Abstract
parabiose chirurgicale de deux animaux de différentes origines génétiques crée un scénario unique pour étudier la cellule intrinsèque par rapport à des rôles de cellules extrinsèque pour les gènes candidats d'intérêt, les comportements migratoires des cellules, et des signaux sécrétées dans les milieux génétiques distincts. Parce que les animaux parabiose partagent une circulation commune, de sang ou d'un facteur par le sang d'un animal ne sera échangée avec son partenaire et vice-versa. Ainsi, les cellules et les facteurs moléculaires dérivées d'un fond génétique peuvent être étudiés dans le cadre d'un deuxième arrière-plan génétique. Parabiose des souris adultes a été largement utilisé pour le vieillissement de la recherche, le cancer, le diabète, l'obésité et le développement du cerveau. Plus récemment, parabiose des embryons de poisson zèbre a été utilisé pour étudier la biologie du développement de l'hématopoïèse. Contrairement aux souris, la nature transparente des embryons de poisson zèbre permet la visualisation directe des cellules dans le contexte parabiose, ce qui en fait une méthode unique et puissant pour étudier fmécanismes cellulaires et moléculaires FONDAMENTAUX. L'utilité de cette technique, cependant, est limitée par une courbe d'apprentissage abrupte pour générer les embryons de poisson zèbre parabiose. Ce protocole fournit une méthode étape par étape sur la façon de fusionner chirurgicalement l'blastulas de deux embryons de poisson zèbre de différentes origines génétiques pour étudier le rôle des gènes candidats d'intérêt. En outre, les embryons de poisson zèbre parabiose sont tolérants au choc thermique, ce qui rend le contrôle temporel de l'expression du gène possible. Cette méthode ne nécessite pas un système sophistiqué set-up et a de larges applications pour l' étude de la migration des cellules, la spécification du destin, et la différenciation in vivo au cours du développement embryonnaire.
Introduction
Création de mosaïques génétiques (chimères) entre type sauvage et les animaux génétiquement modifiés est une stratégie bien établie et classique pour étudier la cellule intrinsèque par rapport à des fonctions cellulaires extrinsèque de gènes candidats 1-6. Blastula transplantation chez le poisson zèbre a été largement utilisé pour générer des embryons chimères pour les études de cellules-autonomie 7-9. Selon le tissu d'intérêt, cependant, il peut être difficile de cibler de manière prévisible les cellules du donneur au tissu désiré (par exemple, le sang) 1-3, 7-9. Généticiens souris ont longtemps utilisé des méthodes chirurgicales parabiose pour générer des organismes conjoints avec une circulation partagée 10-14. Étant donné que les animaux parabiose partagent un flux sanguin commun, les interactions entre les cellules qui proviennent d'un animal avec des cellules d'un autre animal d'un arrière - plan génétique différent peuvent être étudiés 10-16. Récemment, le groupe de Karima Kissa a démontré avec élégance la capacité de cremangé embryons de poisson zèbre conjoints et ensuite utiliser ce système pour étudier souches hématopoïétiques et cellules progénitrices (HSPC) migration 15. En outre, parabiose zebrafish a récemment été utilisé pour étudier le rôle de la cadhérine endothéliale 5 dans la cellule souche hématopoïétique (CSH) émergence et la migration, 16 et d'étudier le rôle des cellules stromales dans le créneau HSPC au cours du développement zebrafish 17.
Contrairement à des souris, des embryons de poisson zèbre sont transparents et permettent une visualisation directe des cellules au cours du développement parabiose, ce qui rend le système unique et puissant. L'utilité de parabiose zebrafish, cependant, est limitée par une courbe d'apprentissage abrupte, et la chirurgie parabiose sur les embryons délicats peuvent être techniquement difficile sans instructions détaillées et démonstration visuelle. L'objectif de ce protocole est de fournir un ensemble d'instructions étape par étape claires pour accompagner des didacticiels vidéo sur la façon de générer des embryons de poisson zèbre pour étudier parabiosetemporelle de cellule intrinsèque, ou des fonctions cellulaires extrinsèque d'un gène (s) candidat par fusion chirurgicale de développer blastulas. Les modifications clés et des recommandations supplémentaires pour augmenter la survie des parabiont et de nouvelles applications expérimentales sont incluses.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ce protocole a été approuvé par le Comité soin et l'utilisation Animal Hospital de Boston Children. Ce protocole est modifié à partir d' une méthode précédemment publiée le 15.
1. Préparation des réactifs (jours ou semaines à l'avance)
- Préparer des plats d'agarose revêtues de 1,5%. Ajouter 1,5 g d'agarose à 100 ml de milieu Zebrafish E3 dans un flacon Erlenmeyer. Chaleur, dissoudre l'agarose, puis verser environ 5 ml en 100 mm de diamètre x 20 mm de boîtes de Pétri profondes.
Note: Ils sont utilisés pour dechorionation d'embryons (étape 3.1) et pour la chirurgie parabiose (étape 3.3). Rangez plats agarose revêtues à 4 ° C pendant quelques semaines; les sortir du réfrigérateur et réchauffer à température ambiante, le matin du jour de la chirurgie parabiose. - Préparer 4% de méthylcellulose. Dissoudre 4 g de poudre de cellulose de méthyle dans 100 ml de E3 dans une fiole Erlenmeyer avec un barreau d'agitation. Placer le ballon sur une plaque d'agitation à 4 ° C, réglé à la vitesse la plus basse, et laissez-le mélangerjusqu'à 2 jours.
- utiliser par intermittence une spatule pour briser les mottes blanches de la méthylcellulose. Les cristaux de méthylcellulose ne se dissolvent pas complètement à cette concentration. Lorsque la solution devient claire et semble homogène, sans grumeaux blancs restants, aliquote de la solution dans 1,5 ml microtubes et congeler à -20 ° C pour le stockage à long terme.
Note: Des concentrations plus faibles de la cellulose de méthyle peuvent être utilisés; cependant, ce pourcentage plus élevé, la méthylcellulose plus visqueuse a donné les meilleurs résultats.
- utiliser par intermittence une spatule pour briser les mottes blanches de la méthylcellulose. Les cristaux de méthylcellulose ne se dissolvent pas complètement à cette concentration. Lorsque la solution devient claire et semble homogène, sans grumeaux blancs restants, aliquote de la solution dans 1,5 ml microtubes et congeler à -20 ° C pour le stockage à long terme.
- Préparer Ringer (HCR) solution High Calcium. Pour 400 ml de solution HCR, mélanger 8 ml de NaCl 5M (116 mM final), 400 pi de KCl 3M (2,9 mM final), 800 pi de 5 M CaCl 2 (10 mM final), et 2ml de 1M HEPES (5 mM final) avec 390 ml de E3 médias.
Remarque: solution magasin HCR à 4 ° C pendant quelques semaines; réchauffer à température ambiante, le matin du jour de la chirurgie parabiose. - Préparer 5 - 6 pipettes Pasteur modifiés pour le transfertanneau blastula paires. chauffer brièvement l'extrémité de la pipette sur un brûleur Bunsen. Ensuite, en utilisant de grandes pinces, plier l'extrémité de la pipette à environ 45 ° C, tandis qu'il est encore chaud.
- Pour assurer qu'il n'y a pas de bords tranchants qui pourraient endommager les embryons, tenir la pointe de la pipette brièvement dans la flamme pendant environ 3 sec. Cela facilitera / polish la fin de la pipette. Cette pipette Pasteur en verre modifié est utilisé en conjonction avec une pompe 10 ml de pipette (figure 1) à l' étape 3.5.
- Préparer des outils d'aiguille de verre pour la couture chirurgicale de paires de blastula. Tirez 2 - 3 aiguilles de verre comme cela se fait pour la microinjection d'embryons de poisson zèbre. Utilisez laboratoire film pour fixer chaque aiguille de verre à l'extrémité d'une aiguille de taquineries bois ou en plastique manche (figure 1A). En utilisant des pinces, brisez l'extrémité de l'aiguille à un diamètre d'environ 20 - 30 um. Utiliser un micromètre pour guider cette étape (figure 1B).
Note: La taille de la needle pointe est importante. Si la pointe est trop grand, il devient difficile de contrôler avec précision et peut causer des dommages excessifs. Si la pointe est trop petit, il est difficile de suffisamment blesser les embryons.
2. Mise en place de couples reproducteurs de Zebrafish et Collection de Embryons (Jour -1 à jour 0)
- Mettre en place couples reproducteurs de poisson zèbre adulte. Mettre en place des poissons la nuit avant la chirurgie de parabiose doit être effectuée. Utilisez diviseurs pour séparer les mâles et les femelles. Pour augmenter les chances que les embryons désirés seront obtenus, mis en place plusieurs paires de chaque ligne. Nous constatons que généralement de 20 - 50% des couples se reproduire.
- Le lendemain matin, tirez les diviseurs et permettre l'accouplement. Recueillir des embryons en utilisant une passoire à thé fin de maille, puis les transférer sur une boîte de Pétri contenant du milieu de l' embryon E3 18.
- Micro-injecter les embryons comme souhaité (par exemple avec 25 pg d' ADN de plasmide, 200 pg d' ARNm ou à 1 - 6 ng morpholino) à 1 h de recouvrement. Leur permettrecroître jusqu'à ce stade 256 cellules. Si la construction d'expression d'ADN est placée sous le contrôle d'un promoteur de choc thermique (par exemple, hsp70, figure 4B), contrôler le moment de l' expression génique par la chaleur choquer les parabionts à 37 ° C à un stade ultérieur (par exemple., À 36 HPF ).
Remarque: Comme une alternative à un transgène fluorescent, le dextran fluorescent peut être ajouté à l'ADN, l' ARN, ou la combinaison d'injection morpholino (par exemple, le dextran, le bleu cascade à 2 mg / ml). Le colorant dextran ne sera pas interférer avec le développement normal et permettra de l'embryon injecté à être identifié sous la lumière fluorescente appropriée après la fusion parabiose. En variante, la parabiose d'une souche pigmentée (par exemple, AB) avec une souche non pigmentée (par exemple, Casper) pourrait être utilisé pour identifier l'embryon injecté à des stades ultérieurs. - Incuber les embryons à 28,5 ° C.Utilisation un stéréoscope pour surveiller leur développement périodiquement comme ils près de la dev 256 cellulesstade elopmental (environ 2,5 HPF).
Remarque: Si nécessaire, déplacer des embryons à des températures différentes pour assurer l' appariement de scène entre les partenaires parabiose (par exemple, des embryons de morpholino-injecté développent souvent plus lents que leurs homologues de l' ONU-injecté Shifting les embryons un-injecté à la température ambiante tandis que les embryons de morpholino-injecté sont placés. à 28,5 ° C entraînera dans leurs phases d'alignement après quelques heures de développement).
3. Génération de parabiose Zebrafish Embryons par Fusion chirurgicale de développement blastulas
- Comme les embryons approchent le stade 256 cellules (environ 2,5 HPF), transférer les embryons de l'arrière - plan génétique (c. -à- mutant génétique, lignées transgéniques et / ou manipulation génétique) dans des boîtes d'agarose revêtues distinctes (par exemple, un plat pour morpholino- embryons injectés et un second plat pour les embryons de contrôle). Vous pouvez également transférer les embryons à nettoyer, béchers de verre sans rayures ou verre boîtes de Pétri.
Remarque: Évitez d'utiliser des plats en plastique non couchés que les embryons vont coller à la matière plastique et être endommagé une fois hors de leurs chorions. - Décanter les médias E3 jusqu'à ce que suffisamment de liquide reste à couvrir les embryons (environ 7 - 10 ml). Ajouter 200 ul de 50 mg / ml de mélange de proteases isolées du liquide extracellulaire de Streptomyces griseus (protéases). Agiter les embryons doucement toutes les deux minutes.
- Lorsque 50% des embryons sont sortis de leurs chorions, ce qui prend généralement de 5 - 10 minutes, rincez-les trois fois avec un volume généreux (environ 15 - 20 ml) de milieu E3 d'embryons frais.
- Dechorionate tous les embryons restants dans leurs chorions en les tirant doucement dans la pipette Pasteur en verre modifié et puis doucement les dissiper. Une fois que les embryons ont été dechorionated et lavé, remplacer les médias E3 avec une solution HCR. Comme alternative aux protéases, retirez les chorions manuellement à l'aide d'une pince fine. But d'avoir 60 - 100 dechorembryons ionated disponibles pour chaque condition expérimentale.
Note: Ceci est plusieurs fois plus que sera finalement utilisé, mais de nombreux embryons sont susceptibles d'être endommagés lors de la manipulation ou la chirurgie pour parabiose. Une fois que les embryons sont dechorionated, gardez-les submergées et ne leur permettent pas de toucher la surface de l'eau, comme la tension superficielle provoque leur destruction. Gardez à l'esprit que l'utilisation d'une dose plus élevée de protéases permet aux embryons de sortir de leurs chorions plus tôt et d'une manière plus synchronisée. Lors de l'utilisation d'une dose plus faible de protéases, les embryons prennent plus de temps pour sortir de leurs chorions et de le faire d'une manière synchrone moins, ce qui peut entraîner une partie des embryons soient endommagés par une exposition prolongée aux protéases.
- Dechorionate tous les embryons restants dans leurs chorions en les tirant doucement dans la pipette Pasteur en verre modifié et puis doucement les dissiper. Une fois que les embryons ont été dechorionated et lavé, remplacer les médias E3 avec une solution HCR. Comme alternative aux protéases, retirez les chorions manuellement à l'aide d'une pince fine. But d'avoir 60 - 100 dechorembryons ionated disponibles pour chaque condition expérimentale.
- Lorsque 50% des embryons sont sortis de leurs chorions, ce qui prend généralement de 5 - 10 minutes, rincez-les trois fois avec un volume généreux (environ 15 - 20 ml) de milieu E3 d'embryons frais.
- Décongeler la méthylcellulose (faite à l'étape 1.2 ci-dessus) et centrifuger dans une centrifugeuse de table sur la vitesse max pendant 10 min pour sédimenter cristaux non dissous qui peuvent endommager les embryons ou la rupture de leur jaunes.
- Après centrifugation, utiliser la fraction supérieure claire (environ 75% du volume). Transfert 1 - gouttes de diamètre 1,5 cm de methylcellulose dans une boîte de Petri 1,5% d'agarose revêtues. Prenez soin d'éviter l'élaboration de l'un des cristaux granulées du fond du tube.
- Utiliser un marqueur pour prédéterminer la position de chaque gouttelette sur la face inférieure de la coupelle. Placez 12 - 15 gouttes (2 - worth de 3 aliquotes) de méthylcellulose par boîte de 100 mm de diamètre de Pétri. Préparer autant de plaques, au besoin, par expérience.
Remarque: Utilisez chaque gouttelette pour la fusion d'une paire de blastula unique. La marque désignera l'emplacement de chaque gouttelette une fois que le support est ajoutée à quel point les gouttes deviennent presque invisibles.
- Préparer un 40 ml aliquote de solution antibiotique supplémenté HCR par plat d'agarose revêtu préparé ci-dessus à l'étape 3.3. 40 ml à chaque aliquote d'ajouter HCR pénicilline-streptomycine à 50 U / ml d'ampicilline, à 50 U / ml et de la kanamycine à 0,5 pg/ Ml.
- Lorsque vous êtes prêt à effectuer blastula fusions, remplissez soigneusement chacun des plats contenant de la méthyl gouttelettes de cellulose avec 40 ml de la solution d'antibiotique supplémenté HCR. Si la solution HCR est ajouté trop rapidement, il peut perturber les gouttelettes.
- Fixer le verre modifiée pipette Pasteur (faite à l'étape 1.4 ci-dessus) à une pompe à pipette de 10 ml. Dans le cadre d' un stéréoscope recueillir un embryon dechorionated de l'arrière - plan (par exemple, un embryon de morpholino-injecté et un embryon de type sauvage).
- Avant de distribuer les deux embryons, utiliser la pipette Pasteur pour faire une petite dépression dans le milieu de la chute de la méthylcellulose, puis doucement déposer les deux embryons dans la dépression.
Remarque: Au cours du processus de transfert, tourner la pipette Pasteur légèrement vers le haut pour que les embryons se déposent dans le virage de la pipette Pasteur afin d'éviter leur prise de contact avec la surface du liquide en haut ou en bas de la pipette (qui peut conduire à their rupture).
- Avant de distribuer les deux embryons, utiliser la pipette Pasteur pour faire une petite dépression dans le milieu de la chute de la méthylcellulose, puis doucement déposer les deux embryons dans la dépression.
- Immédiatement après le dépôt des embryons dans la cellulose de méthyle, en utilisant une aiguille de taquin bois ou de matière plastique traitée avec une pointe de pipette de gel de chargement à l'extrémité (figure 1A) afin de repositionner soigneusement les embryons au sein de la méthyl cellulose de telle sorte que leurs pôles d'animaux sont directement toucher les uns les autres.
- Utiliser des mouvements de balayage doux à travers la méthylcellulose à proximité des embryons pour les repositionner sans les toucher directement. Laissez les embryons reposer pendant 5 min de sorte que la méthylcellulose réglera autour d'eux. Pendant ce temps, charger la paire suivante dans une autre goutte.
Remarque: Éviter tout contact direct avec les embryons et de prendre soin de ne pas toucher une partie de la vésicule ombilicale, qui sera facilement se rompre.
- Utiliser des mouvements de balayage doux à travers la méthylcellulose à proximité des embryons pour les repositionner sans les toucher directement. Laissez les embryons reposer pendant 5 min de sorte que la méthylcellulose réglera autour d'eux. Pendant ce temps, charger la paire suivante dans une autre goutte.
- Utilisation de l'outil aiguille de verre, enroulé soigneusement chaque embryon à leur point de contact. Avec un mouvement de couture douce, les cellules du premier embryon peut être tiré dans le second embryon, puis de nouveau.A la fin de ce mouvement, maintenir l'aiguille en place pendant 2 - 3 sec puis dessiner loin très lentement.
Note: Il y a une période d'environ 2 - 3 sec après que les embryons sont blessés où les deux tissus semblent être plus adhésif et plus susceptibles de joindre les uns aux autres. Ainsi, nous croyons que la tenue de l'aiguille en place brièvement après la blessure aide à garder les tissus blessés de chaque embryon en contact pendant la période initiale de temps immédiatement après la blessure. - Permettre à ces embryons reposer pendant 10 - 15 min à température ambiante. En attendant, continuer d'assembler des nouvelles paires dans d'autres gouttes de méthylcellulose. Au bout de 10 - 15 min, évaluer si la première paire est resté attaché (figure 2A).
Remarque: Si les embryons sont plus attachés, répétez le processus de couture aussi longtemps que les embryons sont plus jeunes que autour de la scène épibolie 30%. Typiquement, cela permet jusqu'à trois tentatives pour assembler les embryons ensemble. Si les embryons semblent avoir maintenu une pièce jointe, mais le connection ne sont pas importantes, effectuer des coutures supplémentaires au niveau du bord de la connexion pour le renforcer. Évitez de secouer ou de déplacer la vaisselle durant les périodes de chirurgie et d'incubation parabiose.
Note: En dépit de leur stade de développement précoce et la fragilité perçue, les masses cellulaires des embryons peuvent tolérer une quantité substantielle de manipulation (ie, blessant et couture), et encore se développer normalement. Le jaune, cependant, peut se rompre avec seulement le moindre contact, tuant l'embryon. Lorsque coudre les deux blastulas avec l'aiguille de verre, ne pas entrer en contact avec l'interface entre la masse cellulaire et le jaune de chaque embryon. - Incuber les embryons O / N à 28,5 ° C dans le même plat et les médias (ne pas changer les médias). Le matin suivant, les embryons se sont déplacés hors des gouttelettes de méthylcellulose essentiellement dissous. Retirez tous les embryons qui ne sont pas fusionnés avec succès. Décanter les médias et le remplacer par un nouveau 25 ml E3.
Remarque: Si vous travaillez avec unsouche pigmentée, ajouter 500 ul de 0,15% (50x) phénylthiourée (PTU) à une concentration finale de 0,003% pour bloquer la pigmentation. Embryons devront rester en permanence en PTU pour maintenir la suppression de la pigmentation.
4. Microscope Setup, l'acquisition d'images, traitement et analyse
- Préparer 0,8% à faible point de fusion (LMP) agarose: Ajouter 0,8 g d'agarose LMP à 100 ml E3 et de la chaleur jusqu'à dissolution complète. Bien chaud, aliquote 1 ml d'agarose LMP dans 1,5 ml microtubes dans un C bloc 37 ° de chauffage. L'agarose LMP restera fondu à 37 ° C. Ajouter 40 pi de 4 mg / ml (25x), pH 7,0 tricaïne à chaque aliquote de 1 ml d'agarose LMP à 37 ° C. Remarque: Si vous travaillez avec une souche pigmentée, ajouter 20 pi de 0,15% (50x) PTU à chaque aliquote 1ml.
- Stocker l'agarose LMP restant pendant plusieurs mois dans scellés tubes de 50 ml à 4 ° C.
- Anesthésier les embryons parabiose devant être imagé par l'addition de 1 ml de 4 mg / ml (25x), pH 7,0 tricaïneaux 25 ml de l'E3 que les embryons sont déjà.
- Remuer doucement le plat de sorte que les embryons en commun dans le milieu. Puis, à l'aide d'une pipette de transfert en plastique large pointe établit les embryons en aussi peu de liquide que possible. Tournez la pipette en position verticale et rebondir doucement les embryons afin qu'ils déposent au fond même de la pipette.
- Les embryons au fond de la pipette, transférer à une aliquote de 1 ml d'agarose LMP en touchant légèrement la pointe de la pipette à la surface de l'agarose. Évitez le transfert du liquide en excès car cela va diluer l'agarose.
- Après l'expulsion de l'excès de liquide de la pipette, utiliser la pipette pour mélanger doucement les embryons dans le agarose, puis utilisez la pipette pour transférer la totalité de l'agarose et des embryons pour le bien d'un fond de verre (n ° 1,5 lamelle), 6- bien assiette.
Remarque: Assurez-vous de jeter la pipette après le transfert des embryons à la plaque d'imagerie. agarose résiduel sera fixé à l'intérieur de la pipette, rendering inefficace pour une utilisation ultérieure. Au contraire, utiliser une nouvelle pipette à chaque fois. - Dans le cadre d'un stéréoscope, utilisez une pointe de pipette gel chargement fixé sur l'extrémité d'une aiguille de taquineries bois manipulé pour positionner les embryons vers le bas vers le couvercle en verre (pour assurer qu'ils sont dans la distance de travail de l'objectif du microscope) et dans l'orientation souhaitée pour l'imagerie.
Remarque: Repositionner en continu jusqu'à ce que l'agarose est complètement réglé. Prendre soin de monter les embryons parabiose selon lequel l'embryon de la paire est à imager. Compte tenu de l'orientation aléatoire des embryons conjoints, pour certaines paires, il peut être difficile d'imaginer les deux embryons. Dans ce scénario, récupérer les embryons à partir de l'agarose à l'aide d'une pince et une pipette de transfert en plastique large pointe puis remontez pour l'imagerie d'une perspective différente. - Une fois que l'agarose a fixé, couvrir avec 2 - 3 ml de E3 supplémenté avec tricaïne (et PTU si nécessaire).
- Image les embryons en utilisant un grand champ epi-fluorescence inversée, lasconfocal er-balayage, ou tourner le disque microscope confocal. Sélectionnez l'objectif le plus approprié pour l'imagerie souhaitée. Pour un champ de vision entier embryon, utiliser un objectif 4x. Sélectionnez un grossissement plus élevé, comme un objectif 20x, à l' image d' un tissu spécifique 16, 19.
Remarque: Si vous utilisez un microscope droit, monter en agarose LMP (comme ci-dessus) sur une lamelle de verre. Inversez la lamelle de verre sur une lame de microscope en verre qui a un anneau de graisse à vide rempli avec le même E3-tricaïne-PTU 16, 19. - Processus images acquises en utilisant des logiciels d'analyse d'images libres tels que NIH Image J / FIDJI 16, 19.
Remarque: Comptez le nombre de cellules et de quantifier la dynamique tels que la migration cellulaire et la division cellulaire en utilisant la segmentation et le suivi des algorithmes 16, 19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Conformément aux études publiées antérieurement 15, avec succès la fusion parabiose des embryons de poisson zèbre dépend de la mise en scène et l' orientation des deux embryons et la concentration de méthylcellulose. Avec seulement quelques outils simples et peu coûteux, blastulas développement chirurgicalement fusionnées ont été générés qui a grandi dans des embryons parabiose avec la circulation partagée. Ces outils comprennent une pipette modifiée Pasteur, une pompe à pipette de 10 ml, et le bois manipulé aiguilles taquineries qui ont été utilisés seuls ou avec une aiguille de pointe de gel de chargement ou de microinjection de verre fixé à l'extrémité par le laboratoire-film (Figure 1).
Après avoir placé les deux blastulas à 4% de cellulose de méthyle et en utilisant la pointe de gel de chargement pour les orienter avec leurs pôles d'animaux faisant face (figure 2A), les embryons ont été soigneusement blessés à leur point de contact avec la microinjection de verre nEedle (figure 2B). Un degré plus élevé de blesser (comparer la figure 2B à la figure 2C), et de revisiter paires d'embryons pour soutenir une connexion initiale avec une blessure supplémentaire, a augmenté la probabilité des embryons maintenir une connexion qui a abouti à la fusion réussie (Figure 3A-C, Film 1) , et sans défauts morphologiques supplémentaires ou un retard de développement. Quand cela est fait avec soin, près de 100% des paires d'embryons ont été fusionnées, même si une fraction de ces embryons (environ 25%) n'a jamais établi une circulation saine dans les deux moitiés. En orientant les deux blastulas avec leurs pôles d'animaux directement alignés, fusions fiables tête-à-tête ou le jaune sac-à-jaune sac ont été générées avec la circulation partagée. Dans la plupart des cas, les embryons avaient deux cœurs de pompage une circulation commune partagée (Figure 3D).
Pour confirmer que les embryons en effet partagé leur circulation, le dextran fluorescent était injète en circulation, ce qui pourrait être vu ensuite circuler à travers les deux embryons (film 2). En outre, les embryons transgéniques qui avaient GFP + érythrocytes (LCR: eGFP) ont été fusionnés à des embryons qui avaient mCherry + cellules endothéliales vasculaires (flk1: HRAS-mCherry). Par 48 HPF, GFP + érythrocytes ont été observés circulant à travers le flk1: HRAS-mCherry partenaire embryon (figure 4A et Movie 3). Pour élargir l'utilité du système parabiose, contrôle temporel de l'expression génique a été ajouté. Avant la fusion, l' un des deux embryons ont été injectés avec une hsp70: eGFP 20 construction d' ADN. Bien que les embryons fusionnés croissaient à 28,5 ° C, aucune fluorescence n'a été observée. En revanche, après un bref choc thermique de 30 min à 37 ° C, un signal de GFP clair était visible dans l' un des deux embryons (figure 4B). Dans certains cas , les cellules sont GFP +observé circulant dans le partenaire embryon non injecté. Ainsi, en plaçant un gène d'intérêt sous le contrôle d'un promoteur de choc thermique permet un contrôle temporel supplémentaire aux études portant sur les fonctions cellulaires intrinsèques ou extrinsèques des cellules gènes candidats.
Figure 1. Outils pour générer parabiose Zebrafish Embryons.
(A) l' image annotée montre les outils utilisés pour la fusion chirurgicale de développement blastulas. Les outils comprennent une pipette Pasteur modifié (en haut), qui est utilisé en conjonction avec une pompe de pipette de 10 ml (vert). Bois traité aiguilles taquineries sont utilisés seuls ou avec une pointe de gel de chargement pipette en plastique ou tiré microinjection de verre aiguilleté fixée à l'extrémité avec le laboratoire-film. (B) L' image montre les extrémités de trois verre microinjection nécessitéles qui ont été rompu avec une pince à différents diamètres. Les aiguilles sont couchés sur le dessus d'un micromètre; les plus petites lignes sont espacées de 10 um d' intervalle. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Fusion chirurgicale de développement blastulas.
Des images de haute grossissement montrent deux embryons de poisson zèbre au stade élevé de développement, orientées avec leurs pôles d'animaux faisant face, avant couture chirurgicale (A), immédiatement après la blessure minimale (B), et après une blessure plus importante (C). 20 minutes plus tard , il est évident que les embryons ont été fusionnées avec succès sur la base du pont continu de cellules entre les deux blastulas (D). Échellebarre représente 250 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Développement de parabiose embryons de poissons zèbres.
(AC) Images montrent une vue toute-parabiont du développement précoce juste après la blessure (A) et que les embryons continuent à se développer et subissent épibolie (B et C) Ces images correspondent à film 1. (D) L' image montre une paire d'embryons parabiose à 36 hPF. Les embryons sont reliés à leurs sacs de jaune, ont deux coeurs et de partager une circulation commune. Les barres d'échelle représentent 250 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. Visualizing parabiose avec des protéines fluorescentes génétiquement encodés.
(A) Images (fluorescence seul, droit; superposition avec la lumière transmise, gauche) montrent la région de la tête d'embryons conjoints à 48 HPF. L'embryon bas de cette paire est transgénique pour lcr: eGFP (erythroctyes, vert) , tandis que son partenaire ( en haut) est transgénique pour flk1: HRAS-mCherry, qui marque les cellules endothéliales vasculaires (rouge). érythrocytes verts peuvent être vus circulant dans l'embryon de partenaire. Cette image correspond à 3. Film (B) L'embryon de gauche dans cette paire a été injecté avec un hsp70: eGFP construire au stade d' une cellule, puis fusionnée à un partenaire non-injecté ( à droite). Lorsque les animaux ont été un choc thermique à 37 ° C pendant 30 min à 36 HPF, la fluorescence verte de la GFP a été observée dans le chier ft embryon à 60 HPF. Les barres d'échelle représentent 500 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Film 1. Le développement précoce de chirurgicalement fusionné blastulas zebrafish. (Clic pour télécharger).
Film montre le développement précoce d'une paire de blastulas zebrafish chirurgicalement fusionné. Épibolie peut être vu se produisant simultanément dans chaque embryon. Ce film est lié à la figure 3A-C.
2.jpg "/>
Film 2. Injection dextran fluorescent illumine une circulation partagée. (Clic droit pour télécharger).
Film montre dextran fluorescent étant injecté dans la veine cardinale commune d'une paire d'embryons parabiose à 60 HPF. Le colorant fluorescent peut être vu circulant ensuite à travers les deux embryons.
Film 3. sang vert qui coule à travers les vaisseaux rouges.mov "> (clic pour télécharger).
Film montre la région de la tête d'embryons conjoints à 48 HPF. L'embryon bas de cette paire est transgénique pour lcr: eGFP (erythroctyes, vert) , tandis que son partenaire ( en haut) est transgénique pour flk1: HRAS-mCherry, qui marque les cellules endothéliales vasculaires (rouge). érythrocytes verts sont vus circulant dans l'embryon de partenaire. Ce film est lié à la figure 4A.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fusion parabiose a été un outil puissant pour étudier les fonctions cellulaires de gènes candidats dans des modèles murins adultes et d' embryons de poulet 10-14. Plus récemment, une méthode blastula de fusion a été décrite pour la génération d' embryons de poisson zèbre conjoints 15. Dans le présent protocole, des didacticiels vidéo sont utilisés pour démontrer et mieux décrire la méthodologie pour la création d'embryons de poisson zèbre parabiose de différentes origines génétiques afin d'étudier les rôles temporels, cellules intrinsèque et cellules extrinsèque de gènes candidats d'intérêt dans le développement hématopoïétique et au-delà.
La méthode décrite dans le présent document a été récemment utilisé pour suivre HSC émergence dans un embryon, la migration par le sang-circulation à un embryon de fond génétique différent, et la greffe subséquente et la différenciation 16. En accord avec les résultats, la mise en scène et de l'embryon positionnement du groupe Kissa ont été trouvés pour déterminer le taux de réussiteanatomique et de la nature de la fusion parabiose. Avec quelques modifications clés du protocole, parabionts ont été générés avec un taux de survie nettement plus élevé. Ceux-ci comprennent en blessant l'blastulas à un degré plus élevé, en maintenant l'aiguille en place pendant 2 - 3 sec après la blessure, puis revenir sur blastula paires après 15 min pour renforcer une connexion initiale avec une blessure supplémentaire, si nécessaire. Avec ces recommandations supplémentaires, près de 100% des parabionts a survécu et est resté attaché, et 75% d'entre eux partagent une circulation commune.
Pour incorporer un élément supplémentaire de contrôle expérimental à la méthode, les embryons parabiose sont démontrées ici pour être tolérant à un choc thermique, permettant un contrôle temporel de l' expression des gènes dans le contexte parabiose 20. Une limitation de cette technique est que, dans certains cas, les embryons partenaires parabiose ne sont pas dans le même plan après fusion parabiose. Ceci peutil est difficile de monter des embryons en agarose LMP pour suivre les cellules dans les deux embryons simultanément en utilisant la microscopie time-lapse. Pour contourner ce problème potentiel, il faut prévoir de générer plusieurs embryons parabiose pour assurer l'orientation désirée. Alternativement, les embryons peuvent être récupérés à partir de la LMP en utilisant une pince fine et pipette Pasteur et re-montés pour l'imagerie d'une perspective différente. L'objectif de ce protocole est de fournir un ensemble de instructions claires et concises pour accompagner des didacticiels vidéo sur la façon de développer chirurgicalement fusible blastulas pour générer des embryons de poisson zèbre parabiose.
Avec les modifications clés et des recommandations supplémentaires pour augmenter la survie des parabiont, ce protocole, nous l'espérons habiliter les chercheurs qui souhaitent utiliser des embryons conjoints pour étudier les facteurs régissant la migration des cellules, la spécification du destin, et la différenciation dans une gamme de tissus et contextes cellulaires.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Methyl cellulose | Sigma | M0387 | |
| Individual components for E3/HCR: | For 1L: 14,61g NaCl, 0,63g KCl, 2,43g CaCl2-2H2O, 1,99g MgSO4 | ||
| NaCl (Sodium chloride) | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| KCl (Potassium chloride) | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| CaCl2 (Calcium chloride dihydrate) | Sigma-Aldrich | 223506 | |
| MgSO4 (Magnessium sulfate heptahydrate) | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Hepes (1M ) buffer solution | ThermoFisher | 15630-080 | |
| Name | Company | Catalog Number | |
| Antibiotics: | |||
| Pen/Strep | gibco by Life technologies | 15140-120 | |
| Ampicilin sodium salt | Sigma Life Science | A0166 | |
| Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus | Sigma Life Science | K1377 | |
| Name | Company | Catalog Number | |
| 50 mg/ml Pronase from Streptomyces griseus | Roche | 11459643001 | |
| capillary glass used for needles (Capillary Glass & Filaments) | Sutter Instrument | ITEM#: BF 100-50-10 | |
| Teasing needles with wooden handles | Fisher Scientific | S07894 | |
| Glass Pasteur pipettes | Fisherbrand | 13-678-20A | |
| 10 ml pipette pump (green) (Pipette Pump Pipettor) | Novatech International | F37898-0000 | |
| 100 mm diameter/ 20 mm deep plastic petri dishes (PETRI DISH, 100/20 MM, PS, CLEAR, WITH VENTS, HEAVY DESIGN, 15 PCS./BAG ) |
Greiner Bio-one | 664102 | |
| Dextran, Cascade Blue, 10,000 MW, Anionic, Lysine Fixable | ThermoFisher | D-1976 | |
| PTU. working stock is 0.003% (50x is 0.15%). for 500 ml, 0.75 g N-Phenylthiourea | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| Tricaine (powder) (Tricaine Methanesulfonato, Tricaine-S) | Western Chemical Inc | MS 222 | |
| LMP agarose (Ultrapure LMP agarose) | Invitrogen | 16520100 | |
| plastic transfer pipette (just the wide ended one I think) | Fisherbrand | 137115AM | |
| Glass-bottom 6-well plates used for imaging | MatTek | P06G1.5-20-F | |
| plastic western gel loading tip fixed on the end of a wood-handled dissecting needle (GELoader tips) | Eppendorf | 22351656 | |
| glass cover slips, slides and vacuum grease if mounting for an upright microscope: | |||
| Vaccum grease ( Dow Corning® high-vacuum silicone grease colorless, weight 5.3 oz (tube) ) |
Dow Corning | Z273554 | |
| Glass cover slips | Corning Life Sciences | 2960-244 |
References
- Zon, L. I., Orkin, S. H. Hematopoiesis: An evolving paradigm for stem cell biology. Cell. 132 (4), 631-644 (2008).
- Dzierzak, E., Speck, N. A. Of lineage and legacy: the development of mammalian hematopoietic stem cells. Nat Immunol. 9 (2), 129-136 (2008).
- Li, P., et al. Epoxyeicosatrienoic acids enhance embryonic haematopoiesis and adult marrow engraftment. Nature. 523 (7561), 468-471 (2015).
- Tam, P. P., Rossant, J. Mouse embryonic chimeras: tools for studying mammalian development. Development. 130 (25), 6155-6163 (2003).
- Tanaka, M., Gertsenstein, M., Rossant, J., Nagy, A. Mash2 acts cell autonomously in mouse spongiotrophoblast development. Dev. Biol. 190 (1), 55-65 (1997).
- Morin-Kensicki, E. M., Faust, C., LaMantia, C., Magnuson, T. Cell and tissue requirements for the gene eed during mouse gastrulation and organogenesis. Genesis. 31 (4), 142-146 (2001).
- Ho, R. K., Kane, D. A. Cell-autonomous action of zebrafish spt-1 mutation in specific mesodermal precursors. Nature. 348 (6303), 728-730 (1999).
- Parker, L., Stainier, D. Y. Cell-autonomous and non-autonomous requirements for the zebrafish gene cloche in hematopoiesis. Development. 126 (12), 2643-2651 (1999).
- Liao, E. C., Trede, N. S., Ransom, D., Zapata, A., Kieran, M., Zon, L. I. Non-cell autonomous requirement for the bloodless gene in primitive hematopoiesis of zebrafish. Development. 3 (3), 649-659 (2002).
- Kamran, P., Sereti, K. I., Zhao, P., Ali, S. R., Weissman, I. L., Ardehali, R. Parabiosis in mice: a detailed protocol. J Vis Exp. (80), (2013).
- Wagers, A. J., Sherwood, R. I., Christensen, J. L., Weissman, I. L. Little evidence for developmental plasticity of adult hematopoietic stem cells. Science. 297 (5590), 2256-2259 (2002).
- Hervey, G. R. The effects of lesions in the hypothalamus in parabiotic rats. J. Physiol. 145 (2), 336-352 (1959).
- Goldman, D. C., Bailey, A. S., Pfaffle, D. L., Al Masri, A., Christian, J. L., Fleming, W. H. BMP4 regulates the hematopoietic stem cell niche. Blood. 114 (20), 4393-4401 (2009).
- Dieterlen-Lièvre, F., Martin, C., Beaupain, D. Quail-chick chimaeras and parabionts: several new models to investigate early developmental events in the haemopoietic system. Folia Biol (Praha). 25 (5), 293-295 (1979).
- Demy, D. L., Ranta, Z., Giorgi, J. M., Gonzalez, M., Herbomel, P., Kissa, K. Generating parabiotic zebrafish embryos for cell migration and homing studies). Nat. Methods. 10 (3), 256-258 (2013).
- Anderson, H., et al. Hematopoietic stem cells develop the absence of endothelial cadherin 5 expression. Blood. 126 (26), 2811-2820 (2015).
- Murayama, E., Sarris, M., Redd, M., Le Guyader, D., Vivier, C., Horsley, W., Trede, N., Herbomel, P. NACA deficiency reveals the crucial role of somite-derived stromal cells in haematopoietic niche formation. Nat Commun. 28 (6), 8375 (2015).
- Shah, D. I., et al. Mitochondrial Atpif1 regulates haem synthesis in developing erythroblasts. Nature. 491 (7425), 608-612 (2012).
- Tamplin, O. J., et al. Hematopoietic stem cell arrival triggers dynamic remodeling of the perivascular niche. Cell. 160 (1-2), 241-252 (2015).
- Adám, A., Bártfai, R., Lele, Z., Krone, P. H., Orbán, L. Heat-inducible expression of a reporter gene detected by transient assay in zebrafish. Exp. Cell Res. 256 (1), 282-290 (2000).
