Abstract
parabiosis כירורגי של שתי חיות של רקע גנטי שונה יוצר תרחיש ייחודי ללמוד תא פנימי לעומת תפקידי תא-חיצוני עבור גני מועמדים של עניין, התנהגויות נדידה של תאים, אותות מופרשים הגדרות גנטיות מובהקות. בגלל חי parabiotic לשתף תפוצה משותפת, כל דם או גורם מובל דם חיה אחת יתחלף עם השותף שלה, ולהיפך. לכן, תאים וגורמים מולקולריים מרקע גנטי אחד ניתנים ללמוד בהקשר של רקע גנטי שני. Parabiosis של עכברים בוגרים כבר נעשה שימוש נרחב להזדקנות מחקר, סרטן, סוכרת, השמנת יתר, והתפתחות המוח. לאחרונה, parabiosis של עוברי דג הזברה נעשה שימוש כדי ללמוד את הביולוגיה ההתפתחותית של hematopoiesis. בניגוד לעכברים, האופי השקוף של עוברי דג זברה מתיר הדמיה הישירה של תאים בהקשר parabiotic, מה שהופך אותו שיטה חזקה באופן ייחודי על חקירת fמנגנונים תאיים ומולקולריים undamental. השירות של טכניקה זו, לעומת זאת, הוא מוגבל על ידי עקומת למידה תלולה להפקת עוברי דג הזברה parabiotic. פרוטוקול זה מספק שיטת צעד אחר צעד כיצד בניתוח פתיל blastulae של שני עוברי דג זברה של רקע גנטי שונה לחקור את התפקיד של גני מועמדים מעניינים. בנוסף, עוברי דג הזברה parabiotic סובלניים הלם חום, מה שהופך שליטה הזמני של ביטוי גנים אפשריים. שיטה זו אינה דורשת הגדרה משוכללת בעל יישומים רחבים ללימוד נדידת תאים, מפרט גורל, והבחנת in vivo במהלך התפתחות עוברית.
Introduction
יצירת פסיפסים גנטיים (מפלצות) בין wild-type ובעלי החיים מהונדסים גנטיים היא אסטרטגיה ומבוססת וקלסי לחקירת תא-מהותי לעומת פונקציות תא-חיצוני של גני המועמדים 1-6. Blastula השתלת דג הזברה נוצלה נרחב כדי לייצר עובר chimeric ללימודים של תא-אוטונומיה 7-9. בהתאם הרקמה של עניין, לעומת זאת, זה יכול להיות מאתגר למקד תאים תורמים כצפוי לרקמה הרצויה (למשל, דם) 1-3, 7-9. גנטיקאים עכבר זמן מנוצלים שיטות כירורגיות parabiotic ליצור אורגניזמים סיאמיים עם תפוצה משותפת 10-14. בגלל חי parabiotic לשתף דם משותף, אינטראקציות בין תאים שמקורם מן חי אחד עם תאים של בעלי החיים האחרים של רקע גנטי שונה ניתן ללמוד 10-16. לאחרונה, הקבוצה של כרימה Kissa באלגנטיות הפגינו את היכולת creאכלו עוברי דג הזברה סיאמיים ולאחר מכן להשתמש במערכת הזאת כדי ללמוד גזע hematopoietic ו תא אב (HSPC) ההגירה 15. בנוסף, parabiosis דג הזברה שימש לאחרונה לחקור את התפקיד של cadherin אנדותל 5 בתא גזע hematopoietic (HSC) הופעתה והגירה, 16 ו כדי ללמוד את התפקיד של תאי סטרומה בגומחה HSPC במהלך ההתפתחות דג הזברה 17.
בניגוד עכברים, עוברי דג הזברה הם שקוף ולאפשר להדמיה ישירה של תאים במהלך ההתפתחות parabiotic, מה שהופך את מערכת רבת עוצמה באופן ייחודי. השירות של parabiosis דג זברה, לעומת זאת, הוא מוגבל על ידי עקום למידה תלולה, וניתוחי parabiotic על העוברים העדינים יכול להיות מאתגר מבחינה טכנית ללא הדרכה מפורטת והדגמה ויזואלית. מטרת פרוטוקול זה היא לספק סט של ברור, צעד-אחר-צעד ללוות הדרכות וידאו מבוסס על איך ליצור עוברי דג הזברה parabiotic ללימודזמני, תא-מהותי, או פונקציות חיצוני תאים של גן מועמד (ים) על ידי היתוך כירורגית לפתח blastulae. שינויים עיקריים והמלצות נוספות להישרדות parabiont הגדלה ויישומים ניסיוניים חדשים כלולים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
פרוטוקול זה אושר על ידי הטיפול בבעלי החיים החולים לילדים בבוסטון ועדת השימוש. פרוטוקול זה הוא שונה משייט שפורסם בעבר 15.
1. הכנת ריאגנטים (ימים או שבועות מראש)
- כן 1.5% מנות agarose מצופה. להוסיף agarose 1.5 גרם ל -100 מיליליטר דג הזברה E3 בינוני נאד Erlenmeyer. חום, לפזר את agarose, ואז לשפוך כ 5 מ"ל ל 100 מ"מ קוטר x 20 מ"מ צלחות פטרי עמוק.
הערה: אלה משמשים dechorionation של עוברים (שלב 3.1) ועבור ניתוח parabiotic (שלב 3.3). אחסן מנות agarose מצופה ב 4 מעלות צלזיוס במשך כמה שבועות; לקחת אותם מהמקרר וחם כדי RT בבוקר ביום הניתוח parabiotic. - כן תאי מתיל 4%. ממסי 4 גרם של אבקה תאית מתיל 100 מיליליטר של E3 בתוך בקבוק Erlenmeyer עם בר ומערבב. מניחים את הבקבוק על צלחת ומערבבים על 4 מעלות צלזיוס, מוגדר במהירות הנמוכה ביותר, ולתת לו לערבבעד 2 ימים.
- לסירוגין להשתמש במרית להתפרק בגושים לבנים של תאית מתיל. הגבישים התאיים מהתיל אינם נמסים לחלוטין בריכוז הזה. כאשר הפתרון מתבהר ומופיע הומוגנית ללא גושים לבנים שנותרו, aliquot הפתרון לתוך צינורות 1.5 מיליליטר microfuge ולהקפיא ב -20 ° C עבור אחסון לטווח ארוך.
הערה: ריכוזים נמוכים של תאית מתיל יכול לשמש; עם זאת, אחוז גבוה זה, תאית מתיל צמיגה יותר הניבה את התוצאות הטובות ביותר.
- לסירוגין להשתמש במרית להתפרק בגושים לבנים של תאית מתיל. הגבישים התאיים מהתיל אינם נמסים לחלוטין בריכוז הזה. כאשר הפתרון מתבהר ומופיע הומוגנית ללא גושים לבנים שנותרו, aliquot הפתרון לתוך צינורות 1.5 מיליליטר microfuge ולהקפיא ב -20 ° C עבור אחסון לטווח ארוך.
- הכן סידן גבוה Ringer (HCR) פתרון. כדי להפוך 400 מ"ל של תמיסת HCR, לערבב 8 מ"ל של 5M NaCl (116 מ"מ הסופי), 400 μl של 3M KCl (2.9 מ"מ הסופי), 800 μl של 5M CaCl 2 (10 מ"מ הסופי), ו 2ml של 1M HEPES (5 מ"מ סופי) עם 390 מיליליטר של תקשורת E3.
הערה: פתרון חנות HCR ב 4 מעלות צלזיוס במשך כמה שבועות; חם RT בבוקר ביום הניתוח parabiotic. - כן 5 - 6 טפטפות פסטר שונים להעברהלצלצל blastula זוגות. בקצרה לחמם סוף פיפטה מעל מבער בונזן. לאחר מכן, בעזרת מלקחיים גדולים, תכופף את קצהו של פיפטה כ 45 מעלות צלזיוס בזמן שהוא עדיין חם.
- כדי לוודא שאין קצוות חדים שעלולים לגרום נזק עוברי, להחזיק את קצה פיפטה בקצרה להבה במשך כ 3 שניות. זה יהיה להחליק / פולני סוף פיפטה. פיפטה פסטר שונה זכוכית זו משמשת בשילוב עם משאבת פיפטה 10 מ"ל (איור 1) בשלב 3.5 להלן.
- הכין כלי מחט זכוכית ספרוני כירורגית של זוגות blastula. משוך 2 - 3 מחטים זכוכית כפי שנעשה עבור microinjection של עוברי דג הזברה. השתמש סרט במעבדה כדי לתקן כל זכוכית מחט עד סוף המחט מתגרה עם קורות עץ או פלסטיק עם ידיות (איור 1 א). בעזרת מלקחיים, לנתק סוף המחט בקוטר של כ 20 - 30 מיקרומטר. השתמש מיקרומטר הבמה כדי להנחות את הצעד הזה (איור 1B).
הערה: הגודל של neטיפ edle חשוב. אם קצה גדול מדי הוא הופך להיות קשה לשלוט במדויק והוא יכול לגרום נזק מוגזם. אם הקצה קטן מדי קשה מספיק לפצוע את העוברים.
2. הגדרת זוגות רבייה של דג הזברה אוסף של עוברים (יום -1 עד יום 0)
- הגדרת זוגות רבייה של דג זברה מבוגרת. הגדרת דגים בלילה שלפני הניתוח parabiosis הוא להתנהל. השתמש חוצץ להפריד זכרים ונקבות. כדי להגדיל את הסיכויים כי את העוברים הרצויים יושגו, להגדיר כמה זוגות של כל שורה. אנו מוצאים כי בדרך כלל 20 - 50% של הזוגות יהיו שרצים.
- למחרת בבוקר, למשוך את החוצצים ולאפשר הזדווגות. איסוף כל עוברים באמצעות מסננת תה משובחת-רשת, ולאחר מכן להעביר אותם בצלחת פטרי המכילה בינוני עובר E3 18.
- מיקרו-להזריק עוברים על פי הצורך (למשל, עם DNA פלסמיד 25 pg, 200 mRNA pg, או עם 1 - 6 morpholino נ"ג) בתוך שעה 1 של האוסף. לאפשר להםלגדול עד שלב 256 תאים. אם לבנות ביטוי DNA מושם תחת שליטה של מקדם הלם החום (למשל, hsp70, איור 4B), לשלוט בעיתוי של ביטוי גנים על ידי חום מזעזע את parabionts ב 37 ° C בשלב מאוחר יותר (למשל. כ -36 hpf ).
הערה: כחלופה על transgene ניאון, ניאון dextran ניתן להוסיף את ה- DNA, RNA, או שילוב הזרקת morpholino (למשל, dextran, כחול מפל ב 2 מ"ג / מ"ל). לצבוע dextran לא יפריע להתפתחות תקינה, ויאפשר את העובר מוזרק להיות מזוהה תחת אור פלורסנט המתאים לאחר היתוך parabiotic. לחלופין, parabiosis של זן פיגמנט (למשל, AB) עם זן שאינו פיגמנט (למשל, קספר) יכול לשמש כדי לזהות את העובר מוזרק בשלבים מאוחרים יותר. - דגירה עוברים על 28.5 ° C.Use סטריאוסקופ יוכלו לעקוב אחר ההתפתחות שלהם, כפי שהם מעת לעת ליד dev 256 תאיםבשלב elopmental (כ 2.5 hpf).
הערה: אם יש צורך, משמרת עוברת לטמפרטורות שונות על מנת להבטיח התאמת במה בין שותפי parabiotic (למשל, עובר מוזרק morpholino לעתים קרובות לפתח לאט יותר מאשר עמיתיהם הלא מוזרק שלהם הסטה את העוברים מוזרקים-האו"ם RT בעוד עוברי מוזרק morpholino ממוקמות. ב 28.5 מעלות צלזיוס תגרום משלביו יישור אחרי כמה שעות של פיתוח).
דור 3. Parabiotic דג הזברה עוברת ידי Fusion כירורגי של פיתוח Blastulae
- ככל עובריים להתקרב לבמת 256 התאים (כ 2.5 hpf), להעביר את העוברים מכל רקע גנטי (כלומר, מוטציה גנטית, קווים מהונדסים ו / או מניפולציה גנטית) לתוך צלחות agarose המצופית נפרדות (למשל, צלחת אחת עבור morpholino- עובר הזריק מנה שנייה עוברת בקרה). לחלופין, להעביר את העוברים לנקות, כוסות זכוכית ללא שריטה או זכוכית צלחות פטרי.
הערה: הימנע משימוש צלחות פלסטיק ללא ציפוי כמו העוברים ידבקו הפלסטיק להינזק פעם מתוך chorions שלהם. - למזוג התקשורת E3 עד ממש מספיק נוזל נשאר לכיסוי העוברים (כ 7 - 10 מ"ל). הוסף 200 μl של 50 מ"ג / מ"ל תערובת של פרוטאזות מבודד מן הנוזל החוץ-תאי של Streptomyces griseus (פרוטאזות). מערבולת את העוברים בעדינות כל כמה דקות.
- כאשר 50% מן העוברים יצאו chorions שלהם, אשר בדרך כלל לוקח 5 - 10 דקות, לשטוף אותם שלוש פעמים עם נפח נדיב (כ 15 - 20 מיליליטר) של מדיום העובר E3 הטרי.
- Dechorionate כל העוברים הנותרים ב chorions שלהם על ידי ציור אותם בעדינות לתוך פיפטה פסטר זכוכית שונה ולאחר מכן להפיג אותם בעדינות. לאחר עוברים כבר dechorionated ורחץ, להחליף את התקשורת E3 עם פתרון HCR. כחלופה פרוטאזות, להסיר את chorions באופן ידני באמצעות מלקחיים בסדר. שואפים יש 60 - 100 dechorעוברים זמין ionated עבור כל תנאי הניסוי.
הערה: זהו פי כמה וכמה יותר מאשר בסופו של דבר ישמש, אבל עוברים רבים צפויים להינזק במהלך הטיפול או הניתוח עבור parabiosis. לאחר העוברים dechorionated, לשמור שקוע אותם ואינם מאפשרים להם לגעת פני המים, כמו מתח הפנים יגרום להם להיהרס. זכור כי שימוש במינון גבוה של פרוטאזות מאפשר את העוברים לצאת chorions שלהם מוקדם יותר באופן מסונכרן יותר. בעת שימוש במינון נמוך של פרוטאזות, העוברים להימשך זמן רב יותר לצאת מן chorions שלהם ועושים זאת בצורה סינכרונית פחות, אשר יכול לגרום חלק של העוברים שניזוקה על ידי חשיפה ממושכת פרוטאזות.
- Dechorionate כל העוברים הנותרים ב chorions שלהם על ידי ציור אותם בעדינות לתוך פיפטה פסטר זכוכית שונה ולאחר מכן להפיג אותם בעדינות. לאחר עוברים כבר dechorionated ורחץ, להחליף את התקשורת E3 עם פתרון HCR. כחלופה פרוטאזות, להסיר את chorions באופן ידני באמצעות מלקחיים בסדר. שואפים יש 60 - 100 dechorעוברים זמין ionated עבור כל תנאי הניסוי.
- כאשר 50% מן העוברים יצאו chorions שלהם, אשר בדרך כלל לוקח 5 - 10 דקות, לשטוף אותם שלוש פעמים עם נפח נדיב (כ 15 - 20 מיליליטר) של מדיום העובר E3 הטרי.
- להפשיר את methylcellulose (תוצרת שלב 1.2 לעיל) ו צנטריפוגות בצנטריפוגה השולחן על מהירות מרבית של 10 דקות עד גלולה גבישים שלא נמס אשר תגרום נזק עוברי או להיקרע חלמון שלהםים.
- לאחר צנטריפוגה, השתמש חלק עליון ברור (כ -75% מנפח). העברת 1 - 1.5 ס"מ קוטר טיפות של תאית מתיל לתוך צלחת 1.5% agarose מצופה פטרי. תשמור על עצמך כדי למנוע עריכה כל גבישי pelleted מתחתית הצינור.
- השתמש סמן כדי לחרוץ מראש את המיקום של כל אגל בצד התחתון של המנה. מניחים 12 - 15 טיפות (2 - 3 בשווי aliquots) של תאית מתיל לכל צלחת פטרי בקוטר 100 מ"מ. הכן כמה צלחות כנדרשות לכל ניסוי.
הערה: השתמש בכל אגל עבור ההיתוך של זוג blastula יחיד. הסימן יהיה לייעד את המיקום של כל אגל פעם התקשורת מתווספת-ובנקודת הטיפין להיות כמעט בלתי נראות.
- הכן אחד 40 מ"ל aliquot של פתרון HCR-בתוספת אנטיביוטיקה לכל צלחת agarose מצופה מוכן לעיל בשלב 3.3. לכל 40 מ"ל aliquot של HCR להוסיף פניצילין, סטרפטומיצין ב -50 U / ml, אמפיצילין 50 U / ml, ו kanamycin ברמה של 0.5 מיקרוגרם/ מ"ל.
- כאשר מוכן לבצע התכת blastula, בזהירות למלא כל אחת מהמנות המכילות טיפות תאיות מתיל עם 40 מיליליטר של פתרון HCR-בתוספת האנטיביוטיקה. אם הפתרון HCR מתווסף מהר מדי, זה יכול לשבש את טיפות.
- צרף את פיפטה פסטר זכוכית שונה (תוצרת שלב 1.4 לעיל) משאבת פיפטה 10 מ"ל. תחת stereoscope לאסוף עובר אחד dechorionated מכל ברקע (למשל, עובר חד-מוזרק morpholino ואת העובר בר-סוג אחד).
- לפני מחלק שני העוברים, השתמש פיפטה פסטר לעשות בשקע קטן באמצע הירידה התאית מתיל, ואז בעדינות להפקיד הן העוברים לתוך הדיכאון.
הערה: במהלך תהליך ההעברה, להפוך את פיפטה פסטר מעט כלפי מעלה כך עוברים להתיישב לתוך הסיבוב של פיפטה פסטר כדי להימנע ממגע לעריכתם עם פני השטח של הנוזל בחלק העליון או התחתון של פיפטה (מה שעלול להוביל כדי their קרע).
- לפני מחלק שני העוברים, השתמש פיפטה פסטר לעשות בשקע קטן באמצע הירידה התאית מתיל, ואז בעדינות להפקיד הן העוברים לתוך הדיכאון.
- מייד לאחר הפקיד את העוברים לתוך התאית מהתיל, להשתמש במחט מתגרה עם קורות עץ או פלסטיק ידית עם טיפ pipet ג'ל טעינה בצד (איור 1 א) כדי למקם את העוברים בזהירות בתוך התאית מהתיל כך הקטבים החיים שלהם ישירות נוגעות אחת בשנייה.
- לנצל תנועות רחבות עדין דרך קרוב תאית מתיל אל העוברים למקם אותם בלי לגעת בהם ישירות. תן עובר לשבת במשך 5 דקות כך תאי מהתיל יהיה להתיישב סביבם. במהלך תקופה זו, טען את הצמד הבא לתוך עוד טיפה.
הערה: הימנע ליצור קשר ישיר עם עוברי ולטפל מיוחד לא לגעת בשום חלק של שק החלמון, אשר להיקרע בקלות.
- לנצל תנועות רחבות עדין דרך קרוב תאית מתיל אל העוברים למקם אותם בלי לגעת בהם ישירות. תן עובר לשבת במשך 5 דקות כך תאי מהתיל יהיה להתיישב סביבם. במהלך תקופה זו, טען את הצמד הבא לתוך עוד טיפה.
- באמצעות כלי מחט זכוכית, פצע כל עובר בזהירות בשלב של קשר שלהם. בתנועה תפירה עדינה, תאים מעובר הראשון יכול להיות משך לתוך העובר השני ובחזרה.בסוף תנועה זו, להחזיק את המחט במקום במשך 2 - 3 שניות ולאחר מכן להתרחק זה מאוד לאט.
הערה: יש תקופה של כ 2 - 3 שניות לאחר עובר נפצעות שבו שתי הרקמות נראות יותר דבק ועוד צפוי לצרף זה לזה. לפיכך, אנו מאמינים כי קיום המחט במקום בקצרה לאחר והפצע עוזר לשמור על הרקמות הפצועות של כל עובר במגע לתקופה הראשונית של זמן מייד לאחר והפצע. - אפשר העוברים האלה לשבת במשך 10 - 15 דקות ב RT. בינתיים, ממשיך לתפור זוגות חדשים בטיפות אחרות של תאית מתיל. אחרי 10 - 15 דקות, להעריך אם הזוג הראשון נותר מצורף (איור 2 א).
הערה: אם עוברים מחוברים יותר, לחזור על התהליך תפרים כל עוד הם עוברים מתחת לגיל סביב הבמה 30% epiboly. בדרך כלל זה מאפשר עבור עד שלושה ניסיונות לתפור את העוברים ביחד. אם את העוברים נראים שמרו קובץ מצורף אבל גonnection אינו מהותי, לבצע תפרים נוספים בקצה החיבור לחזקם. הימנע רועד או העברת מנות בתקופות ניתוח הדגירה parabiotic.
הערה: למרות הבמה שלהם מוקדם התפתחותי והשברירי נתפס, המוני התא של העוברים יכולים לסבול כמות משמעותית של מניפולציה (כלומר, ופצע ורקמה), ועדיין להתפתח בצורה תקינה. החלמון, לעומת זאת, יכול להיקרע עם המגע הקל ביותר בלבד, להרוג את העובר. כאשר תופרים את שני blastulae עם מחט הזכוכית, לא ליצור קשר עם הממשק בין מסת התאים והחלמון של כל עובר. - דגירה עוברים O / N ב 28.5 ° C בצלחת ומדיה אותו (לא לשנות את התקשורת). עד למחרת בבוקר, את העוברים ינועו מתוך טיפות תאית מתיל מומס בעיקר. הסר את כל עוברים כי לא היו התמזגו בהצלחה. למזוג התקשורת ולהחליף עם E3 25 מיליליטר טרי.
הערה: אם עובד עםזן פיגמנט, להוסיף 500 phenylthiourea 0.15% (50x) μl (PTU) לריכוז סופי של 0.003% לחסום פיגמנטציה. עובר יצטרך להישאר ברציפות PTU לשמור דיכוי פיגמנטציה.
4. התקנת מיקרוסקופ, רכישת תמונה, עיבוד וניתוח
- הכן נקודת התכה 0.8% נמוך (LMP) agarose: להוסיף 0.8 גרם LMP agarose ל -100 מ"ל E3 וחום עד להמסה מלאה. בעוד חם, aliquot 1 מ"ל של LMP agarose לתוך צינורות 1.5 מ"ל microfuge בתוך גוש חימום 37 מעלות צלזיוס. את agarose LMP יישאר מותך על 37 מעלות צלזיוס. הוסף 40 μl של 4 מ"ג / מ"ל (25x), pH 7.0 tricaine לכל aliquot 1 מ"ל של LMP agarose ב 37 ° C. הערה: אם עובדים עם זן פיגמנט, להוסיף 20 μl של 0.15% (50x) PTU לכל aliquot 1ml.
- אחסן את agarose LMP הנותרים במשך כמה חודשים ב -50 אטום צינורות מ"ל ב 4 מעלות צלזיוס.
- להרדים עוברים parabiotic להיות צילמו על ידי הוספת 1 מ"ל של 4 מ"ג / מ"ל (25x), pH 7.0 tricaineאל 25 מ"ל של E3 כי הם עוברים כבר.
- המערבולת בעדינות את המנה כך עוברים יהיה ברכה באמצע. לאחר מכן, בעזרת פיפטה העברת פלסטיק רחב שקצהו לצייר את העוברים בנוזל כמה שפחות. סובבו את פיפטה זקוף בעדינות להקפיץ את העוברים, כך שהם ליישב לתחתית מאוד של פיפטה.
- עם העוברים בתחתית פיפטה, ולהעבירם aliquot 1 מ"ל של agarose LMP ידי נגיעה קצה פיפטה בקלילות על פני השטח של agarose. הימנע העברת נוזל עודף כמו זה יהיה לדלל את agarose.
- לאחר גירוש הנוזלים העודפים פיפטה, להשתמש פיפטה לערבב את העוברים בעדינות בתוך agarose, ולאחר מכן השתמש פיפטה להעביר כל agarose ועוברים אל הבאר של זכוכית התחתונה (מס '1.5 coverslip), 6 גם צלחת.
הערה: הקפד לבטל את פיפטה לאחר ההעברה עוברת לצלחת ההדמיה. agarose שיורית יקבע בתוך פיפטה, renderinז זה לא יעיל לשימוש נוסף. במקום זאת, השתמש פיפטה חדשה בכל פעם. - תחת stereoscope, להשתמש קצה פיפטה ג'ל טעינה קבוע על קצה מחט מתגרה בעלת ידית עץ למקם את העוברים לכיוון הזכוכית המכסה (כדי לוודא שהם בתוך מרחק העבודה של המטרה מיקרוסקופ) ו בכיוון הרצוי הדמיה.
הערה: מיקום מחדש ללא הרף עד agarose קבעה באופן מלא. תשמור על עצמך כדי לעלות את עוברי parabiotic לפיה עובר של הזוג הוא להיות צלם. בהינתן הנטייה האקראית של העוברים הסיאמיים, עבור זוגות מסוימים זה יכול להיות קשה תמונה הן עוברות. בתרחיש זה, לשחזר את העוברים מן agarose באמצעות מלקחיים פיפטה העברת פלסטיק רחב שקצהו ולאחר מכן לעלות שוב הדמיה מנקודת מבט שונה. - לאחר agarose קבע, לכסות עם 2 - 3 מ"ל של E3 בתוספת tricaine (ו PTU במידת הצורך).
- התמונה העוברים באמצעות קרינת עלית רחב בתחום הפוך, lasאה-סריקת confocal, או ספינינג מיקרוסקופ confocal דיסק. בחר את המטרה המתאימה ביותר עבור ההדמיה הרצויה. במשך כל שדה-העובר מבט, להשתמש מטרת 4x. בחר הגדלה גבוהה, כגון מטרת 20x, לתדמית רקמה ספציפית 16, 19.
הערה: אם באמצעות מיקרוסקופ זקוף, הר ב agarose LMP (בדומה לעיל) על פיסת כיסוי זכוכית. היפוך coverslip הזכוכית לשקופית מיקרוסקופ זכוכית כי יש טבעת של שומן ואקום מתמלא באותה 16 E3-tricaine-PTU, 19. - תהליך רכש תמונות באמצעות חבילות תוכנה לניתוח תמונה חינם כגון NIH תמונת J / פיג'י 16, 19.
הערה: מנת מספרים סלולריים ולכמת דינמיקה כגון נדידת תאים וחלוקת תא באמצעות פילוח ומעקב אלגוריתמים 16, 19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בקנה אחד עם מחקרים שפורסמו בעבר 15, היתוך parabiotic מוצלח של עוברי דג הזברה תלוי staging והכיוון של שני עוברים ואת הריכוז של methylcellulose. עם רק כמה כלים פשוטים זולים, blastulae בפיתוח התמזגו בניתוח נוצרו שצמחו לעוברי parabiotic בעלי תפוצה משותפת. כלים אלה כללו פיפטה פסטר שונה, משאבה פיפטה 10 מ"ל, ומחטים מתגרה טיפל עץ אשר שימשו לבד או עם מחט ג'ל טעינת טיפ או זכוכית microinjection קבוע עד הסוף בסרט-מעבדה (איור 1).
לאחר הצבת שני blastulae ב תאי 4% מתיל באמצעות קצה ג'ל הטעינה להתמצא אותם עם מוטות החיה שלהם אחד מול שני (איור 2 א), העוברים נפצעו בזהירות בשלב שלהם מגע עם n microinjection הזכוכיתeedle (איור 2 ב). מידה רבה יותר של ופצעיו (השווה איור 2B איור 2 ג), ו המחודשת זוגות העוברים לחזק חיבור ראשוני עם פציעה נוספת, הגבירה את הסיכוי של עוברי שמירה על קשר שהסתיים היתוך מוצלח (איור 3 א-ג, סרט 1) , וללא פגמים מורפולוגיים נוספים או מהתפתחות מאוחרת. כאשר נעשה בזהירות, כמעט 100% של הזוגות העוברים היו התמזגו, למרות לחלק מהעוברים אלה (כ -25%) לא הוקם במחזור בריא בשני חצי. על ידי המכוון את שני blastulae עם מוטות החיה שלהם מיושרות באופן ישיר, אמין הראש אל הראש או צק חלמון-אל-חלמון בשילובי צק נוצרו עם זרימה משותפת. ברוב המקרים, את העוברים היו שני לבבות פועמים תפוצה משותפת (האיור 3D).
כדי לאשר את העוברים אכן משותפים הפצה, dextran הניאון היה injected למחזור, אשר ניתן היה לראות לאחר מכן במחזור דרך שני עוברי (סרט 2). בנוסף, עוברים מהונדס שיש GFP + אריתרוציטים (LCR: eGFP) היו התמזגו עוברי כי היה mCherry + כלי הדם לתאי אנדותל (flk1: HRAS-mCherry). על ידי 48 hpf, GFP + אריתרוציטים נצפו הזורם flk1: העובר שותף HRAS-mCherry (איור 4 א ו סרט 3). כדי להרחיב את השירות של מערכת parabiotic, שליטה זמנית של ביטוי גנים נוספה. לפני היתוך, אחד משני עוברים שהוזרק עם hsp70: eGFP DNA לבנות 20. בעוד העוברים התמזגו צמחו ב 28.5 מעלות צלזיוס, לא קרינה נצפתה. לעומת זאת, לאחר הלם חום קצר 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, אות GFP ברורה הייתה גלויה באחד משני העוברים (איור 4B). בכמה מקרים GFP + תאים היוציין במחזור העובר שותף מוזרק האו"ם. לכן, הצבת גן של עניין תחת השליטה של מקדם הלם חום מספקת שליטה זמנית נוספת ללימודים החוקרים תא פנימי או תא-חיצוני פונקציות של גני מועמדים.
איור 1. כלים ליצירת Parabiotic דג הזברה עוברים.
(א) תמונה מבוארת מציגה כלים המשמשים היתוך כירורגית לפתח blastulae. הכלים כוללים פיפטה פסטר שונה (למעלה), אשר משמש יחד עם משאבה פיפטה 10 מ"ל (ירוק). ווד טפל מחטים מתגרות משמשות לבד או עם קצה פיפטה פלסטיק ג'ל טעינה או microinjection זכוכית משך עקץ קבוע עד הסוף עם סרט במעבדה. (ב) תמונה מראה את הקצוות של צורך microinjection שלוש זכוכיתles כי נשבר עם מלקחיים על קטרים שונים. מחט משקרים על גבי מיקרומטר; הקווים הקטנים הם במרווחים 10 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. Fusion כירורגי של פיתוח Blastulae.
תמונות גדלות גבוה להראות שני עוברי דג זברה בשלב פיתוח הגבוה, אורינטציה עם מוטות החיה שלהם אחד מול שנייה, לפני תפרים כירורגי (א), מייד לאחר פציעה מינימאלית (B), ואחרי פציעה משמעותית יותר (C). 20 דקות מאוחר יותר נראה כי עובר כבר התמזגו מבוסס בהצלחה על הגשר ללא הפרעה של תאים בין שני blastulae (D). סוּלָםעמודה מייצגת 250 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. פיתוח Parabiotic דג הזברה עוברת.
תמונות (AC) להראות השקפה שלמה-parabiont של ההתפתחות המוקדמת רק לאחר ופצעו (א) וככל עוברי להמשיך ולפתח ועוברים epiboly (B ו- C) אלו תמונות מתאימות סרט 1. (ד ') תמונה מראה זוג העובר parabiotic ב 36 hpf. עובר מחוברים בו צקי החלמון שלהם, יש שני לבבות ולשתף תפוצה משותפת. ברי סולם מייצגים 250 מיקרומטר. לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4. החזותיים Parabiosis עם חלבוני ניאון מקודדים גנטיים.
תמונות (א) (קרינה לבד, נכון; כיסוי עם אור מסור, שמאל) להראות את אזור הראש של עובר שהיו מחובר 48 hpf. העובר בתחתית זוג זה מהונדס עבור LCR: eGFP (erythroctyes, ירוק) בעוד שותפתה (למעלה) הוא מהונדס עבור flk1: HRAS-mCherry, אשר תוויות בתאי האנדותל של כלי הדם (אדום). אריתרוציטים ירוק ניתן לראות במחזור דרך עובר השותף. תמונה זו תואמת את הסרט 3. (ב) העובר השמאלי בצמד זה הוזרק עם hsp70: eGFP לבנות בשלב אחד התא ולאחר מכן התמזגו שותף בלתי מוזרק (מימין). כאשר בעלי החיים היו מומים חומים על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות ב 36 hpf, פלואורסצנטי הירוק של ה- GFP נצפה le העובר רגל ב 60 hpf. ברי סולם מייצגים 500 מיקרומטר. לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
סרט 1. התפתחות מוקדמת של blastulae דג הזברה התמזגו באופן כירורגי. (קליק ימני להוריד).
סרט מציג את ההתפתחות המוקדמת של זוג blastulae דג הזברה התמזג באופן כירורגי. Epiboly ניתן לראות המתרחש בו זמנית בכל עובר. הסרט הזה קשור איור 3A-C.
2.jpg "/>
הזרקת dextran פלורסנט סרט 2. מאיר תפוצה משותפת. (קליק ימני להוריד).
הסרט מראה dextran ניאון להיות מוזרק לווריד הקרדינל משותף של זוג העובר parabiotic ב 60 hpf. צבע פלואורסצנטי ניתן לראות בהמשך זורם הן עוברות.
דם Movie 3. הירוק זורם דרך כלי אדום.mov "> (קליק ימני להוריד).
סרט מציג את אזור הראש של עובר שהיה מחובר 48 hpf. העובר בתחתית זוג זה מהונדס עבור LCR: eGFP (erythroctyes, ירוק) בעוד שותפתה (למעלה) הוא מהונדס עבור flk1: HRAS-mCherry, אשר תוויות בתאי האנדותל של כלי הדם (אדום). אריתרוציטים גרין נראים במחזור דרך עובר השותף. הסרט הזה קשור איור 4 א.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
היתוך Parabiotic כבר כלי רב עוצמה כדי לחקור תפקודים תאיים של גנים מועמדים בדגמים עוברים חומוס בעכברים בוגרים 10-14. לאחרונה, שיטה היתוך blastula תוארה להפקת 15 עוברי דג הזברה סיאמיים. בפרוטוקול הנוכחי, הדרכות וידאו מבוססות משמשות כדי להדגים וטוב יותר לתאר את המתודולוגיה ליצירת עוברי דג זברת parabiotic של רקע גנטי שונה כדי ללמוד תפקידים זמניים, תא-מהותי, ותא-חיצוני של גני מועמדי עניין בפיתוח hematopoietic ומעבר.
השיטה המתוארת במאמר זה שמשה לאחרונה לעקוב הופעתה HSC בעובר אחד, הגירה באמצעות דם במחזור לעובר של רקע גנטי שונה, ו engraftment עוקבת והבחנה 16. בהסכם עם ממצאי קבוצת Kissa, בימוי ומיצוב עובר נמצאו לקבוע את שיעור ההצלחהוהטבע האנטומי של היתוך parabiotic. עם כמה שינויי מפתח בפרוטוקול, parabionts נוצר עם שיעור הישרדות גבוה יותר באופן משמעותי. אלה כוללים ופצע את blastulae במידה רבה, מחזיק את המחט במקום במשך 2 - 3 שניות לאחר ופצעו, ולאחר מכן בחינה מחדש blastula זוגות אחרי 15 דקות כדי לחזק חיבור ראשוני עם פציעה נוספת, במידת הצורך. עם המלצות נוספות אלה, כמעט 100% של parabionts שרדו נשארו קשור, ו -75% מהם משותפים תפוצה משותפת.
כדי לשלב אלמנט שליטה נוסף ניסיון לשיטה, עובר parabiotic מודגם כאן להיות סובלני לחמם הלם, המאפשר שליטה זמנית של ביטוי גנים בתוך ההקשר parabiotic 20. הגבלה של טכניקה זו היא כי במקרים מסוימים את עוברי שותף parabiotic אינם באותו המטוס לאחר היתוך parabiotic. זה יכוללהקשות על הר עוברים ב LMP agarose כדי לעקוב אחר תאים בשני עוברים בו זמנית באמצעות מיקרוסקופיה זמן לשגות. כדי לעקוף בעיה פוטנציאלית זו, אחד צריכה לתכנן ליצור עבר parabiotic מרובים כדי להבטיח את הכיוון הרצוי מושג. לחלופין, ניתן לשחזר העוברים מן LMP באמצעות מלקחיים בסדר פיפטה פסטר מחדש רכוב הדמיה מנקודת מבט שונה. מטרת פרוטוקול זה היה כדי לספק סדרה של הנחיות ברורות ותמציתיות ללוות הדרכות וידאו מבוסס על איך כמנתח הפתיל בפיתוח blastulae ליצור עוברי דג הזברה parabiotic.
עם השינויים המרכזיים והמלצות נוספות להישרדות parabiont הגדלה, פרוטוקול זה יהיה בתקווה להעצים חוקרים המעוניינים לנצל עוברים סיאמיים לחקור גורמי ויסות נדידת תאים, מפרט גורל, והבחנה במגוון של רקמות וקשרים הסלולר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Methyl cellulose | Sigma | M0387 | |
| Individual components for E3/HCR: | For 1L: 14,61g NaCl, 0,63g KCl, 2,43g CaCl2-2H2O, 1,99g MgSO4 | ||
| NaCl (Sodium chloride) | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| KCl (Potassium chloride) | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| CaCl2 (Calcium chloride dihydrate) | Sigma-Aldrich | 223506 | |
| MgSO4 (Magnessium sulfate heptahydrate) | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Hepes (1M ) buffer solution | ThermoFisher | 15630-080 | |
| Name | Company | Catalog Number | |
| Antibiotics: | |||
| Pen/Strep | gibco by Life technologies | 15140-120 | |
| Ampicilin sodium salt | Sigma Life Science | A0166 | |
| Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus | Sigma Life Science | K1377 | |
| Name | Company | Catalog Number | |
| 50 mg/ml Pronase from Streptomyces griseus | Roche | 11459643001 | |
| capillary glass used for needles (Capillary Glass & Filaments) | Sutter Instrument | ITEM#: BF 100-50-10 | |
| Teasing needles with wooden handles | Fisher Scientific | S07894 | |
| Glass Pasteur pipettes | Fisherbrand | 13-678-20A | |
| 10 ml pipette pump (green) (Pipette Pump Pipettor) | Novatech International | F37898-0000 | |
| 100 mm diameter/ 20 mm deep plastic petri dishes (PETRI DISH, 100/20 MM, PS, CLEAR, WITH VENTS, HEAVY DESIGN, 15 PCS./BAG ) |
Greiner Bio-one | 664102 | |
| Dextran, Cascade Blue, 10,000 MW, Anionic, Lysine Fixable | ThermoFisher | D-1976 | |
| PTU. working stock is 0.003% (50x is 0.15%). for 500 ml, 0.75 g N-Phenylthiourea | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| Tricaine (powder) (Tricaine Methanesulfonato, Tricaine-S) | Western Chemical Inc | MS 222 | |
| LMP agarose (Ultrapure LMP agarose) | Invitrogen | 16520100 | |
| plastic transfer pipette (just the wide ended one I think) | Fisherbrand | 137115AM | |
| Glass-bottom 6-well plates used for imaging | MatTek | P06G1.5-20-F | |
| plastic western gel loading tip fixed on the end of a wood-handled dissecting needle (GELoader tips) | Eppendorf | 22351656 | |
| glass cover slips, slides and vacuum grease if mounting for an upright microscope: | |||
| Vaccum grease ( Dow Corning® high-vacuum silicone grease colorless, weight 5.3 oz (tube) ) |
Dow Corning | Z273554 | |
| Glass cover slips | Corning Life Sciences | 2960-244 |
References
- Zon, L. I., Orkin, S. H. Hematopoiesis: An evolving paradigm for stem cell biology. Cell. 132 (4), 631-644 (2008).
- Dzierzak, E., Speck, N. A. Of lineage and legacy: the development of mammalian hematopoietic stem cells. Nat Immunol. 9 (2), 129-136 (2008).
- Li, P., et al. Epoxyeicosatrienoic acids enhance embryonic haematopoiesis and adult marrow engraftment. Nature. 523 (7561), 468-471 (2015).
- Tam, P. P., Rossant, J. Mouse embryonic chimeras: tools for studying mammalian development. Development. 130 (25), 6155-6163 (2003).
- Tanaka, M., Gertsenstein, M., Rossant, J., Nagy, A. Mash2 acts cell autonomously in mouse spongiotrophoblast development. Dev. Biol. 190 (1), 55-65 (1997).
- Morin-Kensicki, E. M., Faust, C., LaMantia, C., Magnuson, T. Cell and tissue requirements for the gene eed during mouse gastrulation and organogenesis. Genesis. 31 (4), 142-146 (2001).
- Ho, R. K., Kane, D. A. Cell-autonomous action of zebrafish spt-1 mutation in specific mesodermal precursors. Nature. 348 (6303), 728-730 (1999).
- Parker, L., Stainier, D. Y. Cell-autonomous and non-autonomous requirements for the zebrafish gene cloche in hematopoiesis. Development. 126 (12), 2643-2651 (1999).
- Liao, E. C., Trede, N. S., Ransom, D., Zapata, A., Kieran, M., Zon, L. I. Non-cell autonomous requirement for the bloodless gene in primitive hematopoiesis of zebrafish. Development. 3 (3), 649-659 (2002).
- Kamran, P., Sereti, K. I., Zhao, P., Ali, S. R., Weissman, I. L., Ardehali, R. Parabiosis in mice: a detailed protocol. J Vis Exp. (80), (2013).
- Wagers, A. J., Sherwood, R. I., Christensen, J. L., Weissman, I. L. Little evidence for developmental plasticity of adult hematopoietic stem cells. Science. 297 (5590), 2256-2259 (2002).
- Hervey, G. R. The effects of lesions in the hypothalamus in parabiotic rats. J. Physiol. 145 (2), 336-352 (1959).
- Goldman, D. C., Bailey, A. S., Pfaffle, D. L., Al Masri, A., Christian, J. L., Fleming, W. H. BMP4 regulates the hematopoietic stem cell niche. Blood. 114 (20), 4393-4401 (2009).
- Dieterlen-Lièvre, F., Martin, C., Beaupain, D. Quail-chick chimaeras and parabionts: several new models to investigate early developmental events in the haemopoietic system. Folia Biol (Praha). 25 (5), 293-295 (1979).
- Demy, D. L., Ranta, Z., Giorgi, J. M., Gonzalez, M., Herbomel, P., Kissa, K. Generating parabiotic zebrafish embryos for cell migration and homing studies). Nat. Methods. 10 (3), 256-258 (2013).
- Anderson, H., et al. Hematopoietic stem cells develop the absence of endothelial cadherin 5 expression. Blood. 126 (26), 2811-2820 (2015).
- Murayama, E., Sarris, M., Redd, M., Le Guyader, D., Vivier, C., Horsley, W., Trede, N., Herbomel, P. NACA deficiency reveals the crucial role of somite-derived stromal cells in haematopoietic niche formation. Nat Commun. 28 (6), 8375 (2015).
- Shah, D. I., et al. Mitochondrial Atpif1 regulates haem synthesis in developing erythroblasts. Nature. 491 (7425), 608-612 (2012).
- Tamplin, O. J., et al. Hematopoietic stem cell arrival triggers dynamic remodeling of the perivascular niche. Cell. 160 (1-2), 241-252 (2015).
- Adám, A., Bártfai, R., Lele, Z., Krone, P. H., Orbán, L. Heat-inducible expression of a reporter gene detected by transient assay in zebrafish. Exp. Cell Res. 256 (1), 282-290 (2000).
