Abstract
Chirurgische Parabiose von zwei Tiere von verschiedenen genetischen Hintergründe schafft ein einzigartiges Szenario Zell-Eigengegenüber zell extrinsische Rollen für Kandidatengene von Interesse, Migrationsverhalten von Zellen zu untersuchen, und sekretiertes Signale in unterschiedlichen genetischen Einstellungen. Da parabiotic Tiere eine gemeinsame Kreislauf, jede Blut oder durch Blut übertragbaren Faktor von einem Tier gemeinsam mit dem Partner ausgetauscht werden und umgekehrt. So ist aus einem genetischen Hintergrund abgeleiteten Zellen und molekularen Faktoren kann im Kontext eines zweiten genetischen Hintergrund studiert werden. Parabiose von erwachsenen Mäusen wurde intensiv für die Forschung Alterung, Krebs, Diabetes, Fettleibigkeit, und die Entwicklung des Gehirns eingesetzt. In jüngerer Zeit hat Parabiose von Genaktivität verwendet worden, um die Entwicklungsbiologie der Hämatopoese zu studieren. Im Gegensatz zu Mäusen erlaubt die transparente Natur der Genaktivität die direkte Visualisierung von Zellen im parabiotic Zusammenhang ist ein einmalig leistungsfähiges Verfahren zur Untersuchung von f machenundamental zellulären und molekularen Mechanismen. Die Nützlichkeit dieser Technik wird jedoch durch eine steile Lernkurve begrenzt für die parabiotic Genaktivität zu erzeugen. Dieses Protokoll stellt eine Schritt-für-Schritt-Methode, wie die Blastulae von zwei Genaktivität von verschiedenen genetischen Hintergründen chirurgisch verschmelzen die Rolle der Kandidaten-Gene von Interesse zu untersuchen. Darüber hinaus sind die parabiotic Zebrabärblingembryonen Hitzeschock-tolerant, mögliche zeitliche Kontrolle der Genexpression zu machen. Diese Methode ist nicht ein ausgeklügeltes Set-up erfordert und hat breite Anwendungen für das Studium der Zellmigration, das Schicksal der Beschreibung und Differenzierung in vivo während der embryonalen Entwicklung.
Introduction
Erstellung von genetischen Mosaiken (Chimären) zwischen Wildtyp und gentechnisch veränderten Tieren ist eine gut etablierte und klassische Strategie zur Untersuchung von Zell-Eigengegenüber zell extrinsische Funktionen von Kandidatengenen 1-6. Blastula Transplantation in Zebrabärbling wurde in großem Umfang Chimären - Embryonen für die Untersuchung der Zell Autonomie 7-9 zu erzeugen , verwendet werden . In Abhängigkeit von dem Gewebe von Interesse kann es jedoch schwierig sein , vorhersagbar 7-9 Donorzellen zu dem gewünschten Gewebe (zB Blut) 1-3, abzuzielen. Maus - Genetiker haben lange parabiotic chirurgische Methoden verwendet , um verbundene Organismen mit einem gemeinsamen Kreislauf 10-14 erzeugen. Da die Tiere parabiotic eine gemeinsame Blutstrom, Wechselwirkungen zwischen Zellen teilen , die von einem Tier mit Zellen des anderen Tieres von einem anderen genetischen Hintergrund hat , kann 10-16 untersucht werden. Vor kurzem elegant Karima Kissa Gruppe demonstriert die Fähigkeit, creaß verbunden Genaktivität und dann dieses System verwenden , um 15 hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzelle (HSPC) Migration studieren. Darüber hinaus wurde kürzlich Zebrabärbling Parabiose während Zebrabärblingentwicklung 17 zur Untersuchung der Rolle der endothelialen cadherin 5 in hämatopoetischen Stammzellen (HSC) Emergenz und Migration, 16 und zur Untersuchung der Rolle von Stromazellen in der HSPC Nische eingesetzt.
Im Gegensatz zu Mäusen sind Genaktivität transparent und ermöglichen eine direkte Visualisierung von Zellen während der parabiotic Entwicklung, so dass das System einzigartig leistungsfähige. Die Nützlichkeit von Parabiose in Zebrabärbling, wird jedoch durch eine steile Lernkurve begrenzt und parabiotic Operation an den empfindlichen Embryonen ohne detaillierte Anleitung und visuelle Demonstration technisch anspruchsvoll sein. Das Ziel dieses Protokolls ist es, eine Reihe von klaren, Schritt-für-Schritt-Anleitungen Videoschulungen auf zu begleiten, wie parabiotic Zebrabärblingembryonen erzeugen für das Studiumtemporal, zell intrinsische oder extrinsische zell Funktionen eines Kandidatengens (e) durch chirurgische Fusion von Blastulae entwickeln. Key Modifikationen und zusätzliche Empfehlungen zur Erhöhung parabiont Überleben und neue experimentelle Anwendungen sind im Lieferumfang enthalten.
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Protocol
Dieses Protokoll wurde von Boston Kinderkrankenhaus Animal Care und Use Committee genehmigt. Dieses Protokoll wird von einem zuvor veröffentlichten Verfahren 15 modifiziert.
1. Vorbereitung der Reagenzien (Tage oder Wochen im Voraus)
- Bereiten Sie 1,5% Agarose-beschichteten Schalen. In 1,5 g Agarose zu 100 ml Zebrabärbling E3 Medium in einem Erlenmeyerkolben. Wärme, lösen sich die Agarose und dann etwa 5 ml in 100 mm Durchmesser x 20 mm tief Petrischalen gießen.
Anmerkung: Diese werden verwendet für dechorionation von Embryonen (Schritt 3.1) und für die parabiotic Operation (Schritt 3.3). Bewahren Sie Agarose-beschichteten Schalen bei 4 ° C für ein paar Wochen; nehmen sie aus dem Kühlschrank und warm am Morgen des Tages der parabiotic Operation auf RT. - Herstellung von 4% Methylcellulose. Man löst 4 g Methylcellulose-Pulver in 100 ml E3 in einem Erlenmeyerkolben mit einem Rührstab. Der Kolben wird auf einer Rührplatte bei 4 ° C, auf die niedrigste Geschwindigkeit, und lassen Sie es mischenfür bis zu 2 Tage.
- verwenden Intermittently einem Spatel weißen Klumpen von Methylcellulose aufzubrechen. Die Methylcellulose Kristalle lösen sich nicht vollständig in dieser Konzentration. Wenn wird die Lösung klar und homogen erscheint mit keine weißen Klumpen verbleibenden aliquote die Lösung in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und gefrier bei -20 ° C für die Langzeitlagerung.
Hinweis: Geringere Konzentrationen von Methylcellulose können verwendet werden; aber diese höheren Prozentsatz, zähflüssiger Methylcellulose hat die besten Ergebnisse erzielt.
- verwenden Intermittently einem Spatel weißen Klumpen von Methylcellulose aufzubrechen. Die Methylcellulose Kristalle lösen sich nicht vollständig in dieser Konzentration. Wenn wird die Lösung klar und homogen erscheint mit keine weißen Klumpen verbleibenden aliquote die Lösung in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und gefrier bei -20 ° C für die Langzeitlagerung.
- Bereiten High Calcium Ringer (HCR) Lösung. Zu 400 ml der HCR - Lösung herzustellen, 8 ml 5M NaCl mischen (116 mM Endkonzentration), 400 & mgr; l 3 M KCl (2,9 mM Endkonzentration), 800 & mgr; l 5 M CaCl 2 (10 mM Endkonzentration) und 2 ml 1M HEPES (5 mM final) mit 390 ml E3 Medien.
Hinweis: Bewahren HCR Lösung bei 4 ° C für ein paar Wochen; warme am Morgen des Tages der parabiotic Operation auf RT. - Bereiten Sie 5 - 6 modifizierte Pasteurpipetten für den TransferRing blastula Paare. kurz erhitzen das Ende der Pipette über einem Bunsenbrenner. Dann großen Pinzette, biegen Sie das Ende der Pipette auf etwa 45 ° C, während es noch heiß ist.
- Um sicherzustellen, dass keine scharfen Kanten, die Embryonen schädigen könnten, halten Sie die Spitze der Pipette kurz in der Flamme für etwa 3 Sekunden. Dies wird glätten / polieren das Ende der Pipette. Diese modifizierte Glaspasteurpipette wird in Verbindung mit einer 10 ml Pipette Pumpe (1) in Schritt 3.5 unten verwendet.
- Bereiten Sie Glasnadel Werkzeuge für chirurgische Nähte von blastula Paare. Ziehen Sie 2 - 3 Glasnadeln wie für die Mikroinjektion von Zebrafischembryonen durchgeführt. Verwenden Sie Lab-Film jedes Glas Nadel bis zum Ende eines holz- oder kunststoff behandelt teasing Nadel (Abbildung 1A) zu beheben. Mit einer Pinzette, brechen das Ende der Nadel bei einem Durchmesser von ca. 20 aus - 30 um. Verwenden Sie einen Stufenmikrometer diesen Schritt (1B) zu führen.
Hinweis: Die Größe des needle Spitze ist wichtig. Wenn die Spitze zu groß ist, wird es schwierig, genau zu steuern und zu übermäßigen Schaden verursachen können. Wenn die Spitze zu klein ist, ist es schwierig, ausreichend die Embryonen aufgewickelt.
2. Einrichten Brutpaare von Zebrabärbling und Sammlung von Embryonen (Tag -1 bis Tag 0)
- Richten Sie Brutpaare von erwachsenen Zebrafisch. Richten Sie Fisch in der Nacht vor der Parabiose Operation durchgeführt werden soll. Verwenden Sie Teiler Männchen und Weibchen zu trennen. Um die Chancen zu erhöhen, dass die gewünschten Embryonen werden mehrere Paare von jeder Zeile erhalten, eingerichtet. Wir finden, dass typischerweise 20 - 50% der Paare laichen.
- Am nächsten Morgen ziehen die Teiler und Paarung zu ermöglichen. Sammeln Sie alle Embryonen einen feinmaschigen Teesieb verwendet, übertragen sie dann auf eine Petrischale mit E3 Embryo Medium 18.
- Micro-injizieren Embryonen nach Wunsch (zB mit 25 pg Plasmid - DNA, 200 pg mRNA oder mit 1 bis 6 ng Morpholin) innerhalb 1 Stunde der Sammlung. Lassen Sie sie aufbis 256-Zellen-Stadium wachsen. Wenn das DNA - Expressionskonstrukt unter der Kontrolle eines Hitzeschock - Promotors gestellt wird (zB hsp70, 4B), steuern die Zeitsteuerung der Genexpression durch Wärme schocken die parabionts bei 37 ° C zu einem späteren Zeitpunkt (z. B. bei 36 hpf ).
Anmerkung: Als Alternative zu einem fluoreszierenden Transgen können fluoreszierende Dextran an die DNA, RNA zugesetzt werden oder Morpholino Injektionsmischung (beispielsweise Dextran, Cascade blue bei 2 mg / ml). Das Dextran Farbstoff wird nicht mit der normalen Entwicklung stören und können für die injizierten Embryo unter der entsprechenden Leuchtstofflampe nach parabiotic Fusion identifiziert werden. Alternativ kann die Parabiose eines pigmentierten Stamm (zB AB) mit einem nicht-pigmentierten Stamm (zB Casper) verwendet werden, um die injizierten Embryonen in späteren Stadien zu identifizieren. - Inkubieren Sie die Embryonen bei 28,5 ° C liegt.Verwendung einer Stereoskop ihre Entwicklung in regelmäßigen Abständen, wie sie in der Nähe der 256-Zellen-Entwickler zu überwachenelopmental Stufe (ca. 2,5 HPF).
Hinweis: Bei Bedarf verschieben Embryonen auf unterschiedliche Temperaturen Stufe Anpassung zwischen parabiotic Partnern zu gewährleisten (zB Morpholino-injizierten Embryonen entwickeln sich oft langsamer als ihre nicht-injizierten Pendants Verschiebung der un-injizierten Embryonen auf RT während die Morpholino-injizierten Embryonen platziert werden. bei 28,5 ° C in ihren Stufen führen nach ein paar Stunden der Entwicklung auszurichten).
3. Erzeugung von Parabiotic Zebrabärbling Embryonen, die durch chirurgische Fusion von Blastulae Entwicklung
- Da die Embryonen , die 256-Zellen - Stadium (etwa 2,5 HPF), übertragen Sie die Embryonen von jedem genetischen Hintergrund (dh genetische Mutante, transgenen Linien und / oder genetische Manipulation) in separate Agarose-beschichteten Schalen (zB ein Gericht für Morpholino- nähern injizierten Embryonen und eine zweite Schale für die Kontrolle Embryonen). Alternativ übertragen die Embryonen zu reinigen, kratzfreie Glasbecher oder Petrischalen aus Glas.
Hinweis: Vermeiden Sie unbeschichteten Plastikschalen mit, da die Embryonen in die Kunststoff haften und einmal aus ihrem Chorion beschädigt werden. - Dekantiert die E3 Medien bis gerade genug Flüssigkeit bleibt die Embryonen zu decken (etwa 7 bis 10 ml). Zugabe von 200 ul 50 mg / ml Gemisch aus der extrazellulären Flüssigkeit von Streptomyces griseus isoliert Proteasen (Proteasen). Schwenken Sie die Embryonen vorsichtig alle paar Minuten.
- Wenn 50% der Embryonen aus ihrem Chorion gekommen sind, die in der Regel 5 nimmt - 10 min, spülen Sie sie dreimal mit einem großzügigen Volumen (ca. 15 - 20 ml) von frischen E3 Embryo Medium.
- Dechorionate alle Embryonen in ihren Chorion verbleibenden, indem sie sanft Ausarbeitung in die modifizierte Glas Pasteur Pipette und dann sanft zu zerstreuen. Sobald die Embryonen dechorionated und gewaschen worden ist, ersetzen Sie die E3 Medien mit HCR-Lösung. Als Alternative zu Proteasen, entfernen Sie die Chorion manuell einer feinen Pinzette verwenden. Ziel 60 zu haben - 100 dechorionated Embryonen für jede Versuchsbedingung zur Verfügung.
Anmerkung: Dies ist ein Vielfaches mehr als letztendlich verwendet werden, aber viele Embryonen werden wahrscheinlich während der Handhabung oder der Chirurgie für Parabiose beschädigt werden. Sobald die Embryonen dechorionated sind, halten sie untergetaucht und nicht zulassen, dass sie die Oberfläche des Wassers zu berühren, da die Oberflächenspannung bewirkt, dass sie vernichtet werden. Beachten Sie, dass eine höhere Dosis von Proteasen, die Embryonen erlaubt aus ihrem Chorion früher und in einer synchronisierten Art und Weise zu kommen. Wenn eine niedrigere Dosis von Proteasen, bringen Sie die Embryonen länger von ihrem Chorion entstehen und tun dies in einer weniger synchronen Art und Weise, die in einem Teil der Embryonen beschädigt längerer Exposition durch Proteasen führen kann.
- Dechorionate alle Embryonen in ihren Chorion verbleibenden, indem sie sanft Ausarbeitung in die modifizierte Glas Pasteur Pipette und dann sanft zu zerstreuen. Sobald die Embryonen dechorionated und gewaschen worden ist, ersetzen Sie die E3 Medien mit HCR-Lösung. Als Alternative zu Proteasen, entfernen Sie die Chorion manuell einer feinen Pinzette verwenden. Ziel 60 zu haben - 100 dechorionated Embryonen für jede Versuchsbedingung zur Verfügung.
- Wenn 50% der Embryonen aus ihrem Chorion gekommen sind, die in der Regel 5 nimmt - 10 min, spülen Sie sie dreimal mit einem großzügigen Volumen (ca. 15 - 20 ml) von frischen E3 Embryo Medium.
- Auftauen Methyl (hergestellt in Schritt 1.2 oben) und Zentrifuge in einer Tischzentrifuge bei Höchstgeschwindigkeit für 10 min ungelöste Kristalle zu pelletieren, die die Embryonen schädigen oder reißen ihren Dotters.
- Nach dem Zentrifugieren, verwenden Sie die klare obere Fraktion (etwa 75% des Volumens). Transfer 1-1,5 cm Durchmesser Tropfen Methylcellulose in einem 1,5% Agarose-beschichteten Petrischale. Achten Sie darauf, von der Unterseite des Rohres eine der pelletierten Kristalle zeichnen zu vermeiden.
- Verwenden, um eine Markierung, um die Position jedes Tröpfchens an der Unterseite des Tellers vorzubestimmen. Legen Sie 12 bis 15 Tropfen (2 - 3 Teilmengen im Wert) von Methylcellulose pro 100 mm Durchmesser Petrischale. Bereiten Sie so viele Platten wie pro Experiment benötigt.
Hinweis: Verwenden Sie jedes Tröpfchen für die Fusion eines einzelnen blastula Paar. Die Markierung wird die Position jedes Tröpfchen bezeichnen, sobald das Medium Mehr, an welchem Punkt die Tropfen werden fast unsichtbar.
- Bereiten Sie eine 40 ml aliquote Menge von Antibiotika ergänzt HCR Lösung pro Agarose-beschichtete Schale oben hergestellt in Schritt 3.3. Zu jeder 40 ml Aliquot von HCR hinzufügen Penicillin-Streptomycin bei 50 U / ml, Ampicillin, bei 50 U / ml und Kanamycin mit 0,5 & mgr; g/ Ml.
- Wenn Sie bereit sind blastula Fusionen durchzuführen, füllen Sie sorgfältig jedes der Gerichte mit 40 ml des Antibiotikums ergänzten HCR Lösung Methylcellulose Tröpfchen enthält. Wenn der HCR-Lösung zu schnell hinzugefügt wird, kann es um die Tröpfchen zu stören.
- Bringen Sie die modifizierte Glaspasteurpipette (hergestellt in Schritt 1.4 oben) zu einer 10 ml Pipette Pumpe. Unter einem Stereoskop sammeln ein dechorionated Embryo aus jedem Hintergrund (zB ein Morpholino-injizierten Embryo und ein Embryo Wildtyp).
- Bevor die beiden Embryonen Abgabe, verwenden Sie die Pasteur-Pipette eine kleine Vertiefung in der Mitte der Methylcellulose Tropfen zu machen, dann deponieren sanft beide Embryonen in die Depression.
Hinweis: Während des Transferprozesses, drehen Sie das Pasteur-Pipette leicht nach oben, so dass die Embryonen in die Biegung des Pasteur-Pipette absetzen, um ihre Herstellung Kontakt mit der Oberfläche der Flüssigkeit am oberen oder unteren Ende der Pipette zu vermeiden (was führen kann zu their Bruch).
- Bevor die beiden Embryonen Abgabe, verwenden Sie die Pasteur-Pipette eine kleine Vertiefung in der Mitte der Methylcellulose Tropfen zu machen, dann deponieren sanft beide Embryonen in die Depression.
- Unmittelbar nach der Embryos in die Methylcellulose Ablagern, mit einem Holz- oder Kunststoffgriff Necken Nadel mit einem Gel-Ladepipettenspitze auf dem Ende (1A) , um sorgfältig die Embryonen in der Methylcellulose repositionieren , so dass ihre Tier Pole direkt berühren einander.
- Nutzen Sie sanft geschwungenen Bewegungen durch die Methylcellulose nahe an den Embryonen sie neu zu positionieren, ohne sie direkt zu berühren. Lassen Sie die Embryonen für 5 Minuten sitzen, so dass die Methylcellulose um sie herum siedeln in wird. Während dieser Zeit, laden Sie das nächste Paar in einen anderen Tropfen.
Hinweis: Vermeiden Sie direkten Kontakt mit den Embryonen zu machen und besondere Sorgfalt walten lassen keinen Teil des Dottersacks zu berühren, die leicht platzen wird.
- Nutzen Sie sanft geschwungenen Bewegungen durch die Methylcellulose nahe an den Embryonen sie neu zu positionieren, ohne sie direkt zu berühren. Lassen Sie die Embryonen für 5 Minuten sitzen, so dass die Methylcellulose um sie herum siedeln in wird. Während dieser Zeit, laden Sie das nächste Paar in einen anderen Tropfen.
- Mit der Glasnadel Werkzeug, Wunde sorgfältig jeden Embryo in ihrem Kontaktpunkt. Mit einer sanften Bewegung Nähen, Zellen aus dem ersten Embryo in den zweiten Embryo herausgezogen werden und dann wieder zurück.Am Ende dieser Bewegung, halten Sie die Nadel an Ort und Stelle für 2 - 3 Sekunden und dann sehr langsam ziehen weg.
Hinweis: Es gibt einen Zeitraum von etwa 2 bis 3 sec, nachdem die Embryonen verwundet werden, wo die beiden Geweben zu sein scheinen mehr Klebstoff und eher aneinander zu befestigen. Daher glauben wir, dass die Nadel an Ort und Stelle hält kurz nach der Verwundung die verwundeten Gewebe jedes Embryos in Kontakt für die Anfangszeit der Zeit unmittelbar nach der Verwundung zu halten hilft. - Lassen Sie diese Embryonen für 10 sitzen - 15 min bei RT. In der Zwischenzeit weiterhin neue Paare in anderen Tropfen Methylcellulose zu nähen. Nach 10 bis 15 min, zu beurteilen , ob das erste Paar befestigt ist geblieben (2A).
Hinweis: Wenn die Embryonen länger angebracht, wiederholen Sie den Nähvorgang solange die Embryonen jünger sind als etwa 30% epiboly Bühne. Typischerweise kann dies bis zu drei Versuche, die Embryonen zusammenheften. Wenn erscheinen die Embryonen eine Anlage gehalten zu haben, aber die cSteckerspleiss ist nicht erheblich, führen zusätzliche Nähte am Rand der Verbindung es zu verstärken. Vermeiden Sie Schütteln oder Gerichte während der parabiotic Chirurgie und Inkubationszeiten bewegen.
Hinweis: Trotz ihres frühen Entwicklungsstadium und wahrgenommen Zerbrechlichkeit, die Zellmassen der Embryonen eine erhebliche Menge an Manipulation tolerieren kann (dh, Verwundung und Nähen), und noch normal entwickeln. Das Eigelb kann jedoch Bruch mit nur der geringsten Berührung, den Embryo zu töten. Wenn die beiden Blastulae mit der Glasnaht, nicht den Kontakt mit der Schnittstelle zwischen der Zellmasse und Eigelb von jedem Embryo zu machen. - Inkubieren Sie die Embryonen O / N bei 28,5 ° C in der gleichen Gericht und Medien (nicht über die Medien ändern). Mit dem folgenden Morgen werden sich die Embryonen der meist gelösten Methylcellulose Tröpfchen ausgezogen. Entfernen Sie alle Embryonen, die nicht erfolgreich verschmolzen waren. Dekantiert die Medien und ersetzen mit einem frischen 25 ml E3.
Hinweis: Wenn bei einem Arbeitspigmentierte Stamm, 500 & mgr; l 0,15% (50x) Phenylthioharnstoff (PTU) bis zu einer Endkonzentration von 0,003% Pigmentierung zu blockieren. Die Embryonen müssen kontinuierlich in PTU bleiben Unterdrückung der Pigmentierung zu halten.
4. Mikroskopaufbau, Bildaufnahme, Verarbeitung und Analyse
- Bereiten Sie 0,8% mit niedrigem Schmelzpunkt (LMP) Agarose: In 0,8 g LMP-Agarose zu 100 ml E3 und Hitze, bis sie vollständig gelöst. Während heiß, aliquoten 1 ml LMP-Agarose in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen in einem 37 ° C Heizblock. Die LMP-Agarose bleiben wird geschmolzen bei 37 ° C. Werden 40 & mgr; l 4 mg / ml (25x), pH 7,0 Tricaine zu je 1 ml Aliquot von LMP-Agarose bei 37 ° C. Hinweis: Wenn mit einer pigmentierten Stamm arbeiten, fügen Sie 20 ul 0,15% (50x) PTU zu jedem 1 ml aliquoten.
- Bewahren Sie die restlichen LMP-Agarose für mehrere Monate in verschlossenen 50-ml-Röhrchen bei 4 ° C.
- Anästhesieren parabiotic Embryonen abzubildenden durch Zugabe von 1 ml von 4 mg / ml (25x), pH 7,0 Tricainezu den 25 ml der E3, dass die Embryonen bereits in.
- Vorsichtig schwenken die Schale, so dass die Embryonen in der Mitte gebündelt werden. Dann eine breite bestückte Plastiktransferpipette die Embryonen in so wenig Flüssigkeit wie möglich aufzustellen verwenden. Drehen Sie die Pipette aufrecht und prallen sanft die Embryonen, so dass sie bis auf den Grund der Pipette zu begleichen.
- Mit den Embryonen am Boden der Pipette, übertragen sie zu einem 1 ml Aliquot der Agarose LMP durch leichtes die Pipettenspitze auf die Oberfläche der Agarose berühren. Vermeiden Sie überschüssige Flüssigkeit, da diese Übertragung wird die Agarose verdünnen.
- Nachdem die überschüssige Flüssigkeit aus der Pipette ausgestoßen, verwenden Sie die Pipette die Embryonen vorsichtig innerhalb der Agarose mischen, dann die Pipette verwenden, um alle der Agarose und Embryonen in die Vertiefung einer Glasboden (Nr 1.5 Deckglas) zu übertragen, 6- Well-Platte.
Hinweis: Stellen Sie sicher, dass die Pipette zu verwerfen, nachdem die Embryonen auf die Bildplatte zu übertragen. Rest Agarose wird im Inneren der Pipette eingestellt, rendering unwirksam für die weitere Verwendung. Vielmehr ist eine neue Pipette jedes Mal verwenden. - Unter einem Stereoskop, verwenden Sie ein Necken am Ende eines Holz behandelt Nadel fixiert Pipettenspitze Gel-Laden um die Embryonen nach unten in Richtung des Deckglases zu positionieren (sicherzustellen, dass sie innerhalb der Arbeitsabstand des Mikroskopobjektivs sind) und in der gewünschten Ausrichtung für die Bildgebung.
Hinweis: Positionieren Sie kontinuierlich, bis die Agarose vollständig gesetzt hat. Achten Sie darauf, die parabiotic Embryonen nach der Embryo des Paares zu montieren abgebildet werden soll. In Anbetracht der zufällige Orientierung der verbundenen Embryonen für einige Paare können es beide Embryonen Bild schwierig sein. In diesem Szenario zu erholen, die Embryonen aus der Agarose eine Zange und eine breite bestückte Plastiktransferpipette und dann wieder montieren für die Bildgebung aus einer anderen Perspektive. - Nachdem die Agarose gesetzt hat, Deckel mit 2 - 3 ml E3 mit Tricaine ergänzt (und PTU falls erforderlich).
- Bild die Embryonen eines invertierten Weitfeld-Epi-Fluoreszenz unter Verwendung, laser-konfokalen oder konfokalen Mikroskop drehende Scheibe. Wählen Sie das Ziel am besten geeignet für die gewünschte Bildgebung. Für einen ganzen Embryo Sichtfeld, mit einem 4-fach Objektiv. Wählen Sie eine höhere Vergrßerung, wie beispielsweise ein 20x - Objektiv, dem Bild mit einem spezifischen Gewebe 16, 19.
Hinweis: Wenn ein aufrechtes Mikroskop, montieren in LMP-Agarose (ähnlich oben) auf einem Deckglas. Kehren Sie die Deckglas auf einem Glasobjektträger , die einen Ring von Vakuumfett mit dem gleichen E3-Tricaine-PTU 16, 19 gefüllt hat. - Prozess erfassten Bilder frei Bildanalyse - Software - Pakete wie NIH Bild J / FIJI 16, 19 verwendet wird .
Hinweis: Count - Zellzahlen und zu quantifizieren Dynamik wie Zellmigration und die Zellteilung Segmentierung und Tracking 16 Algorithmen, 19.
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Representative Results
In Übereinstimmung mit zuvor veröffentlichten Studien 15, erfolgreiche parabiotic Fusion von Zebrabärbling - Embryonen , hängt von der Bereitstellung und Ausrichtung der beiden Embryonen und die Konzentration von Methylcellulose. Mit nur ein paar einfache, kostengünstige Tools, operativ fusioniert Entwicklung Blastulae wurden erzeugt, die in parabiotic Embryonen mit gemeinsamen Umlauf wuchs. Diese Werkzeuge enthalten eine modifizierte Pasteurpipette, eine 10 ml - Pipette Pumpe und Holz behandelt Necken Adeln die verwendet wurden , entweder allein oder mit einem Gel-Ladespitze oder Glasmikroinjektionsnadel an dem Ende befestigt , indem lab-Film (Abbildung 1).
Nach dem Platzieren sie mit ihrem Tier Pole die beiden Blastulae in 4% Methylcellulose und mit Hilfe der Gel-Spitze für einen anderen (2A) vor einer zu orientieren, wurden die Embryonen bei ihrem Kontaktpunkt mit dem Glasmikroinjektions n sorgfältig verwundeteedle (2B). Ein höheres Maß an Verwundung (2B vergleichen 2C Abbildung) und erneuten Besuch Embryo Paare eine erste Verbindung mit zusätzlichen Verwundung zu stärken, erhöht die Wahrscheinlichkeit , dass die Embryonen die Aufrechterhaltung der Verbindung , die in der erfolgreichen Fusion (3A-C, Film 1) ergab und ohne zusätzliche morphologische Defekte oder verzögerte Entwicklung. Wenn sorgfältig durchgeführt wurden fast 100% der Embryo Paare verschmolzen, obwohl ein Bruchteil dieser Embryonen (rund 25%) nie in beiden Hälften gesunden Kreislauf etabliert. Durch Ausrichtung der beiden Blastulae mit ihren tierischen Pole direkt ausgerichtet sind, zuverlässig Kopf-an-Kopf oder Dottersack-to-Dottersack Fusionen wurden mit gemeinsamen Kreislauf erzeugt. In den meisten Fällen hatten die Embryonen zwei Herzen eine gemeinsame gemeinsame Zirkulation (3D) zu pumpen.
Um zu bestätigen, dass die Embryonen teilten zwar ihre Zirkulation, fluoreszierenden Dextran war injektiert in den Verkehr, der anschließend durch beide Embryonen (Film 2) zirkulierende gesehen werden konnte. Zusätzlich transgenen Embryonen , die GFP + Erythrozyten (lcr: eGFP) hatten , wurden an Embryonen fusioniert , die mCherry + vaskulären Endothelzellen (flk1: HRAS-mCherry) hatte. Mit 48 HPF, GFP + Erythrozyten wurden durch die flk1 beobachtet zirkulierenden: HRAS-mCherry Partner Embryo (4A und Movie 3). Zur Erweiterung wurde die Nützlichkeit des parabiotic System, zeitliche Kontrolle der Genexpression hinzugefügt. Vor der Fusion, einer der beiden Embryonen wurde mit einem hsp70 injiziert: eGFP DNA 20 konstruieren. Während die fusionierten Embryos bei 28,5 ° C wachsen wurden, wurde keine Fluoreszenz beobachtet. Im Gegensatz dazu ist nach einer kurzen 30 Minuten Hitzeschock bei 37 ° C, ein klares GFP - Signal war in einem der zwei Embryonen (4B) sichtbar. In einigen Fällen wurden GFP + -Zellenbeobachtet in der un-injizierten Partner Embryo im Umlauf. Somit stellt ein Gen von Interesse unter der Kontrolle eines Hitzeschock-Promotors gestellt wurde zusätzliche zeitliche Kontrolle zu Studien zur Untersuchung zell intrinsische oder zell extrinsische Funktionen von Kandidatengenen.
1. Werkzeuge für die Erzeugung von Parabiotic Zebrafischembryonen Abbildung.
(A) Kommentierte Bild zeigt Werkzeuge für chirurgische Fusion der Entwicklung Blastulae verwendet. Die Tools umfassen eine modifizierte Pasteurpipette (oben), die in Verbindung mit einer 10 ml Pipette Pumpe (grün) verwendet wird. Holz behandelt necken Nadeln verwendet werden , entweder allein oder mit einem Kunststoff - Gel-Ladepipettenspitze gezogen oder Glasmikroinjektions bis zum Ende mit Labor-Folie genadelt fixiert. (B) Bild die Enden von drei Glasmikroinjektions Notwendigkeit zeigtles, die mit unterschiedlichen Durchmessern mit einer Zange aufgebrochen wurden. Die Nadeln liegen auf einem Mikrometer; die kleinsten Linien sind 10 & mgr; m voneinander entfernt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Die chirurgische Fusion der Entwicklung Blastulae.
Hochvergrößernden Bilder zeigen zwei Zebrabärbling Embryonen im hohen Entwicklungsstufe, orientiert mit ihren Tier Pole einander zugewandt sind , vor der chirurgischen Naht (A) unmittelbar nach der Verwundung minimal (B) und nach wesentlichere Verwundung (C). 20 min später wird deutlich , daß die Embryonen wurden auf der Grundlage der ununterbrochenen Brücke von Zellen zwischen den beiden Blastulae (D) erfolgreich fusioniert. RahmenBalken steht für 250 & mgr; m. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Entwicklung von Parabiotic Zebrafischembryonen.
(AC) Bilder zeigen eine Voll parabiont Ansicht der frühen Entwicklung gerade nach der Verwundung (A) und wie die Embryonen entwickeln sich weiter und unterziehen epiboly (B und C) Diese Bilder auf Film entsprechen 1. (D) Bild zeigt ein parabiotic Embryo Paar bei 36 hPF. Die Embryonen werden an ihren Dottersäcke verbunden, zwei Herzen und eine gemeinsame Zirkulation teilen. Maßstabsbalken repräsentieren 250 & mgr; m. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. Visualizing Parabiose mit genetisch kodierter Fluoreszierende Proteine.
(A) Bilder (Fluoreszenz allein, rechts; Overlay mit Durchlicht, links) zeigen den Kopfbereich der verbundenen Embryonen bei 48 HPF. Der untere Embryo dieses Paares ist transgen für lcr: eGFP (erythroctyes, grün) , während sein Partner (oben) transgen für flk1 ist: HRAS-mCherry, die den vaskulären endothelialen Zellen (rot) Etiketten. Grüne Erythrozyten kann verteilend durch den Partner Embryo gesehen werden. Dieses Bild entspricht Film 3. (B) Der linke Embryo in diesem Paar wurde mit einem Hsp70 injiziert: eGFP in der Phase One-Zelle konstruieren und dann zu einem un-injizierten Partner fusioniert (rechts). Wenn die Tiere wurden für 30 min bei 37 ° C Hitzeschock bei 36 hpf wurde die grüne Fluoreszenz von GFP in den le beobachtet ft Embryo bei 60 HPF. Maßstabsbalken repräsentieren 500 & mgr; m. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Film 1. Frühe Entwicklung von chirurgisch fusionierten Zebrabärbling Blastulae. (Rechts Download anklicken).
Film zeigt die frühe Entwicklung eines Paares operativ fusioniert Zebrabärbling Blastulae. Epiboly kann auftreten in jedem Embryo gleichzeitig gesehen werden. Dieser Film wird im Zusammenhang mit 3A-C Abbildung.
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Film 2. Fluorescent Dextraninjektion beleuchtet ein gemeinsames Kreislauf. (Rechts zum Download anklicken).
Film zeigt fluoreszierenden Dextran in die gemeinsame Kardinalvene eines parabiotic Embryo Paar bei 60 HPF eingespritzt wird. Der Fluoreszenzfarbstoff kann anschließend gesehen werden durch beide Embryonen im Umlauf.
Film 3. Grüne Blut durch rote Gefäße fließt.mov "> (Rechtsklick zum Download).
Film zeigt den Kopfbereich der verbundenen Embryonen bei 48 HPF. Der untere Embryo dieses Paares ist transgen für lcr: eGFP (erythroctyes, grün) , während sein Partner (oben) transgen für flk1 ist: HRAS-mCherry, die den vaskulären endothelialen Zellen (rot) Etiketten. Grüne Erythrozyten sind im Umlauf durch den Partner Embryo gesehen. Dieser Film wird im Zusammenhang mit auf 4A.
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Discussion
Parabiotic Fusion ist ein leistungsfähiges Werkzeug gewesen , um zelluläre Funktionen von Kandidatengenen bei erwachsenen Mausmodellen und Hühnerembryonen 14.10 untersuchen. In jüngerer Zeit wurde zur Erzeugung verbunden Zebrabärbling - Embryonen 15 a blastula Fusionsverfahren beschrieben. Im vorliegenden Protokoll, Video-basierte Tutorials werden verwendet, um die Methodik zu demonstrieren und besser zu beschreiben für die Erstellung von parabiotic Genaktivität von verschiedenen genetischen Hintergründe zu untersuchen, um zeitliche, zell intrinsische und zell extrinsische Rollen von Kandidatengenen von Interesse in hämatopoetischen Entwicklung und darüber hinaus.
Das Verfahren in diesem Papier beschrieben wurde vor kurzem 16 zu verfolgen HSC Entstehung in einem Embryo, der Migration über die Blutzirkulation zu einem Embryo von unterschiedlichen genetischen Hintergrund und anschließender Verpflanzung und Differenzierung verwendet. In Übereinstimmung mit den Ergebnissen der Kissa Gruppe, Inszenierung und Embryo Positionierung wurden gefunden, die Erfolgsrate zu bestimmen,und anatomische Beschaffenheit der parabiotic Fusion. Mit wenigen Tasten Änderungen an dem Protokoll, parabionts wurden mit einer deutlich höheren Überlebensrate erzeugt. Dazu gehören Verwundung die Blastulae in einem größeren Ausmaß, hält die Nadel in Platz für 2 - 3 Sekunden nach der Verwundung und erneuten Besuch dann blastula Paare nach 15 Minuten eine erste Verbindung mit zusätzlichen Verwundung zu verstärken, falls erforderlich. Mit diesen zusätzlichen Empfehlungen, fast 100% der parabionts überlebte und blieb befestigt, und 75% von ihnen hatten eine gemeinsame Zirkulation.
Einzuarbeiten sind ein zusätzliches Element der experimentellen Steuerung an die Methode, parabiotic Embryonen zeigten hier tolerant zu sein auf einen Hitzeschock, so dass für die zeitliche Steuerung der Genexpression im parabiotic Kontext 20. Eine Einschränkung dieser Technik ist, dass in einigen Fällen die parabiotic Partner Embryonen nach parabiotic Fusion nicht in der gleichen Ebene liegen. Das kannmachen es schwierig, Agarose-Embryonen in LMP zu montieren Zellen in beiden Embryonen zu verfolgen gleichzeitig Zeitraffer-Mikroskopie. Um dieses potentielle Problem zu umgehen, sollte man planen mehrere parabiotic Embryonen zu erzeugen, die gewünschte Orientierung zu gewährleisten, erreicht wird. Alternativ können Embryonen aus den LMP mit einer feinen Pinzette und Pasteur-Pipette und wiedermontierten für die Bildgebung von einer anderen Perspektive wiedergewonnen werden. Das Ziel dieses Protokoll war eine Reihe von klaren, prägnanten Anweisungen geben videobasierte Tutorials, wie Sicherung der Entwicklung Blastulae zu erzeugen parabiotic Zebrabärblingembryonen chirurgisch zu begleiten.
Mit den wichtigsten Änderungen und zusätzliche Empfehlungen zur Erhöhung parabiont Überleben, wird dieses Protokoll hoffentlich Forscher befähigen, die verbunden Embryonen nutzen möchten Faktoren regulieren die Zellmigration, das Schicksal der Beschreibung und der Differenzierung in einer Reihe von Geweben und Zell Kontexten zu untersuchen.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Methyl cellulose | Sigma | M0387 | |
| Individual components for E3/HCR: | For 1L: 14,61g NaCl, 0,63g KCl, 2,43g CaCl2-2H2O, 1,99g MgSO4 | ||
| NaCl (Sodium chloride) | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| KCl (Potassium chloride) | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| CaCl2 (Calcium chloride dihydrate) | Sigma-Aldrich | 223506 | |
| MgSO4 (Magnessium sulfate heptahydrate) | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Hepes (1M ) buffer solution | ThermoFisher | 15630-080 | |
| Name | Company | Catalog Number | |
| Antibiotics: | |||
| Pen/Strep | gibco by Life technologies | 15140-120 | |
| Ampicilin sodium salt | Sigma Life Science | A0166 | |
| Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus | Sigma Life Science | K1377 | |
| Name | Company | Catalog Number | |
| 50 mg/ml Pronase from Streptomyces griseus | Roche | 11459643001 | |
| capillary glass used for needles (Capillary Glass & Filaments) | Sutter Instrument | ITEM#: BF 100-50-10 | |
| Teasing needles with wooden handles | Fisher Scientific | S07894 | |
| Glass Pasteur pipettes | Fisherbrand | 13-678-20A | |
| 10 ml pipette pump (green) (Pipette Pump Pipettor) | Novatech International | F37898-0000 | |
| 100 mm diameter/ 20 mm deep plastic petri dishes (PETRI DISH, 100/20 MM, PS, CLEAR, WITH VENTS, HEAVY DESIGN, 15 PCS./BAG ) |
Greiner Bio-one | 664102 | |
| Dextran, Cascade Blue, 10,000 MW, Anionic, Lysine Fixable | ThermoFisher | D-1976 | |
| PTU. working stock is 0.003% (50x is 0.15%). for 500 ml, 0.75 g N-Phenylthiourea | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| Tricaine (powder) (Tricaine Methanesulfonato, Tricaine-S) | Western Chemical Inc | MS 222 | |
| LMP agarose (Ultrapure LMP agarose) | Invitrogen | 16520100 | |
| plastic transfer pipette (just the wide ended one I think) | Fisherbrand | 137115AM | |
| Glass-bottom 6-well plates used for imaging | MatTek | P06G1.5-20-F | |
| plastic western gel loading tip fixed on the end of a wood-handled dissecting needle (GELoader tips) | Eppendorf | 22351656 | |
| glass cover slips, slides and vacuum grease if mounting for an upright microscope: | |||
| Vaccum grease ( Dow Corning® high-vacuum silicone grease colorless, weight 5.3 oz (tube) ) |
Dow Corning | Z273554 | |
| Glass cover slips | Corning Life Sciences | 2960-244 |
References
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