Abstract
parabiosis chirurgica di due animali di differenti background genetico crea uno scenario unico per lo studio delle cellule-intrinseco rispetto a ruoli di cellule-estrinseca per geni candidati di interesse, i comportamenti migratori delle cellule, e segnali secreti in contesti genetici distinti. Perché gli animali parabiotic condividono una circolazione comune, il sangue o fattore ematica da un animale saranno scambiati con il suo partner e viceversa. Così, cellule e fattori molecolari derivate da uno sfondo genetico possono essere studiati nel contesto di una seconda background genetico. Parabiosis di topi adulti è stato ampiamente utilizzato per l'invecchiamento della ricerca, il cancro, il diabete, l'obesità, e lo sviluppo del cervello. Più di recente, parabiosis di embrioni di zebrafish è stato utilizzato per studiare la biologia dello sviluppo di emopoiesi. In contrasto con i topi, la natura trasparente di embrioni di zebrafish permette la visualizzazione diretta delle cellule nel contesto parabiotic, che lo rende un metodo unico potente per indagare fmeccanismi cellulari e molecolari FONDAMENTALI. L'utilità di questa tecnica, tuttavia, è limitata da una curva di apprendimento ripida per generare gli embrioni zebrafish parabiotic. Questo protocollo fornisce un metodo passo-passo su come fondere chirurgicamente la blastulae di due embrioni di zebrafish di diversi background genetici per studiare il ruolo dei geni candidati di interesse. Inoltre, gli embrioni di zebrafish parabiotic sono tolleranti a shock termico, rendendo il controllo temporale dell'espressione genica possibile. Questo metodo non richiede un sofisticato set-up e ha ampie applicazioni per lo studio migrazione delle cellule, specifica il destino, e la differenziazione in vivo durante lo sviluppo embrionale.
Introduction
La creazione di mosaici genetici (chimere) tra wild-type e animali geneticamente modificati è una strategia ben consolidata e classica per indagare cellule intrinseca contro le funzioni delle cellule-estrinseca di geni candidati 1-6. Blastula trapianto in zebrafish è stato ampiamente utilizzato per generare embrioni chimerici per gli studi di cellule-autonomia 7-9. A seconda del tessuto di interesse, tuttavia, può essere difficile per indirizzare prevedibile cellule del donatore al tessuto desiderato (ad esempio, sangue) 1-3, 7-9. Genetisti mouse hanno a lungo utilizzato metodi chirurgici parabiotic per generare organismi congiunti con una tiratura condiviso 10-14. Perché gli animali parabiotic condividono un flusso sanguigno comune, le interazioni tra le cellule che ha avuto origine da un animale con cellule del altro animale di un diverso background genetico possono essere studiati 10-16. Di recente, il gruppo di Karima Kissa elegantemente dimostrato la capacità di create embrioni di zebrafish siamesi e quindi utilizzare questo sistema per studiare staminali ematopoietiche e la migrazione 15 cellule progenitrici (HSPC). Inoltre, parabiosis zebrafish è stato recentemente utilizzato per studiare il ruolo della caderina endoteliali 5 di cellule staminali ematopoietiche (HSC) comparsa e la migrazione, e 16 per studiare il ruolo delle cellule stromali nella nicchia HSPC durante lo sviluppo zebrafish 17.
A differenza di topi, embrioni di zebrafish sono trasparenti e consentono la visualizzazione diretta delle cellule durante lo sviluppo parabiotic, rendendo il sistema unico potente. L'utilità di parabiosis in zebrafish, tuttavia, è limitato da una ripida curva di apprendimento, e la chirurgia parabiotic sugli embrioni delicati può essere tecnicamente impegnativo, senza istruzioni dettagliate e dimostrazione visiva. L'obiettivo di questo protocollo è quello di fornire una serie di chiare istruzioni passo-passo per accompagnare video tutorial basati su come generare embrioni di zebrafish parabiotic per lo studiotemporale, cellule intrinseca, o funzioni delle cellule-estrinseca di un gene candidato (s) dalla fusione chirurgica di sviluppare blastulae. modifiche chiave e ulteriori raccomandazioni per aumentare la sopravvivenza parabiont e nuove applicazioni sperimentali sono inclusi.
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Protocol
Questo protocollo è stato approvato dal Comitato di cura e l'uso di animali all'ospedale dei bambini Boston. Questo protocollo viene modificato da un metodo precedentemente pubblicato 15.
1. Preparazione dei reagenti (giorni o settimane in anticipo)
- Preparare piatti 1,5% agarosio rivestite. Aggiungere 1,5 g di agarosio a 100 ml di mezzo Zebrafish E3 in una beuta. Calore, sciogliere l'agarosio, e poi versare circa 5 ml in 100 mm di diametro x 20 mm piatti Petri di profondità.
Nota: Questi sono usati per dechorionation di embrioni (Passo 3.1) e per la chirurgia parabiotic (passo 3,3). Conservare piatti agarosio rivestite a 4 ° C per un paio di settimane; portarli fuori dal frigo e caldo al Rt la mattina del giorno dell'intervento parabiotic. - Preparare 4% metilcellulosa. Sciogliere 4 g di polvere di cellulosa di metile in 100 ml di E3 in una beuta con un ancoretta. Porre il pallone su un piatto mescolare a 4 ° C, impostare la velocità minima, e lasciate mescolareper un massimo di 2 giorni.
- Intermittenza usare una spatola per rompere grumi bianchi di metilcellulosa. I cristalli metil cellulosa non pienamente dissolvono a questa concentrazione. Quando la soluzione diventa chiara e appare omogeneo, senza grumi bianchi rimanente, un'aliquota la soluzione in provette da 1,5 ml microcentrifuga e congelare a -20 ° C per una conservazione a lungo termine.
Nota: Le concentrazioni più basse di metil cellulosa possono essere utilizzate; tuttavia, tale percentuale più elevata, più viscoso metilcellulosa ha dato i migliori risultati.
- Intermittenza usare una spatola per rompere grumi bianchi di metilcellulosa. I cristalli metil cellulosa non pienamente dissolvono a questa concentrazione. Quando la soluzione diventa chiara e appare omogeneo, senza grumi bianchi rimanente, un'aliquota la soluzione in provette da 1,5 ml microcentrifuga e congelare a -20 ° C per una conservazione a lungo termine.
- Preparare la soluzione High Calcium Ringer (HCR). Per fare 400 ml di soluzione di HCR, mescolare 8 ml di 5M NaCl (116 mm finale), 400 ml di 3M KCl (2,9 mm finale), 800 ml di 5M CaCl 2 (10 mM finali), e 2 ml di 1M HEPES (5 mM finale) con 390 ml di E3 media.
Nota: Conservare la soluzione HCR a 4 ° C per un paio di settimane; caldo a Rt la mattina del giorno dell'intervento parabiotic. - Preparare 5 - 6 pipette Pasteur modificati per il trasferimentoanello blastula coppie. Brevemente riscaldare l'estremità della pipetta su un becco Bunsen. Quindi, utilizzando grandi pinze, piegare l'estremità della pipetta a circa 45 ° C mentre è ancora caldo.
- Per garantire non ci sono spigoli vivi che potrebbero danneggiare gli embrioni, tenere la punta della pipetta brevemente la fiamma per circa 3 sec. Questo sarà liscia / polacco alla fine della pipetta. Questo pipetta Pasteur di vetro modificato viene utilizzato in combinazione con una pompa pipetta 10 ml (Figura 1) al punto 3.5.
- Preparare strumenti ago di vetro per la cucitura chirurgica di coppie blastula. Pull 2 - 3 aghi di vetro, come fatto per la microiniezione di embrioni di zebrafish. Utilizzare lab-pellicola per fissare ciascun ago di vetro al fine di un ago eccitante legna o plastica manico (Figura 1A). Utilizzando pinze, rompere l'estremità dell'ago a un diametro di circa 20 - 30 micron. Utilizzare un micrometro per guidare questo passaggio (Figura 1B).
Nota: La dimensione del NEpunta edle è importante. Se la punta è troppo grande diventa difficile controllare con precisione e può causare danni eccessivi. Se la punta è troppo piccola, è difficile sufficientemente ferire gli embrioni.
2. Impostazione coppie nidificanti di Zebrafish e raccolta di embrioni (Giorno -1 al giorno 0)
- Impostare coppie nidificanti di zebrafish adulto. Impostare il pesce la sera prima della chirurgia parabiosis deve essere effettuata. Utilizzare divisori per separare maschi e femmine. Per aumentare le probabilità che gli embrioni desiderati saranno ottenuti, impostare diverse coppie di ogni linea. Troviamo che in genere 20 - 50% delle coppie si riproducono.
- La mattina seguente, tirare i divisori e consentire l'accoppiamento. Raccogliere eventuali embrioni usando una a maglia fine colino da tè, poi trasferirli in una capsula di Petri contenente E3 medio embrione 18.
- Embrioni Micro-iniettare come desiderato (ad esempio, con 25 pg di DNA plasmidico, 200 pg mRNA, o: 1 - 6 ng morfolino) entro 1 ora di raccolta. permettere loro dicrescere fino a quando fase a 256 cellule. Se il costrutto di espressione del DNA è posto sotto il controllo di un promotore shock termico (ad esempio, hsp70, Figura 4B), controllano la tempistica di espressione genica dal calore shocking le parabionts a 37 ° C in una fase successiva (ad es., A 36 HPF ).
Nota: In alternativa ad un transgene fluorescente, destrano fluorescente può essere aggiunto al DNA, RNA, o mix iniezione morfolino (ad esempio, destrano, blu cascata a 2 mg / ml). Il colorante destrano non interferirà con il normale sviluppo e consentirà per l'embrione iniettato da identificare sotto la luce fluorescente appropriato dopo la fusione parabiotic. In alternativa, il parabiosis di un ceppo pigmentata (ad esempio, AB) con un ceppo non pigmentato (ad esempio, Casper) potrebbe essere utilizzato per identificare l'embrione iniettato in fasi successive. - Incubare gli embrioni a 28,5 ° C.Use uno stereoscopio per monitorare il loro sviluppo periodicamente in quanto nei pressi del dev-256 cellulefase elopmental (circa 2,5 HPF).
Nota: Se necessario, spostare gli embrioni a temperature diverse per garantire la corrispondenza fase tra i partner parabiotic (ad esempio, gli embrioni morpholino-iniettato spesso sviluppano più lentamente rispetto alle loro controparti non-iniettato Spostando gli embrioni non-iniettata per RT, mentre gli embrioni morpholino-iniettata sono collocati. a 28,5 ° C si tradurrà in loro fasi allineamento dopo un paio d'ore di sviluppo).
3. Generazione di Parabiotic embrioni di zebrafish da fusione chirurgica di Sviluppo Blastulae
- Come gli embrioni si avvicinano alla fase 256 celle (circa 2,5 HPF), di trasferire gli embrioni da ogni background genetico (cioè, mutante genetico, linee transgeniche e / o manipolazione genetica) in piatti agarosio rivestite separate (per esempio, un piatto per morpholino- embrioni iniettati e un secondo piatto per gli embrioni di controllo). In alternativa, il trasferimento degli embrioni per la pulizia, bicchieri di vetro senza graffio o vetro piastre di Petri.
Nota: evitare di utilizzare piatti di plastica non rivestite come gli embrioni che si attacchi alla plastica ed essere danneggiata una volta fuori dalle loro chorions. - Decantare il supporto E3 fino a poco abbastanza liquido rimane per coprire gli embrioni (circa 7 - 10 ml). Aggiungere 200 ml di 50 mg / ml della miscela di proteasi isolato dal liquido extracellulare di Streptomyces griseus (proteasi). Agitare delicatamente gli embrioni ogni paio di minuti.
- Quando il 50% degli embrioni sono usciti loro chorions, che prende tipicamente 5 - 10 min, risciacquarli tre volte con un volume generoso (circa 15 - 20 ml) di mezzo di E3 embrione fresco.
- Dechorionate eventuali embrioni rimasti nelle loro chorions trascinandoli delicatamente nella pipetta Pasteur di vetro modificato e poi delicatamente dissipare. Una volta che gli embrioni sono stati dechorionated e lavato, sostituire il supporto E3 con soluzione HCR. In alternativa alla proteasi, rimuovere le chorions manualmente utilizzando una pinza sottile. Obiettivo di avere 60 - 100 dechorembrioni ionated disponibili per ogni condizione sperimentale.
Nota: Questo è molte volte più che in ultima analisi, essere usato, ma molti embrioni sono suscettibili di essere danneggiate durante la movimentazione o l'intervento chirurgico per parabiosis. Una volta che gli embrioni sono dechorionated, tenerli sommerse e non permettere loro di toccare la superficie dell'acqua, come la tensione superficiale causerà loro di essere distrutti. Tenete a mente che l'utilizzo di una dose maggiore di proteasi permette embrioni a venire fuori dalle loro chorions più presto e in modo più sincronizzato. Quando si utilizza una dose minore di proteasi, gli embrioni richiedono più tempo per uscire dalla loro chorions e fanno in modo sincrono meno, che può risultare in una porzione degli embrioni essere danneggiato da una prolungata esposizione alle proteasi.
- Dechorionate eventuali embrioni rimasti nelle loro chorions trascinandoli delicatamente nella pipetta Pasteur di vetro modificato e poi delicatamente dissipare. Una volta che gli embrioni sono stati dechorionated e lavato, sostituire il supporto E3 con soluzione HCR. In alternativa alla proteasi, rimuovere le chorions manualmente utilizzando una pinza sottile. Obiettivo di avere 60 - 100 dechorembrioni ionated disponibili per ogni condizione sperimentale.
- Quando il 50% degli embrioni sono usciti loro chorions, che prende tipicamente 5 - 10 min, risciacquarli tre volte con un volume generoso (circa 15 - 20 ml) di mezzo di E3 embrione fresco.
- Scongelare la metilcellulosa (fatta al precedente punto 1.2) e centrifugare in una centrifuga da tavolo sulla velocità massima per 10 minuti per far sedimentare cristalli insoluti, che danneggiano gli embrioni o rompersi il tuorloS.
- Dopo centrifugazione, utilizzare la frazione superiore chiaro (circa il 75% del volume). Trasferimento 1-1,5 cm gocce del diametro di metilcellulosa in una capsula di Petri 1,5% agarosio rivestite. Fare attenzione ad evitare stesura qualsiasi cristalli pellettati dal fondo della provetta.
- Utilizzare un marcatore per predeterminare la posizione di ogni gocciolina sul lato inferiore del piatto. Mettere 12 - 15 gocce (2 - del valore di 3 aliquote ') di metilcellulosa ogni 100 mm di diametro piatto di Petri. Preparare come molti piatti come necessario per esperimento.
Nota: utilizzare ogni goccia per la fusione di una singola coppia blastula. Il marchio designa la posizione di ogni goccia una volta che si aggiunge-in media che punto le gocce diventano quasi invisibili.
- Preparare un 40 ml un'aliquota di soluzione HCR antibiotico-integrato per ogni piatto agarosio rivestite preparata sopra al punto 3.3. Per ogni 40 ml aliquota di HCR aggiungere penicillina-streptomicina a 50 U / ml, ampicillina a 50 U / ml, e kanamicina a 0.5 mg/ Ml.
- Quando si è pronti per eseguire blastula fusioni, riempire con cura ciascuno dei piatti contenenti goccioline metilcellulosa con 40 ml di soluzione HCR antibiotico-integrato. Se viene aggiunto troppo rapidamente la soluzione HCR, può disturbare le goccioline.
- Fissare la pipetta Pasteur di vetro modificata (fatta al precedente punto 1.4) ad una pompa pipetta 10 ml. Sotto uno stereoscopio raccogliere un embrione dechorionated da ogni background (ad esempio, un embrione morfolino-iniettata e una wild-type embrione).
- Prima di erogare i due embrioni, utilizzare la pipetta Pasteur di fare una piccola depressione nel mezzo della goccia metil cellulosa, poi delicatamente depositare due embrioni nella depressione.
Nota: Durante il processo di trasferimento, ruotare la pipetta Pasteur leggermente verso l'alto in modo che gli embrioni stabilirsi nella curva della pipetta Pasteur in modo da evitare il contatto making con la superficie del liquido nella parte superiore o inferiore della pipetta (che può portare a theiR rottura).
- Prima di erogare i due embrioni, utilizzare la pipetta Pasteur di fare una piccola depressione nel mezzo della goccia metil cellulosa, poi delicatamente depositare due embrioni nella depressione.
- Subito dopo aver depositato gli embrioni in metilcellulosa, utilizzare un ago eccitante legna o plastica manico con puntali gel di caricamento sulla estremità (Figura 1A) per riposizionare accuratamente gli embrioni all'interno della metilcellulosa tale che i loro poli animali sono direttamente toccarsi.
- Utilizzare delicati movimenti radicali attraverso il metil cellulosa vicino agli embrioni per riposizionare loro senza toccarli direttamente. Lasciate che gli embrioni riposare per 5 minuti in modo che il metil cellulosa si assesterà intorno a loro. Durante questo tempo, caricare la coppia successiva in un'altra goccia.
Nota: evitare il contatto diretto con gli embrioni e prestare particolare attenzione a non toccare alcuna parte del sacco vitellino, che sarà facilmente rompersi.
- Utilizzare delicati movimenti radicali attraverso il metil cellulosa vicino agli embrioni per riposizionare loro senza toccarli direttamente. Lasciate che gli embrioni riposare per 5 minuti in modo che il metil cellulosa si assesterà intorno a loro. Durante questo tempo, caricare la coppia successiva in un'altra goccia.
- Utilizzando lo strumento ago di vetro, accuratamente avvolto ogni embrione al loro punto di contatto. Con un movimento di cucitura dolce, le cellule del primo embrione può essere tirato nel secondo embrione e poi di nuovo indietro.Al termine di questo movimento, tenere l'ago in posizione per 2 - 3 secondi e quindi trascinare via molto lentamente.
Nota: Vi è un periodo di circa 2 - 3 secondi dopo che gli embrioni sono feriti dove i due tessuti sembrano essere più adesivo e più probabile per collegare l'uno all'altro. Così, noi crediamo che tenere l'ago in posizione brevemente dopo il ferimento aiuta a mantenere i tessuti feriti di ogni embrione in contatto per il periodo iniziale di tempo subito dopo il ferimento. - Lasciare questi embrioni di sedersi per 10 - 15 minuti a temperatura ambiente. Nel frattempo, continuare a punto nuove coppie in altre gocce di metilcellulosa. Dopo 10 - 15 minuti, valutare se la prima coppia è rimasta attaccata (Figura 2A).
Nota: Se gli embrioni sono più collegati, ripetere il processo di cucitura finché gli embrioni sono più giovani attorno al palco epiboly 30%. In genere questo permette fino a tre tentativi di cucire gli embrioni insieme. Se gli embrioni sembrano aver mantenuto un allegato ma il connection non è sostanziale, eseguire ulteriori cuciture sul bordo della connessione per rinforzarlo. Evitare di scuotere o spostare i piatti durante i periodi di chirurgia e di incubazione parabiotic.
Nota: Nonostante la loro fase iniziale di sviluppo e fragilità percepita, le masse cellulari dei embrioni possono tollerare una notevole quantità di manipolazione (cioè, ferendo e cuciture), e ancora svilupparsi normalmente. Il tuorlo, tuttavia, può rompersi con solo il minimo tocco, uccidendo l'embrione. Quando le due cuciture blastulae con l'ago di vetro, non di entrare in contatto con l'interfaccia tra la massa cellulare e tuorlo di ogni embrione. - Incubare gli embrioni O / N a 28,5 ° C nello stesso piatto e dei media (non modificare la media). Il mattino seguente, gli embrioni sono spostati fuori delle goccioline metil cellulosa prevalentemente disciolti. Rimuovere eventuali embrioni che non sono stati fusi con successo. Decantare i media e sostituirlo con un nuovo 25 ml E3.
Nota: Se si lavora con unceppo pigmentata, aggiungere 500 microlitri phenylthiourea 0,15% (50x) (PTU) ad una concentrazione finale di 0,003% per bloccare la pigmentazione. Gli embrioni dovranno restare costantemente in PTU per mantenere la soppressione di pigmentazione.
4. Configurazione Microscopio, Immagine acquisizione, elaborazione e analisi
- Preparare 0,8% agarosio a basso punto di fusione (LMP): Aggiungere 0,8 g LMP agarosio a 100 ml E3 e di calore fino a completo scioglimento. Mentre caldo, aliquota 1 ml di LMP agarosio in provette da 1,5 ml microcentrifuga in C blocco riscaldante 37 °. L'agarosio LMP rimarrà fuso a 37 ° C. Aggiungere 40 ml di 4 mg / ml (25x), pH 7,0 tricaine ad ogni 1 ml aliquota di LMP agarosio a 37 ° C. Nota: Se si lavora con un ceppo pigmentata, aggiungere 20 ml di 0,15% (50x) PTU per ogni aliquota 1 ml.
- Conservare il restante LMP agarosio per diversi mesi in sigillati provette da 50 ml a 4 ° C.
- Anestetizzare gli embrioni parabiotic per essere ripreso con l'aggiunta di 1 ml di 4 mg / ml (25x), pH 7,0 tricaineai 25 ml di E3 che gli embrioni sono già in.
- Agitare delicatamente il piatto in modo che gli embrioni piscina in mezzo. Quindi, utilizzando una pipetta di trasferimento di plastica a livello di punta elaborare gli embrioni in appena liquido possibile. Girare la pipetta in posizione verticale e rimbalzare delicatamente gli embrioni in modo che essi depositano sul fondo della pipetta.
- Con gli embrioni nella parte inferiore della pipetta, trasferirli ad un'aliquota di 1 ml di agarosio LMP toccando leggermente la punta della pipetta alla superficie del agarosio. Evitare di trasferire il liquido in eccesso come questo diluire il agarosio.
- Dopo l'espulsione del liquido in eccesso dalla pipetta, utilizzare la pipetta per mescolare delicatamente gli embrioni all'interno del agarosio, quindi utilizzare la pipetta per trasferire tutto il agarosio e embrioni al pozzo di un fondo di vetro (No. 1.5 vetrino), 6- pozzetti.
Nota: Assicurarsi di scartare la pipetta dopo il trasferimento degli embrioni alla piastra di imaging. agarosio residua imposterà all'interno della pipetta, rendering inefficace per ulteriore uso. Piuttosto, utilizzare una nuova pipetta ogni volta. - In uno stereoscopio, utilizzare un puntale gel-loading fisso sull'estremità di un ago eccitante manico legno per posizionare gli embrioni verso il vetro di copertura (per garantire che siano all'interno della distanza di lavoro del obiettivo microscopio) e nell'orientamento desiderato per l'imaging.
Nota: Riposizionare continuamente fino l'agarosio si è completamente impostata. Fare attenzione a montare gli embrioni parabiotic secondo cui embrione della coppia è quello di essere ripreso. Dato l'orientamento casuale degli embrioni siamesi, per alcune coppie può essere difficile immagine entrambe embrioni. In questo scenario, recuperare gli embrioni dal agarosio utilizzando una pinza e una vasta a punta pipetta di trasferimento di plastica e poi rimontare per l'imaging da una prospettiva diversa. - Una volta che l'agarosio si è impostato, coprire con 2 - 3 ml di E3 integrato con tricaine (e PTU se necessario).
- Immagine gli embrioni utilizzando una rovesciata a grande campo epi-fluorescenza, lasconfocale er-scansione o disco rotante microscopio confocale. Selezionare l'obiettivo più appropriato per imaging desiderata. Per un campo intero embrione di vista, utilizzare un obiettivo 4x. Selezionare un ingrandimento superiore, come un obiettivo 20x, all'immagine un tessuto specifico 16, 19.
Nota: Se si utilizza un microscopio in posizione verticale, il montaggio a LMP agarosio (simile al precedente) su un vetrino di vetro. Capovolgere il vetrino di vetro su un vetrino da microscopio in vetro che ha un anello di grasso per vuoto riempito con lo stesso E3-tricaine-PTU 16, 19. - Processo di immagini utilizzando libere pacchetti software di analisi delle immagini, quali NIH Immagine J / FIJI 16, 19 acquisito.
Nota: Contare il numero di cellule e quantificare le dinamiche quali la migrazione delle cellule e la divisione cellulare utilizzando la segmentazione e monitoraggio di algoritmi di 16, 19.
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Representative Results
In linea con gli studi pubblicati in precedenza 15, con successo la fusione parabiotic di embrioni di zebrafish dipende la messa in scena e l'orientamento dei due embrioni e la concentrazione di metilcellulosa. Con pochi e semplici, poco costosi strumenti, blastulae in via di sviluppo chirurgicamente fuse sono stati generati che è cresciuta in embrioni parabiotic con circolazione condiviso. Questi strumenti inclusi una pipetta Pasteur modificato, una pompa pipetta 10 ml, e legno trattate aghi teasing che sono stati utilizzati da soli o con una punta di gel-loading o microiniezione vetro dell'ago fissato all'estremità da laboratorio pellicola (Figura 1).
Dopo aver posizionato i due blastulae in 4% metilcellulosa e usando la punta di gel-loading di orientare con i loro poli animali uno di fronte all'altro (figura 2A), gli embrioni sono stati accuratamente feriti nel loro punto di contatto con il vetro microiniezione nEedle (Figura 2B). Un maggior grado di ferire (confrontare Figura 2B alla figura 2C), e rivisitare coppie embrioni per sostenere una connessione iniziale con ferimento aggiuntivo, aumentato la probabilità degli embrioni mantenere una connessione che ha portato riuscita fusione (Figura 3A-C, Film 1) , e senza difetti morfologici aggiuntivi o ritardo nello sviluppo. Quando fatto con attenzione, quasi il 100% delle coppie embrione sono stati fusi, anche se una frazione di questi embrioni (circa il 25%) non stabilito circolazione sana in due metà. Orientando le due blastulae con i loro poli di animali allineati direttamente, affidabili sac-a-tuorlo fusioni sac testa a testa o tuorlo sono stati generati con la circolazione condiviso. Nella maggior parte dei casi, gli embrioni avevano due cuori che pompano una circolazione comune condivisa (Figura 3D).
Per confermare che gli embrioni infatti condiviso la loro circolazione, destrano fluorescente era injette in circolazione, che potrebbe essere visto in seguito che circola attraverso due embrioni (Movie 2). Inoltre, gli embrioni transgenici che avevano GFP + eritrociti (LCR: eGFP) sono state fuse per gli embrioni che avevano mCherry + vascolare cellule endoteliali (Flk1: HRAS-mCherry). Con 48 HPF, sono stati osservati GFP + eritrociti che circola attraverso il Flk1: HRAS-mCherry partner di embrione (Figura 4A e Movie 3). Per espandere l'utilità del sistema parabiotic, è stato aggiunto il controllo temporale dell'espressione genica. Prima di fusione, uno dei due embrioni è stato iniettato con hsp70: eGFP DNA costruire 20. Mentre gli embrioni fusi crescevano a 28,5 ° C, è stata osservata alcuna fluorescenza. Al contrario, dopo un breve shock termico 30 min a 37 ° C, un segnale GFP chiaro era visibile in una delle due embrioni (Figura 4B). In alcuni casi le cellule GFP + sono statiosservato che circola nel partner embrione non-iniettato. Così, ponendo un gene di interesse sotto il controllo di un promotore shock termico fornisce il controllo temporale aggiuntivo per studi che esaminano le funzioni cellulari intrinseca o cellule estrinseco di geni candidati.
Figura 1. strumenti per la generazione Parabiotic embrioni di zebrafish.
(A) immagine commentata mostra strumenti utilizzati per la fusione chirurgica di sviluppare blastulae. Strumenti includono modificato pipetta Pasteur (in alto), che è usato in combinazione con una pompa pipetta 10 ml (verde). Legno gestito aghi prendere in giro sono utilizzati da soli o con una punta di gel-carico pipetta di plastica o di vetro microiniezione tirato Needled fissata all'estremità con laboratorio-pellicola. (B) L'immagine mostra le estremità della microiniezione bisogno di tre vetroLes che sono stati rotto con una pinza a diversi diametri. Gli aghi sono distesi sulla cima di un micrometro; le linee più piccole sono distanziate di 10 micron a parte. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. fusione chirurgica di Sviluppo Blastulae.
Le immagini ad alta ingrandimento mostrano due embrioni di zebrafish presso l'elevato grado di sviluppo, orientati con i loro poli animali uno di fronte all'altro, prima di cuciture chirurgica (A), subito dopo il ferimento minimo (B), e dopo il ferimento più consistente (C). 20 minuti più tardi, è evidente che gli embrioni sono stati fusi con successo basata sul ponte ininterrotta di cellule tra i due blastulae (D). Scalabarra rappresenta 250 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Sviluppo di Parabiotic embrioni di zebrafish.
(AC) Le immagini mostrano una visione tutta-parabiont di sviluppo iniziale, subito dopo il ferimento (A) e come gli embrioni continuano a sviluppare e sottoposti a epiboly (B e C) Queste immagini corrispondono ai film 1. (D) Immagine mostra una coppia embrione parabiotic a 36 HPF. Gli embrioni sono collegati a loro sacchi di tuorlo, hanno due cuori e condividere una circolazione comune. Barre di scala rappresentano 250 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Visualizing parabiosis con proteine fluorescenti geneticamente codificati.
(A) Immagini (fluorescenza solo, giusto, di sovrapposizione con la luce trasmessa, a sinistra) mostrano la regione della testa di embrioni siamesi a 48 HPF. L'embrione di fondo di questa coppia è transgenico per LCR: eGFP (erythroctyes, verde), mentre il suo partner (in alto) è transgenico per Flk1: HRAS-mCherry, che le etichette cellule endoteliali vascolari (rosso). eritrociti verdi possono essere visti circola attraverso l'embrione partner. Questa immagine corrisponde a Movie 3. (B) L'embrione di sinistra in questa coppia è stato iniettato con una HSP70: eGFP costruire nella fase di un cellulare e poi fusa ad un partner non-iniettato (a destra). Quando gli animali sono stati calore scossi a 37 ° C per 30 min a 36 HPF, la fluorescenza verde della GFP è stato osservato nel le ft embrione a 60 HPF. Barre di scala rappresentano 500 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Film 1. lo sviluppo precoce di blastulae zebrafish chirurgicamente fuso. (Tasto destro del mouse per scaricare).
Film mostra lo sviluppo precoce di un paio di blastulae zebrafish chirurgicamente fuso. Epiboly può essere visto che si verificano simultaneamente in ogni embrione. Questo film è legato alla figura 3A-C.
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Movie 2. iniezione di destrano fluorescente illumina una circolazione condivisa. (Clic destro per il download).
Film mostra destrano fluorescente viene iniettato nella vena cardinale comune di una coppia di dell'embrione parabiotic a 60 HPF. Il colorante fluorescente può essere visto successivamente circola attraverso entrambi embrioni.
Movie 3. sangue verde che scorre attraverso i vasi rossi.mov "> (Tasto destro del mouse per scaricare).
Film mostra la regione della testa di embrioni siamesi a 48 HPF. L'embrione di fondo di questa coppia è transgenico per LCR: eGFP (erythroctyes, verde), mentre il suo partner (in alto) è transgenico per Flk1: HRAS-mCherry, che le etichette cellule endoteliali vascolari (rosso). eritrociti verdi sono visti che circola attraverso l'embrione partner. Questo film è legato alla Figura 4A.
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Discussion
Fusion Parabiotic è stato un potente strumento per studiare le funzioni cellulari di geni candidati in modelli murini adulti e embrioni di pollo 10-14. Più di recente, un metodo di fusione blastula è stata descritta per la generazione di embrioni di zebrafish siamesi 15. Nel presente protocollo, video tutorial-based sono utilizzati per dimostrare e meglio descrivere la metodologia per la creazione di parabiotic embrioni di zebrafish di diversi background genetico al fine di studiare i ruoli temporali, cellule intrinseca, e cellule estrinseca di geni candidati di interesse nello sviluppo ematopoietiche e oltre.
Il metodo descritto in questo articolo è stato recentemente utilizzato per monitorare HSC emergere in un embrione, la migrazione tramite la circolazione del sangue a un embrione di diverso background genetico, e la successiva attecchimento e la differenziazione 16. In accordo con i risultati, messa in scena e degli embrioni posizionamento del gruppo Kissa sono stati trovati per determinare il tasso di successoe la natura anatomica della fusione parabiotic. Con alcune modifiche chiave al protocollo, parabionts sono stati generati con un tasso di sopravvivenza significativamente più alto. Questi includono ferire la blastulae in misura maggiore, tenendo l'ago in posizione per 2 - 3 secondi dopo ferimento, quindi rivisitare blastula coppie dopo 15 min per rinforzare una connessione iniziale con ferimento aggiuntivo, se necessario. Con queste ulteriori raccomandazioni, quasi il 100% dei parabionts è sopravvissuto ed è rimasta attaccata, e il 75% di loro ha condiviso una circolazione comune.
Per inserire un ulteriore elemento di controllo sperimentale al metodo, gli embrioni parabiotic sono dimostrati qui per essere tolleranti a shock termico, consentendo il controllo temporale dell'espressione genica nel contesto parabiotic 20. Una limitazione di questa tecnica è che in alcuni casi gli embrioni Partner parabiotic non sono sullo stesso piano dopo la fusione parabiotic. Questo puòrendono difficile montare embrioni in LMP agarosio per monitorare le cellule in entrambi gli embrioni contemporaneamente usando la microscopia time-lapse. Per aggirare questo potenziale problema, si dovrebbe pianificare per generare embrioni multipli parabiotic per garantire l'orientamento desiderato si ottiene. In alternativa, gli embrioni possono essere recuperati dal LMP utilizzando una pinza sottile e pipetta Pasteur e ri-montati per l'imaging da una prospettiva diversa. L'obiettivo di questo protocollo è stato quello di fornire una serie di istruzioni chiare e concise per accompagnare video tutorial basati su come chirurgicamente fusibile sviluppo blastulae per generare embrioni di zebrafish parabiotic.
Con le modifiche chiave e ulteriori raccomandazioni per aumentare la sopravvivenza parabiont, questo protocollo, si spera, responsabilizzare gli investigatori che desiderano utilizzare gli embrioni siamesi di indagare i fattori che regolano la migrazione cellulare, specifica il destino, e la differenziazione in una gamma di tessuti e contesti cellulari.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Methyl cellulose | Sigma | M0387 | |
| Individual components for E3/HCR: | For 1L: 14,61g NaCl, 0,63g KCl, 2,43g CaCl2-2H2O, 1,99g MgSO4 | ||
| NaCl (Sodium chloride) | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| KCl (Potassium chloride) | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| CaCl2 (Calcium chloride dihydrate) | Sigma-Aldrich | 223506 | |
| MgSO4 (Magnessium sulfate heptahydrate) | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Hepes (1M ) buffer solution | ThermoFisher | 15630-080 | |
| Name | Company | Catalog Number | |
| Antibiotics: | |||
| Pen/Strep | gibco by Life technologies | 15140-120 | |
| Ampicilin sodium salt | Sigma Life Science | A0166 | |
| Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus | Sigma Life Science | K1377 | |
| Name | Company | Catalog Number | |
| 50 mg/ml Pronase from Streptomyces griseus | Roche | 11459643001 | |
| capillary glass used for needles (Capillary Glass & Filaments) | Sutter Instrument | ITEM#: BF 100-50-10 | |
| Teasing needles with wooden handles | Fisher Scientific | S07894 | |
| Glass Pasteur pipettes | Fisherbrand | 13-678-20A | |
| 10 ml pipette pump (green) (Pipette Pump Pipettor) | Novatech International | F37898-0000 | |
| 100 mm diameter/ 20 mm deep plastic petri dishes (PETRI DISH, 100/20 MM, PS, CLEAR, WITH VENTS, HEAVY DESIGN, 15 PCS./BAG ) |
Greiner Bio-one | 664102 | |
| Dextran, Cascade Blue, 10,000 MW, Anionic, Lysine Fixable | ThermoFisher | D-1976 | |
| PTU. working stock is 0.003% (50x is 0.15%). for 500 ml, 0.75 g N-Phenylthiourea | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| Tricaine (powder) (Tricaine Methanesulfonato, Tricaine-S) | Western Chemical Inc | MS 222 | |
| LMP agarose (Ultrapure LMP agarose) | Invitrogen | 16520100 | |
| plastic transfer pipette (just the wide ended one I think) | Fisherbrand | 137115AM | |
| Glass-bottom 6-well plates used for imaging | MatTek | P06G1.5-20-F | |
| plastic western gel loading tip fixed on the end of a wood-handled dissecting needle (GELoader tips) | Eppendorf | 22351656 | |
| glass cover slips, slides and vacuum grease if mounting for an upright microscope: | |||
| Vaccum grease ( Dow Corning® high-vacuum silicone grease colorless, weight 5.3 oz (tube) ) |
Dow Corning | Z273554 | |
| Glass cover slips | Corning Life Sciences | 2960-244 |
References
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