Abstract
neuromuscular जंक्शन (NMJ) उम्र बढ़ने, चोट और बीमारी का एक परिणाम के रूप में हानिकारक संरचनात्मक और कार्यात्मक परिवर्तन आए। इस प्रकार, इसे बनाए रखने और NMJs की मरम्मत में शामिल सेलुलर और आणविक परिवर्तन को समझने के लिए जरूरी है। इस प्रयोजन के लिए, हम मज़बूती से और लगातार चूहों में NMJs regenerating जांच करने के लिए एक तरीका विकसित किया है। यह तंत्रिका चोट विधि आम अनुजंघास्थिक तंत्रिका पेराई शामिल है के रूप में यह घुटने के पास gastrocnemius मांसपेशी कण्डरा के पार्श्व सिर के ऊपर से गुजरता। 70 दिन पुराने मादा चूहों का उपयोग करना, हम उस मोटर axons 7 दिनों के बाद कुचलने के भीतर पिछले पोस्टअन्तर्ग्रथनी लक्ष्यों reinnervate करने के लिए शुरू प्रदर्शित करता है। वे पूरी तरह से 12 दिनों से उनके पिछले synaptic क्षेत्रों पुन: अधिकार। इस चोट विधि की विश्वसनीयता का निर्धारण करने के लिए, हम अलग-अलग 70 दिन पुराने मादा चूहों के बीच reinnervation दरों की तुलना में। हमने पाया है कि reinnervated पोस्टअन्तर्ग्रथनी साइटों की संख्या 7, 9 पर चूहों के बीच इसी तरह की थी, और 12 दिनों के बाद क्रश। यदि निर्धारित करने के लिएइस चोट परख भी मांसपेशियों में आणविक परिवर्तन तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, हम पेशी निकोटिनिक रिसेप्टर (गामा-ACHR) और मांसपेशियों-विशिष्ट काइनेज (कस्तूरी) के गामा-सबयूनिट के स्तर की जांच की। गामा ACHR सबयूनिट और कस्तूरी अत्यधिक निम्न वितंत्रीभवन upregulated और NMJs की reinnervation निम्नलिखित सामान्य स्तर पर लौटने के लिए कर रहे हैं। हम इन जीनों और मांसपेशियों के तंत्रिका वितरण की स्थिति के लिए प्रतिलेख के स्तर के बीच एक करीबी संबंध पाया गया। हम मानते हैं कि इस विधि NMJ और अन्य synapses की मरम्मत में शामिल सेलुलर और आणविक परिवर्तन के बारे में हमारी समझ को गति देगा।
Protocol
सभी प्रयोगों एनआईएच दिशा निर्देशों और पशु प्रोटोकॉल वर्जीनिया टेक संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित के तहत बाहर किया गया था।
1. सर्जरी के लिए तैयारी पशु
- एक बाँझ 1 मिलीलीटर इंसुलिन सिरिंज के साथ ketamine (90 मिलीग्राम / किग्रा) और xylazine (10 मिलीग्राम / किग्रा) चमड़े के नीचे इंजेक्शन के माध्यम से वंक्षण का एक मिश्रण के साथ चूहों anesthetize। वाहक समाधान 0.9% खारा, 17.4 मिलीग्राम / एमएल ketamine, और 2.6 मिलीग्राम / एमएल xylazine का मिश्रण होता है। जबकि प्रभाव लेने के लिए दवा के लिए इंतजार कर पिंजरों में वापस जानवरों रखें।
नोट: लोडिंग खुराक प्रक्रिया की अवधि के लिए पर्याप्त संज्ञाहरण प्रदान नहीं करता है, तो लोडिंग खुराक की एक अतिरिक्त 25% इंजेक्ट किया जा सकता है। - मॉनिटर जानवरों इंजेक्शन पोस्ट स्थिर श्वसन दर और कामोत्तेजना के स्तर के उचित अवसाद के लिए जाँच करें। एक हिंद पैर चुटकी, जो कोई प्रतिक्रिया प्रकाश में लाना चाहिए जब पर्याप्त anesthetized साथ कामोत्तेजना के स्तर की जाँच करें।
ध्यान दें: यह आमतौर पर 3-5 लेता हैएक युवा वयस्क माउस 25 से 30 ग्राम के औसत के लिए मिनट। पशु अभी भी 10 मिनट के बाद इंजेक्शन के बाद से संवेदनशील है, तो संवेदनाहारी लोडिंग खुराक की एक अतिरिक्त 25% इंजेक्ट किया जा सकता है। - जानवर की आँखों के लिए पेट्रोलियम और प्रकाश खनिज तेल नेत्र मरहम लागू सूखापन को रोकने के लिए। पिंजरे और जगह से जानवरों को एक साफ, सपाट सतह पर निकालें। एक बिजली के बाल trimmer का उपयोग करने के लिए श्रोणि पैर से वांछित हिंद अंग दाढ़ी, अंग का केवल पार्श्व पहलू उजागर।
- 1 मिनट के लिए मुंडा साइट के लिए एक रासायनिक बाल पदच्युत लागू करें। मैन्युअल प्रयोगशाला पोंछे का उपयोग बालों को हटा दें। स्वच्छ प्रयोगशाला के साथ depilated क्षेत्र इथेनॉल में भिगो साफ कर लें।
2. सर्जिकल प्रक्रिया
- आटोक्लेव या अन्य उपयुक्त विधि के माध्यम से शल्य चिकित्सा उपकरणों जीवाणुरहित। 80% इथेनॉल / एच 2 0 के साथ शल्य साइट और शल्य चिकित्सा बोर्ड को साफ करें। proviodine साथ शल्य साइट कीटाणुरहित। शल्य चिकित्सा बोर्ड पर माउस प्लेस और अंग मजबूरी के साथ पंक्ति में। रखनासंयुक्त घुटने के साथ एक anatomically प्राकृतिक स्थिति में लक्ष्य हिंद अंग थोड़ा आंतरिक या बाहरी रोटेशन के बिना बढ़ाया।
- जानवर और बोर्ड सर्जिकल माइक्रोस्कोप के नीचे रखें। सतही स्थलों, विशेष रूप से बोनी संयुक्त घुटने और tibialis पूर्वकाल और gastrocnemius मांसपेशियों के बीच रिज के माध्यम से टटोलने का कार्य उचित चीरा साइट के लिए ओरिएंट।
- मनोरंजक के लिए सामान्य संदंश का उपयोग करते हुए एक छुरी या वसंत कैंची का उपयोग त्वचा के माध्यम से एक लगभग 3 सेमी चीरा। आम अनुजंघास्थिक तंत्रिका के मूल पाठ्यक्रम के लिए सीधा चीरा।
- सतही प्रावरणी के माध्यम से चीरा जारी, मछलियां ग्रीवा को प्रकाश में लाने और उत्तर मांसपेशियों lateralis। को जोड़ने गहरी प्रावरणी के माध्यम से काटने द्वारा इन मांसपेशियों को अलग करें। एक 1-2 सेमी कटौती पर्याप्त होना चाहिए।
- मछलियां वापस लेना पेशी ग्रीवा दुमदारी यांत्रिक retractors का उपयोग कर, आम अनुजंघास्थिक तंत्रिका खुलासा।
- तंत्रिका proximally ट्रेस इसकी इंटर तकgastrocnemius मांसपेशियों के पार्श्व सिर का पट्टा के साथ खंड पाया जाता है। नोट: एक्सपोजर मुकर त्वचा और मांसपेशियों की अतिरिक्त हेरफेर की आवश्यकता हो सकती है। इस चौराहे तंत्रिका चोट के लिए स्थिर मील का पत्थर के रूप में प्रयोग किया जाता है।
- एक ठीक संदंश के साथ तंत्रिका समझ, gastrocnemius कण्डरा के पार्श्व सीमा के लिए एक समानांतर फैशन में सुझावों संरेखित। 5 सेकंड के लिए स्थिर, हार्ड दबाव लागू करने से आम अनुजंघास्थिक तंत्रिका क्रश।
- शल्य गुंजाइश के माध्यम से दृश्य निरीक्षण द्वारा तंत्रिका से भरा कुचलने की पुष्टि। यह चोट के स्थल पर पारदर्शी दिखाई देगा। अगर परिधीय axons में प्रतिदीप्ति प्रोटीन व्यक्त चूहों का उपयोग, प्रतिदीप्ति चोट की साइट से गायब हो जाएगा।
- retractors निकालने और उनके शारीरिक स्थितियों में मांसपेशियों को फिर से संगठित करना। 6-0 रेशम टांके के साथ चीरा साइट को बंद करें। 1-3 सरल बाधित टांके पर्याप्त है। एक साफ पिंजरे में एक हीटिंग पैड पर माउस स्वास्थ्य लाभ रखें।
- 2 घंटे बाद ओपेरा के लिए सभी जानवरों को मॉनिटरtion श्वास और संज्ञाहरण के लिए किसी भी प्रतिकूल प्रतिक्रिया के लिए जाँच करें। चमड़े के नीचे इंजेक्शन के माध्यम से वंक्षण buprenorphine 0.05-0.10 मिलीग्राम / किग्रा का एक प्रारंभिक खुराक प्रशासन तुरंत सर्जरी से वसूली के बाद। 3 अतिरिक्त खुराक अगले 48 घंटा भर में हर 12 घंटा दें। पूरी वसूली के बाद, जानवरों की देखभाल की सुविधा के लिए चूहों वापसी।
3. अलगाव और extensor का धुंधला digitorum longus (EDL) मांसपेशियों
- isoflurane का उपयोग जानवरों के बलिदान। शोषक labwipes के साथ पैक एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में 0.5 मिलीलीटर बांटना तरल isoflurane। एक मोहरबंद 2,500 3 सेमी कक्ष में पशु के साथ नवोदित ट्यूब रखें। जोखिम कम से कम 4 मिनट के लिए पर्याप्त है। द्विपक्षीय नेत्रच्छद, पैर के अंगूठे चुटकी, और पूंछ चुटकी सजगता के नुकसान के लिए टेस्ट सुनिश्चित करने के लिए कि प्रत्येक जानवर के छिड़काव के साथ आगे बढ़ने से पहले बेहोश है।
- Transcardially पहले 10 मिलीलीटर 0.1M पीबीएस के साथ 16 जानवरों छिड़कना, तो 0.1M पीबीएस (7.4 पीएच) में 4% paraformaldehyde के 25 मिलीलीटर। हेपरिन (30 इकाइयों / 20जी जानवर वजन) पीबीएस के साथ जोड़ा जा सकता है (10 इकाइयों / एमएल) के छोटे केशिका बेड में रक्त के थक्के रोकने के लिए, छिड़काव परिणामों में सुधार।
- कैंची का उपयोग पेट की परिधि के चारों ओर त्वचा के माध्यम से transversally में कटौती करने से हिंद अंग को कवर त्वचा निकालें। त्वचा के नीचे छील अतीत हिंद अंग और पैरों संदंश का उपयोग।
- लोभी और संदंश के साथ छीलने से हिंद अंग की सतही प्रावरणी निकालें। अगर परिधीय axons में प्रतिदीप्ति प्रोटीन व्यक्त चूहों का उपयोग, पूरे चूहों रात भर 4% पीएफए में 50 मिलीलीटर ट्यूब में पोस्ट-ठीक। पीबीएस के साथ तीन बार कुल्ला।
नोट: फिक्स्ड चूहों 4 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस में संग्रहित किया जा सकता है। यदि नहीं, तो इस कदम को छोड़ और बाद फिक्सिंग जानवरों के बिना 3.6 कदम आगे बढ़ना। - माउस हिंद अंग से EDL मांसपेशियों 18 काटना, प्रॉक्सिमल और बाहर tendons के रूप में संभव के रूप में बरकरार रखने के लिए सुनिश्चित किया जा रहा।
- बफर अवरुद्ध में EDL की मांसपेशियों में कम से कम 1 घंटे के लिए (1x पीबीएस युक्त 0.5% ट्राइटन X-100, 3% बीएसए और 5% बकरी सीरम) सेते हैं।
- contralateral पूरा NMJ तंत्रिका वितरण के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में रिहाई EDL दाग। नकारात्मक नियंत्रण एक edl 4 दिनों के बाद चोट, एक समय इस मुद्दे पर जहां NMJ पूरी तरह से denervated है पर प्राप्त किया है, साथ ही एक edl केवल माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ दाग को शामिल करना चाहिए।
- उचित fluorescently टैग माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ मांसपेशियों को सेते हैं 1 दिन के लिए neurofilament और synaptotagmin -2 पता लगाने के लिए। मांसपेशियों और 10 मिनट के लिए हर बार 1x पीबीएस के साथ तीन बार धोएं। नोट: यह कदम कदम 3.10 के साथ मिलकर किया जा सकता है। इस कदम को छोड़ यदि परिधीय axons में प्रतिदीप्ति प्रोटीन व्यक्त चूहों का उपयोग।
- postsy कल्पना करने के लिएNMJ की naptic क्षेत्र, 5 माइक्रोग्राम / एमएल एलेक्सा-555 संयुग्मित अल्फा-bungarotoxin कम से कम 2 घंटे के लिए अवरुद्ध बफर में पतला के साथ मांसपेशियों को सेते हैं। मांसपेशियों और 10 मिनट के लिए हर बार 1x पीबीएस के साथ तीन बार धोएं।
- सकारात्मक आरोप लगाया गिलास स्लाइड पर पूरे मांसपेशियों को माउंट करने के लिए, स्लाइड पर सीधे पेशी जगह, बढ़ते स्लाइड पर मध्यम आधारित ग्लिसरॉल की कुछ बूँदें जोड़ने के लिए और एक coverslip के साथ कवर। पेशी समतल करने के लिए स्लाइड के खिलाफ coverslip दबाएँ। स्लाइड और coverslip का उपयोग कर प्रयोगशाला पोंछे की परिधि से बढ़ते मीडिया से दूर लेना। नेल पॉलिश लागू coverslip और स्लाइड के बीच किनारों को सील करने के लिए।
4. इमेजिंग और डेटा विश्लेषण
- NMJs, छवि EDL मांसपेशी एक confocal लेजर स्कैनिंग 488, 555 और 633 एनएम प्रकाश उत्तेजित और 20X 40X और उद्देश्यों के साथ उत्सर्जित प्रकाश पर कब्जा करने के लिए सुसज्जित माइक्रोस्कोप का उपयोग कर की संरचना का विश्लेषण करने के लिए।
- पूरे NMJs कल्पना, ऑप्टिकल सेकंड की अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण चित्र बनानेमाहौल 1 2 माइक्रोन के लिए स्थान दिया गया है के अलावा सबसे कम करने के लिए उच्चतम NMJ के दृश्य क्षेत्रों से विस्तार। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग कर अधिकतम तीव्रता के अनुमानों बनाएँ।
- reinnervation की दरों का निर्धारण करने के लिए, NMJs वर्गीकृत के रूप में: 1) पूरी तरह से denervated = पोस्टअन्तर्ग्रथनी साइट अक्षतंतु और AChRs के बीच कम से कम 5% colocalization अक्षतंतु के साथ संपर्क का पूरी तरह से रहित है। 2) आंशिक रूप से इन्नेर्वतेद = अक्षतंतु आंशिक रूप से postsynapse, 5-95% अक्षतंतु और AChRs बीच colocalization overlaps। 3) पूर्ण इन्नेर्वतिओन = पूर्व और बाद अन्तर्ग्रथन के बीच लगभग पूर्ण समानाधिकरण, अक्षतंतु और AChRs के बीच 95% से अधिक colocalization। NMJs कि इमेजिंग विमान को सीधा झूठ या पूरी तरह से छवि में कल्पना नहीं कर रहे हैं बाहर। नोट: इन सभी प्रयोगों में, कम से कम 3 जानवरों और पशु प्रति 50 NMJs जांच की गई। परिणाम कम से कम 0.05 के पी मूल्य के साथ एक छात्र टी परीक्षण का उपयोग महत्वपूर्ण समझा रहे थे।
- ऑपरेटर अंधा, अलग व्यक्तियों प्रदर्शन कर सकते हैंसर्जरी और छवि विश्लेषण। उपचार समूहों के ज्ञान के बिना, विश्लेषक NMJ स्कोरिंग के साथ उद्देश्य हो सकता है। वैकल्पिक रूप से, छवियों बेतरतीब और स्रोत पशु के ज्ञान के बिना विश्लेषण के लिए ऑपरेटर के लिए प्रस्तुत किया जा सकता है।
5. मात्रात्मक पीसीआर
- isoflurane और गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था का उपयोग पशुओं बलिदान। त्वचा और सतही कदम करने के लिए 3.3 अनुसार पैर की मांसपेशियों को कवर प्रावरणी निकालें। tibialis पूर्वकाल और कदम करने के लिए 3.4 अनुसार EDL मांसपेशियों काटना।
- फ्लैश पूरे tibialis पूर्वकाल और तरल नाइट्रोजन में एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में edl की मांसपेशियों को फ्रीज। एक पूर्व ठंडा मोर्टार आंशिक रूप से तरल नाइट्रोजन में जलमग्न में ट्यूब और जगह से ऊतक निकालें। एक ठीक पाउडर एक मोर्टार और मूसल का उपयोग करने में जमे हुए पेशी पीस।
- एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध आरएनए निष्कर्षण अभिकर्मक में जमे हुए पेशी पाउडर भंग और निर्माता की मैं के अनुसार एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट के साथ शाही सेना निष्कर्षण और जीनोमिक डीएनए हटाने प्रदर्शनnstructions।
- निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस मिश्रण के साथ रिवर्स प्रतिलेखन प्रदर्शन करना।
- प्रदर्शन एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट का उपयोग qPCR उचित गृह व्यवस्था जीन का उपयोग कर (सामग्री की तालिका देखें)। (सामग्री की तालिका देखें) पीसीआर बाहर ले जाने के लिए एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध मात्रात्मक पीसीआर थर्मल साइक्लर का प्रयोग करें।
- 58 डिग्री सेल्सियस के लिए annealing तापमान सेट करें। Taq पोलीमर्स / SYBR हरे रंग के मिश्रण के निर्माता के विनिर्देशों के लिए अतिरिक्त साइकिल चालन के मापदंडों को समायोजित करें। थर्मल साइक्लर 65 डिग्री सेल्सियस से 95 डिग्री सेल्सियस से 0.5 डिग्री सेल्सियस वृद्धिशील बढ़ जाती है से मिलकर प्राइमर विशिष्टता के लिए परीक्षण और डिमर गठन प्राइमर के लिए कार्यक्रम में एक अंतिम पिघल वक्र कदम शामिल करें।
- ΔΔCT विधि 21 18S शाही सेना का उपयोग नियंत्रण जीन के रूप में - 2 से रिश्तेदार mRNA अभिव्यक्ति के स्तर का निर्धारण करें।
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Representative Results
आम अनुजंघास्थिक तंत्रिका भी आम peroneal तंत्रिका कहा जाता है, घुटने की चक्की खात ऊपर sciatic तंत्रिका, जहां यह पैर (चित्रा 1 ए) के पूर्वकाल पहलू को बहिर्जंघिका के सिर के चारों ओर झूलों से उठता है। वहाँ सतही और गहरी अनुजंघास्थिक नसों में शाखाओं यह एक साथ, पैर और पैर की उंगलियों के dorsiflexors की आपूर्ति (पूर्वकाल tibialis, extensor digitorum longus और ब्रेविस, और प्रसारिणी halluces longus मांसपेशियों), और पैर की everters (peroneus मांसपेशियों)। यह तंत्रिका भी संवेदी तंतुओं कि पैर और पैर के निचले आधे के पार्श्व पहलू की पीठ के लिए परियोजना किया जाता है। यह एक अपेक्षाकृत पतली मोटर और संवेदी axons की रचना की संरचना है। यह तंत्रिका शाखा एक उम्मीद के मुताबिक शारीरिक पाठ्यक्रम निम्नानुसार है। घुटने के लिए पार्श्व, तंत्रिका ज्यादातर सतही रूप में यह gastrocnemius मांसपेशी (चित्रा 1 और चित्रा 2) के पार्श्व सिर का पट्टा पर चलाता है। गुस्थान एक स्थिर मील का पत्थर है कि आसानी से एक छोटा सा चीरा के साथ पहुंचा जा सकता है, त्वचा और प्रावरणी (चित्रा 1 ए) के लिए नुकसान को सीमित करने के रूप में कार्य करता है। इस तंत्रिका के छोटे व्यास, जब sciatic और tibial नसों की तुलना में, यह संभव कम बल का उपयोग कर, पूरी तरह से अधिक सतही एक्सोन विच्छेद की संभावना को कम करने के लिए सभी एक्सोन को कुचलने के लिए बनाता है।
पीले प्रतिदीप्ति प्रोटीन (YFP) केवल न्यूरॉन्स 17 में व्यक्त चूहे आम अनुजंघास्थिक तंत्रिका पर क्रश प्रक्रिया अनुकूलन करने के लिए और असंदिग्ध रूप से regenerating axons कल्पना इस्तेमाल किया गया। तंत्रिका gastrocnemius कण्डरा लक्ष्य की मांसपेशियों के लिए सबसे समीपस्थ क्योंकि इस साइट चीरा के स्थान से अधिक सुलभ है के किनारे पर कुचल दिया गया। इस साइट में भी एक विश्वसनीय संरचनात्मक मील का पत्थर के रूप में कार्य करता है, यह एक ही उम्र और सेक्स के जानवरों के बीच NMJs के उत्थान की तुलना संभव बना रही है। 5 सेकंड के लिए तंत्रिका संपीड़ित एक ठीक संदंश का उपयोग कर resचोट की साइट (चित्रा 2 बी) से YFP के लापता होने में ults। हालांकि, संयोजी ऊतक और epineurium में रहने वाले कोशिकाओं सटे रहते हैं, उनके मूल लक्ष्यों (चित्रा 2 बी) को एक्सोन के तेजी से और सटीक उत्थान के लिए एक नाली के रूप में सेवारत। 70 दिन पुरानी मादा चूहों में, यह चोट न्यूरोनल सोमा (चित्रा 4 बी) से बाहर का सब axonal खंडों के पतन का कारण करने के लिए पर्याप्त है।
विश्वसनीयता और इस चोट विधि के reproducibility निर्धारित करने के लिए, extensor digitorum longus (EDL) मांसपेशी के reinnervation जांच की गई थी। यह मांसपेशियों के कई कारणों के लिए चुना गया था: 1) यह समीपस्थ अभी तक शारीरिक रूप से चीरा और तंत्रिका चोट साइटों (चित्रा 3) से अलग है। इसलिए, मांसपेशियों में ही कटे innervating एक्सोन के अध: पतन से बदल रहा है। क्रश साइट के लिए अपनी निकटता समय की जरूरत यह reinnervated जा करने के लिए और मांसपेशियों को कम करता है atrophवाई। 2) यह मुख्य रूप से तेजी से टाइप कंकाल की मांसपेशी फाइबर, जो उम्र बढ़ने और रोगों के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं से बना है। 3) इसके NMJs रोगों और बुढ़ापे की प्रगति कि व्यायाम और गरमी प्रतिबंध द्वारा तनु जा सकती दौरान महत्वपूर्ण संरचनात्मक परिवर्तन से गुजरना। 4) यह लाइव इमेजिंग और आणविक हेरफेर (चित्रा 3 डी) के लिए आसानी से सुलभ है। 5) यह आसानी से अपने चार phalangeal घटकों में विभाजित किया जा सकता है कि पूरे घुड़सवार यह संभव बना रही हो सकता है पूरी तरह से छवि अपनी innervating axons और उनके कनेक्शन प्रकाश माइक्रोस्कोपी (चित्रा 3 बी) का उपयोग कर के सभी के लिए।
दाहिना पैर पर अनुजंघास्थिक तंत्रिका पेराई के बाद पहले से खाली बाद synaptic साइटों की Reinnervation तीन मोटर axons में YFP व्यक्त 70 दिन पुरानी मादा चूहों में मूल्यांकन किया गया था। बाद synaptic साइटों का उपयोग कर fluorescently कल्पना थे टैग की अल्फा-bungarotoxin (BTX) है, जो चुनिंदा और मांसपेशियों के लिए एनएसी उच्च आत्मीयता के साथ बांधताबजे। 1) denervated मांसपेशी फाइबर में, मोटर axons पूरी तरह से बाद synaptic साइटों से अक्षतंतु और AChRs मनाया गया के बीच कम से कम 5% colocalization लापता और गया: स्नायु आंशिक रूप से या पूरी तरह से इन मानदंडों का पालन reinnervated denervated जा करने के लिए समझा रहे थे। 2) आंशिक रूप से इन्नेर्वतेद मांसपेशी फाइबर कुछ लेकिन अक्षतंतु और AChRs मनाया गया के बीच बाद synaptic साइटों और 5-95% colocalization के साथ मोटर axons की अधूरी समानाधिकरण द्वारा वर्गीकृत किया गया। 3) पूरी तरह से इन्नेर्वतेद मांसपेशी फाइबर में, वहाँ मोटर तंत्रिका अंत और बाद synaptic साइटों और अक्षतंतु और AChRs मनाया गया के बीच 95% से अधिक colocalization के बीच लगभग पूर्ण समानाधिकरण था। अलग-अलग मायने रखता है NMJs से बाहर रखा गया है, तो उनकी endplates इमेजिंग विमान या पूरे NMJ को सीधा रखना कल्पना नहीं की गई थी। इन मानदंडों का प्रयोग, दर और reinnervation की डिग्री में उच्च क़बूल की जांच की सभी चूहों के बीच मनाया गया। 4 दिनों के बाद कुचलने में मांसपेशियों सभी जानवरों EXA में पूरी तरह से denervated पाए गएखनन किया (चित्रा 4 बी)। यह निष्कर्ष से पता चलता है कि 5 सेकंड के लिए आम अनुजंघास्थिक तंत्रिका कुचल, जैसा कि ऊपर वर्णित है, सभी एक्सोन तोड़ने के लिए पर्याप्त है। 7 दिनों के बाद कुचलने से, तंत्रिका अंत पहले से खाली बाद synaptic साइटों (चित्रा 4C, 4E-एफ) reoccupying की प्रक्रिया में थे। हालांकि, ज्यादातर मांसपेशी फाइबर अभी भी आंशिक रूप से ही इन्नेर्वतेद पाए गए। अतिरिक्त दिनों के बाद कुचलने के साथ, तंत्रिका अंत प्रेस्य्नाप्तिक साइटों और NMJs पूरी तरह से 12 दिनों (चित्रा 4D, 4E-एफ) द्वारा reinnervated पाया गया में अंतर करने के लिए जारी रखा। महत्वपूर्ण बात, वहाँ समय का एक ही लंबाई (चित्रा 4E-एफ) के लिए denervated चूहों के बीच में थोड़ा परिवर्तनशीलता था, प्रदर्शन है कि पेराई अनुजंघास्थिक तंत्रिका ही उम्र और सेक्स के जानवरों के बीच की मांसपेशियों के reinnervation तुलना करने के लिए एक परख के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।
ईमानदारी से पशुओं के बीच regenerating NMJs तुलना करने की क्षमता अवसर प्रदान करता हैसेलुलर पूरी तरह से इस अन्तर्ग्रथन मरम्मत के लिए आवश्यक हर कदम के साथ जुड़े सुविधाओं को समझते हैं। 70 दिन पुरानी reinnervation की दरों की तुलना के लिए ऊपर इस्तेमाल चूहों से denervated और regenerating NMJs की वास्तुकला की जांच करने के लिए, NMJs के उच्च संकल्प confocal माइक्रोस्कोपी छवियों प्राप्त किया गया। जैसी कि उम्मीद थी, इस विश्लेषण में परिवर्तन है कि α-मोटर अक्षतंतु तंत्रिका अंत में होने के रूप में वे मांसपेशी फाइबर (चित्रा 4 जी-आई) reinnervate के एक नंबर का पता चला। Axonal विकास शंकु का विस्तार और बाहर शाखा के रूप में वे पोस्टअन्तर्ग्रथनी साइटों (चित्रा 4 जी) से संपर्क शुरू करने के लिए दिखाई देते हैं। ये axonal शाखाओं तो postsynapse के विशिष्ट क्षेत्रों के साथ विकसित, अक्षतंतु तंत्रिका पोस्टअन्तर्ग्रथनी साइट (चित्रा 4H-आई) के साथ समाप्त होने के निकट पूरा मुक़ाबला में बनी। मोटर तंत्रिका अंत अत्यधिक जैसे लगते हैं कि विकास के दौरान पाए जाने वाले एस के लिए प्रतिस्पर्धा कई एक्सोन सहित मनाया गया regenerating में अतिरिक्त ढांचागत सुविधाओंAME लक्ष्य (चित्रा 4H), केवल एक अक्षतंतु में बनी 12 दिनों के बाद कुचलने से एक मांसपेशी फाइबर innervating। इसके अतिरिक्त, के बाद synaptic साइटों से परे का विस्तार axonal शाखाओं, इस के साथ साथ अंकुरित के रूप में संदर्भित सभी स्तरों पर बाद चोट मनाया गया (चित्रा 4I)। ये स्प्राउट्स, अत्यधिक प्रचलित थे सुझाव है कि axonal मरम्मत के अंतिम चरण extrajunctional axonal शाखाओं का त्याग शामिल है पूरी तरह से इन्नेर्वतेद NMJs में भी। तंत्रिका अंत में इन स्पष्ट परिवर्तन के बावजूद, बाद synaptic साइटों ज्यादातर सभी चरणों के बाद चोट पर पृथक बने रिहाई की मांसपेशियों में उन लोगों के, 4 दिनों के बाद क्रश सहित जब मांसपेशी फाइबर पूरी तरह से denervated पाए जाते हैं की तुलना में। AChRs के अतिरिक्त synaptic क्षेत्रों के लिए विखंडन या महत्वपूर्ण नुकसान और पुनर्वितरण का कोई स्पष्ट संकेत नहीं था। इन निष्कर्षों को दृढ़ता से संकेत मिलता है कि अनुजंघास्थिक तंत्रिका क्रश विधि की पहचान करने और आणविक, औषधीय और जीवन-शैली हस्तक्षेप टी परीक्षण करने के लिए एक परख के रूप में इस्तेमाल किया जा सकताटोपी synapses पर तंत्रिका अंत की मरम्मत को बढ़ावा देने, NMJ भी शामिल है।
हाल ही में प्रगति के बावजूद, बहुत कम प्रगति पेशी व्युत्पन्न कारकों की आवश्यकता है और पर्याप्त बनाए रखने और NMJ मरम्मत के लिए की पहचान करने में किया गया है। इसलिए हम उनसे पूछा गया कि आम अनुजंघास्थिक तंत्रिका चोट विधि reinnervation प्रक्रिया के विशिष्ट चरणों में और NMJ की मरम्मत में संभावित भूमिकाओं के साथ बदल अणुओं की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। प्रिंसिपल, दो NMJ से जुड़े जीन की अभिव्यक्ति विश्लेषण का एक सबूत के रूप में, ACHR गामा सबयूनिट और मांसपेशियों-विशिष्ट काइनेज, कस्तूरी 18 प्रदर्शन किया गया था। मात्रात्मक पीसीआर के साथ प्रदर्शन के रूप में, इन जीनों निम्नलिखित वितंत्रीभवन वृद्धि हुई है और कमी आई है के रूप में NMJs reinnervated कर रहे हैं (चित्रा 5 ए-बी) कर रहे हैं। इन जीनों, 4 दिनों के बाद क्रश पर upregulated कर रहे हैं जैसा कि पहले पूरी तरह से denervated मांसपेशियों 19 का उपयोग कर सूचना दी। के रूप में नसों reinnervate मांसपेशी फाइबर, इन जीनों के स्तर में कमी और rapidly आधारभूत की वापसी। जांच जानवरों के बीच, दोनों जीनों के लिए अभिव्यक्ति की तर्ज regenerating NMJs में आणविक और सेलुलर परिवर्तन के बीच एक करीबी संबंध का प्रदर्शन लगभग समान है। इस विधि इसलिए NMJ उत्थान के विभिन्न चरणों के साथ जुड़े आणविक परिवर्तन की पहचान करने के लिए अद्वितीय अवसर प्रदान करता है।
चित्रा 1:। आम अनुजंघास्थिक तंत्रिका एनाटॉमी (ए) योजनाबद्ध sciatic तंत्रिका के पाठ्यक्रम और संबंध में अपने टर्मिनल शाखाओं सतही और बोनी स्थलों के ब्यौरा। SCN = Sciatic तंत्रिका, तमिलनाडु = tibial तंत्रिका, SRN = Sural तंत्रिका, सीपीएन = आम अनुजंघास्थिक तंत्रिका, एसपीएन = सतही अनुजंघास्थिक तंत्रिका, DPN = दीप अनुजंघास्थिक तंत्रिका। वांछित चीरा साइट संकेत दिया है। (बी) के साथ त्वचा को हटा आसपास की मांसपेशियों के संबंध में आम अनुजंघास्थिक तंत्रिका स्थान का आरेख।सापेक्ष चीरा साइट निवेश प्रावरणी overlying दिखाया गया है। टीए = tibialis पूर्वकाल स्नायु EDL = extensor digitorum Longus स्नायु। (सी) उजागर sciatic और आम अनुजंघास्थिक तंत्रिका। सीपीएन घुटने के स्तर पर gastrocnemius मांसपेशी (GN) पट्टा खत्म पार। क्रश साइट दिखाए कण्डरा के सापेक्ष। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2:। आम अनुजंघास्थिक तंत्रिका क्रश सर्जरी (ए) के प्रारंभिक चीरा केवल लंबाई में कुछ सेमी होना चाहिए। त्वचा और सतही प्रावरणी के माध्यम से मर्मज्ञ के बाद, चीरा निवेश / गहरी मछलियां ग्रीवा और प्रादेशिक सेना मांसपेशियों के बीच झूठ बोल प्रावरणी के माध्यम से जारी रखा जाना चाहिए। (A1) आम अनुजंघास्थिक तंत्रिका आसानी से माइक्रोस्कोपी टी के बिना कल्पना हैचीरा (Gn = Gastrocnemius मांसपेशी) hrough। (A2) आम अनुजंघास्थिक तंत्रिका और gastrocnemius कण्डरा के चौराहे आसानी से देखे जा सकते हैं, अगर चीरा चौड़ी है (केवल फोटो उद्देश्यों के लिए आवश्यक)। क्रश तंत्रिका और जी.एन. कण्डरा के समानांतर सीधा करने के लिए स्थान लाल रेखा द्वारा चिह्नित पर रखा जाना चाहिए। (बी) सीपीएन भी अधिक आसानी से एक फ्लोरोसेंट विदारक गुंजाइश के तहत YFP ट्रांसजेनिक चूहों के साथ कल्पना है। (बी 1) तंत्रिका एक पूर्ण कुचलने की चोट की पुष्टि के लिए अनुमति देता है कुचलने के स्थल पर रोशनी खो देता है। (बी 2) एक पूर्ण सीपीएन कुचलने अभी भी नग्न आंखों और कमरे में प्रकाश व्यवस्था के साथ देखे जा सकते हैं। तंत्रिका पारदर्शी हो जाएगा। इस छवि को तथ्य यह है कि epineurium और सीपीएन की अधिरचना बरकरार रहेगा, जबकि एक साथ पास के ऊतक और रक्त वाहिकाओं के लिए नुकसान को सीमित करने पर प्रकाश डाला गया।यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3:। Extensor digitorum Longus (EDL) मांसपेशी के एनाटॉमी (ए) माउस हिंद अंग की हड्डियों के संबंध में edl के 3 आयामी छवि। JAtlasView (बी) आंशिक रूप से विच्छेदित EDL मांसपेशी अपने चार phalangeal डिवीजनों में विभाजित का उपयोग कर और अंक प्रत्येक प्रभाग द्वारा नियंत्रित अंकन उत्पन्न। (सी) YFP लेबल गहरी अनुजंघास्थिक तंत्रिका की शाखा के रूप में यह EDL विभाजन दूसरा अंक को नियंत्रित करने के अंत प्लेट बैंड innervates। (डी) Axonal शाखाओं और उनके संपर्क साइटों को आसानी से पहचाना जा सकता है, चयनित NMJs के अनुरूप परीक्षा के लिए अनुमति देता है। एक बड़ा संस्करण ओ देखने के लिए यहाँ क्लिक करेंयह आंकड़ा च।
चित्रा 4: अनुजंघास्थिक तंत्रिका पेराई के बाद Reinnervation की समान दर एक ही उम्र और लिंग NMJs के विश्लेषण EDL मांसपेशी में पशुओं के बीच।। (ए) के बाद synaptic साइटों पूरी तरह से रिहाई चूहों में एक्सोन के कब्जे में हैं। (बी) के 4 दिनों के बाद कुचलने में मांसपेशियों को पूरी तरह से denervated पाए जाते हैं। (सी) Axons 7 दिन मांसपेशियों reinnervate करने के बाद क्रश और (डी) पूरी तरह से 12 दिनों से पोस्टअन्तर्ग्रथनी साइटों पुन: अधिकार लगते हैं। (ई - एफ) NMJ फिर से अधिभोग की दर लगभग अप्रभेद्य पशुओं के बीच समय का एक ही लंबाई के लिए denervated है। (जी - मैं) परिपक्व प्रेस्य्नाप्तिक साइटों में फिर से फर्क axonal तंत्रिका अंत के प्रतिनिधि छवियाँ। पोस्टअन्तर्ग्रथनी साइटों की reoccupation इस प्रकार एकउम्मीद के मुताबिक पैटर्न, शाखाएं है कि अंत में पूरी तरह से विकास के लिए NMJ region.Similar परे विस्तार के बिना पोस्टअन्तर्ग्रथनी साइटों पर कब्जा विकासशील विकास शंकु के साथ शुरू, पोस्टअन्तर्ग्रथनी साइटों शुरू में कई फिर से बढ़ रही एक्सोन द्वारा आच्छादित कर रहे हैं, लेकिन एक बार NMJ पूरी तरह से पुनर्जीवित किया गया है केवल एक अक्षतंतु बनी हुई है। (एच) ने संकेत कई एक्सोन द्वारा पूर्व और पोस्टअन्तर्ग्रथनी apparatuses, और तंत्रिका वितरण के बीच पूर्ण ओवरलैप बिना विपुल axonal अंकुरण, आंशिक तंत्रिका वितरण के उदाहरण हैं। 70 दिन पुरानी मादा चूहों की जांच कर रहे थे; स्केल बार = 50 माइक्रोन (ई), 20 माइक्रोन (सैनिक)। त्रुटि बार = SEM। एन = 3 चूहों। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 5: अनुजंघास्थिक तंत्रिका एक के रूप में क्रश विधिn परख NMJ मरम्मत में शामिल उम्मीदवार जीनों की पहचान करने के लिए (ए - बी)। दो NMJ जुड़े जीन, ACHR गामा सबयूनिट और कस्तूरी की mRNA के स्तर पर है, इसी तरह चूहों के टीए मांसपेशी में बदल रहे हैं समय का एक ही लंबाई के लिए denervated । बढ़ती समय के बाद तंत्रिका चोट के साथ, दोनों टेप के स्तर में कमी, आधारभूत की ओर लौटने, ऊतकीय विश्लेषण की पुष्टि NMJs के प्रगतिशील reinnervation दिखा। प्रत्येक पंक्ति एक व्यक्ति माउस का प्रतिनिधित्व करता है। त्रुटि बार = तकनीकी प्रतिकृति के मतलब की मानक त्रुटि। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
इस पांडुलिपि में प्रस्तुत विधि neuromuscular जंक्शनों (NMJ) की मरम्मत में शामिल तंत्र की पहचान करने के लिए अद्वितीय अवसर प्रदान करता है। इस विधि आम अनुजंघास्थिक तंत्रिका पेराई शामिल है के रूप में यह घुटने के पास gastrocnemius कण्डरा ऊपर से गुजरता है। हम बताते हैं कि एक संदंश के साथ तंत्रिका संपीड़न का केवल 5 सेकंड के बाद, पूरा अध: पतन की चोट के बाद 4 दिन से विख्यात है। युवा वयस्क चूहों में, अल्फा-मोटर axons के बाद चोट 7 दिन में extensor digitorum longus मांसपेशी (EDL) में पिछले synaptic साइटों reinnervate करने के लिए, प्रेस्य्नाप्तिक साइटों है कि 12 दिनों से रिहाई चूहों में उन लोगों से पृथक कर रहे हैं के सुधार में बनी शुरू करते हैं। इसके अलावा, हम कि चयन करें NMJ जुड़े अणुओं के स्तर को बारीकी से NMJ की इन्नेर्वतिओन स्थिति के साथ संबंध स्थापित प्रदर्शित करता है। महत्वपूर्ण बात, इन सेलुलर और आणविक परिवर्तन, एक ही लिंग और उम्र (चित्रा 5 ए-बी) के जानवरों के बीच अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य हैं की पहचान करने के लिए अवसरों और टीईएस उपलब्ध करानेटी कारक है कि NMJ मरम्मत के लिए काम करते हैं। शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं के संदर्भ में, आम अनुजंघास्थिक तंत्रिका शाखा अत्यधिक सुलभ के रूप में यह gastrocnemius कण्डरा के ऊपर से गुजरता है, केवल एक छोटा सा चीरा कि आसपास की मांसपेशियों और वाहिका को थोड़ा नुकसान में परिणाम की आवश्यकता होती है।
regenerating NMJs के साथ जुड़े सेलुलर और आणविक परिवर्तन की जांच करने के लिए आम अनुजंघास्थिक तंत्रिका का उपयोग कर के लाभ में से एक नंबर रहे हैं। gastrocnemius कण्डरा एक स्थिर संरचनात्मक मील का पत्थर लगातार एक ही स्थान और लक्ष्य मांसपेशियों से दूरी पर आम अनुजंघास्थिक तंत्रिका घायल करने के रूप में कार्य करता है। यह मज़बूती से एक ही उम्र और सेक्स के पशुओं के बीच एक्सोन के उत्थान की दर और मांसपेशियों की reinnervation तुलना करने के लिए यह संभव बनाता है। कदम इस तरह की सफलता के लिए महत्वपूर्ण यह सुनिश्चित करना शामिल है कि चोट साइट सर्जरी के बीच संगत है, पूर्ण तंत्रिका क्रश हर जानवर में प्राप्त की है, और कम से कम नुकसान आसपास के ढांचे को निरंतर है। ग द्वारा आच्छादित मांसपेशियों मेंअनुजंघास्थिक तंत्रिका ommon, tibialis पूर्वकाल (टीए) और प्रसारिणी digitorum longus (EDL) मांसपेशियों NMJ मरम्मत का आकलन करने के लिए उत्कृष्ट लक्ष्य कर रहे हैं। इन दोनों की मांसपेशियों मुख्य रूप से तेजी से टाइप मांसपेशी फाइबर कि गंभीर रूप से चोट, उम्र बढ़ने और रोगों 5 से प्रभावित हैं से बना रहे हैं। NMJ विश्लेषण के लिए, EDL मांसपेशी क्योंकि यह पूरी मुहिम शुरू की विकृतियों के बिना सभी NMJs छवि के लिए हो सकता है विशेष रूप से आकर्षक है। यह भी संभव मांसपेशी फाइबर, मोटर axons और आसपास की कोशिकाओं में कहीं परिवर्तन के साथ NMJs में परिवर्तन सहसंबंधी बनाता है।
टीए और EDL मांसपेशियों को बड़े पैमाने पर है क्योंकि उनके संरचनात्मक स्थान 20 की मांसपेशियों और NMJ मरम्मत पर विभिन्न आणविक और जीवन शैली के हस्तक्षेप के प्रभाव का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। हालांकि, लंबी अवधि के वितंत्रीभवन मांसपेशी फाइबर, सक्रिय प्रतिरक्षा कोशिकाओं और उपग्रह कोशिकाओं 12-14 atrophying में महत्वपूर्ण समारोह के साथ जीनों की अभिव्यक्ति बदल, इसे और अधिक कठिन सेलुलर और आणविक चर्चा का आकलन करने के लिए बनाविशेष रूप से NMJs के उत्थान को बढ़ावा देने के लिए आवश्यक anges। विधि यहाँ वर्णित में अनुजंघास्थिक तंत्रिका टीए और EDL की मांसपेशियों के लिए करीब निकटता में कुचल दिया है, तंत्रिका युवा वयस्क चूहों में पोस्ट-कुचलने के 7 दिनों के भीतर उन तक पहुँचने के लिए अनुमति देता है। इस प्रकार, इस विधि मांसपेशियों और टीए और EDL मांसपेशियों में मांसपेशी फाइबर atrophying के साथ जुड़े आणविक परिवर्तन के नुकसान को कम करना चाहिए।
अनुजंघास्थिक तंत्रिका क्रश प्रोटोकॉल कई अलग फैशन में संशोधित किया जा सकता है। तंत्रिका कटौती चोट आसानी से कुचलने के लिए प्रतिस्थापित किया जा सकता है, परिधीय तंत्रिका उत्थान के vivo इमेजिंग में बेहतर वास्तविक समय के लिए अनुमति देता है। एक कट regrowth के लिए एक बाधा के रूप में मृत अक्षतंतु सामग्री को निकालता है और endoneurial ट्यूब के भीतर हर अक्षतंतु के समरूप नुकसान करता है।
जब सही ढंग से प्रदर्शन अनुजंघास्थिक तंत्रिका क्रश कुछ संबंधित जटिलताओं है। एक समस्या यह है कि हो सकता है का सामना करना पड़ा मूल NMJ लक्ष्यों reinnervate के लिए तंत्रिका की विफलता है। इस एसीसी की वजह से हो सकता हैidental सर्जरी के दौरान तंत्रिका को चोट काटा। किसी भी तेज किनारों के लिए ठीक इत्तला दे दी कुचल संदंश की जाँच करने के लिए सुनिश्चित करें। सर्जरी के दौरान किसी भी बिंदु पर एक तंत्रिका कुचलने की गुणवत्ता संदिग्ध है, तो मूल चीरा बेहतर तंत्रिका कल्पना करने के लिए चौड़ा किया जा सकता। इस घाव का आकार बढ़ता है और अतिरिक्त ढांचे को नुकसान पहुंचा सकता है, यह सही ढंग से अनुजंघास्थिक तंत्रिका की पहचान करने और आकलन किया जाए या नहीं एक पूर्ण कुचलने हासिल की थी के साथ मदद कर सकते हैं।
तकनीक यहाँ वर्णित कुछ सीमाओं के अधिकारी करता है। सबसे पहले, यह मुख्य रूप से वयस्क चूहों में उपयोगी है, क्योंकि इन जानवरों में संरचनाओं काफी बड़े हेरफेर करने के लिए कर रहे हैं। नवजात और किशोर चूहों बहुत छोटे होते हैं, काफी सर्जरी की कठिनाई बढ़ रही है। दूसरा, अनुजंघास्थिक तंत्रिका लक्ष्य ऊतकों NMJ उत्थान की दरों को प्रभावित कर सकता है कि वितंत्रीभवन में जिसके परिणामस्वरूप, संवेदी और मोटर axons में शामिल है।
NMJ पेशीशोषी Lat में विकृति का केन्द्र स्थल के रूप में मान्यता प्राप्त हैआम काठिन्य (ए एल एस) और उम्र बढ़ने। यह भी परिधीय नसों को चोट मोटर कौशल समझौता किए और मांसपेशियों को खोने से बचने के लिए निम्नलिखित मरम्मत की जानी है। अनुजंघास्थिक तंत्रिका क्रश विधि पहचान और NMJ की मरम्मत में महत्वपूर्ण भूमिकाओं के साथ अणुओं के परीक्षण में सहायता करनी चाहिए। एक दृष्टिकोण में, इस विधि आरएनए अनुक्रम विश्लेषण का उपयोग NMJ उत्थान के विभिन्न चरणों में महत्वपूर्ण भूमिका के साथ mRNA और microRNA प्रोफ़ाइल करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। यह भी चुनिंदा शुरू की है और मांसपेशियों से हटा उम्मीदवार जीन के समारोह का निर्धारण करने के लिए लागू किया जा सकता है। इसके अलावा, इस विधि से ही स्थिर और लाइव इमेजिंग का उपयोग तंत्रिका और NMJ उत्थान लाने के लिए बहिर्जात अणुओं की क्षमता का परीक्षण करने के लिए अच्छी तरह से उधार देता है।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine | VetOne | 501072 | |
| Xylazine | Lloyd Inc. | 003437 | |
| Buprenorphine | Zoopharm | 1Z-73000-150910 | |
| Nair | Nair | ||
| Kim-wipes | Kimtech | 34155 | |
| Electric Razor | Braintree Scientific | CLP-64800 | |
| 80% EtOH/H20 | |||
| 10% Proviodine | |||
| 1 ml Insulin Syringe | |||
| Spring Scissors | Vannas | 91500-09 | |
| No. 15 scalpel | Braintree Scientific | SSS 15 | |
| #5 Forceps | Dumont | 11252-00 | |
| 6-0 silk suture on reverse cutting needle | Suture Express | 752B | |
| Rodent Heating Pad | Braintree Scientific | AP-R-18.5 | |
| Alexa 555 conjugated alpha-BTX | Molecular Probes | B35451 | |
| Vectashield | Vector Labs | H-1000 | |
| Olympus Stereo Zoom Microscope | Olympus | 562037192 | |
| Zeiss 700 Confocal Microscope | Zeiss | ||
| Variable-flow peristaltic perfusion pump | Fisher Scientific | 13-876-3 | |
| Aurum Total RNA Mini Kit | Bio-Rad | 7326820 | |
| Bio-Rad iScript RT Supermix | Bio-Rad | 1708840 | |
| SsoFast Evagreen Supermix | Bio-Rad | 1725200 | |
| Bio-Rad CFX96 | Bio-Rad | 1855196 | |
| Puralube Vet ointment | Puralube | 1621 | |
| Synaptotagmin-2 antibody | Antibodies-Online | ABIN401605 | |
| Neurofilament antibody | Antibodies-Online | ABIN2475842 |
References
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