Abstract
La jonction neuromusculaire (JNM) subit des changements structurels et fonctionnels délétères en raison du vieillissement, les blessures et la maladie. Ainsi, il est impératif de comprendre les changements cellulaires et moléculaires impliqués dans le maintien et la réparation des NMJs. A cet effet, nous avons développé une méthode pour examiner de manière fiable et constante régénération NMJs chez la souris. Cette méthode de lésion du nerf implique l'écrasement du nerf fibulaire commun, car elle passe au-dessus de la tête latérale du tendon du muscle gastrocnémien près du genou. Utilisation de vieilles souris femelles 70 jours, nous démontrons que les axones moteurs commencent à reinnervate cibles postsynaptiques précédents dans les 7 jours après l'écrasement. Ils réoccuper complètement leurs zones synaptiques précédents en 12 jours. Pour déterminer la fiabilité de cette méthode de blessure, nous avons comparé les taux de réinnervation entre 70 jour vieilles souris femelles individuelles. Nous avons constaté que le nombre de sites postsynaptiques réinnervé était similaire entre les souris à 7, 9, et 12 jours après l'écrasement. Pour déterminer sicet essai de lésion peut également être utilisé pour comparer les changements moléculaires dans les muscles, nous avons examiné les niveaux de la sous-unité gamma du récepteur nicotinique musculaire (gamma-AChR) et la kinase spécifique du muscle (MuSK). La sous-unité gamma-RACh et MuSK à sont fortement surexprimés dénervation suivant et revenir à des niveaux normaux après réinnervation des NMJs. Nous avons trouvé une relation étroite entre les niveaux de transcription de ces gènes et de l'état de l'innervation des muscles. Nous croyons que cette méthode permettra d'accélérer notre compréhension des changements cellulaires et moléculaires impliqués dans la réparation de la NMJ et d'autres synapses.
Protocol
Toutes les expériences ont été réalisées conformément aux directives du NIH et des protocoles d'animaux approuvés par le Comité Tech soin et l'utilisation des animaux institutionnels Virginie.
1. Préparer les animaux destinés à la chirurgie
- Anesthésier les souris avec un mélange de kétamine (90 mg / kg) et de xylazine (10 mg / kg) par injection sous-cutanée inguinale avec une seringue de 1 ml d'insuline stérile. solution véhiculaire contient un mélange d'une solution saline à 0,9%, 17,4 mg / ml de kétamine et de 2,6 mg / ml de xylazine. Placez les animaux de retour dans des cages en attendant des médicaments à prendre effet.
REMARQUE: si la dose de charge ne fournit pas une anesthésie suffisante pour la durée de la procédure, un supplément de 25% la dose de charge peut être injectée. - animaux Surveiller après l'injection pour vérifier les taux respiratoires stables et la dépression appropriée des niveaux d'excitation. Vérifier le niveau d'excitation avec une pincée de pied arrière, ce qui devrait susciter aucune réponse lorsque suffisamment anesthésiés.
NOTE: Cela prend habituellement 3-5min pour une souris adulte jeune en moyenne 25 à 30 g. Si l'animal est encore sensible après l'injection de poste de 10 min, 25% supplémentaires de la dose de charge anesthésique peut être injecté. - Appliquer la vaseline et l'huile minérale légère pommade ophtalmique aux yeux de l'animal pour prévenir la sécheresse. Retirer les animaux de la cage et la placer sur une surface plane et propre. Rasez la patte postérieure souhaitée du pied à l'aide d'un bassin tondeuse électrique, exposant seulement la face latérale de la branche.
- Appliquer un épilateur chimique sur le site rasé pendant 1 min. Supprimez manuellement les cheveux en utilisant des lingettes de laboratoire. Nettoyer la zone épilée avec le laboratoire lingette trempé dans l'éthanol.
2. Procédure chirurgicale
- Stériliser les instruments chirurgicaux par autoclave ou autre méthode appropriée. Nettoyer le site chirurgical et planche chirurgicale avec 80% d' éthanol / H 2 0. Désinfecter le site chirurgical avec proviodine. Placez la souris à bord chirurgical et aligner les restrictions des membres. Garderle membre cible postérieur dans une position anatomique naturelle avec l'articulation du genou légèrement prolongé sans rotation interne ou externe.
- Placez l'animal et planche sous le microscope chirurgical. Orient sur le site d'incision correcte via la palpation des repères superficiels, en particulier l'articulation du genou osseux et la crête entre le jambier antérieur et les muscles gastrocnémiens.
- Faire une incision d'environ 3 cm à travers la peau à l'aide d'un scalpel ou des ciseaux de printemps tout en utilisant une pince de préhension générales. Faire l'incision perpendiculaire à la couche sous-jacente du nerf fibulaire commun.
- Continuer l'incision à travers l'aponévrose superficielle, exposant le biceps fémoral et vaste externe muscles. Séparer ces muscles en coupant à travers le fascia profond de connexion. A 1-2 cm coupe doit être suffisante.
- Rentrez muscle biceps fémoral en utilisant caudale enrouleurs mécaniques, révélant le nerf fibulaire commun.
- Tracez le nerf proximalement jusqu'à son intersection avec le tendon de la tête latérale du muscle gastrocnémien est trouvé. Remarque: L'exposition peut nécessiter une manipulation supplémentaire de la peau rétractée et musculaire. Cette intersection est utilisée comme point de repère stable pour la lésion nerveuse.
- Saisir le nerf avec une pince fine, en alignant les conseils d'une manière parallèle à la bordure latérale du tendon gastrocnémien. Écraser le nerf fibulaire commun en appliquant une forte pression constante pendant 5 sec.
- Corroborer pleine écrasement du nerf par inspection visuelle à travers le champ chirurgical. Il apparaît translucide au site de la lésion. Si en utilisant des souris exprimant des protéines de fluorescence dans les axones périphériques, la fluorescence disparaît du site de la lésion.
- Retirer écarteurs et réaligner les muscles dans leurs positions anatomiques. Fermez le site d'incision avec 6-0 sutures de soie. 1-3 simples sutures interrompues est suffisante. Placez la récupération de la souris sur un coussin chauffant dans une cage propre.
- Surveiller tous les animaux pendant 2 heures post-opération pour vérifier la respiration et les réactions indésirables à l'anesthésie. Administrer une dose initiale de buprénorphine 0,05-0,10 mg / kg par injection sous-cutanée inguinale immédiatement après récupération de la chirurgie. Donner 3 doses supplémentaires chaque 12 h sur 48 h suivant. Après un rétablissement complet, le retour des souris à l'établissement de soins des animaux.
3. Isolement et Coloration des extensor digitorum longus (EDL) Muscles
- Sacrifiez les animaux en utilisant l'isoflurane. Distribuer 0,5 ml d'isoflurane liquide dans un tube de 50 ml remplie de labwipes absorbants. Placer le tube non coiffé avec l'animal dans une enceinte étanche 2 500 cm 3. Au moins 4 min d'exposition est suffisante. Test de perte de palpébrale bilatérale, toe-pincement, et des réflexes queue-pincement pour veiller à ce que chaque animal est inconscient avant de procéder à la perfusion.
- Perfuser transcardiaque 16 animaux d' abord avec 10 ml de PBS 0,1 M, puis 25 ml de paraformaldehyde à 4% dans du PBS 0,1 M (pH 7,4). Héparine (30 unités / 20g poids de l'animal) peut être ajouté avec le PBS (10 unités / ml) pour empêcher la coagulation du sang dans les petits lits capillaires, améliorant ainsi les résultats de la perfusion.
- Retirer la peau qui recouvre les membres postérieurs en utilisant des ciseaux pour couper transversalement à travers la peau autour de la circonférence de l'abdomen. Peler la peau vers le bas devant les membres et les pieds postérieurs en utilisant une pince.
- Retirer aponévrose superficielle des membres postérieurs en saisissant et le pelage avec une pince. Si en utilisant des souris exprimant des protéines fluorescentes dans les axones périphériques, post-fixer des souris toute la nuit dans 4% PFA dans 50 ml tubes. Rinçage trois fois avec du PBS.
NOTE: Des souris fixes peuvent être stockés dans du PBS à 4 ° C. Sinon, ignorez cette étape et passez à l'étape 3.6 sans animaux de post-fixation. - Disséquer muscles EDL 18 de membres postérieurs de la souris, en étant sûr de garder proximale et distale tendons aussi intact que possible.
- Incuber muscles EDL dans un tampon de blocage (PBS 1X contenant 0,5% de Triton X-100, 3% de BSA et du sérum de chèvre à 5%) pendant au moins 1 h.
- Colorer le controlatéral indemne EDL comme un contrôle positif pour toutes les innervation NMJ. Les contrôles négatifs devraient inclure une liste EDL obtenue à 4 jours après la lésion, un point de temps où le NMJ est complètement dénervé, ainsi qu'une EDL colorées avec un anticorps secondaire.
- Incuber muscles avec des anticorps secondaires appropriés marqués par fluorescence pour détecter neurofilament et synaptotagmin-2 pour 1 jour. Laver les muscles trois fois avec PBS 1x et 10 min à chaque fois. Remarque: Cette étape peut être effectuée en même temps que l'étape 3.10. Passer cette étape si en utilisant des souris exprimant des protéines de fluorescence dans les axones périphériques.
- Pour visualiser le postsynaptic région de la jonction neuromusculaire, incuber les muscles avec 5 pg / ml Alexa-555 alpha-bungarotoxine conjugué dilué dans du tampon de blocage pendant au moins 2 heures. Laver les muscles trois fois avec PBS 1x et 10 min à chaque fois.
- Pour monter les muscles entiers sur des lames de verre chargées positivement, placez le muscle directement sur la diapositive, ajouter quelques gouttes de glycérine à base moyen sur la glissière de montage et couvrir avec une lamelle. Appuyez sur la lamelle contre la glissière pour aplatir le muscle. Tremper hors milieu de montage à partir du périmètre des lingettes de laboratoire lame et lamelle en utilisant. Appliquer le vernis à ongles pour sceller les bords entre la lamelle et un toboggan.
4. Imagerie et analyse des données
- Pour analyser la structure de NMJs, l'image du muscle EDL en utilisant un microscope à balayage laser confocal équipé pour exciter 488, 555 et 633 nm de lumière et de capturer la lumière émise avec 20X et 40X objectifs.
- Pour visualiser l'ensemble NMJs, créer un maximum d'images de projection d'intensité de sec optiquetions espacés de 1 à 2 pm étendant à part la plus faible dans les régions les plus élevées visibles de la NMJ. Créer des projections d'intensité maximale disponible dans le commerce en utilisant un logiciel d'imagerie.
- Pour déterminer les taux de réinnervation, classer NMJs comme: 1) complètement dénervé = le site postsynaptique est complètement dépourvu de contact avec axone, moins de 5% colocalisation entre l'axone et AChR. 2) partiellement innervé = l'axone recouvre partiellement la postsynapse, 5-95% colocalisation entre l'axone et AChR. 3) innervation pleine = presque parfaite apposition entre le pré et post-synaptique, plus de 95% colocalisation entre l'axone et AChR. Exclure NMJs qui se situent perpendiculairement au plan de l'image ou ne sont pas entièrement visualisées dans l'image. Nota: Dans toutes ces expériences, au moins 3 animaux et 50 NMJs par animal ont été examinés. Les résultats ont été jugés significatifs en utilisant un test t de l'étudiant avec une valeur de P inférieure à 0,05.
- Pour aveugler l'opérateur, des individus séparés peuvent effectuerla chirurgie et l'analyse d'images. Sans la connaissance des groupes de traitement, l'analyseur peut être objectif avec NMJ notation. Alternativement, les images peuvent être randomisés et présentés à l'opérateur pour l'analyse sans connaissance de l'animal source.
5. PCR quantitative
- Sacrifiez les animaux en utilisant l'isoflurane et dislocation cervicale. Enlever la peau et le fascia superficiel couvrant les muscles des jambes selon l'étape 3.3. Disséquer jambier antérieur et les muscles EDL selon l'étape 3.4.
- Flash geler l'ensemble du jambier antérieur et les muscles EDL dans un tube de 1,5 ml dans de l'azote liquide. Retirer le tissu du tube et le placer dans un mortier pré-refroidi partiellement immergé dans de l'azote liquide. Broyer le muscle congelé en une fine poudre en utilisant un mortier et un pilon.
- Dissoudre la poudre de muscle congelé dans un réactif d'extraction d'ARN disponibles dans le commerce et d'effectuer l'extraction d'ARN et l'élimination de l'ADN génomique avec un kit disponible dans le commerce selon le constructeur instructions.
- Effectuer la transcription inverse avec un mélange de transcriptase inverse disponible dans le commerce selon les instructions du fabricant.
- Effectuer qPCR en utilisant un kit disponible dans le commerce en utilisant des gènes d'entretien ménager appropriés (voir tableau des matériaux). Utilisez un quantitative cycleur thermique PCR disponible dans le commerce pour effectuer la PCR (voir le tableau des matériaux).
- Régler la température de recuit à 58 ° C. Régler les paramètres de cyclisme supplémentaires aux spécifications du fabricant de Taq polymérase / SYBR vert mix. Inclure une étape finale de la courbe de fusion dans le programme de thermocycleur constitué de 0,5 ° C des augmentations progressives de 65 ° C à 95 ° C pour tester la spécificité d'amorce et amorce la formation du dimère.
- Déterminer les niveaux relatifs d'expression d'ARNm de la 2 - Méthode ΔΔCT 21 en utilisant l' ARN 18S en tant que gène de contrôle.
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Representative Results
Le nerf fibulaire commun, aussi appelé le nerf fibulaire commun, provient du nerf sciatique au- dessus du creux poplité, où il oscille autour de la tête du péroné à la face antérieure de la jambe (figure 1A). Là, il se ramifie en les nerfs fibulaires superficiels et profonds, fournissant ainsi les dorsiflexors du pied et des orteils (anterior tibial, extensor digitorum longus et brevis et hallux extenseurs muscles des orteils), et les everters du pied (muscles péroniers). Ce nerf porte également des fibres sensorielles qui se projettent sur le dos du pied et de l'aspect latéral de la moitié inférieure de la jambe. Il est une structure relativement mince composée de moteur et axones sensoriels. Cette branche du nerf suit un cours anatomique prévisible. Latéral au genou, le nerf est surtout superficiel car il fonctionne sur le tendon de la tête latérale du muscle gastrocnémien (figure 1 et figure 2). thest l' emplacement sert de point de repère stable qui peut être facilement accessible par une petite incision, en limitant les dommages à la peau et le fascia (figure 1A). Le plus petit diamètre de ce nerf, par rapport à la sciatique et le nerf tibial, permet d'écraser les axones en utilisant moins de force, ce qui réduit le risque de sectionner complètement les axones les plus superficielles.
Les souris exprimant la protéine de fluorescence jaune (YFP) seulement dans les neurones 17 ont été utilisés pour optimiser la procédure d'écrasement sur le nerf fibulaire commun et de visualiser clairement axones. Le nerf a été écrasé sur le bord du tendon gastrocnémien la plus proximale des muscles cibles parce que ce site est plus accessible à partir de l'emplacement de l'incision. Ce site sert également de point de repère anatomique fiable, permettant de comparer la régénération des NMJs chez les animaux du même âge et le sexe. Compresser le nerf pendant 5 secondes en utilisant une pince fine resULTS à la disparition de la YFP à partir du site de lésion (figure 2B). Cependant, le tissu conjonctif et des cellules résidant dans la épinèvre demeurent contiguës, servant de conduit pour la régénération rapide et précise des axones vers leurs cibles initiales (figure 2B). Dans l' âge de 70 jours chez les souris femelles, cette lésion est suffisante pour provoquer une dégénérescence des axones de tous les segments distaux du soma neuronal (figure 4B).
Pour déterminer la fiabilité et la reproductibilité de cette méthode de blessure, réinnervation du muscle long extenseur des orteils (EDL) a été examiné. Ce muscle a été choisi pour plusieurs raisons: 1) Il est proximal encore physiquement séparés des sites de blessures incision et nerveuses (figure 3A). Par conséquent, le muscle est seulement modifié par la dégénérescence des axones innervant sectionnés. Sa proximité avec le site d'écrasement réduit au minimum le temps nécessaire pour qu'il soit réinnervé et atroph musculairey. 2) Il est composé principalement de type rapide des fibres musculaires squelettiques qui sont plus sensibles au vieillissement et aux maladies. 3) Ses NMJs subissent des changements structurels importants au cours de la progression des maladies et le vieillissement qui peut être atténué par l'exercice et la restriction calorique. 4) Il est facilement accessible pour l' imagerie en direct et à la manipulation moléculaire (Figure 3D). 5) Il peut être facilement séparé en ses quatre composantes phalangiennes qui peut être toute montée permettant de pleinement l' image de tous ses axones innervant et leurs connexions en utilisant la microscopie optique (figure 3B).
Réinnervation des sites post-synaptiques précédemment libérés après l'écrasement du nerf fibulaire sur la jambe droite a été évaluée dans trois vieux de 70 jours chez les souris femelles exprimant YFP dans les axones moteurs. les sites post-synaptiques ont été visualisées en utilisant la fluorescence marqués alpha-bungarotoxine (BTX), qui se lie sélectivement et avec une grande affinité pour les muscles CNahrs. Muscles ont été considérées comme dénervé, partiellement ou totalement réinnervé suivant ces critères: 1) Dans les fibres musculaires dénervés, axones moteurs ont été complètement absents des sites post-synaptiques et moins de 5% colocalisation entre l'axone et AChR a été observée. 2) les fibres musculaires partiellement innervées ont été classés par certains, mais l'apposition incomplète des axones moteurs avec des sites post-synaptiques et 5-95% colocalisation entre l'axone et AChR a été observée. 3) Dans les fibres musculaires entièrement innervés, il y avait presque parfait entre l'apposition moteur terminaisons nerveuses et les sites post-synaptiques et plus de 95% colocalisation entre l'axone et AChR a été observée. NMJs individuels ont été exclus du dénombrement si leurs plaques d'extrémité pondent perpendiculaire au plan de l'image ou de la totalité NMJ n'a pas été visualisé. En utilisant ces critères, concordance élevée dans le taux et le degré de réinnervation a été observée chez toutes les souris examinées. A 4 jours après l'écrasement, les muscles ont été trouvés complètement dénervé dans tous les animaux exaextrait (figure 4B). Cette découverte montre que l'écrasement du nerf fibulaire commun pour 5 sec, comme décrit ci-dessus, est suffisante pour couper tous les axones. En 7 jours après l'écrasement, les terminaisons nerveuses étaient en train de réoccuper post-synaptique sites précédemment libérés (figure 4C, 4E-F). Cependant, la plupart des fibres musculaires ont encore été que partiellement innervées. Avec jours supplémentaires après l' écrasement, les terminaisons nerveuses ont continué de se différencier en sites et NMJs présynaptiques ont été retrouvés entièrement réinnervé par 12 jours (Figure 4D, 4E-F). Surtout, il y avait peu de variabilité chez les souris dénervés pour la même durée (Figure 4E-F), ce qui démontre que l' écrasement du nerf fibulaire peut être utilisé comme un test pour comparer réinnervation des muscles entre les animaux du même âge et le sexe.
La possibilité de comparer fidèlement NMJs régénérantes entre les animaux offre des possibilitésde comprendre les caractéristiques cellulaires associés à chaque étape nécessaire pour réparer complètement cette synapse. Pour examiner l'architecture de NMJs dénervés et régénérantes de la 70 jours vieille souris utilisée ci-dessus pour comparer les taux de réinnervation, à haute résolution des images de microscopie confocale de NMJs ont été obtenus. Comme prévu, cette analyse a révélé un certain nombre de changements qui se produisent dans α-moteur terminaisons axone nerveuses comme ils reinnervate fibres musculaires (Figure 4G-I). Cônes de croissance axonale semblent se développer et de commencer à se ramifier comme ils contactent les sites postsynaptiques (Figure 4G). Ces branches axonales ensuite croître sur des régions spécifiques du postsynapse, aboutissant à la juxtaposition presque complète du nerf axone se terminant par le site postsynaptique (Figure 4H-I). caractéristiques structurelles supplémentaires dans la régénération des terminaisons nerveuses motrices qui ressemblent fortement ceux trouvés au cours du développement ont été observés, y compris plusieurs axones en compétition pour le scible amme (Figure 4H), aboutissant à un seul axone innervant une fibre musculaire de 12 jours après l'écrasement. En outre, les branches axonales allant au - delà des sites post-synaptiques, désignés ici comme les germes, à tous les stades post-traumatique ont été observées (Figure 4E). Ces germes étaient très répandues, même en NMJs pleinement innervés suggérant que la phase finale de la réparation axonale implique le retrait des branches axonales extrajonctionnels. En dépit de ces changements évidents au niveau des terminaisons nerveuses, les sites post-synaptiques sont restés essentiellement indiscernables à tous les stades après la lésion par rapport à ceux des muscles indemnes, y compris à 4 jours après l'écrasement lorsque les fibres musculaires se trouvent complètement dénervé. Il n'y avait aucun signe évident de la fragmentation ou une perte importante et la redistribution aux régions extra-synaptiques de AChR. Ces résultats indiquent clairement que la méthode nerf fibulaire écrasement peut être utilisé comme un test pour identifier et tester des interventions moléculaires, pharmacologiques et de style de vie tchapeau promouvoir la réparation des terminaisons nerveuses au niveau des synapses, y compris le NMJ.
Malgré les progrès récents, très peu de progrès ont été réalisés dans l'identification des facteurs musculaires dérivés nécessaires et suffisantes pour entretenir et réparer le NMJ. Nous avons donc demandé si la méthode fibulaire commun de lésion nerveuse peut être utilisée pour identifier des molécules modifiées à des étapes spécifiques du processus de réinnervation et avec des rôles potentiels dans la réparation de la NMJ. Comme preuve du principal, analyse de l' expression de deux gènes NMJ-associés, la sous - unité gamma RACh et la kinase spécifique du muscle, MuSK 18 a été réalisée. Comme l'a démontré avec la PCR quantitative, ces gènes sont augmentés suivant dénervation et diminué en NMJs sont réinnervé (Figure 5a-b). Ces gènes sont surexprimés à 4 jours après l'écrasement, comme indiqué précédemment en utilisant complètement les muscles dénervés 19. Comme les fibres musculaires nerfs reinnervate, les niveaux de ces gènes diminuent et rapiretour DLY au niveau de référence. Parmi les animaux examinés, le mode d'expression des deux gènes est presque identique, ce qui démontre une corrélation étroite entre les changements moléculaires et cellulaires à NMJs régénérantes. Cette méthode offre donc des opportunités uniques pour identifier les changements moléculaires associés à différents stades de la régénération NMJ.
Figure 1:. Fibulaire commun Anatomie Nerve (A) Schéma détaillant le trajet du nerf sciatique et ses branches terminales par rapport aux repères superficiels et osseux. ScN = nerf sciatique, TN = nerf tibial, SRN = Nerve Sural, CPN = Common nerf fibulaire, SPN = Superficial nerf fibulaire, DPN = profond nerf fibulaire. Le site d'incision souhaitée est indiquée. (B) Schéma de l' emplacement du nerf fibulaire commun par rapport aux muscles environnants avec la peau enlevée.Relative site d'incision est représenté recouvrant le fascia d'investissement. TA = jambier antérieur Muscle EDL = muscle long extenseur des orteils. (C) sciatiques exposés et nerf fibulaire commun. CPN traverse sur le tendon du muscle gastrocnémien (Gn) au niveau du genou. Site Crush par rapport au tendon indiqué. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2:. Fibulaire commun Nerve Crush Surgery (A) L'incision initiale doit seulement être quelques cm de longueur. Après avoir pénétré à travers la peau et le fascia superficiel, l'incision doit être poursuivie à travers le placement / aponévrose située entre les fémoral et les muscles Biceps TA. (A1) Le nerf fibulaire commun est facilement visualisé sans microscopie trâce l'incision (Gn = Gastrocnemius musculaire). (A2) L'intersection du nerf et gastrocnémien fibulaire tendon commun peut être facilement visualisés si l'incision est élargie (nécessaire uniquement à des fins photographiques). L'écrasement doit être placé à l'endroit marqué par la ligne rouge perpendiculaire au nerf et parallèle au tendon Gn. (B) Le CPN est encore plus facilement visualisés avec des souris transgéniques YFP sous un champ de dissection fluorescent. (B1) Le nerf perd la fluorescence sur le site de l' écrasement, ce qui permet pour la confirmation d'une blessure à l'écrasement complet. (B2) L'écrasement complet CPN peut encore être visualisé avec l'éclairage de l' oeil et une salle nue. Le nerf va devenir translucide. Cette image met en évidence le fait que la épinèvre et de la superstructure du PCN restent intactes tout en limitant les dommages aux tissus et les vaisseaux sanguins à proximité.S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3:. Anatomie du muscle long extenseur des orteils (EDL) (A) 3 image bidimensionnelle de l'EDL en relation avec les os du membre postérieur de la souris. Généré en utilisant JAtlasView (B) partiellement disséquée du muscle EDL séparé en ses quatre divisions phalangiennes et le marquage des chiffres contrôlés par chaque division. (C) YFP branche du nerf fibulaire profond marqué comme il innerve la bande plaque d' extrémité de la division EDL contrôlant le deuxième chiffre. (D) branches axonales et leurs sites de contact peuvent être facilement identifiés, permettant un examen cohérent de NMJs sélectionnés. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande of ce chiffre.
Figure 4: Taux similaires de réinnervation entre les animaux du même âge et le sexe Analyse des NMJs dans le muscle EDL après l' écrasement du nerf fibulaire.. Les sites (A) post-synaptiques sont complètement occupées par des axones chez les souris indemnes. (B) à 4 jours après l'écrasement, les muscles se trouvent complètement dénervé. (C) Les axones commencent à reinnervate muscles 7 jours après l' écrasement et (D) réoccuper complètement les sites postsynaptiques de 12 jours. (E - F) Le taux de NMJ re-occupation est quasiment identique entre les animaux dénervé pour la même durée. (G - I) images représentatifs de re-différenciation axonales terminaisons nerveuses dans les sites présynaptiques mûri. Réoccuper des sites postsynaptiques suit unemodèle prévisible, en commençant par le cône de croissance en développement branches qui occupent finalement pleinement des sites postsynaptiques sans étendre au-delà du NMJ region.Similar au développement, les sites postsynaptiques sont initialement innervé par plusieurs axones re-croissance, mais un seul axone reste une fois que le NMJ a complètement régénéré. (H) Des exemples de bourgeonnement axonal exubérante, innervation partielle sans grand chevauchement entre pré et post - synaptiques appareils et innervation par plusieurs axones indiqués. 70 souris femelles un jour ont été examinés; Barre d'échelle = 50 pm (AD), 20 um (GI). barre d'erreur = SEM. N = 3 souris. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5: Le nerf fibulaire Crush Méthode commen Composition pour identifier les gènes candidats impliqués dans la réparation de l'NMJ (A - B). Le niveau de deux gènes NMJ-associés, la sous - unité gamma RACh et MuSK ARNm, sont de même modifié dans le muscle TA de souris dénervé pour la même durée . Avec l'augmentation des blessures post nerf temps, les niveaux des deux transcriptions diminuent, le retour à la ligne de base, ce qui corrobore l'analyse histologique montrant réinnervation progressive de NMJs. Chaque ligne représente une souris individuelle. Barre d'erreur = erreur standard de la moyenne des répétitions techniques. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
La méthode présentée dans ce manuscrit offre des occasions uniques pour identifier les mécanismes impliqués dans la réparation des jonctions neuromusculaires (NMJ). Cette méthode consiste à écraser le nerf fibulaire commun, car elle passe au-dessus du tendon gastrocnémien près du genou. Nous montrons que, après seulement 5 secondes de la compression du nerf avec une pince, la dégénérescence complète est noté par 4 jours après une blessure. Chez les souris jeunes adultes, les axones alpha-moteur commencent à reinnervate sites synaptiques précédents dans le muscle extensor digitorum longus (EDL) à 7 jours après la blessure, aboutissant à la réforme des sites présynaptiques qui sont impossibles à distinguer de celles des souris indemne de 12 jours. En outre, nous démontrons que les niveaux de sélectionner des molécules NMJ associées en étroite corrélation avec le statut de innervation du NMJ. Fait important, ces changements cellulaires et moléculaires sont hautement reproductibles entre les animaux du même sexe et de l' âge (figure 5a-b), en offrant des possibilités d'identifier et tesfacteurs de T qui agissent pour réparer le NMJ. En termes de procédures chirurgicales, le nerf fibulaire branche commune est très accessible car il passe sur le tendon gastrocnémien, nécessitant seulement une petite incision qui entraîne peu de dommages aux muscles et aux vasculature environnantes.
Il y a un certain nombre d'avantages de l'utilisation du nerf fibulaire commun pour examiner les changements cellulaires et moléculaires associés à NMJs régénérantes. Le tendon gastrocnémien sert de repère anatomique stable pour blesser toujours le nerf fibulaire commun sur le même emplacement et la distance des muscles cibles. Cela permet de comparer de manière fiable le taux de régénération des axones et réinnervation des muscles entre les animaux du même âge et le sexe. Les étapes essentielles à un tel succès comprennent en veillant à ce que le site de la lésion est cohérente entre les chirurgies, plein écrasement du nerf est obtenue chez tous les animaux, et un minimum de dommages est maintenue aux structures environnantes. Parmi les muscles innervés par le cnerf fibulaire COMMUNE, le jambier antérieur (TA) et extensor digitorum longus (EDL) muscles sont d'excellentes cibles pour l'évaluation de la réparation NMJ. Ces deux muscles sont principalement composés de fibres musculaires de type rapide qui sont gravement touchés par les blessures, le vieillissement et les maladies 5. Pour l'analyse NMJ, le muscle EDL est particulièrement intéressante, car elle peut être toute montée à l'image toutes les NMJs sans distorsions. Il permet également de mettre en corrélation des modifications au NMJs avec des changements ailleurs dans les fibres musculaires, axones moteurs et les cellules environnantes.
Les muscles TA et EDL ont été largement utilisés pour évaluer l'impact des différentes interventions moléculaires et de style de vie sur le muscle et la réparation NMJ en raison de leur localisation anatomique 20. Cependant, à long terme dénervation modifie l' expression des gènes ayant une fonction critique dans atrophier les fibres musculaires, les cellules immunitaires activées et les cellules satellites 12-14, ce qui rend plus difficile l'évaluation ch cellulaire et moléculaireANGES requis pour promouvoir spécifiquement la régénération des NMJs. Dans le procédé décrit ici le nerf fibulaire est écrasé à proximité de muscles TA et EDL, permettant le culot de les atteindre dans les 7 jours après l'écrasement chez les souris jeunes adultes. Ainsi, cette méthode devrait minimiser la perte de la masse musculaire et les changements moléculaires associés à atrophier fibres musculaires dans les muscles TA et EDL.
Le protocole d'écrasement du nerf fibulaire peut être modifié dans plusieurs modes distincts. blessure à la coupe de nerf peut être facilement remplacé par écrasement, permettant une meilleure en temps réel dans l'imagerie in vivo de régénération des nerfs périphériques. Une coupe supprime matériel mort axonale comme un obstacle pour la repousse et assure des dommages homogène de chaque axone dans le tube endoneurale.
Quand elle est réalisée correctement le écrasement du nerf fibulaire a peu de complications associées. Un problème qui pourrait être rencontré est l'échec du nerf à reinnervate cibles NMJ originales. Cela peut être causé par accidental coupé lésion du nerf pendant la chirurgie. Assurez-vous de vérifier la pince à pointe fine pour écraser les bords tranchants. Si, à tout moment au cours de la chirurgie de la qualité d'un écrasement du nerf est discutable, l'incision originale peut être élargie afin de mieux visualiser le nerf. Bien que cela augmente la taille de la plaie et peut endommager les structures supplémentaires, il peut aider à identifier correctement le nerf fibulaire et d'évaluer si oui ou non un écrasement complet a été atteint.
La technique décrite ici ne possède quelques limitations. Tout d'abord, il est utile surtout chez les souris adultes comme les structures de ces animaux sont assez grands pour manipuler. Nouveau-nés et les souris adolescentes sont beaucoup plus petits, ce qui augmente considérablement la difficulté de la chirurgie. Deuxièmement, le nerf fibulaire contient les axones sensoriels et moteurs, ce qui entraîne une dénervation des tissus cibles qui peuvent influer sur les taux de NMJ régénération.
Le NMJ est reconnu comme un site central de pathologie amyotrophique latamyotrophique (ALS) et le vieillissement. Il doit également être réparé suite à une lésion des nerfs périphériques pour éviter de compromettre la motricité et de perdre la masse musculaire. La méthode d'écrasement du nerf fibulaire devrait aider à l'identification et l'essai des molécules ayant un rôle important dans la réparation de la NMJ. Dans une approche, cette méthode pourrait être utilisée pour le profil de l'ARNm et microARN avec des rôles clés à différents stades de NMJ régénération en utilisant une analyse de séquence d'ARN. Il peut également être appliqué pour déterminer de manière sélective la fonction de gènes candidats introduits et éliminés à partir des muscles. En outre, cette méthode se prête bien à tester la capacité des molécules exogènes pour accélérer la régénération nerveuse et NMJ utilisant l'imagerie statique et en direct.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine | VetOne | 501072 | |
| Xylazine | Lloyd Inc. | 003437 | |
| Buprenorphine | Zoopharm | 1Z-73000-150910 | |
| Nair | Nair | ||
| Kim-wipes | Kimtech | 34155 | |
| Electric Razor | Braintree Scientific | CLP-64800 | |
| 80% EtOH/H20 | |||
| 10% Proviodine | |||
| 1 ml Insulin Syringe | |||
| Spring Scissors | Vannas | 91500-09 | |
| No. 15 scalpel | Braintree Scientific | SSS 15 | |
| #5 Forceps | Dumont | 11252-00 | |
| 6-0 silk suture on reverse cutting needle | Suture Express | 752B | |
| Rodent Heating Pad | Braintree Scientific | AP-R-18.5 | |
| Alexa 555 conjugated alpha-BTX | Molecular Probes | B35451 | |
| Vectashield | Vector Labs | H-1000 | |
| Olympus Stereo Zoom Microscope | Olympus | 562037192 | |
| Zeiss 700 Confocal Microscope | Zeiss | ||
| Variable-flow peristaltic perfusion pump | Fisher Scientific | 13-876-3 | |
| Aurum Total RNA Mini Kit | Bio-Rad | 7326820 | |
| Bio-Rad iScript RT Supermix | Bio-Rad | 1708840 | |
| SsoFast Evagreen Supermix | Bio-Rad | 1725200 | |
| Bio-Rad CFX96 | Bio-Rad | 1855196 | |
| Puralube Vet ointment | Puralube | 1621 | |
| Synaptotagmin-2 antibody | Antibodies-Online | ABIN401605 | |
| Neurofilament antibody | Antibodies-Online | ABIN2475842 |
References
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