Abstract
צומת עצב-שריר (NMJ) עובר שינויים מבניים ותפקודיים מזיקות כתוצאה הזדקנות, פציעה ומחלה. לכן, זה הכרחי כדי להבין את השינויים התאיים ומולקולריים מעורבים בשמירה ותיקון NMJs. לשם כך, פיתחנו שיטה אמין ועקבי לבחון התחדשות NMJs בעכברים. שיטת עצב פגיעה זו כרוכה ריסוק העצב שׁוֹקִיתִי נפוץ כפי שהיא עוברת מעל הראש הלטרלי של גיד שריר הסובך ליד הברך. שימוש עכברות בן 70 יום, אנו מראים כי אקסונים מוטוריים מתחילים reinnervate מטרות postsynaptic קודמים תוך 7 ימים לאחר למעוך. הם לגמרי לכבוש מחדש שטחים הסינפטי הקודם שלהם ב -12 ימים. כדי לקבוע את האמינות של שיטת פגיעה זו, השווינו שיעורי reinnervation בין עכברות ישנות פרט 70 יום. מצאנו כי מספר אתרי postsynaptic reinnervated היה דומה בין עכברים בבית 7, 9, ו -12 ימים למחוץ-פוסט. כדי לקבוע אםassay פגיעה זו יכולה לשמש גם כדי להשוות השינויים המולקולריים בשרירים, בדקנו רמות של למקטע-גמא של קולטן ניקוטינית שריר (גמא-AChR) ואת קינאז ספציפי-שריר (מושק). למקטע גמא AChR ומושק לדוחות אלו שהוגברו מאוד denervation הבאה ולחזור לרמות נורמליות לאחר reinnervation של NMJs. מצאנו קשר הדוק בין רמות תמליל עבור גנים אלה ומצב עצבוב השרירים. אנו מאמינים כי שיטה זו תאיץ את הבנתנו את השינויים התאיים ומולקולריים מעורבים בתיקון NMJ וסינפסות אחרות.
Protocol
כל הניסויים בוצעו על פי הנחיות NIH ופרוטוקולי חיה אושרו על ידי ועדת הטיפול בבעלי החיים המוסדית וירג'יניה טק ושימוש.
1. בעלי חיים הכנות לקראת ניתוח
- להרדים עכברים בתערובת של קטמין (90 מ"ג / ק"ג) ו xylazine (10 מ"ג / ק"ג) באמצעות זריקה תת עורית מפשעתי עם מזרק אינסולין סטרילי 1 מ"ל. הפתרון המוביל מכיל תערובת של מי מלח 0.9%, 17.4 מ"ג / מ"ל קטמין, ו xylazine 2.6 מ"ג / מ"ל. מניחי חיות בחזרה אל תוך כלובים בזמן המתנת תרופות ייכנסו לתוקף.
הערה: אם מינון העמסה אינו מספק הרדמה מספיק למשך ההליך, תוספת 25% של מינון העמסה ניתן להזריק. - חיות צג לפרסם הזרקה כדי לבדוק מחירי נשימה יציבים ודיכאון מתאים של רמות עוררות. בדוק את הרמה עוררת עם קמצוץ רגל אחורי, שאמורה לעורר שום תגובה כאשר הרדימו מספיק.
הערה: זה בדרך כלל לוקח 3-5דקות עבור עכבר בוגרים צעירים עם ממוצע של 25 עד 30 גרם. אם החיה עדיין תגובה לאחר 10 דקות לאחר ההזרקה, 25% נוספים של מינון העמסה הרדמה ניתן להזריק. - החל וזלין ו משחת עיניים שמן מינרלי אור העיניים של החיה כדי למנוע יובש. הסר חיות מהכלוב ומניחים על משטח נקי וישר. לגלח את הגפיים האחוריים הרצויים מרגל אגן באמצעות גוזם שיער חשמלי, החשיפה בצד הלטרלי רק של האיבר.
- למרוח מסיר שיער כימי לאתר המגולח דקות 1. הסרה ידנית של השיער באמצעות מגבוני מעבדה. לנקות את האזור עם מעבדה מקולף לנגב טבול אתנול.
2. הליך כירורגי
- לעקר מכשירי ניתוח באמצעות חיטוי או שיטה מתאימה אחרת. נקו את האתר כירורגית ולוח כירורגית עם 80% אתנול / H 2 0. לחטא את האתר כירורגית עם proviodine. יש לשים את הסמן על הלוח כירורגית וליישר עם ריסון איבר. לִשְׁמוֹרהגפה האחורית היעד במצב טבעי אנטומית עם מפרק הברך קצת מורחבת ללא סיבוב פנימי או חיצוני.
- מניחים חיה ולוח תחת מיקרוסקופ כירורגי. אוריינט לאתר החתך הסדיר דרך מישוש של ציוני דרך שטחיים, מפרק הברך הגרמי במיוחד ואת הרכס בין קדמי tibialis ואת השרירים הגסטרוקנמיוס.
- עושים חתך כ 3 ס"מ דרך העור באמצעות מספריים או אזמל באביב תוך שימוש מלקחיים כללי עבור מרתק. הפוך את החתך בניצב כמובן שבבסיס של העצב שׁוֹקִיתִי המשותף.
- המשך החתך דרך fascia השטחית, חשיפת femoris שרירי vastus lateralis שרירים. הפרד את השרירים האלה על ידי חיתוך דרך fascia החיבור העמוק. חתך 1-2 ס"מ צריך להספיק.
- לחזור בו שריר הירך הדו-ראשי caudally באמצעות כתיבה מכאנית, חושף את העצבים שׁוֹקִיתִי המשותפים.
- עקבות העצב proximally עד היתר שלהקטע עם גיד של הראש הלטרלי של שריר הסובך נמצא. הערה: זמן חשיפה עשויה לדרוש מניפולציה נוספת של העור והשרירים חזר בו. בצומת זה משמשת ציון הדרך היציבה עבור הפגיעה העצבית.
- אחוז העצב עם מלקחיים בסדר, יישור הטיפים באופן מקביל לגבול הלטרלי של הגיד הגסטרוקנמיוס. למחוץ עצב שׁוֹקִיתִי המשותף על ידי הפעלת לחץ יציב, קשה במשך 5 שניות.
- לאשש למעוך מלא של העצב על ידי בדיקה ויזואלית דרך הטלסקופ כירורגית. היא תופיע שקופה באתר של פציעה. אם באמצעות עכברים לבטא חלבוני קרינת אקסונים פריפריה, את הקרינה תיעלם מן האתר של פציעה.
- הסר כתיבה ויישר מחדש השרירים בעמדות האנטומי שלהם. לסגור את האתר חתך עם 6-0 תפרים משי. 1-3 תפרים קטע פשוט מספיק. מניחי מחל עכבר על כרית חימום בכלוב נקי.
- ניטור כל החיות עבור 2 שעות שלאחר-אופרהtion לבדוק לנשימה וכל תופעות לוואי ההרדמה. נהל מנה ראשונית של עצירות 0.05-0.10 מ"ג / ק"ג באמצעות זריקה תת עורית מפשעתי מיד לאחר ההתאוששות מהניתוח. תן 3 מנות נוספות כל 12 שעות במשך 48 השעות הקרובות. לאחר החלמה מלאה, לחזור עכברים למתקן הטיפול בבעלי החיים.
3. בידוד מכתים של פושטי digitorum Longus (אדי) שרירים
- להקריב חיות באמצעות isoflurane. לוותר 0.5 מ"ל isoflurane נוזל לתוך שפופרת 50 מ"ל ארוז עם labwipes סופג. מניח את הצינור הסגור והפתוח עם החיה בתא 3 אטום 2,500 סנטימטר. לפחות 4 דקות של חשיפה מספיקה. מבחן עבור אובדן palpebral הבילטרליים, הבוהן קמצוץ, ורפלקסים זנב-קורט כדי להבטיח שכל סוס הוא מחוסר הכרה לפני שתמשיך עם זלוף.
- Transcardially perfuse 16 בעלי החיים הראשונים עם 10 מ"ל 0.1M PBS, אז 25 מ"ל של paraformaldehyde 4% ב 0.1M PBS (pH 7.4). הפרין (30 יחידות / 20g משקל חיה) ניתן להוסיף עם PBS (10 יחידות / מיליליטר) כדי למנוע קרישת דם במיטות נימים קטנות, שיפור תוצאות זלוף.
- הסר את עור מכסה גפיים אחוריים באמצעות מספריים לחתוך transversally דרך העור סביב ההיקף של הבטן. מקלפים את העור בעבר הגפיים והרגליים האחוריות באמצעות מלקחיים.
- הסר fascia השטחית של גפיים אחוריים ידי אחיזה ומתקלף עם מלקחיים. אם באמצעות עכברים לבטא חלבוני קרינת אקסונים פריפריה, שלאחר לתקן עכברים כל לילה PFA 4% 50 מ"ל צינורות. לשטוף שלוש פעמים עם PBS.
הערה: עכברים קבועים ניתן לאחסן PBS ב 4 מעלות צלזיוס. אם לא, דלג על שלב זה והמשך לשלב 3.6 בלי חיות שלאחר התיקון. - לנתח את שרירים אדי 18 מ גפיים אחוריים עכבר, ויש להקפיד לשמור הפרוקסימלי וגידים דיסטלי המלאה ככל האפשר.
- דגירה שרירי אדי בחסימת המאגר (PBS 1x המכיל 0.5% Triton X-100, 3% BSA ו -5% נסיוב עז) לפחות 1 שעה.
- כתם הנגדי ללא פגע אד כביקורת חיובית עבור עצבוב NMJ מלא. בקרות שליליות צריכות לכלול אד שהושג ב 4 ימים שלאחר פציעה, נקודת זמן שבו NMJ הוא denervated לחלוטין, כמו גם אד מוכתם נוגדנים משני בלבד.
- דגירה שרירית עם נוגדנים משני מתאימים מתויגים fluorescently כדי לזהות neurofilament ו synaptotagmin-2 עבור 1 יום. לשטוף שרירים שלוש פעמים עם 1X PBS ו 10 דקות בכל פעם. הערה: שלב זה יכול להתבצע ביחד עם צעד 3.10. דלג על שלב זה אם באמצעות עכברים לבטא חלבוני קרינת אקסונים פריפריה.
- כדי להמחיש את postsyבאזור naptic של NMJ, דגירה שרירי עם 5 מיקרוגרם / מ"ל Alexa-555-bungarotoxin אלפא מצומדות מדולל חסימת חיץ לפחות 2 שעות. לשטוף שרירים שלוש פעמים עם 1X PBS ו 10 דקות בכל פעם.
- כדי הר השרירים כולה בשקופיות זכוכית בעלי מטען חשמלי חיובי, למקם את השריר ישירות בשקופית, להוסיף כמה טיפות של גליצרול מבוסס הרכבה בינונית בשקופית ומכסים coverslip. לחץ על coverslip נגד השקופיות כדי לשטח את השריר. משרים את התקשורת הרכבה מההיקף של מגבונים במעבדה באמצעות שקופיות coverslip. החל לק כדי לאטום את הקצוות בין coverslip והחלק.
4. הדמיה וניתוח נתונים
- כדי לנתח את המבנה של NMJs, תמונה השריר אדי באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר confocal מצויד להלהיב 488, 555 ו 633 ננומטר אור וללכוד את האור הנפלט עם 20X ו 40X מטרות.
- כדי להמחיש כולו NMJs, ליצור תמונות הקרנת העוצמה המקסימלית של שניות אופטימשא במרווחי 1 עד 2 מיקרומטר בנפרד משתרעת הנמוכה ביותר לאזורים גלויים הגבוה ביותר של NMJ. צור תחזיות בעצמה מקסימלית באמצעות תוכנת הדמיה זמינה מסחרי.
- כדי לקבוע שיעורי reinnervation, לסווג NMJs כמו: 1) לחלוטין denervated = האתר postsynaptic הוא לגמרי נטול קשר עם האקסון, פחות מ -5% colocalization בין האקסון AChRs. 2) חלקית מעוצבבים = האקסון חלקית חופף postsynapse, 5-95% colocalization בין האקסון AChRs. 3) עצבוב מלא = כמעט פרד המושלם בין-סינפסה פוסט טרום, יותר מ 95% colocalization בין האקסון AChRs. אל תכלול NMJs העומד בניצב למישור ההדמיה או אינם מדמיינים מלא בתמונה. הערה: כל הניסויים האלה, לפחות 3 חיות ו -50 NMJs לכל חיה נבדקו. תוצאות נחשבו משמעותיות באמצעות סטודנט מבחן t עם ערך P של פחות מ 0.05.
- כדי לעוור המפעיל, אנשים נפרדים יכולים לבצעניתוח הניתוח ותמונה. ללא ידע של קבוצות הטיפול, הנתח יכול להיות אובייקטיבי עם ניקוד NMJ. לחלופין, תמונות יכולות להיות אקראיות והציגו למפעיל לניתוח ללא ידיעת בעלי חי המקור.
5. PCR כמותי
- להקריב חיות באמצעות isoflurane נקע בצוואר הרחם. סר עור fascia השטחית מכסה שרירי רגליים על פי צעד 3.3. לנתח הקדמי tibialis ואת השרירים אדי פי לשלב 3.4.
- פלאש להקפיא את קדמי tibialis כולו ושרירי אדי צינור 1.5 מיליליטר על חנקן נוזלי. הסרה של רקמה מהצינור ומקום במכתש מראש צונן שקוע חלקית בחנקן נוזלי. טוחני שריר קפוא לאבקה דקה בעזרת מכתש ועלי.
- ממסי אבקת שריר קפוא לתוך מגיב מיצוי RNA זמין מסחרי ולבצע מיצוי RNA וסרת הדנ"א הגנומי עם ערכה זמינה מסחרי על פי i של היצרןnstructions.
- בצע שעתוק לאחור עם שילוב transcriptase הפוך זמין מסחרי על פי הוראות היצרן.
- בצע qPCR באמצעות ערכה זמינה מסחרי באמצעות גני משק מתאימים (ראה טבלה של חומרים). השתמש Cycler תרמית PCR כמוני זמינה מסחרי לבצע PCR (ראה טבלה של חומרים).
- חישול בטמפרטורת גדר ל -58 מעלות צלזיוס. להתאים את הפרמטרים אופניים נוספים למפרט של יצרן של תערובת ירוקה פולימראז תקי / SYBR. כלול צעד עקום להמס סופי בתכנית Cycler תרמית מורכבת 0.5 ° C מגביר מצטבר מ -65 ° C עד 95 ° C כדי לבדוק סגולי פריימר פריימר היווצרות dimer.
- קביעת רמות ביטוי mRNA ביחס ידי 2 - שיטת ΔΔCT 21 באמצעות 18S RNA כמו גן השליטה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
העצב שׁוֹקִיתִי משותף, גם הנקרא העצב peroneal משותף, נובעת גיד הנשה מעל fossa popliteal, שם הוא נדנדות סביב ראשו של שוקית אל ההיבט הקדמי של הרגל (איור 1 א). יש לה סניפים לתוך עצבים שטחיים ועמוקים שׁוֹקִיתִי, יחד לספק את dorsiflexors של כף הרגל ועל בהונות (הקדמי tibialis, longus digitorum פושטי ו brevis, ו פושטי halluces השרירים longus), ואת everters של כף הרגל (שרירי peroneus). גם עצב זה נושא סיבים חושיים מקרינים אל dorsum של כף הרגל בצד הלטרלי של החצי התחתון של הרגל. זהו מבנה דק יחסית מורכב מנוע אקסונים חושי. הסניף עצב זאת בעקבות קורס אנטומיים לחיזוי. לרוחב עד הברך, העצב הוא שטחי בעיקר כפי שהוא פועל על הגיד של הראש הלטרלי של שריר הסובך (איור 1 ואיור 2). thהמיקום הוא משמש כציון דרך יציבה כי ניתן להגיע בקלות עם חתך קטן, הגבלת נזק לעור ו fascia (איור 1 א). הקוטר הקטן יותר של עצב זה, כשמשווה את הנשה ועצבי שוקה, מאפשר למחוץ כל האקסונים באמצעות כוח פחות, הקטנת הסיכוי לחלוטין ניתוק אקסונים שטחי יותר.
עכברים לבטא חלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP) רק בנוירונים 17 שימשו כדי לייעל את הליך דלוקה עצב שׁוֹקִיתִי משותף וחד משמעי לדמיין אקסונים התחדשות. העצב נמחץ בקצה גיד הגסטרוקנמיוס הפרוקסימלי ביותר לשרירי היעד כי האתר הזה הוא נגיש יותר מהמיקום של החתך. אתר זה משמש גם ציון דרך אנטומי אמין, כך שניתן להשוות התחדשות של NMJs בקרב בעלי חיים מאותו המין והגיל. דחיסת העצב במשך 5 שניות באמצעות מיל מלקחיים בסדראולטס היעלמותו של YFP מהאתר של פציעה (איור 2 ב). עם זאת, הרקמות ותאי חיבור המתגוררים epineurium להישאר רציפים, המשרתים כצינור לחידוש והמדויק של אקסונים ליעדים המקוריים שלהם (איור 2 ב). ב 70 הימים ההם עכברות, פציעה די בכך כדי לגרום לניוון של כל מגזרי אקסונלית דיסטלי מן סומה העצבית (איור 4B).
כדי לקבוע את אמינות שחזור של שיטת פגיעה זו, reinnervation של longus digitorum פושטי (אדי) שריר נבדק. שריר זה נבחר מכמה סיבות: 1) זה הפרוקסימלי עדיין מופרד פיזי מאתרי פגיעת החתך עצבים (איור 3 א). לפיכך, השריר משתנה רק על ידי ניוון של אקסונים innervating ניתק. קרבתה לאתר למעוך ממזערת את הזמן הדרוש על מנת שניתן יהיה reinnervated והשרירים atrophy. 2) הוא מורכב בעיקר של סיבי שריר שלד סוג מהיר, אשר רגישים יותר הזדקנות ומחלות. 3) NMJs שלה עובר שינויים מבניים משמעותיים במהלך ההתקדמות של מחלות והזדקנות שניתן נחלשה באמצעות תרגול גופני או הגבלת קלוריה. 4) זה הוא נגיש הדמיה לחיות ומניפולציה מולקולרית (איור 3D). 5) ניתן להפריד בקלות למרכיבים המטטרסו ארבעה שלה כי יכול להיות שלם רכוב כך שניתן באופן מלא תמונה כל אקסונים innervating שלה והקשרים שלהם באמצעות מיקרוסקופ אור (איור 3).
Reinnervation אתרי פוסט סינפטי ננטשו לפניה לאחר ריסוק העצב שׁוֹקִיתִי על רגל ימין הוערך בשלוש עכברות בן 70 ימים לבטא YFP אקסונים מוטוריים. אתרי הפוסט סינפטי היו דמיינו באמצעות מתויג fluorescently אלפא-bungarotoxin (BTX), אשר נקשר באופן סלקטיבי עם זיקה גבוהה לשרירים NACHRS. השרירים נחשבו להיות denervated, באופן חלקי או מלא reinnervated הבאים הקריטריונים הבאים: 1) בסיבי השריר denervated, אקסונים המנוע היו חסרים לחלוטין מאתרים הפוסט סינפטי ופחות מ -5% colocalization בין האקסון AChRs נצפתה. 2) סיבי שריר מעוצבבים חלקית סווגו על ידי כמה אבל פרד שלם של אקסונים מוטוריים עם אתרי פוסט סינפטי ו colocalization 5-95% בין האקסון AChRs נצפתה. 3) בסיבי שריר מעוצבבים באופן מלא, לא היה כמעט פרד מושלם בין קצות עצבים מוטוריים ואתרי פוסט סינפטי וגדולים colocalization 95% בין האקסון AChRs נצפתה. NMJs הפרט הורחק מספירות אם endplates שלהם שכב בניצב למישור ההדמיה או NMJ כולו לא היה דמיין. שימוש בקריטריונים הללו, קונקורדנציה גבוהה בתעריף ומידת reinnervation נצפתה בקרב כל העכברים שנבדקו. ב 4 ימים לאחר למעוך, השרירים נמצאו denervated לחלוטין בכל EXA חיותממוקש (איור 4B). ממצא זה מראה כי ריסוק העצב שׁוֹקִיתִי המשותף במשך 5 שניות, כמתואר לעיל, די בכך כדי לנתק את כל האקסונים. ב -7 ימים לאחר למעוך, קצות העצבים היו בתהליך של אתרי לשוב הפוסט סינפטי ננטשו לפניה (איור 4C, 4E-F). עם זאת, רוב סיבי השריר עדיין נמצאו חלקי בלבד מעוצבבים. עם ימים נוספים לאחר למעוך, קצות העצבים המשיך להתמיין אתרי presynaptic ו NMJs נמצאו reinnervated מלאה של 12 ימים (איור 4D, 4E-F). חשוב לציין, לא הייתה השתנות מעט בקרב עכברי denervated עבור אותו פרק הזמן (איור 4E-F), הוכחה כי ריסוק העצב שׁוֹקִיתִי יכול לשמש assay להשוות reinnervation של שרירים בין בעלי חיים מאותו המין והגיל.
היכולת להשוות התחדשות NMJs בנאמנות בין בעלי החיים מספקת הזדמנויותכדי להבין את התכונות הסלולר הקשורים לכל צעד נדרש לתקן סינפסה זו במלואה. כדי לבחון את הארכיטקטורה של NMJs denervated ואת ההתחדשות מן העכברים 70 בימים ההם בשימוש מעל להשוואת מחירים של reinnervation, מיקרוסקופיה confocal ברזולוציה גבוהה תמונות של NMJs התקבלו. כצפוי, ניתוח זה חשף מספר שינויים המתרחשים קצות העצבים האקסון α-מנוע כפי שהם reinnervate סיבי שריר (איור 4G-I). קונוסים צמיחה אקסונלית להופיע להרחיב ולהתחיל להסתעף כפי שהם לפנות באתרי postsynaptic (איור 4G). סניפים אקסונלית אלה אז לצמוח לאורך אזורים ספציפיים של postsynapse, שהגיעו לשיאה הסמיך כמעט המוחלטת של עצב האקסון וכלה באתר postsynaptic (איור 4H-I). תכונות מבניות נוספות התחדשות קצות עצבים מוטוריים מאוד דומים גילו כי אלו במהלך ההתפתחות נצפו, כוללים אקסונים מספר מתחרים על היםהיעד ame (איור 4H), שהגיעה לשיאה האקסון היחיד innervating סיב שריר אחד על ידי 12 ימים לאחר למעוך. בנוסף, סניפים אקסונלית החורגות אתרי הפוסט סינפטי, המוזכרים כאן כמו נבטים, בכל שלבי שלאחר פציעה נצפו (איור 4I). נבטי אלה היו תופעה שכיחה מאוד, אפילו NMJs מעוצבבים מלא דבר המצביע על כך את השלב הסופי של תיקון אקסונלית כרוך הכחשה של סניפים אקסונלית extrajunctional. למרות שינויים ברורים אלה קצות עצבים, פוסט סינפטי אתרים נשארים נבדלים בעיקר בכל השלבים שלאחר הפציעה בהשוואה לאלו בשרירים וללא כל פגע, כוללים ב 4 ימים לאחר למחוץ כאשר סיבי שריר נמצאים denervated לחלוטין. לא היה שום סימן של תהליך הפיצול או הפסד מהותי חלוקה מחדש לאזורים נוספים סינפטי של AChRs. ממצאים אלה בתוקף עולה כי שיטת למחוץ עצב שׁוֹקִיתִי יכול לשמש assay לזהות ולבדוק מולקולרית, תרופתי והתערבויות בסגנון החיים tכובע לקדם תיקון של קצות עצבים ב סינפסות, כולל NMJ.
למרות ההתקדמות שחלה באחרונה, התקדמות מועטה נעשתה בזיהוי גורמי הנגזרות השריר הנדרש מספיק כדי לתחזק ולתקן את NMJ. ולכן ביקשנו אם השיטה פגיעה עצבית שׁוֹקִיתִי משותף שניתן להשתמש בהם כדי לזהות מולקולות שינו בשלבים מסוימים של התהליך reinnervation ועם תפקידים פוטנציאליים בתיקון NMJ. כהוכחה עיקרית, ניתוח ביטוי של שני גנים הקשורים NMJ, למקטע גמא AChR ואת קינאז ספציפי שרירים, מושק 18 בוצע. כפי שראינו עם PCR כמותי, הגנים האלה גדל הבאים denervation וירידה כמו NMJs הם reinnervated (איור 5 א-ב). גנים אלה שהוגברו ב 4 ימים לאחר למעוך, כפי שדווח בעבר באמצעות 19 שרירי denervated לחלוטין. כמו סיבי שריר העצבים reinnervate, רמות של גנים אלו מורידות ו rapidly לחזור לנקודת ההתחלה. בין חיות שנבדקו, דפוס הביטוי לשני הגנים זהה כמעט, הוכחת קשר הדוק בין שינויים המולקולריים תאיים ב NMJs התחדשות. שיטה זו ולכן מספקת הזדמנויות ייחודיות לזהות שינויים מולקולריים הקשורים בשלבים שונים של התחדשות NMJ.
איור 1:. Common שׁוֹקִיתִי עצב אנטומיה (א) סכמטי המפרט את מסלול העצב הסכיאטי וענפים מסוף שלה ביחס ציוני דרך שטחית וגרמי. SCN = גיד הנשה, TN = עצב הטיביאלי, עצב SrN = Sural, CPN = עצב הנפוץ שׁוֹקִיתִי, SPN = עצב השטחי שׁוֹקִיתִי, DPN = עצב העמוק שׁוֹקִיתִי. אתר החתך הרצוי מותווה. (ב) תרשים של מיקום העצב המשותף שׁוֹקִיתִי ביחס השרירים המקיפים עם העור הוסר.אתר חתך יחסית מוצג שמעל fascia ההשקעה. TA = השוקה הקדמי שריר אדי = פושטי digitorum Longus שרירים. (C) חשופים הנשה ועצב שׁוֹקִיתִי משותף. CPN חוצה את שריר הסובך (GN) גיד ברמה של הברך. קראש אתר ביחס גיד לראות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2:. ניתוח עצב קראש נפוצות שׁוֹקִיתִי (א) החתך הראשוני צריך להיות רק כמה ס"מ אורך. לאחר חודר דרך העור fascia שטחית, החתך חייב להיות המשך דרך fascia השקעה / עמוק שוכב בין femoris שרירי ושרירים ת"א. (A1) העצב שׁוֹקִיתִי הנפוץ היא דמיינה בקלות בלי t מיקרוסקופיהדרך עינית החתך (Gn = הגסטרוקנמיוס שרירים). (A2) ההצלבה של גיד עצב הגסטרוקנמיוס המשותף שׁוֹקִיתִי ניתן מדמיין בקלות אם החתך הוא התרחב (נחוץ רק למטרות צילום). הדוחק צריך להיות ממוקם במיקום המסומן על ידי הקו האדום בניצב העצב ובמקביל גיד Gn. (ב) CPN הוא אפילו יותר מדמיין בקלות עם עכברים מהונדסים YFP תחת היקף ניתוחי ניאון. (B1) עצב מאבד קרינה באתר של התאהבות, המאפשר אישור של פציעה למחוץ מלאה. (B2) דלוקה מלא CPN יכול עדיין להיות דמיין עם תאורת עין וחדר העירום. העצב יהפוך שקוף. תמונה זו מדגישה את העובדה epineurium והמבנה של CPN נשארים שלמים תוך הגבלת ניזק זמנית לכלי רקמות דם סמוכים.אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3:. האנטומיה של פושטי digitorum Longus (אדי) שרירים (א) 3 ממדי התמונה של אדי ביחס עצמות הגפיים האחוריות בעכבר. שנוצר באמצעות JAtlasView (B) גזור חלקית שריר אדי מתחלק אגפיה ארבעה המטטרסו וסימון הספרות בשליטת כל חטיבה. (C) YFP שכותרתו ענף של העצב שׁוֹקִיתִי עמוק כפי שהוא מעצבב הלהקה סוף-צלחת של חטיבת אדי שליטה על הספרה השנייה. (ד) סניפים אקסונלית ואתרי הקשר שלהם יכולים להיות מזוהים בקלות, המאפשרים בחינה עקבית של NMJs שנבחר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר of דמות זו.
איור 4: שיעור דומה של reinnervation בין בעלי החיים של אותו גיל ומין הניתוח של NMJs בשריר EDL לאחר ריסוק עצב שׁוֹקִיתִי.. (א) הודעה סינפטי אתרים תפוסים לחלוטין על ידי אקסונים בעכברים וללא כל פגע. (ב) בשעה 4 ימים לאחר למעוך, השרירים נמצאים denervated לחלוטין. (C) אקסונים מתחילים reinnervate השרירים 7 ימים לאחר למחוץ (D) לגמרי לכבוש מחדש באתרי postsynaptic ב -12 ימים. (E - F) שיעור מחדש התפוסה NMJ הוא כמעט שאין להבחין בין בעלי חיים denervated עבור אותו אורך זמן. (G - אני) נציג תמונות של קצות עצבים אקסונלית המבדילים-מחדש לתוך אתרי presynaptic התבגר. כיבוש אתרי postsynaptic כדלקמןדפוס צפוי, החל חרוט צמיחה ופיתוח ענפי שבסופו של דבר מילאה לגמרי את אתרי postsynaptic ללא החורגות NMJ region.Similar להתפתחות, אתרי postsynaptic בתחילה מעוצבבים על ידי אקסונים מחדש גדל מספר אבל רק אחד האקסון נשאר ברגע NMJ כבר התאחה לחלוטין. (H) דוגמאות של הנבטה אקסונלית צוהלת, עצבוב חלקי ללא חפיפה מלאה בין מראש ומנגנוני postsynaptic, ו עצבוב על ידי אקסונים מספר מצוינים. 70 עכברות יום בן נבדקו; בר סולם = 50 מיקרומטר (AD), 20 מיקרומטר (GI). שגיאה בר = SEM. N = 3 עכברים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5: העצב שׁוֹקִיתִי קראש שיטה כמוn Assay לזהות גנים מועמדים מעורב בתיקון NMJ (A - B). רמת ה- mRNA של שני גנים הקשורים NMJ, למקטע גמא AChR ומושק, הם שינו באופן דומה בשריר ת"א של עכברים denervated עבור אותו אורך של זמן . עם פגיעה עצבית פוסט זמן להגדיל, רמות של שני התמלילים להקטין, שחזרו בסיס, אשרו ניתוח היסטולוגית מראה reinnervation המתקדמת של NMJs. כל שורה מייצגת עכבר פרט. שגיאה ברה = סטיית התקן של הממוצע של משכפל טכני. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השיטה המוצגת בכתב היד הזה מספקת הזדמנויות ייחודיות לזהות מנגנונים המעורבים בתיקון צמתים תוקפות (NMJ). שיטה זו כרוכה ריסוק העצב שׁוֹקִיתִי נפוץ כפי שהיא עוברת מעל גיד הגסטרוקנמיוס ליד הברך. אנו מראים כי רק אחרי 5 שניות של לחץ בעצבים עם מלקחיים, ניוון מוחלט יצוין ב -4 ימים לאחר פציעה. בעכברים בוגרים צעירים, אלפא-מנוע אקסונים מתחילים reinnervate אתרי הסינפטי קודמים השריר פושט אצבעות הארוכות (EDL) ב -7 ימים שלאחר פציעה, ששיאה היה הרפורמציה של אתרי presynaptic שאינם נבדלים מאלו עכברים וללא כל פגע ב -12 ימים. בנוסף, אנו מראים כי רמות של מולקולות הקשורות NMJ בחר לתאם בשיתוף פעולה הדוק עם מעמד העצבוב של NMJ. חשוב לציין, שינויים תאיים ומולקולריים אלה הם מאוד לשחזור בין בעלי חיים מאותו המין והגיל (איור 5 א-ב), מתן הזדמנויות לזהות tesגורמי t הפועלים לתקן את NMJ. במונחים של הליכים כירורגיים, סניף העצב המשותף שׁוֹקִיתִי נגיש מאוד כפי שהוא עובר על הגיד הגסטרוקנמיוס, מחייב חתך קטן בלבד שתוצאתו ניזק מועט שרירים בכלי דם שמסביב.
ישנם מספר היתרונות של שימוש העצב שׁוֹקִיתִי הנהוג לבחון שינויים תאיים ומולקולריים הקשורים NMJs התחדשות. גיד הגסטרוקנמיוס משמש ציון דרך אנטומי יציב לפגוע העצב שׁוֹקִיתִי המשותף עקבי באותו מיקום ומרחק משרירי היעד. זה מאפשר להשוות את שיעור ההתחדשות של אקסונים reinnervation של שרירים באופן מהימן בין בעלי חיים מאותו המין והגיל. השלבים הקריטיים להצלחה מעין אלה כוללים הבטחת שהאתר הפגיע עקבי בין ניתוחים, למעוך עצב מלא מתקבל בכל בעל חיים, ופגיעה מינימאלית מתמשכת למבנים סמוכים. בין השרירים מעוצבבים על ידי גommon עצב שׁוֹקִיתִי, הקדמי tibialis (ת"א) ו longus digitorum פושטי (EDL) השרירים הם מטרות מצוינות להערכת תיקון NMJ. שני שרירים אלה מורכבים בעיקר של סיבי שריר מסוג מהר כי הם מושפעים באופן חמור פציעה, הזדקנות ומחלות 5. לניתוח NMJ, שריר אדי הוא אטרקטיבי במיוחד, שכן הוא יכול להיות שלם רכוב לתדמית כל NMJs ללא עיוותים. זה גם עושה את זה אפשרי לתאם שינויים ב NMJs בשינויים במקומות אחרים סיבי שריר, אקסונים מוטוריים סביב התאים.
שרירי TA ו אדי נעשו שימוש נרחב על מנת להעריך את ההשפעה של התערבויות מולקולריות אורח חיים שונים על שריר ותיקון NMJ בגלל המיקום האנטומי שלהם 20. עם זאת, denervation לטווח ארוך משנה הביטוי של גנים עם פונקציה קריטית מנוונת סיבי שריר, תאי מערכת החיסון הפעיל ותאי לווין 12-14, מה שהופך אותו קשה יותר להעריך ch תאית ומולקולריתanges שעשוי לסייע בקידום התחדשות של NMJs במיוחד. בשיטה המתוארת כאן העצב שׁוֹקִיתִי נרמס בסמיכות השרירים TA ו אדי, המאפשר החוצפה להגיע אליהם בתוך 7 ימים לאחר למעוך בעכברים בוגרים צעירים. לכן, שיטה זו צריכה להקטין את איבוד מסת שריר שינויים מולקולריים הקשורים מנוון סיבי שריר בשרירי ת"א ואת האד.
הפרוטוקול למחוץ העצב שׁוֹקִיתִי ניתן לשנות באופנת ברורים מרובה. פגיעה עצבית לחתוך ניתן להחליף בקלות עבור למעוך, המאפשרת הדמיה בזמן אמת in vivo טובה יותר של התחדשות עצבים היקפית. חתך מסיר חומר האקסון מת כמכשול לצמיחה מחודשת ומבטיח נזק הומוגנית של כל האקסון בתוך הצינור endoneurial.
כאשר ביצעו כראוי הדוחק עצב שׁוֹקִיתִי יש כמה סיבוכים הקשורים. בעיה אחת שעלולה להיות נתקל היא כישלון של החוצפה reinnervate מטרות NMJ מקוריות. זה יכול להיגרם על ידי ACCidental לחתוך פגיעה העצב במהלך הניתוח. הקפד לבדוק את הקנס שקצו מלקחי ריסוק לכל קצוות חדים. אם בשלב כלשהו במהלך ניתוח איכות דלוקה עצב מוטל בספק, ניתן להרחיב את החתך המקורי כדי להמחיש את העצב טוב יותר. אמנם זה מגדיל את גודל הפצע יכול לגרום נזק לרקמות נוספות, זה יכול לעזור בזיהוי עצב שׁוֹקִיתִי נכונה הבחינה האם או לא דלוקה מלאה הושגה.
הטכניקה המתוארת כאן עושה להחזיק מספר מגבלות. ראשית, כדאי בעיקר בעכברים בוגרים כמו מבני החיות האלה הם גדולים מספיק כדי לתמרן. יילוד ועכברים המתבגר הם הרבה יותר קטנים, הגדלת הקושי של הניתוח באופן משמעותי. שנית, העצב שׁוֹקִיתִי מכיל אקסונים החושי והמוטורי, וכתוצאה מכך denervation של רקמות היעד שעשויים להשפיע שיעורי התחדשות NMJ.
NMJ מוכרת כאתר מוקד של פתולוגיה amyotrophic latטרשת eral (ALS) והזדקנות. כמו כן, יש צורך לתקן בעקבות פציעה בעצבים היקפיים להימנע מלסכן את מוטוריקה ואיבוד מסת שריר. השיטה למחוץ העצב שׁוֹקִיתִי צריכה לסייע בזיהוי ובדיקה של מולקולות עם תפקידים חשובים תיקון NMJ. בגישה אחת, שיטה זו יכולה לשמש לפרופיל mRNA ו microRNA עם תפקידי מפתח בשלבים שונים של התחדשות NMJ באמצעות ניתוח רצף RNA. זה יכול להיות מיושם גם כדי לקבוע את הפונקציה של גני מועמדי סלקטיבי הציגו ויימחקו שרירים. בנוסף, שיטה זו מלווה את עצמה היטב בדיקת היכולת של מולקולות אקסוגניים כדי להאיץ התחדשות עצב NMJ באמצעות הדמיה סטטי חי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine | VetOne | 501072 | |
| Xylazine | Lloyd Inc. | 003437 | |
| Buprenorphine | Zoopharm | 1Z-73000-150910 | |
| Nair | Nair | ||
| Kim-wipes | Kimtech | 34155 | |
| Electric Razor | Braintree Scientific | CLP-64800 | |
| 80% EtOH/H20 | |||
| 10% Proviodine | |||
| 1 ml Insulin Syringe | |||
| Spring Scissors | Vannas | 91500-09 | |
| No. 15 scalpel | Braintree Scientific | SSS 15 | |
| #5 Forceps | Dumont | 11252-00 | |
| 6-0 silk suture on reverse cutting needle | Suture Express | 752B | |
| Rodent Heating Pad | Braintree Scientific | AP-R-18.5 | |
| Alexa 555 conjugated alpha-BTX | Molecular Probes | B35451 | |
| Vectashield | Vector Labs | H-1000 | |
| Olympus Stereo Zoom Microscope | Olympus | 562037192 | |
| Zeiss 700 Confocal Microscope | Zeiss | ||
| Variable-flow peristaltic perfusion pump | Fisher Scientific | 13-876-3 | |
| Aurum Total RNA Mini Kit | Bio-Rad | 7326820 | |
| Bio-Rad iScript RT Supermix | Bio-Rad | 1708840 | |
| SsoFast Evagreen Supermix | Bio-Rad | 1725200 | |
| Bio-Rad CFX96 | Bio-Rad | 1855196 | |
| Puralube Vet ointment | Puralube | 1621 | |
| Synaptotagmin-2 antibody | Antibodies-Online | ABIN401605 | |
| Neurofilament antibody | Antibodies-Online | ABIN2475842 |
References
- Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Induction, assembly, maturation and maintenance of a postsynaptic apparatus. Nat. Rev. Neurosci. 2 (11), 791-805 (2001).
- Moloney, E. B., de Winter, F., Verhaagen, J. ALS as a distal axonopathy: molecular mechanisms affecting neuromuscular junction stability in the presymptomatic stages of the disease. Front. Neurosci. 8, 252 (2014).
- Apel, P. J., Alton, T., et al. How age impairs the response of the neuromuscular junction to nerve transection and repair: An experimental study in rats. J Orthop Res. 27 (3), 385-393 (2009).
- Balice-Gordon, R. J. Age-related changes in neuromuscular innervation. Muscle Nerve Suppl. 5, S83-S87 (1997).
- Valdez, G., Tapia, J. C., Lichtman, J. W., Fox, M. A., Sanes, J. R. Shared resistance to aging and ALS in neuromuscular junctions of specific muscles. PloS one. 7 (4), e34640 (2012).
- Nguyen, Q. T., Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Pre-existing pathways promote precise projection patterns. Nat. Neurosci. 5 (9), 861-867 (2002).
- Küry, P., Stoll, G., Müller, H. W. Molecular mechanisms of cellular interactions in peripheral nerve regeneration. Curr Opin Neurol. 14 (5), 635-639 (2001).
- Gaudet, A. D., Popovich, P. G., Ramer, M. S. Wallerian degeneration: gaining perspective on inflammatory events after peripheral nerve injury. J Neuroinflammation. 8, 110 (2011).
- Chen, P., Piao, X., Bonaldo, P. Role of macrophages in Wallerian degeneration and axonal regeneration after peripheral nerve injury. Acta Neuropathol. 130 (5), 605-618 (2015).
- Chen, Z. -L., Yu, W. -M., Strickland, S. Peripheral regeneration. Annu Rev Neurosci. 30, 209-233 (2007).
- Darabid, H., Perez-Gonzalez, A. P., Robitaille, R. Neuromuscular synaptogenesis: coordinating partners with multiple functions. Nat. Rev. Neurosci. 15 (11), 703-718 (2014).
- Geuna, S. The sciatic nerve injury model in pre-clinical research. J. Neurosci. Methods. 243, 39-46 (2015).
- Batt, J. A. E., Bain, J. R. Tibial nerve transection - a standardized model for denervation-induced skeletal muscle atrophy in mice. J. Vis. Exp. (81), e50657 (2013).
- Savastano, L. E., Laurito, S. R., Fitt, M. R., Rasmussen, J. A., Gonzalez Polo, V., Patterson, S. I. Sciatic nerve injury: a simple and subtle model for investigating many aspects of nervous system damage and recovery. J. Neurosci. Methods. 227, 166-180 (2014).
- Kang, H., Lichtman, J. W. Motor axon regeneration and muscle reinnervation in young adult and aged animals. J Neurosci. 33 (50), 19480-19491 (2013).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J. Vis. Exp. (65), e3564 (2012).
- Feng, G., Mellor, R. H., et al. Imaging Neuronal Subsets in Transgenic Mice Expressing Multiple Spectral Variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).
- Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Development of the vertebrate neuromuscular junction. Annu Rev Neurosci. 22, 389-442 (1999).
- Bowen, D. C., Park, J. S., et al. Localization and regulation of MuSK at the neuromuscular junction. Dev Biol. 199 (2), 309-319 (1998).
- Gay, S., Jublanc, E., Bonnieu, A., Bacou, F. Myostatin deficiency is associated with an increase in number of total axons and motor axons innervating mouse tibialis anterior muscle. Muscle Nerve. 45 (5), 698-704 (2012).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), San Diego, Calif. 402-408 (2001).
