Abstract
Kirurgisk parabiosis af to dyr af forskellige genetiske baggrunde skaber en unik scenario at studere celle-iboende versus celle-ydre roller for kandidatgener af interesse, migrerende adfærd af celler, og udskilles signaler i forskellige genetiske indstillinger. Fordi parabiotic dyr deler en fælles cirkulation, vil enhver blod eller blod-bårne faktor fra et dyr udveksles med sin partner og vice versa. Således kan celler og molekylære faktorer afledt fra en genetisk baggrund studeres i forbindelse med en anden genetisk baggrund. Parabiosis af voksne mus er blevet anvendt i vid udstrækning til forskning aldring, cancer, diabetes, fedme og hjernens udvikling. For nylig er parabiosis af zebrafisk embryoner blevet anvendt til at undersøge udviklingsmæssige biologi hæmatopoiese. I modsætning til mus, den åbne karakter zebrafisk embryoer tillader direkte visualisering af celler i parabiotic sammenhæng, gør det en enestående kraftfuld metode til undersøgelse fundamental cellulære og molekylære mekanismer. Anvendeligheden af denne teknik, er imidlertid begrænset ved en stejl indlæringskurve til frembringelse af parabiotic zebrafisk embryoner. Denne protokol giver en trin-for-trin metode til at kirurgisk sammensmelte blastulae af to zebrafisk embryoner af forskellige genetiske baggrunde for at undersøge den rolle, kandidatgener af interesse. Derudover parabiotic zebrafisk embryoner er tolerante over for varmechok, hvilket gør tidsmæssig kontrol af genekspression muligt. Denne metode kræver ikke en sofistikeret opsætning og har brede applikationer til at studere celle migration, skæbne specifikation, og differentiering in vivo under fosterudviklingen.
Introduction
Oprettelse af genetiske mosaikker (kimærer) mellem vildtype og genmodificerede dyr er en veletableret og klassisk strategi til undersøgelse celle-iboende versus celle-ydre funktioner kandidatgener 1-6. Blastula transplantation i zebrafisk er blevet bredt anvendt til at generere kimære embryoner til studier af celle-autonomi 7-9. Afhængigt af vævet af interesse, men det kan være en udfordring at forudsigeligt målrette donorceller til det ønskede væv (fx blod) 1-3, 7-9. Mus genetikere har længe udnyttet parabiotic kirurgiske metoder til at generere konjunktion organismer med en delt cirkulation 10-14. Fordi parabiotic dyr deler en fælles blodbanen, kan interaktioner mellem celler, der stammer fra et dyr med celler af den anden dyr af en anden genetisk baggrund studeres 10-16. For nylig, Karima Kissa gruppe elegant demonstreret evne til CREspiste konjunktion zebrafisk embryoner og derefter bruge dette system til at studere hæmatopoietisk stilk og progenitorcelle (HSPC) migration 15. Desuden blev zebrafisk parabiosis nylig anvendt til at undersøge rollen af endotel cadherin 5 i hæmatopoietisk stamcelle (HSC) fremkomsten og migration, 16 og til at undersøge den rolle, stromale celler i HSPC niche i zebrafisk udvikling 17.
I modsætning mus, zebrafisk embryoner er gennemsigtige og giver mulighed for direkte visualisering af celler under parabiotic udvikling, hvilket gør systemet entydigt kraftfuld. Nytten af parabiosis i zebrafisk, men er begrænset af en stejl indlæringskurve, og parabiotic kirurgi på de fine fostre kan være teknisk udfordrende uden detaljeret instruktion og visuel demonstration. Målet med denne protokol er at give et sæt klare, trin-for-trin instruktioner til at ledsage video-baserede tutorials om hvordan man kan generere parabiotic zebrafisk embryoner til at studeretemporal, celle-intrinsisk eller celle-extrinsisk funktioner af en kandidat-gen (er) ved kirurgisk fusion af udvikle blastulae. Vigtige ændringer og yderligere anbefalinger til at øge parabiont overlevelse og nye eksperimentelle applikationer er inkluderet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokol blev godkendt af Boston børnehospital Animal Care og brug Udvalg. Denne protokol er modificeret fra en tidligere offentliggjort metode 15.
1. Forberedelse af reagenser (dage eller uger i forvejen)
- Forbered 1,5% agarose-coatede skåle. Tilføj 1,5 g agarose til 100 ml zebrafisk E3-medium i en Erlenmeyerkolbe. Heat, opløse agarose, og derefter hælde ca. 5 ml i mm i diameter 100 x 20 mm dybe petriskåle.
Bemærk: Disse bruges til dechorionation af embryoner (Trin 3.1) og for den parabiotic kirurgi (Trin 3.3). Opbevar agarose-coatede skåle ved 4 ° C i nogle få uger; tage dem ud af køleskabet og opvarme til stuetemperatur morgenen dagen for parabiotic kirurgi. - Forbered 4% methylcellulose. Opløs 4 g methylcellulose pulver i 100 ml E3 i en Erlenmeyerkolbe med en omrører. Kolben anbringes på en røre plade ved 4 ° C, indstillet på laveste hastighed, og lad det mixi op til 2 dage.
- Intermitterende brug en spatel til at bryde op hvide klumper af methylcellulose. De methylcellulose krystaller ikke opløses fuldstændigt ved denne koncentration. Når opløsningen bliver klar og fremstår homogent med ingen hvide klumper tilbage, alikvot af opløsningen i 1,5 ml mikrocentrifugerør og fryses ved -20 ° C til langtidsopbevaring.
Bemærk: kan bruges Lavere koncentrationer af methylcellulose; men dette højere procentdel, har mere viskøse methylcellulose gav de bedste resultater.
- Intermitterende brug en spatel til at bryde op hvide klumper af methylcellulose. De methylcellulose krystaller ikke opløses fuldstændigt ved denne koncentration. Når opløsningen bliver klar og fremstår homogent med ingen hvide klumper tilbage, alikvot af opløsningen i 1,5 ml mikrocentrifugerør og fryses ved -20 ° C til langtidsopbevaring.
- Forbered High Calcium Ringer (UNHCR) løsning. For at gøre 400 ml HCR opløsning, blandes 8 ml 5M NaCl (116 mM endelig), 400 pi 3M KCl (2,9 mM endelig), 800 pi 5 M CaCl2 (10 mM endelig) og 2 ml 1 M HEPES (5 mM endelig) med 390 ml E3 medier.
Bemærk: Opbevar HCR løsning ved 4 ° C i et par uger; opvarme til stuetemperatur morgenen dagen for parabiotic kirurgi. - Forbered 5 - 6 modificeret Pasteur-pipetter til overførselring blastulaen par. Kort fortalt opvarme enden af pipetten over en bunsenbrænder. Derefter bruger store pincet, bukke enden af pipetten til ca. 45 ° C, medens den stadig er varm.
- At der ikke er skarpe kanter, som kan beskadige embryoner, holder spidsen af pipetten kortvarigt i flammen for omkring 3 sek. Dette vil udjævne / polish enden af pipetten. Denne modificerede glas Pasteur-pipette anvendes sammen med en 10 ml pipette pumpe (figur 1) i trin 3.5.
- Forbered glas nål værktøjer til kirurgisk syning af blastula par. Træk 2 - 3 glas nåle som på mikroinjektion af zebrafisk embryoner. Brug lab-filmen at fastsætte hvert glas nål til enden af en træ- eller plast-håndteret drilleri nål (figur 1A). Med pincet, brække enden af nålen ved en diameter på ca. 20 - 30 um. Brug en fasemikrometer at lede dette trin (figur 1B).
Bemærk: Størrelsen af neEdle tip er vigtigt. Hvis spidsen er for stor, bliver det vanskeligt at kontrollere præcist og kan forårsage stor skade. Hvis spidsen er for lille, er det vanskeligt at tilstrækkeligt viklet embryonerne.
2. Opsætning ynglepar af zebrafisk og opsamling af embryoner (dag -1 til dag 0)
- Opsæt ynglende par af voksne zebrafisk. Opsætning fisk natten før parabiosis kirurgi skal gennemføres. Brug dividers at adskille hanner og hunner. For at øge chancerne for, at de ønskede embryoner vil blive opnået, oprette flere par hver linje. Vi finder, at typisk 20 - 50% af parrene vil gyde.
- Den næste morgen, trække dividers og tillade parring. Saml alle embryoner ved hjælp af en finmasket tesi og derefter overføre dem til en petriskål indeholdende E3 embryo medium 18.
- Micro-injicere embryoner som ønsket (f.eks med 25 pg plasmid-DNA, 200 pg mRNA, eller med 1 - 6 ud ng morpholino) inden for 1 time for indsamlingen. Lad demvokse, indtil 256-celle stadiet. Hvis DNA ekspressionskonstruktionen er placeret under kontrol af en varmeshockpromotor (f.eks hsp70, figur 4B), styre tidspunktet for genekspression ved hjælp af varme chokerende parabionts ved 37 ° C på et senere tidspunkt (f.eks., Ved 36 HPF ).
Bemærk: Som et alternativ til en fluorescerende transgen, kan fluorescerende dextran tilsættes til DNA, RNA eller morpholino injektion mix (f.eks dextran, kaskade blå ved 2 mg / ml). Den dextran farvestof vil ikke forstyrre normal udvikling og vil give mulighed for den injicerede embryo kan identificeres under den relevante fluorescerende lys efter parabiotic fusion. Alternativt kunne parabiosis af en pigmenteret stamme (f.eks AB) med en ikke-pigmenteret stamme (f.eks Casper) anvendes til at identificere den injicerede embryon på senere trin. - Inkuberes embryoner ved 28,5 ° C.Use en Stereoskopet til at overvåge deres udvikling periodisk, da de nær 256-celle developmental fase (ca. 2,5 HPF).
Bemærk: Hvis det er nødvendigt, skift embryoner til forskellige temperaturer for at sikre fase matchning mellem parabiotic partnere (f.eks morpholino-injicerede embryoner udvikler ofte langsommere end deres un-injicerede modstykker Shifting un-injicerede embryoner til RT, mens morpholino-injicerede embryoner er placeret. ved 28,5 ° C vil resultere i deres etaper der tilpasser efter et par timers udvikling).
3. Generation af Parabiotic zebrafisk embryoner ved Kirurgisk Fusion af Udvikling Blastulae
- Som embryonerne nærmer sig 256-celle stadie (ca. 2,5 HPF), overføre embryoner fra hver genetisk baggrund (dvs. genetisk mutant, transgene linjer og / eller genetisk manipulation) i separate agarose-coatede retter (f.eks, en parabol for morpholino- injicerede embryoner og en anden skål til kontrol embryoner). Alternativt overføre embryoner til at rense, scratch-fri glas bægre eller glas petriskåle.
Bemærk: Undgå at bruge ikke-coatede plast retter embryoner vil holde sig til plast og blive beskadiget, når ud af deres chorions. - Dekanteres E3 medier indtil lige nok væske er fortsat at dække embryoner (ca. 7 - 10 ml). Tilsæt 200 pi 50 mg / ml blanding af proteaser isoleret fra den ekstracellulære væske af Streptomyces griseus (proteaser). Swirl embryoner forsigtigt hvert par minutter.
- Når 50% af embryonerne er kommet ud af deres chorions, som typisk tager 5 - 10 minutter, skyl dem tre gange med en generøs mængde (ca. 15 - 20 ml) af frisk E3 embryo medium.
- Dechorionate eventuelle embryoner tilbage i deres chorions ved forsigtigt at trække dem op i det modificerede glas Pasteur pipette og derefter forsigtigt bortvejre dem. Når embryonerne er blevet dechorionated og vaskes, udskifte E3 medier med UNHCR løsning. Som et alternativ til proteaser, fjerne chorions manuelt med en fin pincet. Målet er at have 60-100 dechorionated embryoner til rådighed for hver eksperimentel tilstand.
Bemærk: Det er adskillige gange mere end i sidste ende vil blive brugt, men mange embryoner vil sandsynligvis blive beskadiget under håndtering eller operation for parabiosis. Når embryonerne dechorionated, holde dem under vand og ikke tillader dem at røre ved overfladen af vandet, da overfladespændingen vil få dem til at blive destrueret. Husk, at bruge en højere dosis af proteaser tillader embryoner til at komme ud af deres chorions hurtigere og på en mere synkroniseret måde. Når der anvendes en lavere dosis af proteaser, embryonerne tager længere tid at komme ud af deres chorions og gøre det på en mindre synkron måde, hvilket kan resultere i en del af embryonerne bliver beskadiget af langvarig udsættelse for proteaser.
- Dechorionate eventuelle embryoner tilbage i deres chorions ved forsigtigt at trække dem op i det modificerede glas Pasteur pipette og derefter forsigtigt bortvejre dem. Når embryonerne er blevet dechorionated og vaskes, udskifte E3 medier med UNHCR løsning. Som et alternativ til proteaser, fjerne chorions manuelt med en fin pincet. Målet er at have 60-100 dechorionated embryoner til rådighed for hver eksperimentel tilstand.
- Når 50% af embryonerne er kommet ud af deres chorions, som typisk tager 5 - 10 minutter, skyl dem tre gange med en generøs mængde (ca. 15 - 20 ml) af frisk E3 embryo medium.
- Optø den methylcellulose (lavet i trin 1.2 ovenfor) og centrifugeres i en bordplade centrifuge på max hastighed i 10 min til pelletering uopløste krystaller, som vil skade embryonerne eller brud deres æggeblommes.
- Efter centrifugering, skal du bruge klare øvre fraktion (ca. 75% af volumen). Overfør 1 - diameter dråber methylcellulose i en 1,5% agarose-coatet petriskål 1,5 cm. Sørge for at undgå udarbejdelse af alle af de pelleterede krystaller fra bunden af røret.
- Brug en markør til at forudbestemme stillingen af hver dråbe på undersiden af skålen. Placer 12 - 15 dråber (2 - 3 portioner 'værd) methyl cellulose pr 100 mm petri diameter fad. Forbered så mange plader som er nødvendige pr eksperiment.
Bemærk: Brug hver dråbe for fusion af en enkelt blastula par. Mærket udpeger placeringen af hver dråbe når medierne tilføjes-på hvilket tidspunkt dråberne bliver næsten usynlig.
- Der forberedes en 40 ml prøve af antibiotikum-suppleret HCR opløsning pr agarose-coatede skål fremstillet ovenfor i trin 3.3. Til hver 40 ml prøve af HCR tilføje penicillin-streptomycin ved 50 U / ml, ampicillin ved 50 U / ml og kanamycin ved 0,5 ug/ Ml.
- Når klar til at udføre blastula fusioner, omhyggeligt fylde hver af de skåle indeholdende Methylcellulose dråber med 40 ml af antibiotika-suppleret HCR opløsning. Hvis der tilsættes UNHCR løsning for hurtigt, kan det forstyrre dråberne.
- Fastgør den modificerede glas Pasteur-pipette (fremstillet i trin 1.4 ovenfor) til en 10 ml pipette pumpe. Under en Stereoskopet indsamle en dechorionated embryon fra hver baggrund (f.eks, en morpholino-injicerede embryon og én vildtype embryo).
- Før dispensering de to æg, bruge Pasteur pipette til at gøre en lille fordybning i midten af methylcellulose drop, derefter forsigtigt deponere begge embryoner i depression.
Bemærk: Under overførslen drejes Pasteur pipette lidt opad, således at embryonerne løse i bøjningen af Pasteur-pipette for at undgå deres får kontakt med overfladen af væsken i toppen eller bunden af pipetten (hvilket kan føre til theiR brud).
- Før dispensering de to æg, bruge Pasteur pipette til at gøre en lille fordybning i midten af methylcellulose drop, derefter forsigtigt deponere begge embryoner i depression.
- Umiddelbart efter deponering embryonerne i methylcellulose, brug en træ- eller plastik-håndteres drilleri nål med en gel-loading pipettespids på enden (figur 1A) til nøje genplacere embryonerne i methylcellulose således, at deres dyr poler er direkte rører hinanden.
- Udnyt blide fejende bevægelser gennem methylcellulose tæt på embryoner at flytte dem uden direkte at røre dem. Lad embryonerne sidde i 5 minutter, så methylcellulose vil slå sig ned i omkring dem. I løbet af denne tid, skal du lægge det næste par ind i en anden dråbe.
Bemærk: Undgå direkte kontakt med embryonerne og tage særlig pleje for ikke at berøre nogen del af blommesækken, som let vil briste.
- Udnyt blide fejende bevægelser gennem methylcellulose tæt på embryoner at flytte dem uden direkte at røre dem. Lad embryonerne sidde i 5 minutter, så methylcellulose vil slå sig ned i omkring dem. I løbet af denne tid, skal du lægge det næste par ind i en anden dråbe.
- Brug af glas nål værktøj, sår omhyggeligt hver embryo på deres berøringspunkt. Med en blid syning bevægelse kan celler fra den første embryo trækkes ind i det andet embryo og derefter tilbage igen.Ved slutningen af denne bevægelse, holde nålen på plads til 2 - 3 sek og derefter trække det væk meget langsomt.
Bemærk: Der er en periode på ca. 2 - 3 i s efter at embryonerne såret, hvor de to væv synes at være mere klæbemiddel og mere tilbøjelige til at vedhæfte til hinanden. mener derfor, vi at holde nålen på plads kortvarigt efter sårede hjælper med at holde de sårede væv af hver embryo i kontakt for den indledende periode umiddelbart efter såret. - Tillad disse embryoner til at sidde for 10 - 15 minutter ved stuetemperatur. I mellemtiden fortsætter med at sy nye par i andre dråber methylcellulose. Efter 10 - 15 min, vurdere, om det første par er forblevet bundet (figur 2A).
Bemærk: Hvis embryonerne længere fastgjort, gentag syning processen, så længe de embryoner er yngre end omkring 30% epiboly stadie. Typisk dette giver mulighed for op til tre forsøg på at sy embryoner sammen. Hvis embryonerne synes at have opretholdt en vedhæftet fil, men connection er ikke væsentlig, udføre yderligere syning på kanten af forbindelsen til styrke det. Undgå at ryste eller flytte retter i løbet af de parabiotic kirurgi og inkubationsperioder.
Bemærk: På trods af deres tidlige udviklingsfase og opfattet skrøbelighed, kan cellen masserne af embryonerne tolerere en væsentlig mængde manipulation (dvs. sårede og syning), og stadig udvikle sig normalt. Den æggeblomme, dog kan briste med kun den mindste berøring, dræbe fosteret. Når syning af de to blastulae med glas nål, ikke at komme i kontakt med grænsefladen mellem cellemasse og blommen i hvert foster. - Inkubér embryonerne O / N ved 28,5 ° C i samme fad og medier (ændrer ikke medierne). Ved den følgende morgen, vil fostrene har flyttet ud af de meste opløste methyl cellulose dråber. Fjern eventuelle embryoner, der ikke lykkedes smeltet. Dekanteres medierne og erstatte med en frisk 25 ml E3.
Bemærk: Hvis du arbejder med enpigmenteret stamme, tilsættes 500 pi 0,15% (50x) phenylthiourea (PTU) til en slutkoncentration på 0,003% for at blokere pigmentering. Embryoner skal forblive konstant i PTU at opretholde undertrykkelse af pigmentering.
4. Mikroskop Opsætning, Image Acquisition, behandling og analyse
- Forbered 0,8% lavt smeltepunkt (LMP) agarose: Tilføj 0,8 g LMP agarose til 100 ml E3 og varme, indtil fuldt opløst. Mens det er varmt, alikvot 1 ml LMP agarose i 1,5 ml mikrocentrifugerør i en 37 ° C varmeblok. LMP agarose forbliver smeltet ved 37 ° C. Tilsæt 40 pi 4 mg / ml (25x), pH 7,0 tricaine til hver 1 ml prøve af LMP agarose ved 37 ° C. Bemærk: Hvis du arbejder med en pigmenteret stamme, tilsættes 20 ul 0,15% (50x) PTU til hver 1 ml alikvot.
- Opbevar resterende LMP agarose i flere måneder i forseglede 50 ml rør ved 4 ° C.
- Bedøver parabiotic embryoner, der skal afbildes ved tilsætning af 1 ml 4 mg / ml (25x), pH 7,0 tricainetil 25 ml E3 at embryonerne allerede er i.
- Vend forsigtigt fadet, så embryoner vil samle i midten. Så ved hjælp af en bred spids plast overførsel pipette udarbejde embryoner i så lidt væske som muligt. Vend pipetten opret og forsigtigt hoppe embryoner, så de løse til bunden af pipetten.
- Med embryonerne i bunden af pipetten, overføre dem til en 1 ml prøve af LMP agarose ved let berøring af pipettespidsen til overfladen af agarosen. Undgå at overføre overskydende væske, da dette vil udvande agarose.
- Efter udvisningen den overskydende væske fra pipetten, bruge pipetten til forsigtigt blande embryoner i agarose og derefter bruge pipette til at overføre alle de agarose og embryoner til brønden af en glas-bund (nr 1,5 dækglas), 6- brønds plade.
Bemærk: Sørg for at kassere pipetten efter overførsel af embryoner til imaging plate. Resterende agarose vil sætte ind i pipetten, rendering det ineffektivt til videre brug. Snarere, brug en ny pipette hver gang. - Under et stereoskop, bruge en gel-loading pipettespidsen fastgjort på enden af en træ-håndteret drilleri nål for at placere embryoner ned mod dækglasset (for at sikre at de er inden for arbejdsområdet afstand af mikroskopet mål) og i den ønskede orientering til billeddannelse.
Bemærk: Flyt kontinuerligt indtil agarosen er fuldt indstillet. Sørge for at montere parabiotic embryoner hvorefter embryo af parret skal afbildes. I betragtning af den tilfældige orientering af konjunktion embryoner, for nogle par kan det være vanskeligt at afbilde begge embryoner. I dette scenario inddrive de embryoner fra agarose bruger en pincet og en bred spids plast transfer pipette og derefter remount for billeddannelse fra et andet perspektiv. - Når agarosen er indstillet, dække med 2 - 3 ml E3 suppleret med tricaine (og PTU om nødvendigt).
- Billede embryoner bruger en omvendt wide-field epi-fluorescens, laser-scanning konfokal eller spinning disk konfokal mikroskop. Vælg den mest passende for den ønskede billedbehandling mål. For en hel-foster synsfelt, så brug en 4x mål. Vælg en højere forstørrelse, såsom en 20 x objektiv, at billedet et specifikt væv 16, 19.
Bemærk: Hvis du bruger en opretstående mikroskop, montere i LMP agarose (svarende til ovenfor) på et glas dækglas. Vend dækglas på et objektglas, der har en ring af vakuum fedt fyldt med samme E3-tricaine-PTU 16, 19. - Proces erhvervede billeder ved hjælp af gratis billede analyse softwarepakker såsom NIH billede J / FIJI 16, 19.
Bemærk: Tæl celle numre og kvantificere dynamik såsom celle migration og celledeling hjælp segmentering og sporing algoritmer 16, 19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I overensstemmelse med tidligere offentliggjorte undersøgelser 15, vellykket parabiotic fusion af zebrafisk embryoner afhænger af iscenesættelse og orientering af de to embryoner og koncentrationen af methylcellulose. Med blot et par enkle, billige værktøjer, kirurgisk smeltet udviklingslande blastulae blev genereret, der voksede i parabiotic embryoner med fælles cirkulation. Disse værktøjer omfattede en modificeret Pasteur pipette, en 10 ml pipette pumpe, og træ håndteres drilleri nåle, som blev anvendt enten alene eller med en gel-loading spids eller glas mikroinjektion nål fastgjort til enden af lab-filmen (figur 1).
Efter placering af de to blastulae i 4% methylcellulose og brug af gel-loading tip at orientere dem med deres dyr poler vender hinanden (figur 2A), blev embryonerne omhyggeligt sårede på deres berøringspunkt med glasset mikroinjektion nEedle (figur 2B). En større grad af sårdannelse (sammenlign figur 2B til figur 2C), og genoptagelse embryo-par for at styrke en første tilslutning med yderligere sårdannelse, øget sandsynligheden af embryonerne opretholde en forbindelse, der resulterede i vellykket fusion (figur 3A-C, Film 1) , og uden yderligere morfologiske defekter eller forsinket udvikling. Når du er færdig omhyggeligt, blev næsten 100% af foster par smeltet, selv om en brøkdel af disse embryoner (ca. 25%) aldrig etableret sundt kredsløb i begge halvlege. Ved at orientere de to blastulae med deres dyr poler direkte linie, blev pålidelige head-to-head eller blommesæk-til-blommesækken fusioner genereret med delt cirkulation. I de fleste tilfælde, embryonerne havde to hjerter pumpe en delt fælles cirkulation (figur 3D).
For at bekræfte, at embryonerne faktisk delt deres omsætning, fluorescerende dextran var injected i omløb, som kunne ses efterfølgende cirkulerer gennem begge embryoner (Movie 2). Derudover transgene embryoner, der havde GFP + erythrocytter (LCR: eGFP) blev fusioneret til embryoner, der havde mCherry + vaskulære endotelceller (Flk1: HRAS-mCherry). Ved 48 HPF blev GFP + erytrocytter observeret cirkulerer gennem Flk1: HRAS-mCherry partner embryo (figur 4A og Movie 3). At udvide anvendeligheden af parabiotic systemet blev tidsmæssig kontrol af genekspression tilsat. Før fusion, en af de to embryoer blev injiceret med en hsp70: eGFP DNA-konstruktion 20. Mens de fusionerede embryoner voksede ved 28,5 ° C, blev der ikke observeret fluorescens. I modsætning hertil efter en kort 30 minutters varmechok ved 37 ° C, et klart GFP signal var synligt i en af de to embryoner (figur 4B). I nogle tilfælde var GFP + -cellerobserveret cirkulerer i un-injicerede partner foster. Således placerer et gen af interesse under kontrol af en varmechokpromotor giver yderligere tidsmæssig styring til studier, der undersøger celle-intrinsisk eller celle-extrinsisk funktioner kandidatgener.
Figur 1. Værktøjer til Generering Parabiotic zebrafisk embryoner.
(A) kommenteret billede viser værktøjer, der anvendes til kirurgisk fusion af udviklingen blastulae. Værktøjer omfatter en modificeret Pasteur pipette (øverst), der anvendes sammen med en 10 ml pipette pumpe (grøn). Træ håndteres drilleri nåle anvendes enten alene eller med en plast gel-loading pipettespids eller trukket glas mikroinjektion syet fastgjort til enden med lab-filmen. (B) Billedet viser enderne af tre glas mikroinjektion behovles, som er blevet brudt med en pincet på forskellige diametre. Nålene er liggende oven på en mikrometer; de mindste linjer er fordelt 10 um fra hinanden. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Kirurgisk Fusion af Udvikling Blastulae.
Stor forstørrelse billeder viser to zebrafisk embryoner ved den høje udviklingsstade, orienteret med deres dyr poler vender mod hinanden, forud for kirurgisk hæftning (A), umiddelbart efter minimal sårdannelse (B), og efter mere omfattende sårdannelse (C). 20 min senere er det tydeligt, at embryonerne er blevet succesfuldt smeltet baseret på uafbrudt bro af celler mellem to blastulae (D). Scalesøjle repræsenterer 250 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Udvikling af Parabiotic zebrafisk embryoner.
(AC) Billederne viser en hel-parabiont visning af tidlig udvikling lige efter sårede (A) og som de embryoner fortsætte med at udvikle og gennemgå epiboly (B og C) Disse billeder svarer til Movie 1. (D) Billedet viser en parabiotic embryo par ved 36 HPF. Embryonerne forbundet ved deres blommesæk, har to hjerter og deler en fælles cirkulation. Scale søjler repræsenterer 250 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Visualisering Parabiosis med genetisk indkodede fluorescerende proteiner.
(A) Billeder (fluorescens alene, højre, overlay med transmitteret lys, venstre) viser hoved-regionen i konjunktion embryoner ved 48 HPF. Den nederste embryo af dette par er transgene for LCR: eGFP (erythroctyes, grøn) mens dens partner (øverst) er transgene for Flk1: HRAS-mCherry, hvilke etiketter vaskulære endotelceller (rød). Grønne erythrocytter kan ses cirkulerer gennem partner embryo. Dette billede svarer til Movie 3. (B) Den venstre embryo i dette par blev injiceret med en hsp70: eGFP konstruere på én-celle stadiet og derefter fusioneret til et ikke-injiceret partner (til højre). Når dyrene varmechok ved 37 ° C i 30 minutter ved 36 HPF, blev den grønne fluorescens af GFP observeret i le ft embryo på 60 HPF. Scale søjler repræsenterer 500 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Movie 1. Tidlig udvikling af kirurgisk smeltet zebrafisk blastulae. (Højreklik for at downloade).
Film viser den tidlige udvikling af et par kirurgisk smeltet zebrafisk blastulae. Epiboly kan ses forekommende samtidig i hvert foster. Denne film er relateret til figur 3A-C.
2.jpg "/>
Movie 2. Fluorescerende dextran injektion belyser et fælles cirkulation. (Højreklik for at downloade).
Film viser fluorescerende dextran injiceres i den fælles kardinal vene af en parabiotic embryo par ved 60 HPF. Det fluorescerende farvestof kan ses efterfølgende cirkulerer gennem begge embryoner.
Movie 3. Grøn blod strømmer gennem røde fartøjer.mov "> (Højreklik for at downloade).
Film viser hoved-regionen i konjunktion embryoner ved 48 HPF. Den nederste embryo af dette par er transgene for LCR: eGFP (erythroctyes, grøn) mens dens partner (øverst) er transgene for Flk1: HRAS-mCherry, hvilke etiketter vaskulære endotelceller (rød). Grønne erythrocytter ses cirkulerer gennem partner embryo. Denne film er relateret til figur 4A.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Parabiotic fusion har været et kraftfuldt værktøj til at undersøge cellulære funktioner af kandidatgener hos voksne murine modeller og kyllingeembryoer 10-14. For nylig er en blastula fusion fremgangsmåde blevet beskrevet til frembringelse konjunktion zebrafisk embryoner 15. I nærværende protokol, er video-baserede tutorials bruges til at demonstrere og bedre beskrivelse af den metode til at skabe parabiotic zebrafisk embryoner af forskellige genetiske baggrunde for at studere tidsmæssige, celle-iboende, og celle-ydre roller kandidatgener af interesse i hæmatopoietisk udvikling og videre.
Beskrevet i dette dokument metode blev for nylig anvendt til at spore HSC fremkomst i et embryon, migration via blod-cirkulation til et foster af forskellig genetisk baggrund, og efterfølgende inkorporering og differentiering 16. Efter aftale med Kissa gruppens resultater, iscenesættelse og embryo positionering viste sig at bestemme succesratenog anatomiske karakter af parabiotic fusion. Med et par vigtige ændringer af protokollen, blev parabionts genereret med en væsentlig højere overlevelsesrate. Disse omfatter såre blastulae i højere grad, at holde nålen på plads til 2 - 3 sek efter sårede, og derefter besøge igen blastula par efter 15 min at styrke en indledende forbindelse med yderligere såret, hvis det er nødvendigt. Med disse yderligere anbefalinger, næsten 100% af parabionts overlevede og forblev fastgjort, og 75% af dem delte en fælles cirkulation.
For at indarbejde et ekstra element i eksperimentel kontrol metoden, er parabiotic embryoner demonstreres her for at være tolerant over for varme chok, der giver mulighed for tidsmæssig styring af genekspression i parabiotic kontekst 20. En begrænsning ved denne teknik er, at parabiotic partner embryoner i nogle tilfælde ikke er i det samme plan efter parabiotic fusion. dette kangør det vanskeligt at montere embryoner i LMP agarose at spore celler i begge embryoner samtidig bruger time-lapse mikroskopi. For at omgå dette potentielt problem, bør man planlægger at generere flere parabiotic embryoner at sikre opnås den ønskede orientering. Alternativt kan fostre udvindes fra LMP ved hjælp af en fin pincet og Pasteur-pipette og re-monteret for billeddannelse fra et andet perspektiv. Målet med denne protokol var at give et sæt klare, præcise instruktioner for at ledsage video-baserede tutorials om hvordan man kirurgisk sikring udvikle blastulae at generere parabiotic zebrafisk embryoner.
Med de vigtigste ændringer og yderligere anbefalinger til at øge parabiont overlevelse, vil denne protokol forhåbentlig give efterforskere, der ønsker at udnytte konjunktion embryoner til at undersøge faktorer, der regulerer celle migration, skæbne specifikation, og differentiering i en række væv og cellulære sammenhænge.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Methyl cellulose | Sigma | M0387 | |
| Individual components for E3/HCR: | For 1L: 14,61g NaCl, 0,63g KCl, 2,43g CaCl2-2H2O, 1,99g MgSO4 | ||
| NaCl (Sodium chloride) | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| KCl (Potassium chloride) | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| CaCl2 (Calcium chloride dihydrate) | Sigma-Aldrich | 223506 | |
| MgSO4 (Magnessium sulfate heptahydrate) | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Hepes (1M ) buffer solution | ThermoFisher | 15630-080 | |
| Name | Company | Catalog Number | |
| Antibiotics: | |||
| Pen/Strep | gibco by Life technologies | 15140-120 | |
| Ampicilin sodium salt | Sigma Life Science | A0166 | |
| Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus | Sigma Life Science | K1377 | |
| Name | Company | Catalog Number | |
| 50 mg/ml Pronase from Streptomyces griseus | Roche | 11459643001 | |
| capillary glass used for needles (Capillary Glass & Filaments) | Sutter Instrument | ITEM#: BF 100-50-10 | |
| Teasing needles with wooden handles | Fisher Scientific | S07894 | |
| Glass Pasteur pipettes | Fisherbrand | 13-678-20A | |
| 10 ml pipette pump (green) (Pipette Pump Pipettor) | Novatech International | F37898-0000 | |
| 100 mm diameter/ 20 mm deep plastic petri dishes (PETRI DISH, 100/20 MM, PS, CLEAR, WITH VENTS, HEAVY DESIGN, 15 PCS./BAG ) |
Greiner Bio-one | 664102 | |
| Dextran, Cascade Blue, 10,000 MW, Anionic, Lysine Fixable | ThermoFisher | D-1976 | |
| PTU. working stock is 0.003% (50x is 0.15%). for 500 ml, 0.75 g N-Phenylthiourea | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| Tricaine (powder) (Tricaine Methanesulfonato, Tricaine-S) | Western Chemical Inc | MS 222 | |
| LMP agarose (Ultrapure LMP agarose) | Invitrogen | 16520100 | |
| plastic transfer pipette (just the wide ended one I think) | Fisherbrand | 137115AM | |
| Glass-bottom 6-well plates used for imaging | MatTek | P06G1.5-20-F | |
| plastic western gel loading tip fixed on the end of a wood-handled dissecting needle (GELoader tips) | Eppendorf | 22351656 | |
| glass cover slips, slides and vacuum grease if mounting for an upright microscope: | |||
| Vaccum grease ( Dow Corning® high-vacuum silicone grease colorless, weight 5.3 oz (tube) ) |
Dow Corning | Z273554 | |
| Glass cover slips | Corning Life Sciences | 2960-244 |
References
- Zon, L. I., Orkin, S. H. Hematopoiesis: An evolving paradigm for stem cell biology. Cell. 132 (4), 631-644 (2008).
- Dzierzak, E., Speck, N. A. Of lineage and legacy: the development of mammalian hematopoietic stem cells. Nat Immunol. 9 (2), 129-136 (2008).
- Li, P., et al. Epoxyeicosatrienoic acids enhance embryonic haematopoiesis and adult marrow engraftment. Nature. 523 (7561), 468-471 (2015).
- Tam, P. P., Rossant, J. Mouse embryonic chimeras: tools for studying mammalian development. Development. 130 (25), 6155-6163 (2003).
- Tanaka, M., Gertsenstein, M., Rossant, J., Nagy, A. Mash2 acts cell autonomously in mouse spongiotrophoblast development. Dev. Biol. 190 (1), 55-65 (1997).
- Morin-Kensicki, E. M., Faust, C., LaMantia, C., Magnuson, T. Cell and tissue requirements for the gene eed during mouse gastrulation and organogenesis. Genesis. 31 (4), 142-146 (2001).
- Ho, R. K., Kane, D. A. Cell-autonomous action of zebrafish spt-1 mutation in specific mesodermal precursors. Nature. 348 (6303), 728-730 (1999).
- Parker, L., Stainier, D. Y. Cell-autonomous and non-autonomous requirements for the zebrafish gene cloche in hematopoiesis. Development. 126 (12), 2643-2651 (1999).
- Liao, E. C., Trede, N. S., Ransom, D., Zapata, A., Kieran, M., Zon, L. I. Non-cell autonomous requirement for the bloodless gene in primitive hematopoiesis of zebrafish. Development. 3 (3), 649-659 (2002).
- Kamran, P., Sereti, K. I., Zhao, P., Ali, S. R., Weissman, I. L., Ardehali, R. Parabiosis in mice: a detailed protocol. J Vis Exp. (80), (2013).
- Wagers, A. J., Sherwood, R. I., Christensen, J. L., Weissman, I. L. Little evidence for developmental plasticity of adult hematopoietic stem cells. Science. 297 (5590), 2256-2259 (2002).
- Hervey, G. R. The effects of lesions in the hypothalamus in parabiotic rats. J. Physiol. 145 (2), 336-352 (1959).
- Goldman, D. C., Bailey, A. S., Pfaffle, D. L., Al Masri, A., Christian, J. L., Fleming, W. H. BMP4 regulates the hematopoietic stem cell niche. Blood. 114 (20), 4393-4401 (2009).
- Dieterlen-Lièvre, F., Martin, C., Beaupain, D. Quail-chick chimaeras and parabionts: several new models to investigate early developmental events in the haemopoietic system. Folia Biol (Praha). 25 (5), 293-295 (1979).
- Demy, D. L., Ranta, Z., Giorgi, J. M., Gonzalez, M., Herbomel, P., Kissa, K. Generating parabiotic zebrafish embryos for cell migration and homing studies). Nat. Methods. 10 (3), 256-258 (2013).
- Anderson, H., et al. Hematopoietic stem cells develop the absence of endothelial cadherin 5 expression. Blood. 126 (26), 2811-2820 (2015).
- Murayama, E., Sarris, M., Redd, M., Le Guyader, D., Vivier, C., Horsley, W., Trede, N., Herbomel, P. NACA deficiency reveals the crucial role of somite-derived stromal cells in haematopoietic niche formation. Nat Commun. 28 (6), 8375 (2015).
- Shah, D. I., et al. Mitochondrial Atpif1 regulates haem synthesis in developing erythroblasts. Nature. 491 (7425), 608-612 (2012).
- Tamplin, O. J., et al. Hematopoietic stem cell arrival triggers dynamic remodeling of the perivascular niche. Cell. 160 (1-2), 241-252 (2015).
- Adám, A., Bártfai, R., Lele, Z., Krone, P. H., Orbán, L. Heat-inducible expression of a reporter gene detected by transient assay in zebrafish. Exp. Cell Res. 256 (1), 282-290 (2000).
