Abstract
farklı genetik geçmişleri iki hayvan cerrahi parabiyoz hücre içsel farklı genetik ortamlarda aday ilgi genlerin, hücrelerin göç davranışları ve salgılanan sinyaller için hücre dış roller karşı çalışmak için benzersiz bir senaryo oluşturur. Parabiyotik hayvanlar ortak bir dolaşım paylaştığından, bir hayvandan herhangi bir kan ya da kan yoluyla bulaşan faktör ortağı ve tersi geçerli olacak. Bu nedenle, tek bir genetik geçmişe türetilmiş hücreler ve moleküler faktörler ikinci bir genetik arka bağlamında incelenebilir. Yetişkin farelerin parabiyoz araştırma yaşlanmanın, kanser, diyabet, obezite ve beyin gelişimi için yaygın olarak kullanılmaktadır. Daha yakın zamanda, zebra balığı embriyoların parabiyoz hematopoez gelişim biyolojisi okumak için kullanılmıştır. Farelerde tersine, zebra balığı embriyolarının şeffaf doğası f araştırmak için benzersiz bir güçlü bir yöntem yapım Parabiyotik bağlamda hücrelerinin doğrudan görselleştirme izin verirundamental hücresel ve moleküler mekanizmalar. Bu tekniğin programı Ancak Parabiyotik zebrabalıkları embriyolar oluşturmak için bir öğrenme eğrisi ile sınırlıdır. Bu protokol ilgi aday genlerin rolünü araştırmak için farklı genetik geçmişleri iki zebra balığı embriyolarının blastulae sigorta cerrahi için nasıl bir adım-adım bir yöntem sağlar. Buna ek olarak, Parabiyotik zebrafish embriyolar olası gen ifadesinin zamansal kontrolü yapmak, ısı şok hoşgörülü. Bu yöntem sofistike bir set-up gerektirir ve embriyonik gelişim sırasında in vivo hücre göçü, kader özellikleri ve farklılaşma çalışmak için geniş uygulamalar mevcut değil.
Introduction
Yabani tip ve genetik olarak değiştirilmiş hayvanların arasındaki genetik mozaikler (şimerleri) oluşturulması hücre içsel aday genlerin 1-6 hücre-dışsal fonksiyonlar karşı araştırılması için köklü ve klasik bir stratejidir. Zebrabalıkları Blastula nakli yaygın hücre özerklik 7-9 çalışmaları için kimerik embriyolar oluşturmak için kullanılmıştır. Ilgi konusu doku bağlı olarak, ancak, tahmin edilebileceği gibi istenen dokuya (örneğin, kan) 1-3, 7-9 verici hedef hücrelere zor olabilir. Fare genetikçiler uzun bir ortak dolaşımı 10-14 ile yapışık organizmaları üretmek için Parabiyotik cerrahi yöntemler kullanmışlardır. Parabiyotik hayvanlar ortak kan dolaşımına paylaştığından, farklı genetik arka plan diğer hayvan hücreleri, bir hayvanda kökenli hücreler arasındaki etkileşimleri 10-16 incelenebilir. Son zamanlarda, Karima Kissa grubu zarif CRE yeteneğini gösterdiyapışık zebrafish embriyolar yedik ve daha sonra hematopoetik kök ve progenitör hücre (HSPC) göç 15 incelemek için bu sistemi kullanabilirsiniz. Buna ek olarak, Zebra balığı parabiyoz son zamanlarda hematopoetik kök hücre (HSC) ortaya çıkması ve göç, 16 endotelyal kaderin 5 rolünü araştırmak için ve zebra balığı gelişim 17 sırasında HSPC niş içinde stromal hücrelerin rolünü araştırmak için kullanıldı.
Farelerde aksine, Zebra balığı embriyolar şeffaf ve sistem benzersiz güçlü hale Parabiyotik gelişimi sırasında hücrelerin doğrudan görselleştirme için izin verir. Zebra balığı parabiyoz yarar, ancak ayrıntılı talimat ve görsel gösteri olmadan teknik olarak zor olabilir hassas embriyolar üzerinde dik bir öğrenme eğrisi ve Parabiyotik cerrahi ile sınırlıdır. Bu protokolün amacı, eğitim için Parabiyotik zebrafish embriyolar oluşturmak için nasıl video tabanlı öğreticiler eşlik net, adım adım talimatlar bir dizi sağlamaktırTemporal, hücreye özgü veya blastulae geliştirme cerrahi füzyonu ile aday gen (ler), hücre-dışsal fonksiyonlar. Anahtar değişiklikler ve artan parabiont hayatta kalma ve yeni deneysel uygulamalar için ek öneriler yer almaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu protokol, Boston Çocuk Hastanesi Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı. Bu protokol daha önce yayınlanan bir yöntem 15 ile modifiye edilir.
Reaktiflerin 1. Hazırlık (Peşin gün veya hafta)
- % 1.5 agaroz kaplı yemekler hazırlayın. Bir Erlenmeyer şişede 100 mi balığı E3 orta 1.5 g agarozun ekleyin. Isı, agaroz erimesi ve daha sonra yaklaşık 5 ml 100 mm çapında x 20 mm derinlik petri içine dökün.
Not: Bu embriyoların dechorionation için kullanılan (3.1 Adım) ve Parabiyotik cerrahi için (3.3 Adım) vardır. Birkaç hafta boyunca 4 ° C 'de agaroz kaplanmış yemekler saklayın; buzdolabı üzerinden onları almak ve sıcak Parabiyotik ameliyat günü sabahı RT için. - % 4 metil selüloz hazırlayın. Bir karıştırma çubuğu olan bir Erlenmeyer şişesi içinde E3, 100 ml metil selüloz tozu, 4 g çözündürülür. en düşük hıza ayarlanmış 4 ° C'de bir şişeyi çalkalama levhasının üzerine, koyun ve karıştırın izinen fazla 2 gün ısıtıldı.
- Aralıklı metil selüloz beyaz öbekler kırmak için bir spatula kullanın. metil selüloz kristaller tam bu konsantrasyonda çözünmez. Çözelti berrak hale gelir ve hiçbir beyaz topaklar, tablet, uzun süreli depolama için -20 ° C'de 1.5 mi mikrofüj tüplerine çözeltisi ve dondurma kalan homojen görünür.
Not: metil selüloz düşük konsantrasyonlar kullanılabilir; Bununla birlikte, bu daha yüksek bir yüzdesi, daha viskoz metil selüloz, en iyi sonuçları vermiştir.
- Aralıklı metil selüloz beyaz öbekler kırmak için bir spatula kullanın. metil selüloz kristaller tam bu konsantrasyonda çözünmez. Çözelti berrak hale gelir ve hiçbir beyaz topaklar, tablet, uzun süreli depolama için -20 ° C'de 1.5 mi mikrofüj tüplerine çözeltisi ve dondurma kalan homojen görünür.
- Yüksek Kalsiyum Ringer (HCR) çözeltisi hazırlayın. (5 M NaCl, 8 ml (116 mM son), 3M KCI 400 ul (2.9 mM nihai), 1 M HEPES 5M CaCl2 (10 son mM) ve 2 ml 800 ul karışımı, 5 HCR çözeltisi 400 ml yapmak için E3 medya 390 ml mM nihai).
Not: Bir kaç hafta boyunca 4 ° C'de saklayın HCR çözümü; Parabiyotik Ameliyat günü sabahı RT sıcak. - transfer için 6 modifiye Pasteur pipetler - 5 hazırlayınBlastula çiftleri halka. Kısaca Bunsen beki üzerinde pipet ucunu ısıtın. hala sıcakken sonra, geniş bir forseps kullanılarak, yaklaşık 45 ° C'ye kadar pipet ucu bükümü.
- , Embriyoların zarar yaklaşık 3 saniye alev kısaca pipet ucu tutabilir keskin kenarlar olmadığından emin olmak için. Bu pipet sonu / cila pürüzsüz olacaktır. Bu modifiye edilmiş cam Pasteur pipeti aşağıdaki Aşama 3.5 10 ml pipet pompası (Şekil 1) ile bağlantılı olarak kullanılır.
- blastula çiftlerinin cerrahi dikiş için cam iğne araçları hazırlayın. zebra balığı embriyolarının mikroenjeksiyon için yapıldığı gibi 3 cam iğneler - 2 çekin. Bir odun ya da plastik saplı alay iğne (Şekil 1A) sonuna kadar her bir cam iğne düzeltmek için laboratuvar filmi kullanın. 30 mikron - forseps kullanarak, yaklaşık 20 çapında iğnenin ucunu kesiyorum. Bu adımı (Şekil 1B) yönlendirmek için bir sahne mikrometre kullanın.
Not: Ne boyutunuEdle ucu önemlidir. ucu çok büyükse o tam olarak kontrol etmek zorlaşır ve aşırı hasara neden olabilir. ucu çok küçükse yeterince embriyo yara çok zordur.
2. (Gün 0 Günü -1) Embriyolar Zebra balığı ve Toplama Damızlık Çiftler ayarlama
- Yetişkin zebrafish üreyen ayarlayın. parabiyoz ameliyatı yapılacak olan gece önce balık ayarlayın. erkek ve kadın ayrı bölücüler kullanın. İstenilen embriyolar elde her satırın birkaç çift kurulacak oran artırmak için. çiftlerinin% 50 doğacaktır - Biz genellikle 20 olduğunu bulmak.
- Ertesi sabah, bölücüler çekin ve çiftleşme izin verir. Bir ince gözenekli çay süzgeci kullanarak herhangi bir embriyolar toplayın, sonra E3 embriyo orta 18 içeren Petri aktarabilirsiniz.
- Istenildiği gibi embriyolar mikro enjekte (örneğin, 25 ug plasmid DNA, ya da 1 ile 200 ug mRNA ile - 6 ng morfolino) toplama 1 saat içerisinde. Onları izin256 hücre aşamasına kadar büyür. DNA ekspresyon yapısı, bir ısı şoku promotör kontrolü altına yerleştirildiği (örneğin, HSP70, Şekil 4B), (daha sonraki bir aşamada, 37 ° C'de parabionts şok ısı ile gen ifadesinin zamanlaması kontrol örn., 36 hpf ).
Not: bir flüoresan transgen bir alternatif, floresan dekstran (2 mg / ml'de, örneğin, dekstran, çağlayan mavisi), DNA, RNA, veya morfolino enjeksiyon karışımına ilave edilebilir zamanda. dekstran boya normal gelişim engel olmaz ve enjekte embriyo Parabiyotik füzyon sonra uygun floresan ışığı altında tespit edilmesi için izin verecektir. Seçenek olarak ise, bir pigmentsiz suş ile pigmentli bir soyunun parabiyoz (örneğin, AB) (örneğin, Casper) sonraki aşamalarda enjekte embriyo tanımlamak için kullanılabilir. - periyodik olarak kendi gelişimini izlemek için 28.5 ° C.Use bir Stereoskop embriyolar inkübe 256 hücre dev yakın onlarelopmental aşama (yaklaşık 2,5 hpf).
Not:. Gerekirse morfolino enjekte embriyolar yer alırken, Parabiyotik ortakları (örneğin, morfolino enjekte embriyolar genellikle un enjekte muadillerine göre daha yavaş geliştirmek RT un enjekte embriyolar Shifting arasındaki sahne eşleştirme sağlamak için farklı sıcaklıklara embriyolar vardiya 28,5 ° C'de bir gelişim birkaç saat sonra) hizalama aşamalarına neden olur.
Blastulae Gelişmekte Cerrahi Fusion tarafından Parabiyotik Zebra balığı Embriyolar 3. Nesil
- Embriyolar 256 hücre aşamasına (yaklaşık 2.5 HPF) yaklaştıkça, ayrı agaroz kaplı tabaklar (morfolino örneğin, bir çanak her bir genetik arka plan (yani, genetik mutant transgenik kuşaklar ve / veya genetik manipülasyon) için embriyo transferine enjekte edilen embriyoların ve kontrol embriyoları için ikinci bir tabak). Alternatif, çizilmeye ücretsiz cam beher veya cam Petri kapları temizlemek için embriyolar transfer.
Not: embriyolar plastik sopa ve chorions dışarı kez zarar olarak kaplanmamış plastik yemekleri kullanmaktan kaçının. - (- 10 ml, yaklaşık 7) yeterli sıvı embriyoların kapsayacak şekilde kalana kadar E3 medya süzün. 50 mg / Streptomyces griseus (proteazlar) hücre dışı sıvıdan izole proteaz mi karışımına 200 ul ekle. nazikçe embriyoların her birkaç dakikada bir girdap.
- Embriyoların% 50 genellikle 5 sürer kendi chorions, dışarı gelmiş olduğunda - taze E3 embriyo orta - (20 ml yaklaşık 15) 10 dk, cömert bir hacim ile onları üç kez yıkayın.
- onları hafifçe giderilmesinde sonra yavaşça modifiye cam Pasteur pipeti içine hazırlanması ve kendi chorions kalan tüm embriyolar Dechorionate. Embriyolar dechorionated ve yıkanmış edildikten sonra, HCR çözümü ile E3 ortamı değiştirin. proteazlar alternatif olarak, el ile ince forseps kullanılarak chorions çıkarın. 100 dechor - 60 var hedefliyoruzHer deneysel koşul için uygun ionated embriyolar.
Not: Bu sonuçta kullanılacak kat daha fazla birkaç, ancak birçok embriyolar ele ya da parabiyoz için ameliyat sırasında hasar olması muhtemeldir. Embriyolar dechorionated sonra, onları batık tutmak ve yüzey gerilimi onları imha edilmesine neden olacak gibi onları su yüzeyine dokunmamaya izin vermeyin. proteazlar yüksek doz kullanılarak embriyolar er kendi chorions çıkıp bir daha senkronize bir şekilde gelmesini sağlar unutmayın. proteazlar daha düşük bir dozda kullanıldığında, embriyolar chorions çıkmaya daha uzun sürer ve proteazlar uzun süre maruz kalma sonucu zarar gördüğü embriyoların bir kısmına neden olabilecek daha az uyumlu bir şekilde, çok yok.
- onları hafifçe giderilmesinde sonra yavaşça modifiye cam Pasteur pipeti içine hazırlanması ve kendi chorions kalan tüm embriyolar Dechorionate. Embriyolar dechorionated ve yıkanmış edildikten sonra, HCR çözümü ile E3 ortamı değiştirin. proteazlar alternatif olarak, el ile ince forseps kullanılarak chorions çıkarın. 100 dechor - 60 var hedefliyoruzHer deneysel koşul için uygun ionated embriyolar.
- Embriyoların% 50 genellikle 5 sürer kendi chorions, dışarı gelmiş olduğunda - taze E3 embriyo orta - (20 ml yaklaşık 15) 10 dk, cömert bir hacim ile onları üç kez yıkayın.
- Embriyoların hasar ya da yumurta sarısı yırtılacaktır, çözünmemiş kristallerin pelet, 10 dakika boyunca maksimum hızda bir masaüstü santrifüj (yukarıdaki Aşama 1.2'de) metilselüloz ve santrifüj çözülmes.
- Santrifüj işleminden sonra, berrak üst kısmını (hacminin yaklaşık% 75) kullanır. Aktarım 1 -% 1.5 agaroz kaplı Petri kabı içine metil selüloz 1.5 cm çaplı bir düşer. tüpün dibinden pelet kristaller herhangi hazırlanması önlemek için özen gösterin.
- çanak alt tarafında her damla konumunu önceden belirlemek için işaretleyici kullanın. 100 mm çaplı petri başına metil selüloz - (3 alikotları 'değerinde 2) 15 damla - 12 yerleştirin. Deneme başına gerektiği kadar tabak hazırlayın.
Not: Tek Blastula çiftinin füzyon için her damla kullanın. mark medya katma de hangi nokta damla neredeyse görünmez hale kez her damla yerini tayin edecektir.
- Adım 3.3 yukarıda hazırlanan agaroz kaplı çanak başına antibiyotik takviye HCR çözümün bir 40 ml kısım hazırlayın. HCR her biri 40 mi kana 0.5 ug 50 U / ml, 50 U / ml ampisilin ve kanamisin penisilin-streptomisin ilave/ Ml olmuştur.
- Hazır Blastula füzyonlarının gerçekleştirmek için zaman, dikkatli bir şekilde, antibiyotik ile takviye HCR çözeltisi 40 ml metil selüloz damlacıkları içeren tabakların her birine doldurun. HCR çözeltisi çok hızlı bir şekilde ilave edilir, bu damlacıklar bozabilir.
- 10 ml'lik pipet pompasına (yukarıdaki adım 1.4'de yapılan) modifiye cam Pasteur pipeti takın. Bir Stereoskop altında her arka plan (örneğin, bir morfolino enjekte embriyo ve bir vahşi tip embriyo) dan bir dechorionated embriyo toplamak.
- iki embriyo dağıtım önce, sonra yavaşça, metil selüloz damla ortasında küçük bir depresyon yapmak için Pasteur pipet kullanın depresyon içine hem embriyolar mevduat.
Not: yol açabilir pipet üst veya alt kısmında sıvı yüzeyi ile kendi yapım teması (önleyecek şekilde aktarma işlemi sırasında, hafifçe yukarı embriyolar Pasteur pipeti viraj içine yerleşmek, böylece Pasteur pipeti çevirin thei içinr rüptürü).
- iki embriyo dağıtım önce, sonra yavaşça, metil selüloz damla ortasında küçük bir depresyon yapmak için Pasteur pipet kullanın depresyon içine hem embriyolar mevduat.
- , Hayvan kutupları ile doğrudan olarak hemen metil selüloz embriyolar saklandıktan sonra, dikkatli bir şekilde metil selüloz olan embriyolar yeniden konumlandırmak için son (Şekil 1A) bir jel yükleme pipet ucu ile odun ya da plastik saplı alay iğne kullanmak şekilde birbirlerine dokunmadan.
- doğrudan onlara dokunmadan onları yeniden konumlandırmak için embriyolar metil selüloz yakın yoluyla nazik süpürme hareketleri yararlanın. metil selüloz etraflarında yerleşmek böylece embriyolar 5 dakika bekletin. Bu süre zarfında, başka damla içine sonraki çifti yükleyin.
Not: embriyoların doğrudan temas etmeyin ve kolayca rüptüre olur yumurta sarısının, herhangi bir bölümünü dokunmamaya özel özen gösterin.
- doğrudan onlara dokunmadan onları yeniden konumlandırmak için embriyolar metil selüloz yakın yoluyla nazik süpürme hareketleri yararlanın. metil selüloz etraflarında yerleşmek böylece embriyolar 5 dakika bekletin. Bu süre zarfında, başka damla içine sonraki çifti yükleyin.
- Cam iğne aracını kullanarak, dikkatli temas onların noktada her bir embriyo yara. yumuşak dikiş hareketi ile, ilk embriyo hücreleri tekrar ikinci embriyo içine çekilir ve edilebilir.Bu hareketin sonunda, 2 iğneyi yerinde tutun - 3 saniye sonra çok yavaş uzak çizin.
Not: yaklaşık 2 dönemi vardır - iki dokular daha yapışkan ve birbirlerine takmak için daha muhtemel gibi görünüyor nerede embriyolar yaralı sonra 3 sn. Böylece, kısaca yaralama sonra iğneyi yerinde tutarak hemen yaralama sonra zaman ilk dönem için temas halinde her embriyo yaralı dokuların tutmaya yardımcı olduğuna inanıyorum. - Oda sıcaklığında 15 dakika - bu embriyolar, 10 bekletin. Bu arada, metil selüloz diğer damla yeni çiftleri dikiş devam ediyor. 10 Sonra - 15 dakika, ilk çifti ekli (Şekil 2A) kalmıştır olup olmadığını değerlendirmek.
Not: embriyolar daha bağlıysa, sürece embriyolar% 30 epiboly sahne etrafında daha genç olduğu gibi için dikiş işlemini tekrarlayın. üç denemeden kadar birlikte embriyoların dikiş için genellikle bu izin verir. Embriyolar bir eki ama c korumuştur görünüyorsaonnection değil önemli olan, bunu güçlendirmek için bağlantı kenarında ek dikiş gerçekleştirin. sallayarak veya Parabiyotik cerrahi ve inkübasyon dönemlerinde yemekleri hareketli kaçının.
Not: erken gelişim aşamasında ve algılanan kırılganlık rağmen, embriyoların hücre kütleleri manipülasyon önemli bir miktar (yani, yaralama ve dikiş) tahammül ve hala normal gelişebilir. yumurta sarısı, ancak embriyo öldürme, sadece ufak bir dokunuş ile bozulabilir. cam iğne ile iki blastulae dikerken, her embriyonun hücre kütlesi ve yumurta sarısı arasında bir arayüz ile temas kurmaya yok. - Aynı yemeğin ve medya (ortam değişmez) 28.5 ° C embriyolar O / N inkübe edin. Ertesi sabah tarafından, embriyolar çoğu çözülmüş metil selüloz damlacıklarının dışarı taşımış olacaktır. başarıyla erimiş değil tüm embriyolar çıkarın. medyayı Durusu ve taze bir 25 ml E3 ile değiştirin.
Not: ile çalışma durumundaPigmentli soyu, pigmentasyon engellemek için% 0.003 nihai konsantrasyon 500 ul% 0.15 (50x) feniltiyoüre (PTU) ekleyin. Embriyolar pigmentasyon bastırılmasını sağlamak için PTU sürekli kalması gerekir.
4. Mikroskop Kurulum, Görüntü Alma, İşleme ve Analizi
- % 0.8 düşük erime noktası (LMP) agaroz hazırlayın: tamamen çözünene dek 0.8 g agarozun 100 mi E3 LMP ve ısıtılır. sıcakken, kısım agaroz 37 ° C bir ısıtma bloğu içinde 1.5 mi mikrofüj tüplerine LMP 1 mi. LMP agaroz, 37 ° C'de, erimiş kalır. agaroz, 37 ° C 'de, 4 mg / ml (25x), pH LMP her biri 1 mi kısım 7.0 tricaine 40 ul ekle. Not: Bir pigmentli suşu ile çalışan, her 1ml kana% 0.15 (50x) PTU 20 ul ekleyin.
- 4 ° C'de mühürlü 50 ml tüpler birkaç ay için kalan LMP agaroz saklayın.
- Parabiyotik embriyolar anestezisi 4 mg / ml 1 ml (25x), pH 7.0 tricaine eklenerek yansımasıE3 25 ml embriyo zaten olduğu.
- Embriyolar ortada havuz olacak şekilde hafifçe çanak girdap. Sonra, geniş uçlu plastik transfer pipet kullanarak mümkün olduğunca az sıvı embriyoların hazırlar. dik pipet çevirin ve pipet çok dibe şekilde hafifçe embriyolar sıçrama.
- Pipet altındaki embriyolar ile hafifçe agaroz yüzeyine pipet dokunarak LMP agaroz 1 mi tümböleni aktarın. agaroz sulandırmak bu kadar fazla sıvıyı transfer kaçının.
- pipet fazla sıvıyı attıktan sonra, yavaşça, 6- ardından, agaroz içinde embriyo karıştırın cam alt kuyu (No 1.5 lamel) için agaroz ve embriyo tüm aktarmak için pipet kullanmak için pipet kullanın iyi plaka.
Not: Görüntüleme plakasına embriyolar aktardıktan sonra pipet atmak için emin olun. Kalıntı agaroz pipet içine koyacaktır, rendering bir sonraki aşama için etkisiz. Aksine, yeni bir pipet her zaman kullanın. - Bir Stereoskop altında, aşağı cam kapak doğru embriyoları yerleştirmek için ahşap saplı alay iğnenin ucunda sabit bir jel yükleme pipet kullanın (onlar mikroskop objektif çalışma mesafesi sağlamak için) ve istenilen yönde görüntüleme için.
Not: Agaroz tamamen belirledi kadar sürekli yerleştirin. çiftin hangi embriyonun göre Parabiyotik embriyolar monte etmeye özen görüntülü olmaktır. Yapışık embriyoların rastgele yönünü göz önüne alındığında, bir çiftleri için her iki embriyolar görüntü zor olabilir. Bu senaryoda, bir forseps ve geniş uçlu plastik transfer pipet kullanarak agaroz embriyolar kurtarmak ve daha sonra farklı bir bakış açısıyla görüntüleme için yeniden bağlayın. - tricaine (ve PTU gerekirse) ile takviye edilmiş E3 3 ml - agaroz donduktan sonra, 2 ile kaplayın.
- , Las ters geniş bir alan epi-floresan kullanarak görüntü embriyolarkonfokal er-tarayarak veya disk konfokal mikroskop iplik. İstenen görüntüleme için en uygun hedefi seçin. görünümünde bir bütün embriyo alanı için, bir 4x objektif kullanımı. Görüntü, bir 20x objektif olarak, belirli bir doku 16, 19 daha yüksek bir büyütme seçin.
Not: dik bir mikroskop kullanıyorsanız, bir cam kapak kayma (yukarıda benzer) LMP agaroz monte edilir. Aynı E3-tricaine-PTU 16, 19 ile doldurulmuş vakum gres bir halka sahip bir cam mikroskop lamı üzerine cam lamel ters çevirin. - Süreç böyle NIH Image J / FIJI 16, 19 olarak ücretsiz görüntü analiz yazılımı paketleri kullanarak görüntüleri satın aldı.
Not: hücre sayıları Sayısı ve hücre göçü ve hücre bölünmesi segmentasyon kullanarak ve algoritmaları 16, 19 izleme olarak dinamiklerini ölçmek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Daha önce yayınlanmış çalışmaların 15 ile uyumlu olarak, zebra balığı embriyolarının başarıyla Parabiyotik füzyon evreleme ve oryantasyon iki embriyo ve metilselüloz konsantrasyonuna bağlıdır. Sadece birkaç basit ile, ucuz araçlar, cerrahi kaynaşmış gelişmekte blastulae paylaşılan tirajlı Parabiyotik embriyoların içine büyüdüğünü üretildi. Bu araçlar, bir tadil edilmiş Pasteur pipeti, 10 ml pipet pompası ve tek başına ya da laboratuar film ile ucuna sabitlenmiş bir jel yükleme ucu veya cam mikro-enjeksiyon iğnesi (Şekil 1) ya da kullanılan ahşap ele alay iğneler dahildir.
% 4 metil selüloz iki blastulae yerleştirerek ve birbirlerine (Şekil 2A) bakan kendi hayvan direkleri ile yönlendirmek jel yükleme ucu kullandıktan sonra, embriyolar dikkatle cam mikroenjeksiyon n ile temas onların noktada yaralandıeedle (Şekil 2B). (2C Şekil Şekil 2B karşılaştırın) yaralandı ve ek yaralama ile ilk bağlantıyı güçlendirmek için embriyo çiftleri Revisiting daha büyük bir derecesi, başarılı füzyon sonuçlanan bir bağlantı korunarak embriyoların ihtimalini artırmıştır (Şekil 3A-C Film 1) ve ek morfolojik kusurları ya da gecikmiş gelişme olmadan. dikkatli yapılması zaman bu embriyoların (yaklaşık% 25) bir kısmını iki yarısı sağlıklı dolaşımı kurulmuş asla rağmen, embriyo çiftlerinin yaklaşık% 100, erimiş bulundu. onların hayvan direkleri doğrudan hizalanmış iki blastulae yönlendirerek, güvenilir kafa kafaya ya da sarısının kese-to-sarısı kesesi füzyonlar paylaşılan dolaşımı ile üretilmiştir. Çoğu durumda, embriyolar paylaşılan ortak dolaşımı (Şekil 3D) pompalama iki kupa vardı.
Embriyolar gerçekten kendi dolaşımını paylaştı doğrulamak için, floresan dekstran enj olduHer iki embriyoların (Film 2) üzerinde dolaşan sonradan görülebilir dolaşıma içine ected. Buna ek olarak, GFP + eritrositleri (LCR: EGFP) sahip transgenik embriyo MCherry + vasküler endotel hücreleri (: HRAS mCherry flk1) sahip embriyo kaynaştırılmıştır. HRAS mCherry ortağı embriyo (Şekil 4A ve Film 3): 48 hpf tarafından, GFP + eritrositler flk1 dolaşan gözlendi. Parabiyotik sisteminin uygulanmasını yaygınlaştırmak da, gen ekspresyonunun geçici kontrol ilave edildi. Füzyon öncesinde, iki embriyo bir hsp70 enjekte edildi: eGFP DNA, 20 oluştururlar. kaynaşmış embriyolar 28.5 ° C'de büyüyen iken, hiçbir floresan gözlendi. Buna karşılık, 37 ° C'de kısa bir 30 dakika ısı şokundan sonra, berrak bir GFP sinyali iki embriyo (Şekil 4B) birinde görülebiliyordu. Bazı durumlarda GFP + hücreler vardıun enjekte ortak embriyo dolaşan gözlendi. Bu durumda, bir ısı şoku promotörün kontrolü altında ilgi dahilindeki geni yerleştirmek aday genlerin hücre içsel ya da hücre-dışsal fonksiyonlarını araştıran çalışmalar için ek zamansal kontrol sağlar.
Yaratma Parabiyotik Zebra balığı Embriyolar 1. Araçlar rakam.
(A) Açıklamalı görüntü blastulae gelişen cerrahi füzyon için kullanılan araçları göstermektedir. Araçlar 10 ml pipet pompası (yeşil) ile bağlantılı olarak kullanılan bir tadil edilmiş Pasteur pipeti (üst), içerir. Ahşap alay iğneler laboratuvar film sonuna kadar sabit Needled tek başına veya plastik bir jel yükleme pipet veya çekti cam mikroenjeksiyon ile ya kullanılmaktadır ele. (B) Görüntü üç cam mikroenjeksiyon ihtiyacı uçlarını gösterirFarklı çaplarda bir forseps ile kırılmış les. iğneler bir mikrometre üstünde yatarken; En küçük çizgiler 10 mm aralıklıdır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Blastulae Geliştirme 2. Cerrahi Fusion rakam.
Yüksek büyütme görüntüleri önce, cerrahi dikiş (A) hemen çok az yaralanma (B) uygulanmasından sonra, ve daha önemli yaralama (C) sonra, birbirine bakan, hayvan direkleri yönlendirilmiş gelişiminin yüksek aşamasında iki zebra balığı embriyolar göstermektedir. 20 dakika sonra embriyolar, başarılı bir şekilde, iki blastulae (D) hücreler, kesintisiz köprü göre kaynaşık edilmiş olduğu açıktır. ölçekBar 250 mikron temsil etmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Parabiyotik Zebra balığı Embriyolar Şekil 3. geliştirilmesi.
(AC) Görüntüler sadece (A) yaralama sonrası erken gelişme bir bütün parabiont görünümünü göstermek ve embriyolar geliştirmeye devam ve Bu görüntüler Film 1. karşılık (B ve C) epiboly tabi olarak (D) Image Parabiyotik embriyo çifti gösterir 36 hpf. Embriyolar iki kalpleri vardır ve ortak dolaşımı paylaşmak, onların sarısı keseler bağlanmaktadır. Ölçek çubukları 250 mikron temsil etmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Genetik Kodlanmış Floresan Proteinleri 4. görselleştirme parabiyoz Şekil.
(A) Görüntüler (yalnız floresan, sağ, sol iletilen ışık bindirme,) 48 hpf yapışık embriyoların baş bölgesini gösterir. Bu çiftin alt embriyo LCR için transgenik olan: (erythroctyes, yeşil) eGFP ortağı (üst) flk1 için transgenik ise: HRAS-mCherry, vasküler endotelyal hücreler (kırmızı) etiketler. Yeşil eritrositler ortak embriyo üzerinde dolaşan görülebilir. Bu resmi çifti sol embriyo bir hsp70 enjekte edildi Film 3. (B) 'ye karşılık gelir: eGFP tek hücreli aşamada inşa ve daha sonra bir un enjekte ortak (sağda) erimiş. Hayvanlar, ısı 36 HPF C'de 30 dakika boyunca 37 ° C'de şok edildi, GFP yeşil floresan le gözlendi 60 hpf ft embriyo. Ölçek çubukları 500 mikron temsil etmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Film cerrahi erimiş Zebra balığı blastulae 1. Erken gelişme. (Sağ indirmek için tıklayın).
Film cerrahi kaynaşmış Zebra balığı blastulae bir çift erken gelişim gösterir. Epiboly her bir embriyonun aynı anda meydana gelen görülebilir. Bu film Şekil 3A-C, Şekil ilgilidir.
2.jpg "/>
Film 2. Floresan dekstran enjeksiyon paylaşılan bir sirkülasyon aydınlatır. (Sağ indirmek için tıklayın).
Film floresan dekstran 60 hpf bir Parabiyotik embriyo çiftinin ortak kardinal ven içine enjekte ediliyor gösterir. flüoresan boya, daha sonra her iki embriyolar dolaşan görülebilir.
Kırmızı damarları aracılığıyla akan Film 3. Yeşil kan.mov "> (Sağ indirmek için tıklayın).
Film 48 hpf yapışık embriyoların baş bölgesini göstermektedir. Bu çiftin alt embriyo LCR için transgenik olan: (erythroctyes, yeşil) eGFP ortağı (üst) flk1 için transgenik ise: HRAS-mCherry, vasküler endotelyal hücreler (kırmızı) etiketler. Yeşil eritrositler ortak embriyo dolaşan görülür. Bu film Şekil 4A'ya ilgilidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Parabiyotik füzyon yetişkin fare modelleri ve civciv embriyolarının 10-14 aday genlerin hücresel fonksiyonları araştırmak için güçlü bir araç olmuştur. Daha yakın bir zamanda Blastula füzyon metodu yapışık zebrabalıkları embriyolar 15 üretilmesi için tarif edilmiştir. Mevcut protokolde, video tabanlı öğreticiler göstermek ve daha iyi hematopoetik gelişiminde ilgi aday genlerin, zamansal hücre içsel ve dışsal hücre rollerini incelemek amacıyla farklı genetik kökenden Parabiyotik zebrabalıkları embriyolar oluşturmak için metodoloji tanımlamak için kullanılır ve ötesinde.
Bu yazıda anlatılan yöntem son zamanlarda bir farklı genetik kökenli embriyo ve sonraki engraftman ve farklılaşma 16, tek embriyo kan-dolaşım yoluyla göç HSC çıkmasını izlemek için kullanılmıştır. Kissa grubun bulguları, evreleme ve embriyo konumlandırma ile anlaşarak başarı oranını belirlemek için bulunduve Parabiyotik füzyon anatomik yapısı. Protokole birkaç anahtar değişiklik ile, parabionts önemli ölçüde daha yüksek hayatta kalma oranı ile üretilmiştir. yaralama sonra 3 saniye, ve daha sonra, gerekirse, ek bir yaralama ile bir ilk bağlantı güçlendirmek için 15 dakika sonra Blastula çiftleri yeniden ziyaret - Bu, daha büyük bir dereceye kadar blastulae yaralama 2 iğneyi yerinde tutan içerir. Bu ek önerileri ile, parabionts yaklaşık% 100 hayatta ve bağlı kaldı ve bunların% 75'i ortak dolaşım paylaştı.
Yöntemine deney ek bir kontrol elemanını birleştirmek için, Parabiyotik embriyolar Parabiyotik bağlamında 20 içindeki gen sentezlenmesinin zamansal kontrol sağlayan, ısı şokuna karşı toleranslı olması için gösterilmiştir. Bu tekniğin bir sınırlama bazı durumlarda Parabiyotik ortağı embriyolar Parabiyotik füzyon sonra aynı düzlemde değildir olmasıdır. bu canzor anda time-lapse mikroskobu kullanarak her iki embriyolar hücreleri izlemek için agaroz LMP embriyolar monte edin. Bu olası sorunu aşmak için, bir arzu oryantasyon elde edilir sağlamak için birden çok Parabiyotik embriyolar üretmek için planlamalısınız. Alternatif olarak, embriyolar farklı bir perspektiften görüntüleme için monte yeniden-ince forseps ve Pasteur pipeti ve kullanan LMP elde edilebilir. Bu protokolün amacı, Parabiyotik zebrafish embriyolar üretmek için blastulae gelişmekte sigorta cerrahi olarak nasıl video tabanlı öğreticiler eşlik açık, özlü bir dizi talimat sağlamaktı.
artan parabiont hayatta kalmak için temel değişiklikler ve ek önerileri ile, bu protokol umarım doku ve hücresel bağlamlarda bir dizi hücre göçü, kader özellikleri ve farklılaşmasını düzenleyen faktörleri araştırmak amacıyla yapışık embriyolar yararlanmak isteyen araştırmacılara yetkisi olacak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Methyl cellulose | Sigma | M0387 | |
| Individual components for E3/HCR: | For 1L: 14,61g NaCl, 0,63g KCl, 2,43g CaCl2-2H2O, 1,99g MgSO4 | ||
| NaCl (Sodium chloride) | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| KCl (Potassium chloride) | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| CaCl2 (Calcium chloride dihydrate) | Sigma-Aldrich | 223506 | |
| MgSO4 (Magnessium sulfate heptahydrate) | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Hepes (1M ) buffer solution | ThermoFisher | 15630-080 | |
| Name | Company | Catalog Number | |
| Antibiotics: | |||
| Pen/Strep | gibco by Life technologies | 15140-120 | |
| Ampicilin sodium salt | Sigma Life Science | A0166 | |
| Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus | Sigma Life Science | K1377 | |
| Name | Company | Catalog Number | |
| 50 mg/ml Pronase from Streptomyces griseus | Roche | 11459643001 | |
| capillary glass used for needles (Capillary Glass & Filaments) | Sutter Instrument | ITEM#: BF 100-50-10 | |
| Teasing needles with wooden handles | Fisher Scientific | S07894 | |
| Glass Pasteur pipettes | Fisherbrand | 13-678-20A | |
| 10 ml pipette pump (green) (Pipette Pump Pipettor) | Novatech International | F37898-0000 | |
| 100 mm diameter/ 20 mm deep plastic petri dishes (PETRI DISH, 100/20 MM, PS, CLEAR, WITH VENTS, HEAVY DESIGN, 15 PCS./BAG ) |
Greiner Bio-one | 664102 | |
| Dextran, Cascade Blue, 10,000 MW, Anionic, Lysine Fixable | ThermoFisher | D-1976 | |
| PTU. working stock is 0.003% (50x is 0.15%). for 500 ml, 0.75 g N-Phenylthiourea | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| Tricaine (powder) (Tricaine Methanesulfonato, Tricaine-S) | Western Chemical Inc | MS 222 | |
| LMP agarose (Ultrapure LMP agarose) | Invitrogen | 16520100 | |
| plastic transfer pipette (just the wide ended one I think) | Fisherbrand | 137115AM | |
| Glass-bottom 6-well plates used for imaging | MatTek | P06G1.5-20-F | |
| plastic western gel loading tip fixed on the end of a wood-handled dissecting needle (GELoader tips) | Eppendorf | 22351656 | |
| glass cover slips, slides and vacuum grease if mounting for an upright microscope: | |||
| Vaccum grease ( Dow Corning® high-vacuum silicone grease colorless, weight 5.3 oz (tube) ) |
Dow Corning | Z273554 | |
| Glass cover slips | Corning Life Sciences | 2960-244 |
References
- Zon, L. I., Orkin, S. H. Hematopoiesis: An evolving paradigm for stem cell biology. Cell. 132 (4), 631-644 (2008).
- Dzierzak, E., Speck, N. A. Of lineage and legacy: the development of mammalian hematopoietic stem cells. Nat Immunol. 9 (2), 129-136 (2008).
- Li, P., et al. Epoxyeicosatrienoic acids enhance embryonic haematopoiesis and adult marrow engraftment. Nature. 523 (7561), 468-471 (2015).
- Tam, P. P., Rossant, J. Mouse embryonic chimeras: tools for studying mammalian development. Development. 130 (25), 6155-6163 (2003).
- Tanaka, M., Gertsenstein, M., Rossant, J., Nagy, A. Mash2 acts cell autonomously in mouse spongiotrophoblast development. Dev. Biol. 190 (1), 55-65 (1997).
- Morin-Kensicki, E. M., Faust, C., LaMantia, C., Magnuson, T. Cell and tissue requirements for the gene eed during mouse gastrulation and organogenesis. Genesis. 31 (4), 142-146 (2001).
- Ho, R. K., Kane, D. A. Cell-autonomous action of zebrafish spt-1 mutation in specific mesodermal precursors. Nature. 348 (6303), 728-730 (1999).
- Parker, L., Stainier, D. Y. Cell-autonomous and non-autonomous requirements for the zebrafish gene cloche in hematopoiesis. Development. 126 (12), 2643-2651 (1999).
- Liao, E. C., Trede, N. S., Ransom, D., Zapata, A., Kieran, M., Zon, L. I. Non-cell autonomous requirement for the bloodless gene in primitive hematopoiesis of zebrafish. Development. 3 (3), 649-659 (2002).
- Kamran, P., Sereti, K. I., Zhao, P., Ali, S. R., Weissman, I. L., Ardehali, R. Parabiosis in mice: a detailed protocol. J Vis Exp. (80), (2013).
- Wagers, A. J., Sherwood, R. I., Christensen, J. L., Weissman, I. L. Little evidence for developmental plasticity of adult hematopoietic stem cells. Science. 297 (5590), 2256-2259 (2002).
- Hervey, G. R. The effects of lesions in the hypothalamus in parabiotic rats. J. Physiol. 145 (2), 336-352 (1959).
- Goldman, D. C., Bailey, A. S., Pfaffle, D. L., Al Masri, A., Christian, J. L., Fleming, W. H. BMP4 regulates the hematopoietic stem cell niche. Blood. 114 (20), 4393-4401 (2009).
- Dieterlen-Lièvre, F., Martin, C., Beaupain, D. Quail-chick chimaeras and parabionts: several new models to investigate early developmental events in the haemopoietic system. Folia Biol (Praha). 25 (5), 293-295 (1979).
- Demy, D. L., Ranta, Z., Giorgi, J. M., Gonzalez, M., Herbomel, P., Kissa, K. Generating parabiotic zebrafish embryos for cell migration and homing studies). Nat. Methods. 10 (3), 256-258 (2013).
- Anderson, H., et al. Hematopoietic stem cells develop the absence of endothelial cadherin 5 expression. Blood. 126 (26), 2811-2820 (2015).
- Murayama, E., Sarris, M., Redd, M., Le Guyader, D., Vivier, C., Horsley, W., Trede, N., Herbomel, P. NACA deficiency reveals the crucial role of somite-derived stromal cells in haematopoietic niche formation. Nat Commun. 28 (6), 8375 (2015).
- Shah, D. I., et al. Mitochondrial Atpif1 regulates haem synthesis in developing erythroblasts. Nature. 491 (7425), 608-612 (2012).
- Tamplin, O. J., et al. Hematopoietic stem cell arrival triggers dynamic remodeling of the perivascular niche. Cell. 160 (1-2), 241-252 (2015).
- Adám, A., Bártfai, R., Lele, Z., Krone, P. H., Orbán, L. Heat-inducible expression of a reporter gene detected by transient assay in zebrafish. Exp. Cell Res. 256 (1), 282-290 (2000).
