Abstract
parabiosis quirúrgica de dos animales de diferentes orígenes genéticos crea un escenario único para el estudio de células intrínseca frente a las funciones de las células extrínseca de genes candidatos de interés, los comportamientos migratorios de las células, y las señales secretadas en los entornos genéticos distintos. Porque los animales parabiotic comparten una circulación común, nada de sangre o factor transmitida por la sangre de un animal se intercambiarán con su pareja y viceversa. Así, las células y los factores moleculares derivadas de uno antecedentes genéticos pueden ser estudiados en el contexto de un segundo fondo genético. Parabiosis de ratones adultos se ha utilizado ampliamente para la investigación del envejecimiento, cáncer, diabetes, obesidad, y el desarrollo del cerebro. Más recientemente, parabiosis de embriones de pez cebra se ha utilizado para estudiar la biología del desarrollo de la hematopoyesis. En contraste con los ratones, la naturaleza transparente de embriones de pez cebra permite la visualización directa de las células en el contexto parabiotic, por lo que es un método única y poderosa para la investigación de fmecanismos celulares y moleculares undamental. La utilidad de esta técnica, sin embargo, está limitada por una curva de aprendizaje para la generación de los embriones de pez cebra parabiotic. Este protocolo proporciona un método paso a paso sobre cómo fusionar quirúrgicamente el blástulas de dos embriones de pez cebra de diferentes orígenes genéticos para investigar el papel de los genes candidatos de interés. Además, los embriones de pez cebra parabiotic son tolerantes a choque térmico, por lo que el control temporal de la expresión génica posible. Este método no requiere una sofisticada puesta a punto y tiene amplias aplicaciones para el estudio de la migración celular, la especificación del destino, y la diferenciación in vivo durante el desarrollo embrionario.
Introduction
Creación de mosaicos genéticos (quimeras) entre los de tipo salvaje y animales modificados genéticamente es una estrategia bien establecida y clásica para la investigación de células intrínseca frente funciones de las células extrínseca de genes candidatos 1-6. Blastula trasplante en el pez cebra ha sido ampliamente utilizado para generar embriones quiméricos para estudios de células autonomía 7-9. Dependiendo del tejido de interés, sin embargo, puede ser un reto para apuntar predecible células del donante en el tejido deseado (por ejemplo, sangre) 1-3, 7-9. Genetistas de ratón han utilizado mucho los métodos quirúrgicos parabiotic para generar organismos unidos con una circulación compartida 10-14. Debido a que los animales parabiotic comparten un torrente sanguíneo común, las interacciones entre las células que se originaron de un animal con células de los demás animales de un fondo genético diferente pueden ser estudiados 10-16. Recientemente, el grupo de Karima Kissa elegantemente demostrado la capacidad de crecomió embriones de pez cebra unidos y luego utilizar este sistema para estudiar madre hematopoyéticas y la migración de células progenitoras (HSPC) 15. Además, parabiosis pez cebra se utilizó recientemente para investigar el papel de cadherina endotelial 5 en células madre hematopoyéticas de la emergencia (HSC) y la migración, 16 y para estudiar el papel de las células del estroma en el nicho de HSPC durante el desarrollo de pez cebra 17.
A diferencia de los ratones, embriones de pez cebra son transparentes y permiten la visualización directa de las células durante el desarrollo parabiotic, haciendo que el sistema únicamente de gran alcance. La utilidad de parabiosis en el pez cebra, sin embargo, está limitada por una curva de aprendizaje, y la cirugía parabiotic en los embriones delicados puede ser técnicamente difícil sin una instrucción detallada y demostración visual. El objetivo de este protocolo es proporcionar un conjunto de instrucciones claras, paso a paso para acompañar tutoriales basados en vídeo sobre cómo generar embriones de pez cebra para el estudio de parabioticfunciones de las células extrínseca de un gen (s) candidato por fusión quirúrgica de desarrollar blástulas temporal, celular intrínseco, o. modificaciones clave y recomendaciones adicionales para aumentar la supervivencia parabiont y nuevas aplicaciones experimentales se incluyen.
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Protocol
Este protocolo fue aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales del Hospital Infantil de Boston. Este protocolo se modificó a partir de un método publicado previamente 15.
1. Preparación de los reactivos (días o semanas de anticipación)
- Preparar 1,5% de agarosa recubiertas de platos. Añadir 1,5 g de agarosa a 100 ml de medio de pez cebra E3 en un matraz Erlenmeyer. El calor, disolver la agarosa, y luego vierta aproximadamente 5 ml en 100 mm de diámetro x 20 mm placas de Petri profundas.
Nota: Estos se utilizan para dechorionation de embriones (Paso 3.1) y para la cirugía parabiotic (paso 3.3). Almacenar placas revestidas con agarosa a 4 ° C durante unas semanas; sacarlos de la nevera y calentar a ta la mañana del día de la cirugía parabiotic. - Preparar 4% de celulosa de metilo. Disolver 4 g de polvo de metilcelulosa en 100 ml de E3 en un matraz Erlenmeyer con una barra de agitación. Colocar el matraz en una placa de agitación a 4 ° C, ajuste a la velocidad más baja, y dejar que se mezclepara un máximo de 2 días.
- utilizar de forma intermitente una espátula para romper los grumos blancos de metilcelulosa. Los cristales metil celulosa no se disuelven completamente a esta concentración. Cuando la solución se vuelva clara y aparece homogénea sin grumos blancos restante, parte alícuota de la solución en 1,5 ml tubos de microcentrífuga y se congelan a -20 ° C para almacenamiento a largo plazo.
Nota: Las concentraciones más bajas de metil celulosa se pueden utilizar; Sin embargo, este porcentaje más alto, más viscosa de celulosa de metilo ha dado los mejores resultados.
- utilizar de forma intermitente una espátula para romper los grumos blancos de metilcelulosa. Los cristales metil celulosa no se disuelven completamente a esta concentración. Cuando la solución se vuelva clara y aparece homogénea sin grumos blancos restante, parte alícuota de la solución en 1,5 ml tubos de microcentrífuga y se congelan a -20 ° C para almacenamiento a largo plazo.
- Preparar la solución de Ringer alta de calcio (HCR). Para hacer 400 ml de solución HCR, mezcla 8 ml de NaCl 5 M (116 mM final), 400 l de 3M KCl (2,9 mM final), 800 l de 5M de CaCl2 (10 mM final), y 2 ml de HEPES 1 M (5 mM final) con 390 ml de medio E3.
Nota: La solución de tienda HCR a 4 ° C durante unas semanas; calentar a ta la mañana del día de la cirugía parabiotic. - Preparar 5 - 6 pipetas Pasteur modificados para la transferenciasonar blástula pares. Brevemente calentar el extremo de la pipeta sobre un mechero Bunsen. Entonces, el uso de grandes pinzas, doblar el extremo de la pipeta a aproximadamente 45 ° C mientras todavía está caliente.
- Para asegurarse de que no hay bordes afilados que puedan dañar embriones, sostenga la punta de la pipeta brevemente en la llama durante unos 3 seg. Esto suavizará / esmalte al final de la pipeta. Esta pipeta Pasteur de vidrio modificada se utiliza en conjunción con una bomba de pipeta 10 ml (Figura 1) en el paso 3.5 a continuación.
- Preparar herramientas de aguja de vidrio para la costura quirúrgica de pares de blástula. Tire 2 - 3 agujas de vidrio como se hizo para la microinyección de embriones de pez cebra. Utilizar el laboratorio de película para fijar cada aguja de vidrio en el extremo de una aguja burlas leña o con mango de plástico (Figura 1A). El uso de pinzas, rompa el extremo de la aguja en un diámetro de aproximadamente 20 - 30 micras. Use un micrómetro de platina para guiar este paso (Figura 1B).
Nota: El tamaño del needle punta es importante. Si la punta es demasiado grande se hace difícil de controlar con precisión y puede causar un daño excesivo. Si la punta es demasiado pequeño, es difícil bobinado suficientemente los embriones.
2. La creación de parejas reproductoras de pez cebra y percepción de los embriones (día -1 al día 0)
- Configurar parejas de adultos de pez cebra. Configurar el pescado la noche anterior se va a realizar la cirugía parabiosis. Utilice divisores para separar machos y hembras. Para aumentar las probabilidades de que se obtengan los embriones deseados, la creación de varias parejas de cada línea. Nos encontramos con que normalmente 20 - 50% de las parejas se generan.
- A la mañana siguiente, tire de los divisores y permitir el apareamiento. Recoger los embriones utilizando un colador de té de malla fina, y luego transferirlos a una placa de Petri que contiene medio de embrión E3 18.
- Micro-inyectar embriones como desee (por ejemplo, con 25 pg de ADN de plásmido, el ARNm pg 200, o con 1 a 6 ng morfolino) dentro de 1 h de colección. Permitirlescrecer hasta la etapa 256 de células. Si la construcción de expresión de ADN se coloca bajo el control de un promotor de choque térmico (por ejemplo, la hsp70, la Figura 4B), controlar el momento de la expresión génica por desconchado térmico los parabionts a 37 ° C en una etapa posterior (por ejemplo., En 36 hpf ).
Nota: Como alternativa a un transgén fluorescente, dextrano fluorescente se puede añadir a la DNA, RNA, o la mezcla de inyección de morfolino (por ejemplo, dextrano, azul cascada a 2 mg / ml). El tinte de dextrano no interfiere con el desarrollo normal y permitirá el embrión inyectado para ser identificado bajo la luz fluorescente apropiada después de la fusión parabiotic. Alternativamente, la parabiosis de una cepa pigmentado (por ejemplo, AB) con una cepa no pigmentado (por ejemplo, Casper) podría ser utilizado para identificar el embrión inyectado en etapas posteriores. - Incubar los embriones a 28,5 ° C.Use un estereoscopio para controlar su evolución periódicamente a medida que se acercan al dev-256 célulaselopmental etapa (aproximadamente 2,5 HPF).
Nota: Si es necesario, cambiar los embriones a diferentes temperaturas para garantizar la coincidencia de fase entre los socios parabiotic (por ejemplo, embriones de morfolino-inyectada a menudo desarrollan más lento que sus contrapartes de la ONU con inyección de desplazamiento de los embriones de la ONU-inyectada a RT mientras que los embriones de morfolino-inyectada se colocan. a 28,5 ° C resultará en sus etapas de alineación después de un par de horas de desarrollo).
3. Generación de Parabiotic embriones de pez cebra por fusión quirúrgica de Desarrollar blástulas
- Como los embriones se acercan a la etapa 256 de células (aproximadamente 2,5 hpf), la transferencia de los embriones de cada fondo genético (es decir, mutante genético, líneas transgénicas y / o la manipulación genética) en placas de agarosa recubiertas de separados (por ejemplo, un plato de morfolino embriones inyectados y un segundo plato para el control de embriones). Por otra parte, la transferencia de los embriones para limpiar, vasos de vidrio libre de arañazos o platos de Petri de vidrio.
Nota: Evitar el uso de placas de plástico no revestidas como los embriones se adhieren al plástico y dañarse una vez fuera de sus chorions. - Decantar los medios de comunicación E3 hasta justo suficiente líquido permanece para cubrir los embriones (aproximadamente 7 - 10 ml). Añadir 200 l de 50 mg / ml de mezcla de proteasas aislados del fluido extracelular de Streptomyces griseus (proteasas). Agitar suavemente los embriones cada par de minutos.
- Cuando el 50% de los embriones han salido de sus corion, que por lo general tarda de 5 - 10 minutos, enjuagar tres veces con un volumen generoso (aproximadamente 15 - 20 ml) de medio E3 de embriones frescos.
- Dechorionate los embriones restantes en sus chorions dibujando suavemente hacia arriba en la pipeta Pasteur de vidrio modificado y luego suavemente disiparlas. Una vez que los embriones se han dechorionated y lavado, vuelva a colocar los medios de comunicación E3 con una solución de HCR. Como una alternativa a las proteasas, retire los chorions forma manual utilizando una pinza fina. Trate de tener 60 - 100 dechorembriones ionated disponibles para cada condición experimental.
Nota: Esta es varias veces más que en última instancia ser utilizado, pero muchos embriones son propensos a sufrir daños durante la manipulación o la cirugía para la parabiosis. Una vez que los embriones se dechorionated, mantenerlos sumergidos y no permita que se toquen la superficie del agua, ya que la tensión superficial causará que sean destruidos. Tenga en cuenta que el uso de una dosis más alta de las proteasas permite que los embriones salen de sus chorions más pronto y de una forma más sincronizada. Cuando se utiliza una dosis más baja de las proteasas, los embriones toman más tiempo para salir de sus chorions y lo hacen de una manera síncrona menos, lo que puede resultar en una parte de los embriones ser dañado por la exposición prolongada a proteasas.
- Dechorionate los embriones restantes en sus chorions dibujando suavemente hacia arriba en la pipeta Pasteur de vidrio modificado y luego suavemente disiparlas. Una vez que los embriones se han dechorionated y lavado, vuelva a colocar los medios de comunicación E3 con una solución de HCR. Como una alternativa a las proteasas, retire los chorions forma manual utilizando una pinza fina. Trate de tener 60 - 100 dechorembriones ionated disponibles para cada condición experimental.
- Cuando el 50% de los embriones han salido de sus corion, que por lo general tarda de 5 - 10 minutos, enjuagar tres veces con un volumen generoso (aproximadamente 15 - 20 ml) de medio E3 de embriones frescos.
- Descongelar la metilcelulosa (hecho en el paso 1.2 anterior) y se centrifuga en una centrífuga de mesa de la velocidad máxima durante 10 minutos para sedimentar los cristales sin disolver que dañarán los embriones o la ruptura de su yemas.
- Después de la centrifugación, utilice la fracción superior clara (aproximadamente 75% del volumen). Transfer 1 - gotas de diámetro 1,5 cm de metil celulosa en una placa Petri recubierta de agarosa 1,5%. Tenga cuidado de evitar la elaboración de cualquiera de los cristales sedimentadas desde el fondo del tubo.
- Use un marcador para predeterminar la posición de cada gota en la parte inferior del plato. Coloca 12 - 15 gotas (2 - 3 por valor de alícuotas ') de metil celulosa por 100 mm placa de Petri de diámetro. Preparar tantas placas como sea necesario por experimento.
Nota: Use cada gota para la fusión de un solo par de blástula. La marca designará la ubicación de cada gotita vez se añade-en el punto de medios de comunicación que las gotas se convierten casi invisible.
- Preparar uno 40 ml alícuota de solución HCR antibiótico suplementada por placa de agarosa recubiertas de preparado anteriormente en el paso 3.3. A cada 40 ml alícuota de HCR añadir penicilina-estreptomicina a 50 U / ml, ampicilina a 50 U / ml, y kanamicina a 0,5 g/ Ml.
- Cuando esté listo para realizar fusiones de blástula, llenar cuidadosamente cada uno de los platos que contienen gotitas de celulosa de metilo con 40 ml de la solución de antibiótico HCR-suplementado. Si se añade la solución HCR demasiado rápido, puede interrumpir las gotas.
- Una el vidrio modificado pipeta Pasteur (hecho en el paso 1.4 anterior) a una bomba de pipeta 10 ml. En un estereoscopio recoger un embrión dechorionated de cada plano (por ejemplo, un embrión morfolino-inyectado y uno de tipo salvaje embriones).
- Antes de dispensar los dos embriones, utilizar la pipeta Pasteur para hacer una pequeña depresión en el medio de la caída de metil celulosa, luego suavemente depositar ambos embriones en la depresión.
Nota: Durante el proceso de transferencia, gire la pipeta Pasteur ligeramente hacia arriba para que los embriones se depositan en la curva de la pipeta Pasteur a fin de evitar su toma de contacto con la superficie del líquido en la parte superior o inferior de la pipeta (que puede conducir a their ruptura).
- Antes de dispensar los dos embriones, utilizar la pipeta Pasteur para hacer una pequeña depresión en el medio de la caída de metil celulosa, luego suavemente depositar ambos embriones en la depresión.
- Inmediatamente después de depositar los embriones en el metilcelulosa, utilizar una aguja burlas leña o con mango de plástico con una punta de pipeta de carga de gel en el extremo (Figura 1 A) para volver a colocar cuidadosamente los embriones dentro de la metilcelulosa tal manera que sus polos animales son directamente tocarse.
- Utilizar suaves movimientos de barrido a través de la metilcelulosa cerca de los embriones para cambiar su posición sin tocar directamente. Deje que los embriones se sientan durante 5 minutos por lo que la metilcelulosa se instalará en torno a ellos. Durante este tiempo, cargue el siguiente par en otra gota.
Nota: Evitar el contacto directo con los embriones y tener especial cuidado de no tocar ninguna parte del saco vitelino, que se romperá fácilmente.
- Utilizar suaves movimientos de barrido a través de la metilcelulosa cerca de los embriones para cambiar su posición sin tocar directamente. Deje que los embriones se sientan durante 5 minutos por lo que la metilcelulosa se instalará en torno a ellos. Durante este tiempo, cargue el siguiente par en otra gota.
- Con la herramienta de aguja de vidrio, la herida cuidadosamente cada embrión en su punto de contacto. Con un movimiento suave de costura, las células de la primera embriones pueden introducirse en el segundo embrión y luego de vuelta otra vez.Al final de este movimiento, mantener la aguja en el lugar durante 2 - 3 segundos y después alejarla muy lentamente.
Nota: Hay un período de aproximadamente 2 a 3 segundos después de los embriones son heridas donde los dos tejidos parecen ser más adhesivo y más probable para unir el uno al otro. Por lo tanto, creemos que la celebración de la aguja en su lugar brevemente después de la herida ayuda a mantener los tejidos heridos de cada embrión en contacto durante el período inicial de tiempo inmediatamente después de la herida. - Permitir que estos embriones para sentarse durante 10 - 15 min a TA. Mientras tanto, seguir puntadas nuevos pares en otras gotas de metil celulosa. Después de 10-15 min, evaluar si el primer par se ha mantenido adjunto (Figura 2A).
Nota: Si los embriones son ya unidos, repetir el proceso de costura durante el tiempo que los embriones son menores de alrededor del escenario epibolia 30%. Normalmente, esto permite hasta tres intentos para coser los embriones juntos. Si los embriones parecen haber mantenido un archivo adjunto pero la cone xión no es sustancial, realizar la costura adicional en el borde de la conexión para reforzarla. Evite agitar o mover los platos durante los períodos de incubación y de cirugía parabiotic.
Nota: A pesar de su etapa de desarrollo temprano y fragilidad percibido, las masas de células de los embriones pueden tolerar una cantidad sustancial de manipulación (es decir, heridas y la costura), y aún desarrollarse normalmente. La yema de huevo, sin embargo, puede romperse con sólo el más mínimo contacto, causando la muerte del embrión. Cuando coser las dos blástulas con la aguja de vidrio, no para hacer contacto con la superficie de contacto entre la masa celular y la yema de cada embrión. - Incubar los embriones O / N a 28,5 ° C en el mismo plato y medios de comunicación (no cambie los medios de comunicación). Por la mañana siguiente, los embriones se han mudado de las gotitas de metil celulosa sobre todo disueltos. Retire cualquier embriones que no fueron fusionadas con éxito. Decantar los medios de comunicación y reemplazar con una fresca 25 ml E3.
Nota: Si se trabaja con unacepa pigmentada, añadir 500 l feniltiourea 0,15% (50x) (PTU) a una concentración final de 0,003% para bloquear la pigmentación. Los embriones deberán permanecer continuamente en la PTU para mantener la supresión de la pigmentación.
4. Configuración del microscopio, adquisición de imágenes, procesamiento y análisis
- Preparar agarosa al 0,8% de bajo punto de fusión (LMP): Añadir 0,8 g de agarosa LMP a 100 ml E3 y el calor hasta que esté completamente disuelto. Si bien caliente, alícuota de 1 ml de agarosa LMP en 1,5 ml tubos de microcentrífuga en un bloque de calentamiento de 37 ° C. La agarosa LMP permanecerá fundido a 37 ° C. Añadir 40 l de 4 mg / ml (25x), pH 7,0 tricaína a cada alícuota de 1 ml de agarosa LMP a 37 ° C. Nota: Si se trabaja con una cepa pigmentada, se añaden 20 l de 0,15% (50x) PTU a cada alícuota de 1 ml.
- Almacenar la agarosa LMP restante durante varios meses en tubos de 50 ml sellados a 4 ° C.
- Anestesie embriones parabiotic a ser fotografiado mediante la adición de 1 ml de 4 mg / ml (25x), pH 7,0 tricaínaa los 25 ml de E3 que los embriones ya en lo son.
- Hacer girar suavemente el plato de manera que los embriones pondrán en común en el medio. Luego, utilizando una pipeta de transferencia de plástico con puntas anchas elaborar los embriones en tan poco líquido como sea posible. Girar la pipeta en posición vertical y rebotar suavemente los embriones para que se depositan en el fondo mismo de la pipeta.
- Con los embriones en la parte inferior de la pipeta, transferirlos a una alícuota de 1 ml de agarosa LMP tocando ligeramente la punta de pipeta a la superficie de la agarosa. Evitar la transferencia de líquido en exceso ya que esto va a diluir la agarosa.
- Después de expulsar el exceso de líquido de la pipeta, use la pipeta para mezclar suavemente los embriones dentro de la agarosa, a continuación, utilizar la pipeta para transferir la totalidad de la agarosa y embriones para el bienestar de un fondo de vidrio (Nº 1.5 cubreobjetos), 6- así placa.
Nota: Asegúrese de desechar la pipeta después de transferir los embriones a la placa de imagen. agarosa residual se establece dentro de la pipeta, rendering ineficaz para su uso posterior. Más bien, utilizar una pipeta nueva cada vez. - En virtud de un estereoscopio, utilizar una punta de pipeta de carga de gel fijado en el extremo de una aguja burlas mango de madera para colocar los embriones hacia abajo hacia la cubierta de vidrio (para asegurar que están dentro de la distancia de trabajo del objetivo de microscopio), y en la orientación deseada para formación de imágenes.
Nota: Vuelva a colocar de forma continua hasta que la agarosa se ha establecido plenamente. Tenga cuidado para montar los embriones parabiotic según la cual el embrión de la pareja es a explorar. Dada la orientación aleatoria de los embriones unidos, para algunos pares puede ser difícil de imagen ambos embriones. En este escenario, la recuperación de los embriones a partir de la agarosa utilizando unas pinzas y una pipeta de transferencia de plástico con puntas anchas y luego volver a montar para obtener imágenes desde una perspectiva diferente. - Una vez que la agarosa se ha puesto, cubrir con 2 - 3 ml de E3 suplementado con tricaína (y PTU si es necesario).
- Imagen los embriones utilizando un campo amplio epi-fluorescencia invertido, lasconfocal de barrido-er, o girando el disco microscopio confocal. Seleccionar el objetivo más apropiada para la formación de imágenes deseado. Para un campo de todo el embrión de vista, utilice un objetivo de 4x. Seleccionar un aumento mayor, tal como un objetivo de 20x, a la imagen un tejido específico 16, 19.
Nota: Si se utiliza un microscopio vertical, montar en LMP agarosa (similar al anterior) en una hoja de la cubierta de vidrio. Invertir el cubreobjetos sobre un portaobjetos de vidrio que tiene un anillo de grasa de vacío lleno con el mismo E3-tricaína-PTU 16, 19. - Proceso de las imágenes adquiridas utilizando paquetes de software de análisis de imágenes gratuitas, tales como NIH Image J / FIJI 16, 19.
Nota: Contar el número de células y cuantificar la dinámica como la migración celular y la división celular utilizando la segmentación y el seguimiento de los algoritmos 16, 19.
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Representative Results
De acuerdo con estudios publicados previamente 15, el éxito de la fusión parabiotic de embriones de pez cebra depende de la puesta en escena y la orientación de los dos embriones y la concentración de metilcelulosa. Con tan solo unos simples, herramientas de bajo costo, mediante intervención quirúrgica fusionados blástulas en desarrollo se generaron embriones que se convirtió en parabiotic con circulación compartida. Estas herramientas incluyen una pipeta Pasteur modificado, una bomba de pipeta de 10 ml, y madera manejado agujas burlas que fueron utilizados ya sea solos o con una aguja de punta de carga de gel o microinyección de cristal fijo hasta el final por el laboratorio de película (Figura 1).
Después de colocar las dos blástulas en 4% de celulosa de metilo y el uso de la punta de carga de gel para orientarlos con sus polos animales frente a la otra (Figura 2A), los embriones fueron heridos con cuidado en su punto de contacto con la microinyección de vidrio nEedle (Figura 2B). Un mayor grado de heridas (comparar Figura 2B a la Figura 2C), y volver a visitar pares de embriones para reforzar una conexión inicial con la herida adicional, el aumento de la probabilidad de los embriones mantener una conexión que resultó en la fusión con éxito (Figura 3A-C, Película 1) y sin defectos morfológicos adicionales o retraso en el desarrollo. Cuando se hace con cuidado, casi el 100% de los pares de embriones se fusionaron, aunque una fracción de estos embriones (alrededor de 25%) nunca estableció la circulación sana en ambas mitades. Orientando los dos blástulas con sus polos alineados directamente con animales, fusiones fiables de cabeza a cabeza o el saco vitelino-a saco vitelino se generaron con la circulación compartida. En la mayoría de los casos, los embriones tenían dos corazones de bombeo una circulación común compartido (Figura 3D).
Para confirmar que los embriones de hecho comparten su circulación, dextrano fluorescente era injejada en circulación, lo que podría ser visto posteriormente circula por ambos embriones (Película 2). Además, los embriones transgénicos que tenían GFP + eritrocitos (LCR: EGFP) se fusionaron con los embriones que tenían mCherry + células endoteliales vasculares (flk1: HRAS-mCherry). Por 48 hpf, se observaron eritrocitos GFP + en circulación a través de la flk1: HRAS-mCherry embrión pareja (Figura 4A y la película 3). Para ampliar la utilidad del sistema parabiotic, se añadió el control temporal de la expresión génica. Antes de la fusión, uno de los dos embriones se inyectaron con una Hsp70: DNA eGFP construir 20. Mientras que los embriones fusionados estaban creciendo a 28,5 ° C, no se observó fluorescencia. Por el contrario, después de un breve choque térmico 30 min a 37 ° C, una señal de GFP claro era visible en uno de los dos embriones (Figura 4B). En algunos casos las células GFP + eranobservado que circula en el embrión socio no-inyectada. Por lo tanto, la colocación de un gen de interés bajo el control de un promotor de choque térmico proporciona un control temporal adicional para estudios de investigación de funciones de las células intrínseca o extrínseca de células de genes candidatos.
Figura 1. Herramientas para la generación de Parabiotic embriones de pez cebra.
(A) Imagen anotado muestra las herramientas utilizadas para la fusión quirúrgica de desarrollar blástulas. Las herramientas incluyen una pipeta Pasteur modificado (arriba), que se utiliza en conjunción con una bomba de pipeta 10 ml (verde). Mango de madera de agujas burlas se utilizan solos o con una punta de carga de gel pipeta de plástico o de vidrio tirado microinyección Needled fijado al extremo con el laboratorio de película. (B) La imagen muestra los extremos de necesidad microinyección tres cristalles que se han roto con un fórceps en diferentes diámetros. Las agujas están mintiendo en la parte superior de un micrómetro; las líneas más pequeñas están espaciadas 10 m de distancia. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Fusión quirúrgica de desarrollo blástulas.
Las imágenes de alta magnificación muestran dos embriones de pez cebra en el alto grado de desarrollo, orientados con sus polos animales se enfrentan entre sí, antes de la costura quirúrgica (A), inmediatamente después de la herida mínima (B), y después de la herida más sustancial (C). 20 min más tarde, es evidente que los embriones se han fundido con éxito sobre la base del puente ininterrumpido de células entre los dos blástulas (D). Escalabarra representa 250 micras. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Desarrollo de Parabiotic embriones de pez cebra.
(AC) Las imágenes muestran una vista de todo el parabiont del desarrollo temprano justo después de heridas (A) y como los embriones continúan desarrollándose y se someten a epibolia (B y C) Estas imágenes corresponden a la película 1. (D) La imagen muestra un par de embriones parabiotic en 36 HPF. Los embriones son conectadas en sus bolsas de la yema, tiene dos corazones y comparten una circulación común. Las barras de escala representan 250 micras. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Visualización parabiosis con proteínas fluorescentes genéticamente codificados.
(A) Imágenes (fluorescencia solo, derecho; superposición con luz transmitida, izquierda) muestran la región de la cabeza de embriones unidos a las 48 HPF. El embrión parte inferior de este par es transgénico para LCR: eGFP (erythroctyes, verde), mientras que su compañero (arriba) es transgénico para flk1: HRAS-mCherry, que las etiquetas de las células endoteliales vasculares (rojo). eritrocitos verdes se pueden ver que circula por el embrión pareja. Esta imagen corresponde a la película 3. (B) El embrión izquierda en este par se inyectó con una Hsp70: eGFP construir en el estadio de una célula y luego se fusiona a un socio-un inyectada (derecha). Cuando los animales se sorprendieron de calor a 37 ° C durante 30 minutos a 36 HPF, se observó la fluorescencia verde de GFP en el fichero embrión pies a 60 HPF. Las barras de escala representan 500 micras. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Película 1. El desarrollo temprano del pez cebra blástulas quirúrgicamente fusionado. (Haga clic derecho para descargar).
Película muestra el desarrollo de la primera de un par de blástulas pez cebra quirúrgicamente fundido. Epibolia se puede ver que ocurren simultáneamente en cada embrión. Esta película está relacionada a la Figura 3A-C.
2.jpg "/>
2. Película de inyección de dextrano fluorescente ilumina una circulación compartida. (Haga clic derecho para descargar).
Película muestra de dextrano fluorescente que se inyecta en la vena cardinal común de un par de embriones parabiotic en 60 hpf. El colorante fluorescente se puede ver posteriormente circula por ambos embriones.
Película 3. sangre verde que fluye a través de vasos rojos.mov "> (Haga clic derecho para descargar).
Película muestra la región de la cabeza de embriones unidos a las 48 HPF. El embrión parte inferior de este par es transgénico para LCR: eGFP (erythroctyes, verde), mientras que su compañero (arriba) es transgénico para flk1: HRAS-mCherry, que las etiquetas de las células endoteliales vasculares (rojo). eritrocitos verdes se ven circula a través del embrión pareja. Esta película está relacionada a la figura 4A.
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Discussion
Parabiotic fusión ha sido una herramienta poderosa para investigar las funciones celulares de genes candidatos en modelos murinos adultos y embriones de pollo de 10-14. Más recientemente, un método de fusión de blástula se ha descrito para la generación de embriones de pez cebra unidos 15. En el presente protocolo, tutoriales basados en vídeo se utilizan para demostrar y describir la metodología para la creación de embriones de pez cebra parabiotic de diferentes orígenes genéticos con el fin de estudiar las funciones temporales, células intrínsecas, y de células extrínseca de genes candidatos de interés en el desarrollo hematopoyético mejor y más allá.
El método descrito en este documento ha sido utilizado recientemente para realizar un seguimiento de HSC surgimiento de un embrión, la migración a través de la circulación sanguínea a un embrión de diferentes antecedentes genéticos, y su posterior injerto y la diferenciación 16. De acuerdo con los hallazgos, la estadificación y el embrión posicionamiento del grupo Kissa se encontraron para determinar la tasa de éxitoy la naturaleza anatómica de la fusión parabiotic. Con algunas modificaciones importantes en el protocolo, parabionts se generaron con una tasa de supervivencia significativamente mayor. Estos incluyen hiriendo al blástulas en un mayor grado, se mantiene la aguja en su lugar durante 2 - 3 segundos después de la herida, y luego volver a visitar blástula pares Después de 15 minutos para reforzar una conexión inicial con la herida adicional, si es necesario. Con estas recomendaciones adicionales, casi el 100% de los parabionts sobrevivió y se mantuvo unido, y el 75% de ellos compartió una circulación común.
Para incorporar un elemento adicional de control experimental con el método, los embriones parabiotic se demuestran aquí para ser tolerante al choque térmico, lo que permite el control temporal de la expresión génica en el contexto parabiotic 20. Una limitación de esta técnica es que en algunos casos los embriones asociados parabiotic no están en el mismo plano después de la fusión parabiotic. Esto puedehacen que sea difícil para montar embriones en LMP agarosa para realizar un seguimiento de las células tanto en los embriones de forma simultánea utilizando microscopía de lapso de tiempo. Para evitar este problema potencial, se debe planear para generar múltiples embriones parabiotic para asegurar que se alcanza la orientación deseada. Como alternativa, los embriones pueden ser recuperados de la LMP utilizando unas pinzas finas y pipeta Pasteur y vuelve a montar para obtener imágenes desde una perspectiva diferente. El objetivo de este protocolo es proporcionar un conjunto de instrucciones claras y concisas para acompañar tutoriales basados en vídeo sobre cómo desarrollar quirúrgicamente fusible blástulas para generar embriones de pez cebra parabiotic.
Con las modificaciones principales y recomendaciones adicionales para aumentar la supervivencia parabiont, este protocolo se espera capacitar a los investigadores que deseen utilizar embriones unidos para investigar los factores que regulan la migración celular, la especificación del destino, y la diferenciación en una variedad de tejidos y contextos celulares.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Methyl cellulose | Sigma | M0387 | |
| Individual components for E3/HCR: | For 1L: 14,61g NaCl, 0,63g KCl, 2,43g CaCl2-2H2O, 1,99g MgSO4 | ||
| NaCl (Sodium chloride) | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| KCl (Potassium chloride) | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| CaCl2 (Calcium chloride dihydrate) | Sigma-Aldrich | 223506 | |
| MgSO4 (Magnessium sulfate heptahydrate) | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Hepes (1M ) buffer solution | ThermoFisher | 15630-080 | |
| Name | Company | Catalog Number | |
| Antibiotics: | |||
| Pen/Strep | gibco by Life technologies | 15140-120 | |
| Ampicilin sodium salt | Sigma Life Science | A0166 | |
| Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus | Sigma Life Science | K1377 | |
| Name | Company | Catalog Number | |
| 50 mg/ml Pronase from Streptomyces griseus | Roche | 11459643001 | |
| capillary glass used for needles (Capillary Glass & Filaments) | Sutter Instrument | ITEM#: BF 100-50-10 | |
| Teasing needles with wooden handles | Fisher Scientific | S07894 | |
| Glass Pasteur pipettes | Fisherbrand | 13-678-20A | |
| 10 ml pipette pump (green) (Pipette Pump Pipettor) | Novatech International | F37898-0000 | |
| 100 mm diameter/ 20 mm deep plastic petri dishes (PETRI DISH, 100/20 MM, PS, CLEAR, WITH VENTS, HEAVY DESIGN, 15 PCS./BAG ) |
Greiner Bio-one | 664102 | |
| Dextran, Cascade Blue, 10,000 MW, Anionic, Lysine Fixable | ThermoFisher | D-1976 | |
| PTU. working stock is 0.003% (50x is 0.15%). for 500 ml, 0.75 g N-Phenylthiourea | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| Tricaine (powder) (Tricaine Methanesulfonato, Tricaine-S) | Western Chemical Inc | MS 222 | |
| LMP agarose (Ultrapure LMP agarose) | Invitrogen | 16520100 | |
| plastic transfer pipette (just the wide ended one I think) | Fisherbrand | 137115AM | |
| Glass-bottom 6-well plates used for imaging | MatTek | P06G1.5-20-F | |
| plastic western gel loading tip fixed on the end of a wood-handled dissecting needle (GELoader tips) | Eppendorf | 22351656 | |
| glass cover slips, slides and vacuum grease if mounting for an upright microscope: | |||
| Vaccum grease ( Dow Corning® high-vacuum silicone grease colorless, weight 5.3 oz (tube) ) |
Dow Corning | Z273554 | |
| Glass cover slips | Corning Life Sciences | 2960-244 |
References
- Zon, L. I., Orkin, S. H. Hematopoiesis: An evolving paradigm for stem cell biology. Cell. 132 (4), 631-644 (2008).
- Dzierzak, E., Speck, N. A. Of lineage and legacy: the development of mammalian hematopoietic stem cells. Nat Immunol. 9 (2), 129-136 (2008).
- Li, P., et al. Epoxyeicosatrienoic acids enhance embryonic haematopoiesis and adult marrow engraftment. Nature. 523 (7561), 468-471 (2015).
- Tam, P. P., Rossant, J. Mouse embryonic chimeras: tools for studying mammalian development. Development. 130 (25), 6155-6163 (2003).
- Tanaka, M., Gertsenstein, M., Rossant, J., Nagy, A. Mash2 acts cell autonomously in mouse spongiotrophoblast development. Dev. Biol. 190 (1), 55-65 (1997).
- Morin-Kensicki, E. M., Faust, C., LaMantia, C., Magnuson, T. Cell and tissue requirements for the gene eed during mouse gastrulation and organogenesis. Genesis. 31 (4), 142-146 (2001).
- Ho, R. K., Kane, D. A. Cell-autonomous action of zebrafish spt-1 mutation in specific mesodermal precursors. Nature. 348 (6303), 728-730 (1999).
- Parker, L., Stainier, D. Y. Cell-autonomous and non-autonomous requirements for the zebrafish gene cloche in hematopoiesis. Development. 126 (12), 2643-2651 (1999).
- Liao, E. C., Trede, N. S., Ransom, D., Zapata, A., Kieran, M., Zon, L. I. Non-cell autonomous requirement for the bloodless gene in primitive hematopoiesis of zebrafish. Development. 3 (3), 649-659 (2002).
- Kamran, P., Sereti, K. I., Zhao, P., Ali, S. R., Weissman, I. L., Ardehali, R. Parabiosis in mice: a detailed protocol. J Vis Exp. (80), (2013).
- Wagers, A. J., Sherwood, R. I., Christensen, J. L., Weissman, I. L. Little evidence for developmental plasticity of adult hematopoietic stem cells. Science. 297 (5590), 2256-2259 (2002).
- Hervey, G. R. The effects of lesions in the hypothalamus in parabiotic rats. J. Physiol. 145 (2), 336-352 (1959).
- Goldman, D. C., Bailey, A. S., Pfaffle, D. L., Al Masri, A., Christian, J. L., Fleming, W. H. BMP4 regulates the hematopoietic stem cell niche. Blood. 114 (20), 4393-4401 (2009).
- Dieterlen-Lièvre, F., Martin, C., Beaupain, D. Quail-chick chimaeras and parabionts: several new models to investigate early developmental events in the haemopoietic system. Folia Biol (Praha). 25 (5), 293-295 (1979).
- Demy, D. L., Ranta, Z., Giorgi, J. M., Gonzalez, M., Herbomel, P., Kissa, K. Generating parabiotic zebrafish embryos for cell migration and homing studies). Nat. Methods. 10 (3), 256-258 (2013).
- Anderson, H., et al. Hematopoietic stem cells develop the absence of endothelial cadherin 5 expression. Blood. 126 (26), 2811-2820 (2015).
- Murayama, E., Sarris, M., Redd, M., Le Guyader, D., Vivier, C., Horsley, W., Trede, N., Herbomel, P. NACA deficiency reveals the crucial role of somite-derived stromal cells in haematopoietic niche formation. Nat Commun. 28 (6), 8375 (2015).
- Shah, D. I., et al. Mitochondrial Atpif1 regulates haem synthesis in developing erythroblasts. Nature. 491 (7425), 608-612 (2012).
- Tamplin, O. J., et al. Hematopoietic stem cell arrival triggers dynamic remodeling of the perivascular niche. Cell. 160 (1-2), 241-252 (2015).
- Adám, A., Bártfai, R., Lele, Z., Krone, P. H., Orbán, L. Heat-inducible expression of a reporter gene detected by transient assay in zebrafish. Exp. Cell Res. 256 (1), 282-290 (2000).
