydrate) | Sigma-Aldrich | 223506 | |
| MgSO4 (Magnessium sulfate heptahydrate) | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Hepes (1M ) buffer solution | ThermoFisher | 15630-080 | |
| Name | Company | Catalog Number | |
| Antibiotics: | |||
| Pen/Strep | gibco by Life technologies | 15140-120 | |
| Ampicilin sodium salt | Sigma Life Science | A0166 | |
| Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus | Sigma Life Science | K1377 | |
| Name | Company | Catalog Number | |
| 50 mg/ml Pronase from Streptomyces griseus | Roche | 11459643001 | |
| capillary glass used for needles (Capillary Glass & Filaments) | Sutter Instrument | ITEM#: BF 100-50-10 | |
| Teasing needles with wooden handles | Fisher Scientific | S07894 | |
| Glass Pasteur pipettes | Fisherbrand | 13-678-20A | |
| 10 ml pipette pump (green) (Pipette Pump Pipettor) | Novatech International | F37898-0000 | |
| 100 mm diameter/ 20 mm deep plastic petri dishes (PETRI DISH, 100/20 MM, PS, CLEAR, WITH VENTS, HEAVY DESIGN, 15 PCS./BAG ) |
Greiner Bio-one | 664102 | |
| Dextran, Cascade Blue, 10,000 MW, Anionic, Lysine Fixable | ThermoFisher | D-1976 | |
| PTU. working stock is 0.003% (50x is 0.15%). for 500 ml, 0.75 g N-Phenylthiourea | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| Tricaine (powder) (Tricaine Methanesulfonato, Tricaine-S) | Western Chemical Inc | MS 222 | |
| LMP agarose (Ultrapure LMP agarose) | Invitrogen | 16520100 | |
| plastic transfer pipette (just the wide ended one I think) | Fisherbrand | 137115AM | |
| Glass-bottom 6-well plates used for imaging | MatTek | P06G1.5-20-F | |
| plastic western gel loading tip fixed on the end of a wood-handled dissecting needle (GELoader tips) | Eppendorf | 22351656 | |
| glass cover slips, slides and vacuum grease if mounting for an upright microscope: | |||
| Vaccum grease ( Dow Corning® high-vacuum silicone grease colorless, weight 5.3 oz (tube) ) |
Dow Corning | Z273554 | |
| Glass cover slips | Corning Life Sciences | 2960-244 |
References
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