Fibular Nerve Injury Metod: En tillförlitlig analys för att identifiera och testa faktorer som Reparation neuromuskulära korsningar

Abstract

Den neuromuskulära förbindelsen (NMJ) genomgår skadliga strukturella och funktionella förändringar som en följd av åldrande, skador och sjukdom. Således är det viktigt att förstå de cellulära och molekylära förändringar som är involverade i underhåll och reparationer NMJs. För detta ändamål har vi utvecklat en metod för att tillförlitligt och konsekvent undersöka regenere NMJs i möss. Detta nervskada Metoden innebär att krossa den gemensamma fibular nerv när den passerar över den laterala huvudet av gastrocnemius senan nära knäet. Använda 70 dagar gamla honmöss, visar vi att motor axoner börjar reinnervate tidigare postsynaptiska mål inom 7 dagar efter krossa. De återta helt sina tidigare synaptiska områden med 12 dagar. För att bestämma tillförlitligheten hos denna skada metod jämförde vi reinnervation priser mellan enskilda 70 dagar gamla honmöss. Vi fann att antalet reinnervated postsynaptiska platser var liknande mellan möss vid 7, 9, och 12 dagar post-krossa. För att bestämma omdenna skada Analysen kan också användas för att jämföra molekylära förändringar i muskler, undersökte vi nivåer av gamma-underenheten av muskeln nikotinreceptorn (gamma-AChR) och muskelspecifikt kinas (MuSK). Gamma-AChR subenhet och mysk till är mycket uppreglerade efter denervering och återgå till normala nivåer efter reinnervation av NMJs. Vi hittade en nära relation mellan transkriptnivåer för dessa gener och innervation status av muskler. Vi tror att denna metod kommer att påskynda vår förståelse av de cellulära och molekylära förändringar som är involverade i att reparera NMJ och andra synapser.

Protocol

Alla experiment utfördes under NIH riktlinjer och djurprotokoll som godkänts av Virginia Tech Institutional Animal Care och användning kommittén.

1. Förbereda djur för kirurgi

1. Söva möss med en blandning av ketamin (90 mg / kg) och xylazin (10 mg / kg) via subkutan inguinal injektion med en steril spruta 1 ml insulin. Bärarlösningen innehåller en blandning av 0,9% koksaltlösning, 17,4 mg / ml ketamin och 2,6 mg / ml xylazin. Placera djur tillbaka i burar i väntan på medicinering för att träda i kraft.
   OBS: Om laddningsdos inte ger tillräckliga anestesi under hela förfarandet, kan ytterligare 25% av startdosen injiceras.
2. Övervaka djur efter injektion för att kontrollera stadiga andningsfrekvens och lämplig sänkning av upphetsning nivåer. Kontrollera upphetsning nivå med en hind fot nypa, som ska framkalla något svar när tillräckligt sövd.
   OBS: Detta tar vanligtvis 3-5min för en ung vuxen mus genomsnitt 25 till 30 g. Om djuret är fortfarande mottaglig efter 10 min efter injektion, kan en ytterligare 25% av bedövningsmedlet laddningsdos injiceras.
3. Applicera vaselin och ljus mineralolja oftalmologiska salva till djurets ögon för att förhindra torrhet. Ta bort djur från bur och placera på en ren, plan yta. Raka den önskade bakbenen från fot till bäckenet med hjälp av en elektrisk hår trimmer, utsätta endast den laterala sidan av lemmen.
4. Applicera en kemisk hår remover till den rakade plats för en min. ta bort håret manuellt med laboratorie våtservetter. Rengör avhårade området med laboratorium torka indränkt i etanol.

2. Kirurgisk procedur

1. Sterilisera kirurgiska instrument via autoklav eller annan lämplig metod. Rengöra den kirurgiska platsen och kirurgisk bräda med 80% etanol / H ₂ 0. Desinficera den kirurgiska platsen med proviodine. Placera musen på kirurgisk ombord och i linje med begränsningar lem. Ha kvarmålet bakbenet på ett anatomiskt naturlig position med knäleden något förlängs utan intern eller extern rotation.
2. Placera djur och styrelse under operationsmikroskop. Orient till rätt snittet webbplatsen via palpation av ytliga landmärken, särskilt den beniga knäleden och åsen mellan tibialis anterior och gastrocnemius muskler.
3. Gör en ca 3 cm snitt genom huden med hjälp av en skalpell eller våren sax när du använder allmänna pincett för att gripa. Göra snittet vinkelrätt mot den underliggande loppet av den gemensamma fibular nerven.
4. Fortsätt snitt genom ytliga fascia, utsätta biceps femoris och vastus later muskler. Separera dessa muskler genom att skära genom anslutnings djupa fascia. En 1-2 cm snitt bör vara tillräcklig.
5. Fäll in biceps femoris caudally med mekaniska upprullningsdon avslöjar gemensamma fibular nerven.
6. Spåra nerven proximalt tills dess interavsnittet med senan av den laterala huvudet av gastrocnemius hittas. Notera: Exponering kan kräva ytterligare manipulering av den tillbakadragna hud och muskler. Denna skärningspunkt används som den stabila landmärke för nervskada.
7. Ta tag i nerven med en fin pincett, anpassa tipsen i en parallellt med den laterala kanten av gastrocnemius senan. Krossa den gemensamma fibular nerven genom att applicera jämn, hård tryck under 5 sek.
8. Bekräfta fullt krossa nerven genom visuell inspektion genom den kirurgiska omfattning. Det kommer att visas genomskinliga vid platsen för skadan. Om du använder möss som uttrycker fluorescens proteiner i perifera axoner kommer fluorescens försvinna från platsen för skadan.
9. Ta upprullningsdon och justera muskler i sina anatomiska positioner. Stäng snittet platsen med 6-0 silke suturer. 1-3 enkla avbrutna suturer är tillräcklig. Placera recuperating musen på en värmedyna i en ren bur.
10. Övervaka alla djur under 2 timmar efter operaning för att kontrollera andning och eventuella biverkningar av anestesi. Administrera en initial dos av buprenorfin 0,05-0,10 mg / kg via subkutan inguinal injektion omedelbart efter återhämtning från kirurgi. Ge ytterligare 3 doser varje 12 tim under de närmaste 48 timmar. Efter fullständig återhämtning, åter möss till djurvård anläggningen.

3. Isolering och färgning av Extensor digitorum longus (EDL) Muskler

1. Offra djur med användning av isofluran. Fördela 0,5 ml flytande isofluran i ett 50 ml rör packad med absorberande labwipes. Placera icke-begränsade rör med djuret i en förseglad 2500 cm ³ kammaren. Minst fyra minuter av exponering är tillräcklig. Test för förlust av bilaterala palpebrala, toe-nypa, och svans-kläm reflexer för att säkerställa att varje djur är medvetslös innan du fortsätter med perfusion.
2. Transkardiellt BEGJUTA ¹⁶ djur först med 10 ml 0,1 M PBS, varefter 25 ml av 4% paraformaldehyd i 0,1 M PBS (pH 7,4). Heparin (30 enheter / 20g djurvikt) kan tillsättas med PBS (10 enheter / ml) för att förhindra blodproppar i små kapillär sängar, förbättra perfusion resultat.
3. Avlägsna ytmaterial bakbenen genom att använda sax för att klippa transversellt genom huden runt omkretsen av buken. Skala ned huden förbi bakbenen och fötter med hjälp av pincett.
4. Ta bort ytliga fascia av bakbenen genom att greppa och peeling med pincett. Om du använder möss som uttrycker fluorescerande proteiner i perifera axoner, post-fix hela möss över natten i 4% PFA i 50 ml rör. Skölj tre gånger med PBS.
   OBS: Fast möss kan lagras i PBS vid 4 ° C. Om inte, hoppa över detta steg och gå vidare till steg 3,6 utan efter fastställande djur.
5. Dissekera ut EDL muskler ¹⁸ från mus bakbenen, var noga med att hålla proximala och distala senor så intakt som möjligt.
6. Inkubera EDL muskler i blockeringsbuffert (1 x PBS innehållande 0,5% Triton X-100, 3% BSA och 5% getserum) under minst en timme.
7. Färga den kontralaterala oskadade EDL som en positiv kontroll för fullständig NMJ innervation. Negativa kontroller bör omfatta en EDL erhölls vid 4 dagar efter skada, en tid punkt där NMJ är helt denerverad, samt en EDL färgas med endast sekundär antikropp.
8. Inkubera muskler med lämpliga fluorescensetikette sekundära antikroppar för att detektera neurofilament och synaptotagmin-2 för en dag. Tvätta muskler tre gånger med 1 x PBS och 10 minuter varje gång. Obs: Detta steg kan utföras tillsammans med steg 3,10. Hoppa över det här steget om du använder möss som uttrycker fluorescens proteiner i perifera axoner.
9. Att visualisera postsynaptic regionen av NMJ, inkubera muskler med 5 | j, g / ml Alexa-555 konjugerad alfa-bungarotoxin utspätt i blockerande buffert under minst 2 timmar. Tvätta muskler tre gånger med 1 x PBS och 10 minuter varje gång.
10. För att montera hela muskler på positivt laddade objektglas, placera muskeln direkt på bilden, tillsätt några droppar av glycerol baserat monteringsmedium på objektglaset och täck med ett täckglas. Tryck på täck mot bilden för att platta till muskeln. Blötlägg bort fäst media från omkretsen av glid och täck använder laboratorie våtservetter. Tillämpas nagellack för att täta kanterna mellan täckglas och objektglas.

4. Imaging och dataanalys

1. Att analysera strukturen av NMJs, bild EDL muskeln med hjälp av en konfokala laserskanning mikroskop utrustat för att excitera 488, 555 och 633 nm ljus och fånga det emitterade ljuset med 20X och 40X mål.
2. Att visualisera hela NMJs, skapa maximal intensitet projektion bilder av optiska sekningar placerade 1-2 um förutom sträcker sig från lägsta till högsta synliga regioner i NMJ. Skapa maximal intensitet prognoser med hjälp av kommersiellt tillgängliga bildprogram.
3. För att bestämma andelen reinnervation, kategori NMJs som: 1) helt denerverad = postsynaptiska plats är helt utan kontakt med axonet, mindre än 5% colocalization mellan axonet och AChRs. 2) Delvis innerveras = axonet lappar delvis postsynapsen, 5-95% colocalization mellan axonet och AChRs. 3) Hela innervation = nästan perfekt apposition mellan före och efter synapsen, mer än 95% colocalization mellan axonet och AChRs. Uteslut NMJs som ligger vinkelrätt mot avbildningsplanet eller är inte fullt visualiseras i bilden. Obs: I alla dessa experiment minst 3 djur och 50 NMJs per djur som undersökts. Resultaten ansågs signifikant med användning av en student t-test med ett P-värde av mindre än 0,05.
4. Förblinda operatören, kan enskilda individer utföraoperationen och bildanalys. Utan kunskap om behandlingsgrupperna, kan analysatorn vara objektiv med NMJ poäng. Alternativt kan bilderna randomiserade och presenteras för operatören för analys utan kännedom om käll djur.

5. Kvantitativ PCR

1. Offra djur med användning av isofluran och cervikal dislokation. Ta bort huden och ytliga fascia täcker benmusklerna enligt steg 3,3. Dissekera tibialis anterior och EDL muskler enligt steg 3,4.
2. Flash frysa hela tibialis anterior och EDL muskler i en 1,5 ml rör under flytande kväve. Ta bort vävnad från röret och placera i en pre-kyld mortel delvis nedsänkt i flytande kväve. Mala frusen muskel till ett fint pulver med användning av en mortel och mortelstöt.
3. Lös frusen muskel pulver i ett kommersiellt tillgängligt RNA-extraktion reagens och utföra RNA-extraktion och genom-DNA bort med ett kommersiellt tillgängligt kit enligt tillverkarens instructions.
4. Utför omvänd transkription med ett kommersiellt tillgängligt omvänt transkriptas mix enligt tillverkarens anvisningar.
5. Utför qPCR med hjälp av ett kommersiellt tillgängligt kit med hjälp av lämpliga hushållningsgener (se tabell av material). Använd en kommersiellt tillgänglig kvantitativ PCR termocykler för att utföra PCR (se tabell av material).
6. Inställd glödgningstemperaturen till 58 ° C. Justera ytterligare cykelparametrar till tillverkarens specifikationer Taq-polymeras / SYBR grön blandning. Inkluderar en slutlig smältkurva steget i värmecykelprogram bestående av 0,5 ° C stegvisa ökningar från 65 ° C till 95 ° C för att testa för primer specificitet och primer dimerbildning.
7. Bestämma relativa mRNA expressionsnivåer från 2 ^{- ΔΔCT} metod ²¹ med hjälp av 18S RNA som kontroll genen.

Representative Results

Den gemensamma fibular nerv, även kallad den gemensamma peronealnerven uppstår från ischiasnerven över Poplietallymfknutor fossa, där den svänger runt huvudet av vadben till främre delen av benet (Figur 1A). Där förgrenar sig i de ytliga och djupa fibular nerver, tillsammans levererar dorsiflexors av foten och tårna (främre tibialis, extensor digitorum longus och brevis, och extensor halluces longus muskler) och everters av foten (peroneus muskler). Denna nerv uppbär även sensoriska fibrer som skjuter till fotryggen och laterala aspekten av den nedre halvan av benet. Det är en relativt tunn struktur som består av motoriska och sensoriska axoner. Denna nerv gren följer en förutsägbar anatomisk kurs. Lateral till knäet, är nerven mestadels ytlig som den löper över senan av den laterala huvudet av gastrocnemius muskeln (Figur 1 och Figur 2). thär platsen fungerar som en stabil landmärke som lätt kan nås med ett litet snitt, vilket begränsar skador på hud och fascia (Figur 1A). Den mindre diametern av denna nerv, i jämförelse med den sciatic och skenbens nerver, gör det möjligt att krossa alla axoner använder mindre kraft, vilket minskar sannolikheten för att helt avskilja de mer ytliga axoner.

Möss som uttrycker gul fluorescerande protein (YFP) endast i neuroner ¹⁷ användes för att optimera krossa förfarande om den gemensamma fibular nerv och otvetydigt visualisera regenererande axoner. Nerven krossades vid kanten av gastrocnemius senan mest proximalt i förhållande till mål-musklerna eftersom denna webbplats är mer tillgänglig från platsen för snittet. Denna webbplats fungerar också som en pålitlig anatomiska landmärke, gör det möjligt att jämföra regenerering av NMJs bland djur i samma ålder och kön. Komprimera nerven i 5 sek med hjälp av en fin pincett resÜLTS i försvinnandet av YFP från skadestället (Figur 2B). Men bindväv och celler som bor i epineurium förblir sammanhängande, fungerar som inkörsport för snabb och exakt regenerering av axoner till sina ursprungliga mål (Figur 2B). I 70 dagar gamla honmöss, räcker denna skada att orsaka degenerering av alla axonala segment distala från den neuronala soma (Figur 4B).

För att bestämma tillförlitligheten och reproducerbarhet denna skada metod var reinnervation av extensor digitorum longus (EDL) muskel undersöktes. Denna muskel valdes av flera skäl: 1) Det är proximal ändå fysiskt separerade från snittet och nerv platser skada (figur 3A). Därför är muskeln endast förändras genom degeneration av avhuggna innerverar axoner. Dess närhet till det krossade platsen minimerar den tid som krävs för att den skall reinnervated och muskel atrophy. 2) Det är främst består av snabba typ skelettmuskelfibrerna, som är mer mottagliga för åldrande och sjukdomar. 3) Dess NMJs genomgå stora strukturella förändringar under utvecklingen av sjukdomar och åldrande som kan minskas genom motion och kalorirestriktion. 4) Det är lätt åtkomliga för levande avbildning och molekylär manipulation (Figur 3D). 5) Det kan lätt separeras i sina fyra phalangeal komponenter som kan vara hela monterad gör det möjligt att fullt ut bilden alla sina innerverar axoner och deras anslutningar med ljusmikroskop (Figur 3B).

Reinnervation tidigare lediga postsynaptiska platser efter krossa fibular nerven på höger ben bedömdes i tre 70 dagar gamla honmöss uttrycker YFP i motor axoner. Postsynaptiska platser visualiserades med användning av fluorescensmärkta alfa-bungarotoxin (BTX), som selektivt binder och med hög affinitet till muskler nACH. Muskler ansågs vara denerverad, helt eller delvis reinnervated efter dessa kriterier: 1) I denerverade muskelfibrer har motoriska axoner helt saknas postsynaptiska platser och mindre än 5% colocalization mellan axonet och AChRs observerades. 2) Delvis innerverade muskelfibrer kategoriserades av vissa men ofullständig rätten att sätta motor axoner med postsynaptiska platser och 5-95% colocalization mellan axon och AChRs observerades. 3) I fullt innerverade muskelfibrerna, det var nästan perfekt apposition mellan motornervändar och postsynaptiska platser och mer än 95% colocalization mellan axon och AChRs observerades. Enskilda NMJs uteslöts från räknas om deras ändplattor låg vinkelrätt mot bildplanet eller hela NMJ inte visualiseras. Med hjälp av dessa kriterier var hög samstämmighet i hastigheten och graden av reinnervation observerats bland alla möss undersöktes. Vid 4 dagar efter krossa, var muskler hittat helt denerverad i alla djur examined (Figur 4B). Denna upptäckt visar att krossa den gemensamma fibular nerven för 5 sekund, såsom beskrivits ovan, är tillräcklig för att skära av alla axoner. Av 7 dagar efter krossa, nervändar var i färd med att reoccupying tidigare avställda postsynaptiska ställen (fig 4C, 4E-F). De flesta muskelfibrer var fortfarande finns endast delvis innerveras. Med ytterligare dagar efter krossa, nervändar fortsatte att differentiera till presynaptiska platser och NMJs befinns helt reinnervated av 12 dagar (Figur 4D, 4E-F). Viktigt, det var lite variation bland möss denerverade under lika lång tid (Figur 4E-F), vilket visar att krossa fibular nerven kan användas som en analys för att jämföra reinnervation av muskler mellan djur i samma ålder och kön.

Förmågan att troget jämföra regenere NMJs mellan djur ger möjligheteratt förstå de cellulära egenskaper som hör ihop med varje steg som krävs för att fullt ut reparera denna synaps. För att undersöka arkitektur denerverade och regenere NMJs från 70 dagar gamla möss som användes ovan för att jämföra andelen reinnervation ades högupplösta konfokalmikroskopi bilder av NMJs erhållits. Som väntat visade analysen en rad förändringar som sker i α-motoriska axonet nervändar som de reinnervate muskelfibrer (Figur 4G-I). Axonal tillväxt kottar tycks expandera och börja filial ut som de kommer i kontakt postsynaptiska platser (Figur 4G). Dessa axonal grenar växer sedan över specifika regioner av postsynapsen, som kulminerade i en nära fullständig sammanställning av axonet nerven slutar med postsynaptiska plats (figur 4H-I). Ytterligare strukturella funktioner i regenererande motornervändar som är mycket liknar de som finns under utvecklingen observerades, inklusive flera axoner som konkurrerar om same mål (figur 4H), som kulminerar i en enda axon innervating en muskelfiber med 12 dagar efter krossa. Dessutom axonal grenar som sträcker sig utanför postsynaptiska platser hänvisade häri som groddar, på alla stadier efter skada observerades (Figur 4I). Dessa groddar var mycket vanligt, även i fullt innerverade NMJs tyder på att slutfasen av axonal reparation innebär indragning av extrajunctional axonal grenar. Trots dessa uppenbara förändringar i nervändar, förblev postsynaptiska platser mestadels oskiljbara på alla stadier efter skada jämfört med dem i oskadade muskler, även på 4 dagar efter krossa när muskelfibrer finns helt denerverad. Det fanns inga uppenbara tecken på splittring eller betydande förlust och omfördelning till extra-synaptiska regioner AChRs. Dessa fynd tyder starkt på att den fibular nervkross metod kan användas som en analys för att identifiera och testa molekylär, farmakologiska och livsstils interventioner thatt främja reparation av nervändar i synapser, inklusive NMJ.

Trots den senaste tidens framsteg, har mycket få framsteg gjorts när det gäller att identifiera muskel härledda faktorer som krävs och är tillräcklig för att underhålla och reparera NMJ. Vi frågade därför om den gemensamma fibular nervskada metod kan användas för att identifiera molekyler ändras vid specifika stadier av reinnervation processen och med potentiella roller i reparera NMJ. Som ett bevis på rektor, expressionsanalys av två NMJ-associerade gener, den AChR gamma-subenheten och muskelspecifika kinas var MuSK ¹⁸ utförs. Såsom demonstreras med kvantitativ PCR, är dessa gener ökade efter denervation och minskas som NMJs är reinnervated (figur 5a-b). Dessa gener uppregleras vid 4 dagar efter krossa, som tidigare rapporterats med hjälp av helt denerverade muskler ^19. Som nerver reinnervate muskelfibrer, nivåerna av dessa gener minskar och rapiDLY tillbaka till baslinjen. Bland djur undersökts, är uttrycksmönstret för båda generna nästan identiska, vilket visar ett nära samband mellan molekylära och cellulära förändringar på regenere NMJs. Denna metod ger därför unika möjligheter att identifiera molekylära förändringar i samband med olika stadier av NMJ förnyelse.

Figur 1:. Common fibular Nerve anatomi (A) Schematisk detailing loppet av ischiasnerven och dess terminala grenar i förhållande till ytliga och beniga landmärken. SCN = ischiasnerv, TN = tibialnerven, SRN = Sural Nerve, CPN = Common fibular Nerve, SPN = Ytlig fibular Nerve, DPN = Djup fibular Nerve. Den önskade snitt webbplats anges. (B) Diagram av gemensamma fibular nerv läge i förhållande till omgivande muskler med huden avlägsnas.Relativ snitt webbplats visas liggande investera fascia. TA = tibialis anterior EDL = Extensor digitorum longus-muskeln. (C) Exposed ischiasnerven och gemensam fibular nerv. CPN korsar över gastrocnemiusmuskeln (Gn) senan vid nivån för knäet. Krossa plats i förhållande till sena visas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2:. Gemensam fibular Nerve Crush kirurgi (A) Den ursprungliga snitt behöver bara vara några cm i längd. Efter att tränga igenom huden och ytliga fascia, måste snittet fortsättas genom att investera / djup fascia som ligger mellan biceps femoris och TA muskler. (A1) Den gemensamma fibular nerv lätt visualiseras utan mikroskopi through snittet (Gn = gastrocnemius). (A2) Skärningspunkten mellan den gemensamma fibular nerv och gastrocnemius senan kan enkelt visualiseras om snittet vidgas (endast nödvändigt för fotografiska ändamål). Krossa bör placeras på den plats som markeras med den röda linjen som är vinkelrät mot den nerv och parallellt med Gn senan. (B) CPN är ännu lättare visualiseras med YFP transgena möss under en fluorescerande dissekera omfattning. (B1) Nerven förlorar fluorescens vid platsen för krossa, vilket möjliggör bekräftelse av en fullständig krosskada. (B2) En fullständig CPN krossa fortfarande kan visualiseras med blotta ögat och rumsbelysning. Nerven blir genomskinlig. Den här bilden belyser det faktum att epineurium och överbyggnad CPN förblir intakt samtidigt begränsa skador till närliggande vävnad och blodkärl.Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3:. Anatomi extensor digitorum longus (EDL) Muscle (A) 3 dimensionell bild av EDL i förhållande till ben i musens bakben. Genereras med hjälp JAtlasView (B) Delvis dissekeras EDL muskeln separeras i sina fyra phalangeal divisioner och märkning siffrorna som styrs av varje division. (C) YFP märkt gren av den djupa fibular nerven som innerverar gavelplåtband EDL division styra den andra siffran. (D) axonal grenar och deras kontaktplatser kan lätt identifieras, vilket möjliggör konsekvent granskning av utvalda NMJs. Klicka här för att se en större version of denna figur.

Figur 4: Liknande priser för Reinnervation mellan djur i samma ålder och kön analys av NMJs i EDL muskeln efter krossa fibular nerv.. (A) Post-synaptiska platser är helt upptagen av axoner i oskadade möss. (B) Vid 4 dagar efter krossa, musklerna hittat helt denerverad. (C) Axoner börja reinnervate muskler 7 dagar efter krossa och (D) helt återta postsynaptiska ställen genom 12 dagar. (E - F) Graden av NMJ åter beläggning är nästan omöjlig att skilja mellan djur denerverade under lika lång tid. (G - I) Representativa bilder av re-differentierande axonal nervändar i mognade presynaptiska platser. Återockupation av postsynaptiska platser följer enförutsägbart mönster, börjar med tillväxten konen utveckla grenar som så småningom helt upptar postsynaptiska platser utan sträcker sig bortom NMJ region.Similar till utveckling, postsynaptiska platser initialt innerveras av flera åter växande axoner men bara en Axon kvar när NMJ har helt regenereras. (H) Exempel på sprudlande axonal groning, delvis innervation utan fullständig överlappning mellan före och postsynaptiska apparater, och innervation av flera axoner angivna. 70 dagsgamla honmöss undersöktes; Skala Bar = 50 pm (AD), 20 | j, m (GI). Felstapel = SEM. N = 3 möss. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 5: fibular Nerve Crush Metod som enn analys för att identifiera kandidatgener för att reparera NMJ (A - B). mRNA nivån på två NMJ-associerade gener, den AChR gamma-subenheten och mysk, är på liknande sätt förändras i TA muskeln av möss denerverade under lika lång tid . Med ökande tid efter nervskada, nivåer av båda transkript minskar, återvänder till baslinjen, bekräftar histologisk analys visar progressiv reinnervation av NMJs. Varje linje representerar en enskild mus. Felstapel = standardfel av medelvärdet av tekniska replikat. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Den metod som presenteras i detta manuskript ger unika möjligheter att identifiera mekanismer som är involverade i att reparera neuromuskulära korsningar (NMJ). Denna metod innefattar krossning av det gemensamma fibular nerven då den passerar över gastrocnemius senan nära knät. Vi visar att efter endast fem sekunder av nervkompression med en pincett, är klar degeneration noterats av 4 dagar efter skada. Hos unga vuxna möss, alfa-motoriska axoner börjar reinnervate tidigare synaptiska platser i extensor digitorum longus muskeln (EDL) vid 7 dagar efter skada, som kulminerade i reformeringen av presynaptiska platser som är omöjlig att skilja från de i oskadade möss med 12 dagar. Dessutom visar vi att nivåerna av utvalda NMJ-associerade molekyler korrelerar nära med innervation status NMJ. Viktigt är dessa cellulära och molekylära förändringar är mycket reproducerbar mellan djur av samma kön och ålder (figur 5a-b), vilket ger möjligheter att identifiera och test faktorer som verkar för att reparera NMJ. När det gäller kirurgiska ingrepp, är den gemensamma fibular nervgren lättillgängligt när den passerar över gastrocnemius senan, som endast kräver ett litet snitt som resulterar i liten skada på omgivande muskler och kärl.

Det finns ett antal fördelar med att använda den gemensamma fibular nerven för att undersöka cellulära och molekylära förändringar associerade med regenererande NMJs. Gastrocnemius senan fungerar som en stabil anatomiska landmärke att konsekvent skada den gemensamma fibular nerven på samma plats och avstånd från mål muskler. Detta gör det möjligt att på ett tillförlitligt sätt jämföra graden av regenerering av axoner och reinnervation av muskler mellan djur i samma ålder och kön. Stegen kritiska till en sådan framgång bland annat att se till att skadestället är konsekvent mellan operationer, är fullt nerv krossa erhållits i varje djur, och minimal skada upprätthålls till omgivande strukturer. Bland muskler innerverade av cGEMENSAMMA fibular nerv, tibialis anterior (TA) och extensor digitorum longus (EDL) muskler är utmärkta mål för att bedöma NMJ reparation. Dessa två muskler i första hand består av snabba typ muskelfibrer som allvarligt påverkas av skada, åldrande och sjukdomar ^5. För NMJ analys är EDL muskeln särskilt attraktivt eftersom det kan vara hela monterade bilden alla NMJs utan störningar. Det gör det också möjligt att korrelera förändringar på NMJs med förändringar på andra ställen i muskelfibrer, motor axoner och omgivande celler.

TA och EDL muskler har i stor utsträckning använts för att bedöma effekten av olika molekylära och livsstilingripanden på muskler och NMJ reparation på grund av deras anatomiska läge ^20. Men ändrar långsiktig denervation uttryck av gener med kritisk funktion i förtvinar muskelfibrer, aktiverade immunceller och satellitceller ^12-14, vilket gör det svårare att bedöma cellulära och molekylära chAnges krävs för att specifikt främja regenerering av NMJs. I den här beskrivna metoden fibular nerven krossas i nära anslutning till TA och EDL muskler, vilket gör att nerven att nå dem inom 7 dagar efter krossa hos unga vuxna möss. Därför bör denna metod minimerar förlust av muskelmassa och molekylära förändringar i samband med förtvinar muskelfibrer i TA och EDL muskler.

Fibular nerv krossa protokoll kan modifieras på flera olika mode. Nerv cut skada kan lätt ersätta krossa, vilket möjliggör bättre realtid in vivo avbildning av perifer nervregenerering. Ett snitt avlägsnar döda Axon material som ett hinder för återväxt och säkerställer homogen skada av varje axon inom endoneurial röret.

När utförs korrekt fibular nerv krossa har några influensarelaterade komplikationer. Ett problem som kan uppstå är fel på mage att reinnervate ursprungliga NMJ mål. Detta kan orsakas av accidental skära skada nerven under operation. Var noga med att kontrollera de fina spets kross pincett för några vassa kanter. Om du vid något tillfälle under operation kvaliteten på en nerv krossa är tveksamt, kan det ursprungliga snittet utvidgas till bättre visualisera nerven. Även om detta ökar storleken på såret och kan skada ytterligare strukturer, kan det hjälpa till med korrekt identifiera fibular nerv och bedöma huruvida en fullständig krossa uppnåddes.

Tekniken beskrivs här besitter några begränsningar. För det första är det i huvudsak användbart i vuxna möss som strukturerna i dessa djur är tillräckligt stor för att manipulera. Nyfödda och unga möss är mycket mindre, avsevärt öka svårigheten att operationen. För det andra, innehåller fibular nerv sensoriska och motoriska axoner, vilket resulterar i denervering av målvävnader som kan påverka andelen NMJ förnyelse.

NMJ är erkänd som en samlingspunkt platsen för patologi i amyotrofisk latmänna skleros (ALS) och åldrande. Det har också repareras efter skada på perifera nerver för att undvika att äventyra motorik och förlora muskelmassa. Fibular nerv krossa metod bör underlätta identifiering och testning av molekyler med viktiga roller i att reparera NMJ. I ett tillvägagångssätt kan denna metod användas för att profilera mRNA och mikroRNA med nyckelroller i olika skeden av NMJ regeneration med hjälp av RNA-sekvensanalys. Det kan också tillämpas för att selektivt bestämma funktionen hos gener som införs och raderas från muskler. Dessutom lämpar denna metod sig väl för att testa förmågan hos exogena molekyler för att påskynda nerv och NMJ förnyelse med statisk och levande bilder.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketamine	VetOne	501072
Xylazine	Lloyd Inc.	003437
Buprenorphine	Zoopharm	1Z-73000-150910
Nair	Nair
Kim-wipes	Kimtech	34155
Electric Razor	Braintree Scientific	CLP-64800
80% EtOH/H20
10% Proviodine
1 ml Insulin Syringe
Spring Scissors	Vannas	91500-09
No. 15 scalpel	Braintree Scientific	SSS 15
#5 Forceps	Dumont	11252-00
6-0 silk suture on reverse cutting needle	Suture Express	752B
Rodent Heating Pad	Braintree Scientific	AP-R-18.5
Alexa 555 conjugated alpha-BTX	Molecular Probes	B35451
Vectashield	Vector Labs	H-1000
Olympus Stereo Zoom Microscope	Olympus	562037192
Zeiss 700 Confocal Microscope	Zeiss
Variable-flow peristaltic perfusion pump	Fisher Scientific	13-876-3
Aurum Total RNA Mini Kit	Bio-Rad	7326820
Bio-Rad iScript RT Supermix	Bio-Rad	1708840
SsoFast Evagreen Supermix	Bio-Rad	1725200
Bio-Rad CFX96	Bio-Rad	1855196
Puralube Vet ointment	Puralube	1621
Synaptotagmin-2 antibody	Antibodies-Online	ABIN401605
Neurofilament antibody	Antibodies-Online	ABIN2475842