Abstract
다른 유전 적 배경이 동물의 수술 parabiosis는 세포 고유의 독특한 유전 적 설정에서 후보의 관심의 유전자, 세포의 철새 행동 및 분비 신호에 대한 세포 외부의 역할 비교 연구하는 독특한 시나리오를 작성합니다. parabiotic 동물이 공통의 순환을 공유하기 때문에, 하나의 동물에서 어떤 혈액 또는 혈액 매개 인자는 파트너와 그 반대의 경우도 마찬가지 교환 해주는 서비스입니다. 따라서, 하나의 유전 적 배경으로부터 유래 세포 및 분자 요인 제 유전 적 배경과 관련하여 연구 될 수있다. 성인 쥐 Parabiosis는 연구 노화, 암, 당뇨병, 비만, 뇌 발달에 광범위하게 사용되어왔다. 최근 제브라 피쉬 배아의 parabiosis는 조혈의 발달 생물학을 연구하는 데 사용되었습니다. 마우스와 대조적으로, 제브라 피쉬 배아의 투명한 성질은 F를 조사하기위한 고유 강력한 방법 만드는 parabiotic 맥락에서 세포의 직접적인 시각화를 허용undamental 세포 및 분자 메커니즘. 이 방법의 유용성은, 그러나, parabiotic 제브라 피쉬 배아 발생 가파른 학습 곡선에 의해 제한된다. 이 프로토콜은 관심의 후보 유전자의 역할을 조사하기 위해 서로 다른 유전 적 배경이 제브라 배아 blastulae 융합 수술 방법에 대한 단계적인 방법을 제공한다. 또한, 상기 제브라 parabiotic 배아 가능한 유전자 발현의 시간적 제어하게 열충격 내성이다. 이 방법은 복잡한 셋업이 필요하며 배아 개발하는 동안 생체 내에서 세포 이동, 운명 사양 및 분화 연구를위한 다양한 응용 프로그램을 가지고 있지 않습니다.
Introduction
야생 형 및 유전자 변형 동물 사이의 유전 적 모자이크 (키메라)의 생성은 세포 고유의 후보 유전자 1-6의 세포 외부 기능에 대 조사하는 잘 설립하고 고전적인 전략이다. 제브라 피쉬의 포배 이식 널리 세포 자율성 7-9의 연구를위한 키메라 배아를 생성하는 데 이용되고있다. 관심있는 조직에 따라, 그러나, 예측 원하는 조직 (예컨대, 혈액) 1-3, 7-9에 공여 세포를 대상으로 어려울 수있다. 마우스 유전 학자 긴 공유 순환 10-14으로 결합 된 유기체를 생성하는 parabiotic 수술 방법을 이용했다. parabiotic 동물이 공통의 혈류를 공유하기 때문에, 다른 유전 적 배경의 다른 동물의 세포 하나의 동물에서 유래 세포 사이의 상호 작용은 10 ~ 16를 공부하실 수 있습니다. 최근, 카 리마 Kissa의 그룹은 우아하게 CRE 할 수있는 능력을 입증결합 된 제브라 피쉬 배아를 먹은 후 조혈 줄기 및 전구 세포 (HSPC) 마이그레이션 (15)을 연구하기 위해이 시스템을 사용합니다. 또한, 피쉬 parabiosis 최근 조혈 줄기 세포 (HSC) 출현 이전 16 내피 헤린 (5)의 역할을 조사하고 제브라 개발 17 중 HSPC 틈새 간질 세포의 역할을 연구하기 위해 사용되었다.
마우스와 달리, 제브라 피쉬 배아 투명 시스템 고유 강력하게 parabiotic 발달 동안 세포의 직접적인 시각화를 허용한다. 제브라 피쉬의 parabiosis의 유틸리티는, 그러나, 자세한 지침 및 시각적 데모없이 기술적으로 어려울 수 있습니다 섬세한 배아에 가파른 학습 곡선, 그리고 parabiotic 수술에 의해 제한된다. 이 프로토콜의 목표는 공부에 대한 parabiotic 제브라 피쉬의 배아를 생성하는 방법에 대한 비디오 기반 자습서를 동반 명확하고 단계별 지침 세트를 제공하는 것입니다시간, 셀 고유 또는 blastulae 개발 수술 융착 후보 유전자 (들)의 세포 외부 기능한다. 주요 수정 및 증가 parabiont의 생존과 새로운 실험 응용 프로그램에 대한 추가 권장 사항이 포함되어 있습니다.
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Protocol
이 프로토콜은 보스턴 아동 병원 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었다. 이 프로토콜은 이전에 게시 된 방법 (15)에서 수정됩니다.
시약 1. 준비 (사전에 일 또는 주)
- 1.5 % 아가 로스 코팅 요리를 준비합니다. 삼각 플라스크에 100 ㎖ Zebrafish의 E3 매체에 1.5 g 아가로 오스를 추가합니다. 열, 아가로 오스를 분해 한 후 약 5 ml의 100mm 직경 X 20mm 깊은 페트리 접시에 붓는다.
참고 :이 배아의 dechorionation에 사용 (3.1 단계)과 parabiotic 수술 (3.3 단계)된다. 몇 주 동안 4 ° C에서 아가 로스 코팅 요리를 저장; 냉장고 밖으로 데리고와 따뜻한 parabiotic 수술 당일의 아침을 실온으로. - 4 % 메틸 셀룰로오스를 준비합니다. 교반 막대와 함께 삼각 플라스크에 E3 100ml에 메틸 셀룰로오스 분말 4g을 녹인다. 최저 속도로 설정 4 ° C에서 교반 접시에 플라스크를 놓고는 혼합 할 수최대 2 일.
- 일시적으로 메틸 셀룰로오스의 흰색 덩어리를 헤어 주걱을 사용합니다. 메틸 셀룰로오스 결정은 완전히이 농도에서 용해되지 않습니다. 용액을 명확하게 더 흰색 덩어리가 분취 액을 장기 저장을 위해 -20 ℃에서 1.5ml의 미세 원심 분리 튜브에 용액을 동결 나머지 없음으로 균질 나타나면.
주 : 메틸 셀룰로오스의 낮은 농도가 사용될 수있다; 그러나, 이러한 높은 비율은 점성 메틸 셀룰로오스가 최상의 결과를 산출 하였다.
- 일시적으로 메틸 셀룰로오스의 흰색 덩어리를 헤어 주걱을 사용합니다. 메틸 셀룰로오스 결정은 완전히이 농도에서 용해되지 않습니다. 용액을 명확하게 더 흰색 덩어리가 분취 액을 장기 저장을 위해 -20 ℃에서 1.5ml의 미세 원심 분리 튜브에 용액을 동결 나머지 없음으로 균질 나타나면.
- 높은 칼슘 벨소리 (HCR) 솔루션을 준비합니다. (5M NaCl을 8 ㎖ (116 mM의 최종), 3M KCl을 400 μL (2.9 mM의 최종), 1M HEPES의 500 염화칼슘 2 (10 최종 mM)을, 그리고 2 ㎖의 800 μl를 혼합, 5 HCR 용액 400 mL로한다 E3 미디어의 390 mL를 mM의 최종).
참고 : 몇 주 동안 4 ° C에서 보관 HCR 솔루션을; parabiotic 수술 당일의 아침을 실온으로 따뜻한. - 전송을위한 6 수정 파스퇴르 피펫 - (5) 준비포배 쌍 반지. 간단히 분젠 버너를 통해 피펫의 끝을 가열한다. 여전히 뜨거운시키면서 큰 집게를 사용하여 약 45 ° C로 피펫의 끝을 구부리.
- 배아에 손상을 약 3 초 동안 화염에 간단히 피펫의 끝을 잡고 있습니다 날카로운 모서리가 없는지 확인합니다. 이는 피펫의 끝 / 폴란드을 매끄럽게한다. 이 변형 유리 파스퇴르 피펫 아래 단계 3.5에서 10 ㎖ 피펫 펌프 (도 1)와 함께 사용된다.
- 포배 쌍 수술 봉합 용 유리 바늘 도구를 준비합니다. 제브라 피쉬 배아의 미세 주입에 대해 수행으로 3 유리 바늘 - 2 당깁니다. 나무 - 또는 플라스틱 처리 괴롭 히고 바늘 (그림 1A)의 끝 부분에 각각의 유리 바늘을 해결하기 위해 랩 필름을 사용합니다. 30 μm의 - 집게를 사용하여, 약 20의 직경의 바늘 끝을 분해. 이 단계 (그림 1B)를 안내하는 스테이지 마이크로 미터를 사용합니다.
참고 : 북동의 크기edle 팁은 중요하다. 선단이 너무 크면 정밀하게 제어하는 것이 곤란해진다 과도한 손상을 일으킬 수있다. 선단이 너무 적 으면 충분히 배아 상처가 어렵다.
2. (주 0 일 -1) 배아의 제브라 피쉬와 컬렉션의 번식 쌍을 설정
- 성인 제브라 피쉬의 번식 쌍을 설정합니다. parabiosis 수술이 실시하는 전날 밤에 물고기를 설정합니다. 남성과 여성을 구분하는 칸막이를 사용합니다. 원하는 배아를 얻을 각 행의 여러 쌍을 설정할 수 확률이 증가합니다. 쌍의 50 % 스폰 - 우리는 일반적으로 20 것을 찾을 수 있습니다.
- 다음날 아침, 디바이더를 끌어와 짝짓기를 할 수 있습니다. 미세 메쉬 차 여과기를 사용하여 태아를 수집하고 E3 배아 매체 (18)를 함유하는 페트리 접시로 옮긴다.
- 원하는 배아를 마이크로-주입 (예를 들어, 25 페이지의 플라스미드 DNA, 또는 1 200 페이지의 mRNA를 가진 - 6 NG의 모르 폴리 노) 컬렉션의 1 시간 이내. 에이를 허용256 세포 단계까지 성장한다. DNA의 발현 구조체는 열 충격 프로모터의 조절하에 배치되는 경우 (예를 들어, HSP70는도 4b) (이후 단계에서 37 ° C에서 parabionts 충격을 열에 의해 유전자 발현의 타이밍을 제어하는 예. 36 HPF에서 ).
주 : 형광 유전자의 대안은 형광 덱스 트란 (2 ㎎ / ㎖로 예를 들면, 덱스 트란, 캐스케이드 블루)이 DNA, RNA, 또는 모르 폴리 분사 혼합물에 첨가 될 수있다. 덱스 트란 염료 정상적인 발달을 방해하지 않으며, 주입 된 배아 parabiotic 융합 후 적절한 형광등 아래에서 확인되는 것을 허용한다. 대안 적으로, 비 착색 된 균주와 균주의 착색 parabiosis (예 AB) (예 캐스퍼) 이후 단계에서 주입 된 배아를 식별하는 데 사용될 수있다. - 주기적으로 자신의 발전을 모니터링하는 28.5 ° C.Use에서 입체경을 배아를 품어 256 셀 dev에 가까운 그들elopmental 단계 (약 2.5 HPF).
주 :. 필요한 경우 모르 주입 배아가 배치되어 있지만, parabiotic 파트너 (예를 들면, 모르 폴리 노 주입 배아 종종 비 - 주입에 비해 느린 개발 RT로 미 주입 배아 쉬프팅 사이 단 매칭을 보장하기 위해 서로 다른 온도로 배아 시프트 28.5 °에서 C 개발의 몇 시간) 후 정렬 자신의 단계에서 발생합니다.
Blastulae 개발의 외과 융합에 의해 Parabiotic 제브라 피쉬 배아의 3 세대
- 배아가 256 세포 단계 (약 2.5 HPF)를 접근 할 때, 별도의 아가로 오스 - 코팅 요리 (모르 폴리 노에 대한 예를 들어, 하나의 접시에 각각의 유전 적 배경 (즉, 유전자 돌연변이, 유전자 변형 라인 및 / 또는 유전자 조작)에서 배아를 전송 주입 된 배아 및 제어 배아에 대한 두 번째 요리). 또한, 스크래치가없는 유리 비커, 유리 페트리 접시를 청소 배아를 전송합니다.
참고 : 배아는 플라스틱에 충실하고 자신의 chorions에서 한 번 손상으로 코팅 플라스틱 접시를 사용하지 마십시오. - (- 10 ml의 약 7) 충분한 액체가 배아를 충당하기 위해 남아 때까지 E3 미디어를 가만히 따르다. 50 밀리그램 / 스트렙토 griseus의 (단백질 분해 효소)의 세포 외액에서 분리 된 단백질 분해 효소 ml의 혼합물 200 μl를 추가합니다. 부드럽게 배아 분마다 몇 소용돌이 친다.
- 배아의 50 %는 일반적으로 5 소요 자신의 chorions, 나올 때 - 신선한 E3 배아 매체의 - (20 ㎖ 약 15) 10 분, 관대 한 부피로 세 번 씻어.
- 부드럽게를 밝혀 부드럽게 한 후 수정 된 유리 파스퇴르 피펫으로 그들을 그리기에 의해 자신의 chorions에 남아있는 배아를 Dechorionate. 배아는 dechorionated 세척 한 후, HCR 용액으로 E3 미디어를 교체합니다. 단백질 분해 효소에 대한 대안으로, 수동으로 미세 집게를 사용하여 chorions를 제거합니다. 100 dechor - 60을 목표로각 실험 조건에 사용할 수 ionated 배아.
참고 :이 궁극적으로 사용될 것보다 배 더 여러 가지이지만, 많은 배아는 취급 또는 parabiosis에 대한 수술 중 손상 될 가능성이 높다. 배아는 dechorionated되면, 그들이 침수 유지하고 표면 장력이 그들을 파괴하는 원인이됩니다 그들에게, 물의 표면을 터치하는 것을 허용하지 않습니다. 단백질 분해 효소의 높은 복용량을 사용하여 배아 빨리 자신의 chorions에서 그리고 더 동기화 된 방식으로 제공 할 수 있음을 유의하십시오. 단백질 분해 효소의 낮은 복용량을 사용하는 경우, 배아는 chorions에서 등장하는 데 시간이 오래 걸릴 및 단백질 분해 효소에 장기간 노출에 의해 손상되는 배아의 일부 발생할 수 있습니다 덜 동기 방식에서 이렇게.
- 부드럽게를 밝혀 부드럽게 한 후 수정 된 유리 파스퇴르 피펫으로 그들을 그리기에 의해 자신의 chorions에 남아있는 배아를 Dechorionate. 배아는 dechorionated 세척 한 후, HCR 용액으로 E3 미디어를 교체합니다. 단백질 분해 효소에 대한 대안으로, 수동으로 미세 집게를 사용하여 chorions를 제거합니다. 100 dechor - 60을 목표로각 실험 조건에 사용할 수 ionated 배아.
- 배아의 50 %는 일반적으로 5 소요 자신의 chorions, 나올 때 - 신선한 E3 배아 매체의 - (20 ㎖ 약 15) 10 분, 관대 한 부피로 세 번 씻어.
- 배아를 손상 시키거나 자신의 노른자를 파열 것이다 용해되지 않은 결정을 펠렛 10 분 동안 최대 속도에 탁상 원심 분리기에서 (위의 단계 1.2에서 만든) 메틸 원심 분리기를 해동에스.
- 원심 분리 후, 투명한 상부 분획 (용적의 약 75 %)를 사용한다. 전송 - 1을 1.5 % 아가 로스 코팅 페트리 접시에 메틸 셀룰로오스 1.5 cm 직경 방울. 튜브의 바닥에서 펠렛 결정 중 하나를 그리기 않도록주의하십시오.
- 접시의 바닥면 각 액체 방울의 위치를 미리 결정 마커를 사용한다. 100mm 직경 페트리 접시 당 메틸 셀룰로오스 - (3 분취 '가치 2) 15 방울 - 12 놓습니다. 실험에 따라 필요한만큼 접시를 준비합니다.
참고 : 하나의 포배 쌍의 융합에 대한 각각의 방울을 사용합니다. 마크는 미디어가 부가로되어있는 점 방울 거의 보이지 않게되면 각 방울의 위치를 지정합니다.
- 단계 3.3에서 상기 제조 된 아가로 오스 - 코팅 접시 당 항생제 보충 HCR 솔루션 중 하나를 40 ml의 분취 량을 준비합니다. HCR 각각 40 ml의 분취 량 0.5 μg의 50 U / ㎖, 50 U / ㎖의 앰피 실린, 카나마이신에 페니실린 - 스트렙토 마이신을 추가/ ㎖.
- 준비 포배 융합체를 수행 할 때는 신중 항생제 첨가 HCR 용액 40 ㎖로 메틸 셀룰로오스 방울을 함유하는 접시의 각 채운다. HCR 용액을 너무 빨리 첨가하면 방울을 방해 할 수있다.
- 10 ml를 피펫 펌프 (위의 단계 1.4에서 만든) 수정 유리 파스퇴르 피펫을 연결합니다. 입체경에서 각각의 배경 (예를 들어, 하나의 모르 폴리 노 주입 배아 한 야생 형 배아)에서 한 dechorionated 배아를 수집합니다.
- 두 태아 분배 전에 부드럽게이어서, 메틸 셀룰로오스 강하의 중간에 작은 오목 있도록 파스퇴르 피펫을 사용하여 오목 부에 모두 배아 증착.
참고 이어질 수있는 피펫의 상단 또는 하단의 액체의 표면과 그 결정 연락 (피하도록 전사 과정에서 약간 위쪽으로 배아 파스퇴르 피펫의 굴곡에 정착되도록 파스퇴르 피펫 차례 파묻혀에R 파열).
- 두 태아 분배 전에 부드럽게이어서, 메틸 셀룰로오스 강하의 중간에 작은 오목 있도록 파스퇴르 피펫을 사용하여 오목 부에 모두 배아 증착.
- 자신의 동물 극은 직접적 즉시 메틸 셀룰로오스로 배아를 증착 한 후, 조심스럽게 메틸 셀룰로오스에서 배아의 위치를 변경하는 말 (그림 1A)에 젤 로딩 피펫 팁으로 나무 - 또는 플라스틱 처리 괴롭 히고 바늘을 사용하도록 서로를 만지고.
- 직접 건드리지 않고 그 위치를 변경하기 위해 배아로 메틸 셀룰로오스 가까이를 통해 부드러운 청소 동작을 활용합니다. 메틸 셀룰로오스가 그들 주위에 정착 할 수 있도록 배아가 5 분 동안 앉아 보자. 이 기간 동안, 다른 드롭으로 다음 쌍을로드합니다.
참고 : 배아와 직접 접촉을 피하고 쉽게 파열 될 난황의 어떤 부분을 건드리지 않도록 특별한주의를 기울입니다.
- 직접 건드리지 않고 그 위치를 변경하기 위해 배아로 메틸 셀룰로오스 가까이를 통해 부드러운 청소 동작을 활용합니다. 메틸 셀룰로오스가 그들 주위에 정착 할 수 있도록 배아가 5 분 동안 앉아 보자. 이 기간 동안, 다른 드롭으로 다음 쌍을로드합니다.
- 유리 바늘 도구를 사용하여 조심스럽게 접촉 그 지점에서 각각의 배아 상처. 부드러운 봉제 운동으로, 최초의 배아에서 세포는 다시 다음 두 번째 배아에 들어갔습니다 될 수 있습니다.이 운동의 끝에서, 2 곳의 바늘을 잡고 - 3 초 후 아주 천천히 떨어져립니다.
참고 : 약 2의 기간이 있습니다 - 두 조직이 더 접착제 서로에 연결할 가능성이있을 것으로 보인다 곳 배아가 부상 후 3 초. 따라서, 우리는 간단히 부상 후 자리에 바늘을 유지하는 것은 바로 부상 후 시간의 초기 기간 동안 접촉 각 배아의 상처 조직을 유지하는 데 도움이 있다고 생각합니다. - RT에서 15 분 -이 배아가 10 앉아서 할 수 있습니다. 한편, 메틸 셀룰로오스의 다른 방울의 새로운 쌍을 스티치로 진행합니다. 10 후 - 15 분, 첫 번째 쌍은 첨부 (그림 2A)을 유지하고 있는지 여부를 평가합니다.
참고 : 배아가 더 이상 연결된 경우, 한 배아가 30 % epiboly 무대 주위 세 미만으로의 봉합 과정을 반복합니다. 세 번까지 함께 배아를 스티치하는 일반적이 있습니다. 배아는 첨부하지만 C를 유지 한 것으로 나타날 경우통해서만 이루어진다없는 충실이를 강화하는 연결 가장자리 부가 봉합을 수행한다. 진동 또는 parabiotic 수술과 배양 기간 동안 요리를 이동하지 마십시오.
참고 : 자신의 초기 발달 단계 및 인식 취약성에도 불구하고, 배아의 세포 대중 조작의 상당한 양 (즉, 상처와 스티치)을 허용하고, 정상적으로 개발할 수 있습니다. 노른자는, 그러나, 배아를 죽이는 만 조금 터치 파열 할 수 있습니다. 유리 바늘 두 blastulae 스티치 때 각 배아 균체 및 난황의 계면에 접촉하게하지 않는다. - 같은 요리와 미디어 (미디어를 변경하지 마십시오)에서 28.5 ° C에서 배아 O / N을 품어. 다음 아침, 배아는 대부분 용해 메틸 셀룰로오스 방울 밖으로 이동 한 것입니다. 성공적으로 융합되지 않은 모든 배아를 제거합니다. 미디어를 가만히 따르다하고 신선한 25 ml의 E3로 교체합니다.
참고 : 작업하는 경우착색 균주 염색을 차단하는 0.003 %의 최종 농도로 500 ㎕를 0.15 % (50X) 페닐 티오 (PTU)를 추가한다. 배아 착색 억제를 유지 PTU 연속적으로 유지해야한다.
4. 현미경 설정, 이미지 획득, 처리 및 분석
- 0.8 % 저 융점 (LMP) 아가로 오스를 준비 : 완전히 용해 될 때까지 0.8 g 아가로 오스 100 ㎖ E3에 LMP와 열을 추가합니다. 뜨거운 반면, 나누어지는 아가로 오스 37 ° C 가열 블록에 1.5 ml의 미세 원심 분리 튜브에 LMP 1 ㎖. LMP 아가로 오스는 37 ℃에서 용융 유지됩니다. 아가로 오스 37 ° C에서 4 ㎎ / ㎖ (25 배), pH를 LMP 각각 1 ml의 분취 7.0 tricaine의 40 μl를 추가합니다. 참고 : 색소 변형 작업을 각각 1ml를 나누어 0.15 % (50 배) PTU의 20 μl를 추가합니다.
- 4 ℃에서 밀봉 된 50 ㎖ 튜브에 몇 달 동안 나머지 LMP 아가로 오스를 저장합니다.
- parabiotic 배아 마취 4 ㎎ / ㎖ 1 ㎖ (25 배), pH를 7.0 tricaine 추가하여 묘화 될E3의 25 ml의 배아는 이미 있음.
- 배아가 중간에 풀 수 있도록 조심스럽게 접시를 소용돌이 친다. 그런 다음, 넓은 만들어진 플라스틱 전송 피펫을 사용하여 가능한 한 작은 액체의 배아를 그립니다. 똑바로 피펫을 켜고 그들이 피펫의 맨 아래에 정착되도록 부드럽게 배아를 반송.
- 피펫 아래쪽의 배아 가볍게 아가의 표면에 피펫 팁을 터치하여 LMP 아가 로스의 1 mL의 분취 량으로 옮긴다. 아가로 오스를 희석 것이로 물기를 전송하지 마십시오.
- 피펫으로부터 과량의 액체를 배출하기 후에 부드럽게 6- 후, 아가로 오스에서 배아를 혼합 유리 바닥 웰 (제 1.5 커버 슬립)로 오스 및 배아를 모두 전송하기 위해 피펫을 사용하여 피펫을 사용하여 웰 플레이트.
참고 : 이미징 플레이트에 배아를 전송 한 후 피펫을 폐기해야합니다. 잔류 아가로 오스는 피펫 내부 설정하며, rendering는 추가 사용에 대한 효과. 오히려 새로운 피펫 때마다 사용합니다. - 입체경에서 아래로 커버 유리를 향해 배아의 위치를 나무 손잡이 괴롭 히고 바늘의 끝 부분에 고정 된 겔 로딩 피펫 팁을 사용 (그들은 현미경 목적의 작동 거리 내에있는 보장)하고 원하는 방향으로 이미징.
참고 : 아가로 오스가 완전히 설정 될 때까지 지속적으로 위치를 조정합니다. 한 쌍의 어떤 배아에 따라 parabiotic 배아를 장착하는데주의를 기울여야하는 것은 몇 군데한다. 결합 된 배아의 임의의 방향을 감안할 때, 일부 쌍을 위해 모두 배아 이미지 어려울 수 있습니다. 이 경우, 겸자 넓은 만들어진 플라스틱 이전 피펫을 사용하여 아가로 오스로부터 배아를 복구하고 다른 관점에서 이미징 마운트. - tricaine (과 PTU 필요한 경우)로 보충 E3의 3 ㎖ - 아가로 오스가 설정되면, 2 다룹니다.
- 라스를 거꾸로 넓은 필드 에피 형광을 사용하여 이미지 배아공 초점을 어 - 스캔 또는 디스크 공 초점 현미경을 회전합니다. 원하는 이미지에 가장 적합한 목표를 선택합니다. 보기의 전체 배아 필드를 들어, 4 배 목표를 사용합니다. 이미지 같은 20 배 대물 같은 특정 조직 (16), (19) 높은 배율을 선택한다.
참고 : 직립 현미경을 사용하는 경우, 유리 커버 슬립에 (위 유사) LMP 아가로 오스에 탑재합니다. 같은 E3-tricaine - PTU 16, 19로 채워진 진공 그리스의 링이 유리 현미경 슬라이드에 유리 커버 슬립을 반전. - 공정은 NIH 이미지 J / 피지 16 19 무료 이미지 분석 소프트웨어 패키지를 사용하여 이미지를 획득.
참고 : 세포 수를 계산 및 세포 이동 및 세포 분열이 분할을 사용하여 알고리즘 (16), (19)를 추적하는 등의 역 동성을 정량화.
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Representative Results
이전에 발표 된 연구 (15)과 일치, 제브라 피쉬 배아의 성공적인 parabiotic 융합 준비와 방향 두 개의 배아 및 메틸의 농도에 따라 달라집니다. 몇 가지 간단한으로 저렴한 도구는 수술 융합 개발 blastulae 공유 순환 parabiotic 배아로 성장이 발생했다. 이 도구는 수정 된 파스퇴르 피펫, 10 ml를 피펫 펌프, 단독 또는 실험실 필름에 의해 단부에 고정 겔 로딩 팁 또는 유리 미세 주사 바늘 (그림 1)과 중 사용 된 목재 처리 괴롭 히고 바늘을 포함했다.
4 % 메틸 셀룰로오스에 두 blastulae을 배치하고 서로 (그림 2A)을 마주 보는 그들의 동물 극로 방향을 젤 로딩 팁을 사용 후, 배아는 신중하게 유리 마이크로 인젝션 N과의 접촉 자신의 지점에서 부상 당했다eedle (그림 2B). (2C 그림 그림 2B 비교) 부상 및 추가 상처와 초기 연결을 강화하기 위해 배아 쌍을 다시 방문의 큰 정도, 성공적인 융합의 결과 연결을 유지 배아의 가능성을 증가 (그림 3A-C, 영화 1) 및 추가 형태 학적 결함이나 지연 현상없이. 주의 깊게 완료되면이 배아 (약 25 %)의 비율이 모두 절반에 건강한 혈액 순환을 설립 적이 있지만, 배아 쌍의 거의 100 %가 융합되었다. 자신의 동물 극 직접 정렬로 두 blastulae을 배향으로 신뢰할 수있는 일대일 또는 난황 낭 - 투 - 난황 주머니 융합 공유 순환으로 생성되었다. 대부분의 경우, 배아는 공유 일반적인 순환 (그림 3D)를 펌핑 두 마음을 가지고 있었다.
배아가 실제로 자신의 순환을 공유 한 것으로 확인하려면 형광 덱스 트란은 INJ했다모두 배아 (동영상 2)를 통해 순환 이후에 볼 수 있었다 순환으로 반사된다. 또한, GFP + 적혈구 (LCR : eGFP는)를 가지고 유전자 변형 배아는 mCherry + 혈관 내피 세포 (: HRAS - mCherry flk1)을 가지고 있었다 배아에 융합되었다. HRAS - mCherry 파트너 배아 (그림 4A 및 영화 3) : 48 HPF으로 GFP + 적혈구는 flk1을 통해 순환 관찰되었다. parabiotic 시스템의 유용성을 확장하기 위해, 유전자 발현의 일시적 조절 하였다. 융합 전에, 두 태아 중 하나는 HSP70 주입 하였다 eGFP는 DNA (20)를 구성. 융합 배아는 28.5 ° C로 성장 동안, 형광은 관찰되지 않았다. 대조적으로, 37 ° C에서 30 분 간단한 열 쇼크 후, 맑고 GFP 신호는 두 개의 배아 (도 4b) 중 하나에 표시 하였다. 일부 예에서 GFP + 세포였다미 주입 파트너 배아에서 순환 관찰했다. 따라서, 열 충격 프로모터의 조절하에 관심있는 유전자를 배치하는 후보 유전자의 셀 고유 또는 외인성 세포의 기능을 연구 조사 추가적인 시간 제어를 제공한다.
생성 Parabiotic Zebrafish의 배아 1. 도구 그림.
(A) 주석이 이미지는 blastulae 개발의 수술 융합에 사용되는 도구를 보여줍니다. 도구는 10 ㎖ 피펫 펌프 (녹색)과 연계하여 사용되는 변형 된 파스퇴르 피펫 (위)를 포함한다. 목재 괴롭히는 바늘 랩 필름 단부에 고정 니들 형 또는 플라스틱 겔 로딩 피펫 팁 또는 인출 유리 미세 주사로를 사용하는 처리. (B) 화상은 3 개의 유리 마이크로 인젝션 필요성의 단부를 도시다른 직경에서 집게로 세분화 된 레. 바늘은 마이크로 미터의 상단에 누워있다; 작은 선이 10 μm의 이격되어있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Blastulae 개발 2. 수술 퓨전 그림.
고배율 이미지는 종래 외과 스티치 (A)에 즉시 최소 상처 (B) 후에,보다 실질적인 상처 (C) 이후에 서로 마주 보는 그들의 동물 극 배향 개발 고단 두 제브라 피쉬 배아를 나타낸다. 20 분 후에는 배아 성공적 두 blastulae (D) 사이에서 세포의 중단 다리에 기초하여 융합 된 것을 알 수있다. 규모바는 250 μm의를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Parabiotic Zebrafish의 배아 그림 3. 개발.
(AC) 이미지는 (A) 부상 후 초기 개발의 전체 parabiont보기를 표시하고 배아 개발을 계속하고 이러한 이미지는 영화 1에 해당하는 (B 및 C) epiboly 받아야로 (D)의 이미지는 parabiotic 배아 쌍을 보여줍니다 36 HPF에서. 배아는 두 마음을 가지고 공통의 순환을 공유하고, 자신의 난황 주머니에 연결되어 있습니다. 스케일 바는 250 μm의를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
유전자 인코딩 된 형광 단백질과 4 떠올리 Parabiosis 그림.
(A) 이미지 (단독 형광, 오른쪽, 왼쪽 전송 된 빛 오버레이는) 48 HPF에서 결합 된 배아의 머리 영역을 보여줍니다. 이 쌍 바닥 배아는 LCR에 대한 형질 전환입니다 : (erythroctyes, 녹색) eGFP는 파트너 (상단) flk1에 대한 유전자 동안 : HRAS - mCherry, 혈관 내피 세포 (적색) 레이블. 녹색 적혈구 파트너 배아를 통해 순환을 알 수있다. 이 이미지는이 쌍의 왼쪽 배아는 HSP70 주입 된 영화 3 (B)에 해당 eGFP는이 하나의 세포 단계에서 구축 한 다음 취소 주입 파트너 (오른쪽)에 융합. 동물을 열 HPF (36)에서 30 분 동안 37 ℃에서 충격 때, GFP의 녹색 형광이 관찰되었다 르 60 HPF에서 피트 배아. 스케일 바는 500 μm의를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
영화 수술 융합 제브라 피쉬의 blastulae 1. 초기 개발. (오른쪽 다운로드 클릭).
영화는 수술 융합 제브라 피쉬 blastulae 한 쌍의 초기 개발을 보여줍니다. Epiboly 각 배아에서 동시에 발생 볼 수 있습니다. 이 영화는 3A-C도 관련이 있습니다.
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영화 2. 형광 덱스 트란 주입은 공유 순환을 조명한다. (오른쪽 다운로드 클릭).
영화는 형광 덱스 트란 60 HPF에서 parabiotic 배아 쌍의 일반 추기경 정맥에 주입되는 것을 보여줍니다. 형광 염료는 이후 두 배아를 통해 순환을 알 수있다.
붉은 혈관을 통해 흐르는 영화 3. 녹색 혈액.MOV "> (오른쪽 다운로드 클릭).
영화는 48 HPF에서 결합 된 배아의 머리 영역을 보여줍니다. 이 쌍 바닥 배아는 LCR에 대한 형질 전환입니다 : (erythroctyes, 녹색) eGFP는 파트너 (상단) flk1에 대한 유전자 동안 : HRAS - mCherry, 혈관 내피 세포 (적색) 레이블. 녹색 적혈구는 파트너 배아를 통해 순환 볼 수 있습니다. 이 영화는 4A 그림과 관련이있다.
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Discussion
Parabiotic 융합은 성인 쥐 모델과 병아리 배아 10-14에서 후보 유전자의 세포 기능을 조사하는 강력한 도구왔다. 더 최근, 포배 융합 방법 연결형 제브라 배아 15를 생성하기위한 설명되었다. 본 프로토콜에서는, 비디오 기반 자습서 보여 더 나은 조혈 개발에 대한 관심의 후보 유전자의 시간적 세포 고유하고, 세포 외부의 역할을 연구하기 위해 서로 다른 유전 적 배경 parabiotic 제브라 피쉬 배아를 만들기위한 방법을 설명하는 데 사용되는 이후.
이 논문에 기술 된 방법은 최근 서로 다른 유전 적 배경의 배아, 이후 생착 및 분화 16, 하나의 배아 혈액 순환을 통해 마이그레이션을 HSC의 출현을 추적하는 데 사용되었다. Kissa 그룹의 조사 결과, 준비 및 배아의 위치와 일치 성공률을 결정하기 위해 발견그리고 parabiotic 융합의 해부학 적 특성. 프로토콜에 대한 몇 가지 주요 변경으로 parabionts은 상당히 높은 생존율을 생성 하였다. 부상 후 3 초 후 필요한 경우 추가 상처와 초기 연결을 강화하기 위해 15 분 후 포배 쌍을 재 방문 - 이들은 더 큰 정도에 blastulae 부상이 장소에 바늘을 들고 있습니다. 이러한 추가 권장 사항으로, parabionts의 거의 100 %가 생존 및 장착 된 남아, 그 중 75 %는 공통의 순환을 공유했습니다.
방법과 실험 제어의 추가 요소를 통합하려면 parabiotic 배아는 parabiotic 컨텍스트 (20) 내에서 유전자 발현의 시간적 제어를 허용, 충격을 가열하는 관대 여기를 입증하고 있습니다. 이 기술의 한계는 어떤 경우에 parabiotic 파트너 배아 parabiotic 융합 후 동일 평면에 있지 않은 점이다. 이 수어렵게 동시에 시간 경과 현미경을 사용하여 모두 배아에서 세포를 추적하는 아가로 오스 LMP에서 배아를 탑재 할 수 있습니다. 이러한 잠재적 인 문제를 회피하기 위해, 하나는 원하는 방향이 달성 될 수 있도록 여러 parabiotic 배아를 생성하기 위해 계획해야합니다. 또한, 배아는 다른 관점에서 영상 마운트 재 미세 집게와 파스퇴르 피펫과를 사용하여 LMP에서 복구 할 수 있습니다. 이 프로토콜의 목표는 parabiotic 제브라 피쉬 배아를 생성하기 위해 blastulae 개발의 퓨즈 외과 적 방법에 대한 비디오 기반 자습서를 동반 명확하고 간결한 명령 세트를 제공하는 것이 었습니다.
증가 parabiont 생존의 키 변경 및 추가 권장 사항으로,이 프로토콜은 희망 조직 및 세포 상황의 범위에서 세포 이동, 운명 사양 및 분화를 조절하는 요인을 조사하기 위해 결합 된 배아를 이용하고자하는 연구자 권한을 부여합니다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Methyl cellulose | Sigma | M0387 | |
| Individual components for E3/HCR: | For 1L: 14,61g NaCl, 0,63g KCl, 2,43g CaCl2-2H2O, 1,99g MgSO4 | ||
| NaCl (Sodium chloride) | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| KCl (Potassium chloride) | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| CaCl2 (Calcium chloride dihydrate) | Sigma-Aldrich | 223506 | |
| MgSO4 (Magnessium sulfate heptahydrate) | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Hepes (1M ) buffer solution | ThermoFisher | 15630-080 | |
| Name | Company | Catalog Number | |
| Antibiotics: | |||
| Pen/Strep | gibco by Life technologies | 15140-120 | |
| Ampicilin sodium salt | Sigma Life Science | A0166 | |
| Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus | Sigma Life Science | K1377 | |
| Name | Company | Catalog Number | |
| 50 mg/ml Pronase from Streptomyces griseus | Roche | 11459643001 | |
| capillary glass used for needles (Capillary Glass & Filaments) | Sutter Instrument | ITEM#: BF 100-50-10 | |
| Teasing needles with wooden handles | Fisher Scientific | S07894 | |
| Glass Pasteur pipettes | Fisherbrand | 13-678-20A | |
| 10 ml pipette pump (green) (Pipette Pump Pipettor) | Novatech International | F37898-0000 | |
| 100 mm diameter/ 20 mm deep plastic petri dishes (PETRI DISH, 100/20 MM, PS, CLEAR, WITH VENTS, HEAVY DESIGN, 15 PCS./BAG ) |
Greiner Bio-one | 664102 | |
| Dextran, Cascade Blue, 10,000 MW, Anionic, Lysine Fixable | ThermoFisher | D-1976 | |
| PTU. working stock is 0.003% (50x is 0.15%). for 500 ml, 0.75 g N-Phenylthiourea | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| Tricaine (powder) (Tricaine Methanesulfonato, Tricaine-S) | Western Chemical Inc | MS 222 | |
| LMP agarose (Ultrapure LMP agarose) | Invitrogen | 16520100 | |
| plastic transfer pipette (just the wide ended one I think) | Fisherbrand | 137115AM | |
| Glass-bottom 6-well plates used for imaging | MatTek | P06G1.5-20-F | |
| plastic western gel loading tip fixed on the end of a wood-handled dissecting needle (GELoader tips) | Eppendorf | 22351656 | |
| glass cover slips, slides and vacuum grease if mounting for an upright microscope: | |||
| Vaccum grease ( Dow Corning® high-vacuum silicone grease colorless, weight 5.3 oz (tube) ) |
Dow Corning | Z273554 | |
| Glass cover slips | Corning Life Sciences | 2960-244 |
References
- Zon, L. I., Orkin, S. H. Hematopoiesis: An evolving paradigm for stem cell biology. Cell. 132 (4), 631-644 (2008).
- Dzierzak, E., Speck, N. A. Of lineage and legacy: the development of mammalian hematopoietic stem cells. Nat Immunol. 9 (2), 129-136 (2008).
- Li, P., et al. Epoxyeicosatrienoic acids enhance embryonic haematopoiesis and adult marrow engraftment. Nature. 523 (7561), 468-471 (2015).
- Tam, P. P., Rossant, J. Mouse embryonic chimeras: tools for studying mammalian development. Development. 130 (25), 6155-6163 (2003).
- Tanaka, M., Gertsenstein, M., Rossant, J., Nagy, A. Mash2 acts cell autonomously in mouse spongiotrophoblast development. Dev. Biol. 190 (1), 55-65 (1997).
- Morin-Kensicki, E. M., Faust, C., LaMantia, C., Magnuson, T. Cell and tissue requirements for the gene eed during mouse gastrulation and organogenesis. Genesis. 31 (4), 142-146 (2001).
- Ho, R. K., Kane, D. A. Cell-autonomous action of zebrafish spt-1 mutation in specific mesodermal precursors. Nature. 348 (6303), 728-730 (1999).
- Parker, L., Stainier, D. Y. Cell-autonomous and non-autonomous requirements for the zebrafish gene cloche in hematopoiesis. Development. 126 (12), 2643-2651 (1999).
- Liao, E. C., Trede, N. S., Ransom, D., Zapata, A., Kieran, M., Zon, L. I. Non-cell autonomous requirement for the bloodless gene in primitive hematopoiesis of zebrafish. Development. 3 (3), 649-659 (2002).
- Kamran, P., Sereti, K. I., Zhao, P., Ali, S. R., Weissman, I. L., Ardehali, R. Parabiosis in mice: a detailed protocol. J Vis Exp. (80), (2013).
- Wagers, A. J., Sherwood, R. I., Christensen, J. L., Weissman, I. L. Little evidence for developmental plasticity of adult hematopoietic stem cells. Science. 297 (5590), 2256-2259 (2002).
- Hervey, G. R. The effects of lesions in the hypothalamus in parabiotic rats. J. Physiol. 145 (2), 336-352 (1959).
- Goldman, D. C., Bailey, A. S., Pfaffle, D. L., Al Masri, A., Christian, J. L., Fleming, W. H. BMP4 regulates the hematopoietic stem cell niche. Blood. 114 (20), 4393-4401 (2009).
- Dieterlen-Lièvre, F., Martin, C., Beaupain, D. Quail-chick chimaeras and parabionts: several new models to investigate early developmental events in the haemopoietic system. Folia Biol (Praha). 25 (5), 293-295 (1979).
- Demy, D. L., Ranta, Z., Giorgi, J. M., Gonzalez, M., Herbomel, P., Kissa, K. Generating parabiotic zebrafish embryos for cell migration and homing studies). Nat. Methods. 10 (3), 256-258 (2013).
- Anderson, H., et al. Hematopoietic stem cells develop the absence of endothelial cadherin 5 expression. Blood. 126 (26), 2811-2820 (2015).
- Murayama, E., Sarris, M., Redd, M., Le Guyader, D., Vivier, C., Horsley, W., Trede, N., Herbomel, P. NACA deficiency reveals the crucial role of somite-derived stromal cells in haematopoietic niche formation. Nat Commun. 28 (6), 8375 (2015).
- Shah, D. I., et al. Mitochondrial Atpif1 regulates haem synthesis in developing erythroblasts. Nature. 491 (7425), 608-612 (2012).
- Tamplin, O. J., et al. Hematopoietic stem cell arrival triggers dynamic remodeling of the perivascular niche. Cell. 160 (1-2), 241-252 (2015).
- Adám, A., Bártfai, R., Lele, Z., Krone, P. H., Orbán, L. Heat-inducible expression of a reporter gene detected by transient assay in zebrafish. Exp. Cell Res. 256 (1), 282-290 (2000).
