Abstract
異なる遺伝的背景の2匹の動物の外科並体結合は、異なる遺伝的設定で細胞固有の関心の候補遺伝子のための細胞外因性の役割、細胞の移動行動、および分泌シグナル対を研究するユニークなシナリオを作成します。並体結合動物が共通の循環を共有しているため、一匹の動物からの血液や血液媒介因子は、そのパートナーとその逆と交換されます。したがって、一つの遺伝的背景に由来する細胞および分子因子は、第二の遺伝的背景との関連で研究することができます。成体マウスの並体結合研究の老化、癌、糖尿病、肥満、および脳の発達に広く使用されています。さらに最近では、ゼブラフィッシュ胚の並体結合は、造血の発生生物学を研究するために使用されています。マウスとは対照的に、ゼブラフィッシュ胚の透明な性質は、それFを調査するためのユニークでパワフルな方法作り、並体結合文脈での細胞の直接可視化を可能にしますundamental細胞および分子メカニズム。この技術の有用性は、しかし、並体結合ゼブラフィッシュ胚を生成するための急な学習曲線によって制限されます。このプロトコルは、関心のある候補遺伝子の役割を調べるために、異なる遺伝的背景の2ゼブラフィッシュの胚の胞胚を融合外科的にする方法についてステップバイステップの方法を提供します。また、並体結合ゼブラフィッシュ胚を可能遺伝子発現の時間的制御を行う、熱ショックに対して耐性です。この方法は、高度なセットアップを必要とし、胚発生の間、in vivoでの細胞遊走、運命の仕様、および分化を研究するための幅広い用途を持っていません。
Introduction
野生型および遺伝子改変動物の間の遺伝的モザイク（キメラ）の作成 は、細胞固有の候補遺伝子1-6の細胞外部関数に対する調査するための十分に確立し、古典的な戦略です。ゼブラフィッシュにおける胞胚移植は広く、細胞自律7-9の研究のためのキメラ胚を生成するために利用されてきました。目的の組織に応じて、しかし、予想通り、所望の組織（ 例えば、血液）1-3、7-9にドナー細胞を標的化するために挑戦することができます。マウスの遺伝学者は、長い共有循環10-14と結合した生物を生成するために、並体結合外科的方法を利用してきました。並体結合動物が共通の血流を共有しているため、異なる遺伝的背景の他の動物の細胞と一匹の動物由来の細胞間の相互作用は、10-16を研究することができます。最近、カリマ喫茶のグループは、エレガントなCREする能力を示しました移行15（HSPC）結合したゼブラフィッシュ胚を食べ、その後、造血幹細胞および前駆細胞を研究するためにこのシステムを使用しています。また、ゼブラフィッシュ並体結合は最近、造血幹細胞（HSC）の出現と移行、16で内皮カドヘリン5の役割を調査し、ゼブラフィッシュの開発17時のHSPCのニッチで間質細胞の役割を研究するために使用されました。
マウスとは異なり、ゼブラフィッシュの胚は透明であり、システムがユニークでパワフルな作り、並体結合開発中の細胞の直接可視化を可能にします。ゼブラフィッシュにおける並体結合の有用性は、しかし、急な学習曲線によって制限され、かつ繊細な胚上の並体結合手術は、詳細な指示とビジュアルデモせず、技術的に挑戦することができます。このプロトコルの目的は、研究するための並体結合ゼブラフィッシュの胚を生成する方法についてのビデオベースのチュートリアルを伴うために明確な、ステップバイステップの命令のセットを提供することです時間的、細胞固有の、または胞胚を開発するの外科的融合による候補遺伝子（複数可）の細胞外部関数。増加parabiont生存と新しい実験的なアプリケーションのためのキーの変更や追加の推奨事項が含まれています。
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Protocol
このプロトコルは、ボストン小児病院動物実験委員会によって承認されました。このプロトコルは、以前発表された方法15から変更されています。
試薬の調製（事前に数日または数週間）
- 1.5％アガロースでコーティングされた料理を準備します。 三角フラスコに100ミリリットルゼブラフィッシュE3培地に1.5グラムのアガロースを追加します。熱、アガロースを溶解し、その後、直径100mmのx 20ミリメートル、深ペトリ皿に約5ミリリットルを注ぎます。
注：これらは、胚（ステップ3.1）のdechorionationのためと並体結合手術（ステップ3.3）に使用されています。数週間、4℃で、アガロースでコーティングされた料理を保管してください。並体結合手術当日の朝を室温に冷蔵庫、暖かいからそれらを取ります。 - 4％のメチルセルロースを準備します。 攪拌棒を備えた三角フラスコにE3 100ml中のメチルセルロース粉末を4gを溶解します。最低速度に設定4℃にて撹拌プレート上フラスコを置き、それを混ぜてみましょう最大2日間。
- 断続的にメチルセルロースの白い塊を破壊するためにスパチュラを使用しています。メチルセルロース結晶は完全にこの濃度では溶解しません。溶液は透明になり、白い塊が残っていないとの均質表示され、一定分量1.5mlマイクロチューブに溶液および長期保存のために-20℃で凍結した場合。
注：メチルセルロースのより低い濃度を使用することができます。しかし、これより高い割合は、より粘性メチルセルロースは、最良の結果をもたらしました。
- 断続的にメチルセルロースの白い塊を破壊するためにスパチュラを使用しています。メチルセルロース結晶は完全にこの濃度では溶解しません。溶液は透明になり、白い塊が残っていないとの均質表示され、一定分量1.5mlマイクロチューブに溶液および長期保存のために-20℃で凍結した場合。
- 高カルシウムリンガー（HCR）溶液を調製します。 （5MのNaClの8ミリリットル（116 mMの最終）、3MのKCl400μlの（2.9 mMの最終）、1M HEPESの5MのCaCl 2（10最終ミリモル）、および2ミリリットルの800μLを混合し、5をHCR液の400ミリリットルを作成するにはE3メディアの390ミリリットルでmMの最終）。
注：数週間のために4℃で保存HCRソリューションを。並体結合手術当日の朝を室温に温めます。 - 転送のための6修正されたパスツールピペット - 5を準備します胞胚ペアを鳴らします。簡単に説明するとブンゼンバーナーの上にピペットの端を加熱します。それがまだ熱いうちに続いて、大規模な鉗子を使用して、約45℃にピペットの端を曲げます。
- 胚を損傷する可能性のある鋭いエッジがないことを確認するには、約3秒間炎に簡単にピペットの先端を保持します。これは、ピペットの終わり/ポリッシュを滑らかにします。この修飾されたガラスパスツールピペットは、以下のステップ3.5 10 mlピペットポンプ（ 図1）と併せて使用されます。
- 胞胚ペアの外科手術用の縫合用ガラス針ツールを準備します。ゼブラフィッシュ胚のマイクロインジェクションのために行ったように3ガラス針 - 2を引き出します。 wood-またはプラスチック製の柄のからかい針（ 図1A）の最後に各ガラス針を固定するためにラボ・フィルムを使用してください。 30ミクロン - 鉗子を使用して、約20の直径で針の端部を断ちます。この工程（図1B）を導くために、ステージマイクロメーターを使用してください。
注：NEの大きさedle先端が重要です。先端が大きすぎる場合は、正確に制御することが困難になり、過度の損傷を引き起こす可能性があります。先端が小さすぎる場合には十分に胚を創傷することは困難です。
2.（0日目に1日目）ゼブラフィッシュ胚のコレクションの繁殖ペアを設定します
- 大人のゼブラフィッシュの繁殖ペアを設定します。並体結合の手術が行われるべきである前に、夜の魚を設定します。雄と雌を分離するために分周器を使用します。希望の胚が得られることが確率を高めるためには、各ラインのいくつかのペアを設定します。ペアの50％出現します - 私たちは、一般的に20がいることを見つけます。
- 翌朝、分周器を引っ張ると相手を許します。細かいメッシュの茶こしを使用して、任意の胚を収集し、その後、E3胚の媒体18を含むペトリ皿に移します。
- 所望のように胚をマイクロ-注射（ 例えば、25 pgのプラスミドDNA、または1と200 pgのmRNAと- 6 ngのモルホリノ）コレクションの1時間以内です。にそれらを許可します256細胞期まで成長します。 DNA発現構築物は、熱ショックプロモーターの制御下に置かれている場合（ 例えば、HSP70は、 図4B）は 、（後の段階で、37℃でparabiontsを衝撃的な熱によって、遺伝子発現のタイミングを制御し、例えば 、36 HPFで）。
注：蛍光導入遺伝子の代替は、蛍光デキストラン（2ミリグラム/ mlで、例えば、デキストラン、カスケードブルー）DNA、RNA、またはモルホリノ注射混合物に添加することができるように。デキストラン色素は、正常な発達を妨害しないと注入された胚は並体結合融合した後、適切な蛍光灯の下で識別することが可能になります。あるいは、非着色株で着色株の並体結合（ 例えば、AB）（ 例えば、キャスパー）は後の段階で注入胚を識別するために使用することができます。 - 28.5°C.Use 256細胞devの近くに定期的として、その開発を監視するためのステレオスコープで胚をインキュベートelopmental段階（約2.5 HPF）。
注：必要に応じて、並体結合パートナー間の段整合性を確保するために、異なる温度に胚をシフト（ 例えば、モルホリノ注入胚は、多くの場合、それらの非注入対応よりも遅い開発モルホリノ注入胚が配置されている間RTに非注入胚をシフト。 28.5℃で）は、開発の数時間後に整列させる彼らのステージになります。
胞胚の開発の外科的融合による並体結合ゼブラフィッシュ胚の3世代
- 胚は256細胞期（約2.5 HPF）に近づくように、独立したアガロースコートディッシュ（ 例えば、モルホリノのための1つの皿に各遺伝的背景（ すなわち、遺伝的変異体、トランスジェニック系統および/ または遺伝子操作）から胚を転送します注入された胚と対照胚ための第二の皿）。あるいは、傷のないガラスビーカーやガラスペトリ皿をきれいにするために胚を移します。
注：胚がプラスチックに固執し、彼らの絨毛膜の外に一度損傷するようコーティングされていないプラスチック製の食器を使用しないでください。 - （ - 10ミリリットル約7）だけで十分な液体が胚をカバーするために残るまでE3メディアをデカント。 50ミリグラム/ ストレプトミセス・グリセウス （プロテアーゼ）の細胞外液から単離されたプロテアーゼのミリリットル混合物の200μLを加えます。静かに胚数分おきに渦巻。
- 胚の50％は、一般的に5取る彼らの絨毛膜、外に出ているとき - 新鮮なE3胚の培地の - （20ミリリットル約15）10分を、寛大なボリュームでそれらを3回すすいでください。
- 優しく、それらを払拭優しく、その後修正されたガラスパスツールピペットにそれらを描くとすることにより、それらの絨毛膜内に残っている胚をDechorionate。胚がdechorionatedし、洗浄された後、HCR溶液でE3メディアを交換。プロテアーゼの代わりに、細かい鉗子を使用して手動で絨毛膜を除去します。 100 dechor - 60を持っていることを目指して各実験条件のために利用可能な胚をionated。
注：これは、最終的に使用されるよりも倍以上、いくつかのですが、多くの胚は、取り扱いや並体結合のための手術中に破損する可能性があります。胚はdechorionatedされると、それらを沈めておくと、表面張力は、それらが破壊されることになりますように、彼らは水の表面に接触しないようにしてください。プロテアーゼの高用量を使用すると、胚が早く、より同期して、それらの絨毛膜から出てくることができますことを覚えておいてください。プロテアーゼの低用量を使用する場合、胚は彼らの絨毛膜から出てくるに時間がかかりおよびプロテアーゼへの長期曝露によって損傷される胚の一部になることが少ない同期方式で行ってください。
- 優しく、それらを払拭優しく、その後修正されたガラスパスツールピペットにそれらを描くとすることにより、それらの絨毛膜内に残っている胚をDechorionate。胚がdechorionatedし、洗浄された後、HCR溶液でE3メディアを交換。プロテアーゼの代わりに、細かい鉗子を使用して手動で絨毛膜を除去します。 100 dechor - 60を持っていることを目指して各実験条件のために利用可能な胚をionated。
- 胚の50％は、一般的に5取る彼らの絨毛膜、外に出ているとき - 新鮮なE3胚の培地の - （20ミリリットル約15）10分を、寛大なボリュームでそれらを3回すすいでください。
- 胚を傷つけたり、卵黄を破裂する未溶解の結晶をペレット化し、10分間最大速度に卓上遠心分離機で（上記のステップ1.2で行われた）メチルセルロースおよび遠心分離機を解凍秒。
- 遠心分離後、透明な上部分率（体積の約75％）を使用。 1.5％アガロースでコーティングされたペトリ皿にメチルセルロースの直径1.5cmの滴 - 転送1。チューブの底からペレット化結晶のいずれかを描画しないように注意してください。
- 皿の底側に各液滴の位置を予め決定するためのマーカーを使用してください。直径100mmのペトリ皿当たりメチルセルロースの - （3アリコート '価値2）15滴 - 12を配置します。実験ごとに必要な数のプレートを準備します。
注：単一胞胚ペアの融合のために各液滴を使用してください。メディアが追加-にされると、その時点滴がほとんど見えなくなるマークは、各液滴の場所を指定します。
- ステップ3.3で上記のように調製したアガロースでコーティングされた皿当たり抗生物質を補充したHCRソリューションの1 40ミリリットルのアリコートを準備します。 HCRの各40ミリリットルのアリコートに0.5μgので50 U / mlのストレプトマイシン、ペニシリン、50 U / mlのアンピシリン、およびカナマイシンを追加/ mlです。
- 準備胞胚融合を実行するときは、慎重に抗生物質を補充したHCR液40mlでメチルセルロース液滴を含む料理のそれぞれを埋めます。 HCR溶液をあまりに速く添加されている場合、それは、小滴を破壊することができます。
- 10ミリリットルピペットポンプに（上記の手順1.4で行われた）修正されたガラスパスツールピペットを取り付けます。ステレオスコープの下では、各背景（ 例えば、1モルホリノ注入胚と1の野生型胚）から1 dechorionated胚を収集します。
- 2胚を分配する前に、そっとくぼみに両方の胚を堆積させる、メチルセルロースドロップの真ん中に小さなくぼみを作るためにパスツールピペットを使用しています。
ピペットの上部または下部に液体の表面との意思の接触を避けるように胚をパスツールピペットの曲がりに落ち着くようにやや上向きにパスツールピペットを回し、転送処理中に（つながることがある注： theiへR破裂）。
- 2胚を分配する前に、そっとくぼみに両方の胚を堆積させる、メチルセルロースドロップの真ん中に小さなくぼみを作るためにパスツールピペットを使用しています。
- 直ちにメチルセルロースに胚を堆積した後、慎重に動物極が直接であるようにメチルセルロース内で胚を再配置するために、エンド（ 図1A）上でのゲルローディングピペットチップとwood-またはプラスチック製の柄のからかいの針を使用しますお互いに触れます。
- それらを直接触れることなく、それらを再配置するために、胚に近いメチルセルロースを通して穏やかな抜本的な動きを利用しています。メチルセルロースは、彼らの周りで落ち着きますので、胚は5分間座ってみましょう。この間、他のドロップに次のペアをロードします。
注：胚と直接接触することは避け、容易に破裂する卵黄嚢、のいずれかの部分に触れないように特別な注意を払います。
- それらを直接触れることなく、それらを再配置するために、胚に近いメチルセルロースを通して穏やかな抜本的な動きを利用しています。メチルセルロースは、彼らの周りで落ち着きますので、胚は5分間座ってみましょう。この間、他のドロップに次のペアをロードします。
- ガラス針ツールを使用して、慎重にその接触点でそれぞれの胚を巻か。穏やかな縫製運動で、最初の胚から細胞を再び戻って、第2の胚に引っ張られ、することができます。この運動の終わりに、2所定の位置に針を保持 - 3秒、その後、非常にゆっくりとそれを離れて描画します。
注：約2の期間がある - 2つの組織は、より接着剤と相互にアタッチする可能性が高いように見える場所胚を負傷した後に3秒。したがって、我々は場所に針を保持することは簡単に負傷した直後に負傷した後、時間の初期期間に接触して各胚の創傷組織を維持するのに役立ちますと信じています。 - RTで15分 - これらの胚は10のために座ってできるようにします。一方、メチルセルロースの他の滴の新しいペアをステッチし続けています。 10後- 15分、最初のペアが（ 図2A）添付残っているかどうかを評価します。
注：胚が長い接続されている場合、限り胚は30％被包のステージの周りよりも若いとしてのために綴じ処理を繰り返します。通常、これは一緒に胚をステッチするために最大3つの試みを可能にします。胚は、添付ファイルが、Cを維持しているように見える場合onnectionはそれを強化するために、接続の端に追加のステッチを実行し、実質的ではありません。並体結合手術およびインキュベーション期間中の料理を振ったり移動しないでください。
注：彼らの初期の発達段階と知覚脆弱性にもかかわらず、胚の細胞塊は、操作のかなりの量（ すなわち、負傷やステッチ）を容認し、まだ正常に開発することができます。卵黄は、しかし、胚を殺し、唯一のわずかなタッチで破裂することができます。ガラス針を持つ2つの胞胚をステッチすると、各胚の細胞塊と卵黄の間のインタフェースに接触するようにしないでください。 - 同じ皿やメディア（メディアを変更しない）で28.5℃で胚O / Nインキュベートします。翌朝により、胚はほとんど溶解メチルセルロース滴の外に移動しているであろう。首尾よく融合されなかった胚を削除します。メディアをデカントし、新鮮な25ミリリットルE3と交換してください。
注：で作業している場合着色された株は、色素沈着をブロックするために0.003％の最終濃度になるように500μlの0.15％（50倍）フェニルチオ尿素（PTU）を追加します。胚は、色素沈着の抑制を維持するために、PTUに連続的に残るする必要があります。
4.顕微鏡のセットアップ、イメージの取得、処理および解析
- 0.8％低融点（LMP）アガロースを準備し、完全に溶解するまで0.8グラムアガロース100ミリリットルE3にLMPと熱を追加します。熱いうちに、アリコートをアガロース37℃の加熱ブロック中の1.5mlマイクロチューブにLMPの1ミリリットル。 LMPアガロースを37℃で溶融したままになります。 37℃でアガロースLMPの各1ミリリットルのアリコートに4 mg / mlで（25倍）を40μl、pHが7.0トリカインを追加します。注：着色された菌株で作業し、各1ミリリットルのアリコートに0.15％（50倍）PTUの20μlを添加した場合。
- 4℃で密封された50mlチューブに数ヶ月のために残りのLMPアガロースを保管してください。
- 並体結合胚を麻酔4 mg / mlで1mlの（25倍）、pH7.0のトリカインを添加することにより撮像されますE3の25ミリリットルに胚はすでにでていること。
- 胚が真ん中にプールするようにゆっくりと料理を旋回。次に、ワイドひっくり返したプラスチック製トランスファーピペットを用いて、できるだけ少ない液体中の胚を描きます。直立ピペットを回し、ゆっくりと、彼らはピペットの非常に底に沈殿するように胚をバウンス。
- ピペットの底の胚では、軽くアガロースの表面にピペットの先端をタッチして、LMPアガロースの1ミリリットルのアリコートに転送します。アガロースを希釈します。このように過剰な液体を移送することは避けてください。
- ピペットから過剰な液体を排出した後、グラスボトム（第1.5カバースリップ）のウェルにアガロースおよび胚のすべてを転送するために、ピペットを使用した後、静かにアガロース内に胚を混合するために、ピペットを使用して、6-ウェルプレート。
注：イメージングプレートに胚を転送した後、ピペットを破棄してください。残留アガロースは、ピペットの内側renderinを設定しますGさらなる使用のために、それは無効。むしろ、新しいピペットを毎回使用しています。 - ステレオスコープの下では、ダウンカバーガラスに向けて胚を配置するために木柄のからかいの針の端部に固定されたゲルローディングピペットチップを使用します（これらは顕微鏡対物レンズの作動距離の範囲内であることを確認するため）、所望の方向でイメージングのため。
注：アガロースが完全に設定されるまで継続的に再配置します。ペアの胚が撮像されるべきである従った並体結合胚をマウントするように注意してください。結合した胚のランダムな配向を与え、いくつかのペアのためには、両方の胚画像に困難な場合があります。このシナリオでは、鉗子およびワイドひっくり返したプラスチック製トランスファーピペットを用いてアガロースから胚を回収し、別の視点から撮像のために再マウントします。 - トリカイン（とPTU必要な場合）を補充したE3の3ミリリットル - アガロースを設定したら、2をカバーしています。
- 画像反転広視野落射、ラスを使用して胚ER走査共焦点、またはディスク共焦点顕微鏡を回転。所望の撮影のために最も適切な目標を選択します。ビューの全胚フィールドの場合、4倍対物レンズを使用しています。画像には、このような20X目的として、特定の組織16、19を高倍率を選択します。
注：正立顕微鏡を使用している場合は、ガラスカバースリップ上（上記と同様）LMPアガロースでマウントします。同じE3-トリカイン-PTU 16、19で満たされた真空グリースの環を有するガラス顕微鏡スライド上にカバーガラスを反転。 - プロセスは、NIHイメージJ /フィジー16、19のようなフリーの画像解析ソフトウェアパッケージを用いて画像を取得しました。
注：細胞数をカウントし、セグメント化及びトラッキングアルゴリズム16を使用して、細胞遊走および細胞分裂などの動態を定量化する、19。
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Representative Results
以前に発表された研究15と一致して、ゼブラフィッシュ胚の成功並体結合融合は、ステージングと向き2胚のとメチルセルロースの濃度に依存します。いくつかの簡単な、安価なツールを使用して、外科的に融合した開発胞胚は、共有循環と並体結合胚に成長し、その生成しました。これらのツールは、変更されたパスツールピペット、10ミリリットルのピペットポンプ、および単独で、またはラボ・フィルムによって端部に固定されたゲルローディングチップやガラスマイクロインジェクション針（ 図1）のいずれかで使用された木材取り扱いからかい針が含まれていました。
4％のメチルセルロース二つ胞胚を配置し、それらの動物極が互いに（ 図2A）に向けてそれらを配向するゲルローディングチップを使用した後、胚を、慎重にガラスマイクロインジェクションnでその接触点で負傷しましたeedle（ 図2B）。 （ 図2C 図2Bを比較）負傷、および追加の創傷との初期接続を強化するために胚のペアを再訪の大きい程度は、成功した融合をもたらした接続を維持胚の可能性を増加させた（ 図3A-C、映画1） 、および追加の形態学的欠陥や発達の遅れなし。注意深く行われた場合、これらの胚（約25％）の割合は両半分に健全な循環を確立することはありませんが、胚のペアのほぼ100％が、融合させました。その動物極が直接整列して2胞胚を配向させることにより、信頼性の頭に頭や卵黄嚢ツー卵黄嚢の融合は、共有循環で生成されました。ほとんどの場合、胚が共通循環（ 図3D）をポンプ2の心を持っていました。
胚は確かに彼らの循環を共有していることを確認するために、蛍光デキストランはINJましたその後、両方の胚（ 動画2）を循環見ることができる循環にected。さらに、GFP +赤血球（LCR：eGFPのを ）持っていたトランスジェニック胚は、mCherryを+血管内皮細胞（：HRAS-mCherryをFLK1）を有していた胚と融合させました。 HRAS-mCherryをパートナー胚（ 図4Aおよびムービー3）：48 HPFにより、GFP +赤血球はFLK1を循環観察されました。並体結合システムの有用性を拡張するために、遺伝子発現の時間的制御が追加されました。融合の前に二つの胚の一方がHSP70を注射したeGFPの DNAは20を構成します 。融合した胚は28.5℃で成長したが、全く蛍光は観察されませんでした。これとは対照的に、37℃で短時間の30分の熱ショック後、明確なGFPシグナルは2胚（ 図4B）のいずれかに見えました。いくつかの例ではGFP +細胞でした非注入パートナー胚内を循環観察。したがって、熱ショックプロモーターの制御下に目的の遺伝子を配置することは、候補遺伝子の細胞内因性または外因性細胞の機能を調べる研究に追加の時間的制御を提供します。
生成並体結合ゼブラフィッシュ胚1.ツール図。
（A）注釈付きの画像は、胞胚を開発するの外科的融合のために使用されるツールを示しています。ツールを10mlピペットポンプ（緑）と組み合わせて使用される修飾されたパスツールピペット（上部）を含みます。木材はいじめ針がラボフィルム付き端部に固定されたニードリング単独で、またはプラスチック製のゲルローディングピペットチップまたは引っ張られたガラスマイクロインジェクションのいずれかを使用している取り扱う。（B）画像は3ガラスマイクロインジェクション必要性の両端を示しています異なる直径で鉗子で破壊されているレ。針はマイクロメーターの上に横たわっています。最小のラインが10μmの間隔を置いて配置されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
胞胚の開発2.外科融合図。
高倍率画像は、前の外科的ステッチ（A）に、直ちに最小創傷（B）の後に、より実質的な創傷（C）の後に互いに面する動物極と指向開発の高い段階にある2つのゼブラフィッシュ胚を示します。 20分後には胚が正常に2胞胚（D）間の細胞の中断のない橋をもとに融合されていることは明らかです。規模バーは250μmで表す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
並体結合ゼブラフィッシュ胚の図3.開発。
これらの画像は、ムービー1に対応（AC）画像はちょうど（A）創傷後の早期開発の全parabiontビューを表示し、胚は開発を継続し、（BおよびC）被包受けるとして（D）イメージは並体結合胚のペアを示しています36 HPFで。胚は2心を持っており、一般的な循環を共有し、彼らの卵黄嚢に接続されています。スケールバーは250μmで表す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図遺伝的にコードされた蛍光タンパク質と4.視覚化並体結合。
（A）画像（単独の蛍光、右;透過光とオーバーレイ、左）48 HPFで結合した胚の頭部領域を示します。このペアの下胚は、LCRのためのトランスジェニックである：（erythroctyes、緑） のeGFPパートナー（トップ）はFLK1についてトランスジェニックである間：HRAS-mCherryを 、血管内皮細胞（赤）をラベル付けします。グリーン赤血球は、パートナーの胚を循環見ることができます。この画像は、このペアの左の胚は、HSP70を注射したムービー3（B）に対応する：EGFPが 1細胞期で構築した後、非注入パートナー（右）に融合しました。動物は、36 HPF、30分間37℃で熱ショックを与えたときに、GFPの緑色蛍光は、ルで観察されました 60 HPFでフィート胚。スケールバーは500μmで表す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
ムービー1.外科的に融合したゼブラフィッシュ胞胚の早期開発。 （右クリックしてダウンロード）。
映画は、外科的に融合したゼブラフィッシュ胞胚のペアの早期開発を示しています。被包は、各胚に同時に発生見ることができます。この映画は、3A-C図に関係します。
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映画2.蛍光デキストランの注射は、共有循環を照らす。 （右クリックしてダウンロード）。
映画は60 HPFで並体結合胚対の共通主静脈内に注入された蛍光デキストランを示しています。蛍光染料は、その後、両方の胚を循環見ることができます。
映画3.赤い血管を流れる緑の血液。MOV ">（右クリックしてダウンロード）。
映画は48 HPFで結合した胚の頭部領域を示しています。このペアの下胚は、LCRのためのトランスジェニックである：（erythroctyes、緑） のeGFPパートナー（トップ）はFLK1についてトランスジェニックである間：HRAS-mCherryを 、血管内皮細胞（赤）をラベル付けします。グリーン赤血球は、パートナーの胚を循環見られています。この映画は、 図4Aを関連しています。
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Discussion
並体結合融合は、大人のマウスモデルおよびニワトリ胚10-14で候補遺伝子の細胞機能を調査するための強力なツールとなっています。より最近では、胞胚融合方法は、結合したゼブラフィッシュ胚15を生成するために記載されています。本プロトコルでは、ビデオベースのチュートリアルを示し、より良い造血開発に関心のある候補遺伝子の、一時的なセル固有の、および細胞外因性の役割を研究するために、異なる遺伝的背景の並体結合ゼブラフィッシュ胚を作成するための方法を説明するために使用されます以降。
この論文に記載された方法は、最近1胚、異なる遺伝的背景の胚への血液循環を介した移行、その後の生着および分化16におけるHSCの出現を追跡するために使用されました。喫茶グループの知見と一致して、ステージング及び胚の位置が成功率を決定することが見出されましたそして、並体結合融合の解剖学的な性質。プロトコルへのいくつかの重要な変更を加えるだけで、parabiontsは有意に高い生存率で生成されました。創傷後3秒間、その後必要に応じて、追加の創傷との初期接続を補強するために15分後に胞胚のペアを再訪 - これらは、より高度に胞胚を負傷2所定の位置に針を保持してあります。これらの追加の推奨事項では、parabiontsのほぼ100％が生存し、付着したまま、それらの75％が共通の循環を共有しました。
メソッドに実験的な制御の追加の要素を組み込むには、並体結合胚を並体結合コンテキスト20内の遺伝子発現の時間的制御を可能にする、熱ショックへの耐性があるためにここに実証されています。この技術の制限は、いくつかの例では並体結合パートナー胚は並体結合融合後の同一平面上にないことです。これは、することができますそれが困難なタイムラプス顕微鏡を用いて同時に両方の胚の細胞を追跡するためにアガロースLMPで胚をマウントすることを可能にします。この潜在的な問題を回避するためには、所望の配向が達成されることを保証するために、複数の並体結合胚を生成するために計画する必要があります。代替的に、胚は、微細鉗子とパスツールピペットを用いて、LMPから回収することができ、異なる視点からの撮影のために再マウント。このプロトコルの目的は、外科的にヒューズ並体結合ゼブラフィッシュの胚を生成するために、胞胚を開発する方法についてのビデオベースのチュートリアルを伴うために明確、簡潔な命令セットを提供することでした。
キーの変更及びparabiont生存率を増加させるための追加の推奨事項では、このプロトコルは、うまくいけば、細胞遊走、運命の仕様、および組織および細胞の文脈の範囲内の分化を調節する因子を調査するために結合した胚を利用したい研究者に力を与えるだろう。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Methyl cellulose | Sigma | M0387 | |
| Individual components for E3/HCR: | For 1L: 14,61g NaCl, 0,63g KCl, 2,43g CaCl2-2H2O, 1,99g MgSO4 | ||
| NaCl (Sodium chloride) | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| KCl (Potassium chloride) | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| CaCl2 (Calcium chloride dihydrate) | Sigma-Aldrich | 223506 | |
| MgSO4 (Magnessium sulfate heptahydrate) | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Hepes (1M ) buffer solution | ThermoFisher | 15630-080 | |
| Name | Company | Catalog Number | |
| Antibiotics: | |||
| Pen/Strep | gibco by Life technologies | 15140-120 | |
| Ampicilin sodium salt | Sigma Life Science | A0166 | |
| Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus | Sigma Life Science | K1377 | |
| Name | Company | Catalog Number | |
| 50 mg/ml Pronase from Streptomyces griseus | Roche | 11459643001 | |
| capillary glass used for needles (Capillary Glass & Filaments) | Sutter Instrument | ITEM#: BF 100-50-10 | |
| Teasing needles with wooden handles | Fisher Scientific | S07894 | |
| Glass Pasteur pipettes | Fisherbrand | 13-678-20A | |
| 10 ml pipette pump (green) (Pipette Pump Pipettor) | Novatech International | F37898-0000 | |
| 100 mm diameter/ 20 mm deep plastic petri dishes (PETRI DISH, 100/20 MM, PS, CLEAR, WITH VENTS, HEAVY DESIGN, 15 PCS./BAG ) |
Greiner Bio-one | 664102 | |
| Dextran, Cascade Blue, 10,000 MW, Anionic, Lysine Fixable | ThermoFisher | D-1976 | |
| PTU. working stock is 0.003% (50x is 0.15%). for 500 ml, 0.75 g N-Phenylthiourea | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| Tricaine (powder) (Tricaine Methanesulfonato, Tricaine-S) | Western Chemical Inc | MS 222 | |
| LMP agarose (Ultrapure LMP agarose) | Invitrogen | 16520100 | |
| plastic transfer pipette (just the wide ended one I think) | Fisherbrand | 137115AM | |
| Glass-bottom 6-well plates used for imaging | MatTek | P06G1.5-20-F | |
| plastic western gel loading tip fixed on the end of a wood-handled dissecting needle (GELoader tips) | Eppendorf | 22351656 | |
| glass cover slips, slides and vacuum grease if mounting for an upright microscope: | |||
| Vaccum grease ( Dow Corning® high-vacuum silicone grease colorless, weight 5.3 oz (tube) ) |
Dow Corning | Z273554 | |
| Glass cover slips | Corning Life Sciences | 2960-244 |
References
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