Abstract
La unión neuromuscular (UNM) sufre cambios estructurales y funcionales deletéreos como resultado del envejecimiento, lesiones y enfermedades. Por lo tanto, es imprescindible para entender los cambios celulares y moleculares implicados en el mantenimiento y la reparación de NMJs. Para este propósito, hemos desarrollado un método para examinar fiable y consistente regeneración NMJs en ratones. Este método consiste en la lesión del nervio de aplastamiento del nervio peroneo común, ya que pasa por encima de la cabeza lateral del tendón del músculo gemelo cerca de la rodilla. Utilizando viejos ratones hembra de 70 días, se demuestra que los axones motores comienzan a reinervar objetivos postsinápticos anteriores dentro de los 7 días posteriores a aplastamiento. Que reingresen completamente sus áreas sinápticas anteriores por 12 días. Para determinar la fiabilidad de este método de la lesión, se compararon las tasas de reinervación entre 70 días de edad ratones hembras individuales. Se encontró que el número de sitios postsinápticos reinervados fue similar entre los ratones a los 7, 9, y 12 días post-aplastamiento. Para determinar sieste ensayo lesión también se puede utilizar para comparar los cambios moleculares en los músculos, se examinaron los niveles de la subunidad gamma del receptor nicotínico muscular (gamma-AChR) y la cinasa específica de músculo (MuSK). La subunidad gamma-AChR y almizcle que están altamente regulados por incremento tras la denervación y vuelven a los niveles normales después de la reinervación de NMJs. Hemos encontrado una estrecha relación entre los niveles de transcripción de estos genes y el estado de la inervación de los músculos. Creemos que este método se acelerará la comprensión de los cambios celulares y moleculares implicados en la reparación de la NMJ y otras sinapsis.
Protocol
Todos los experimentos se llevaron a cabo bajo las directrices del NIH y los animales protocolos aprobados por el Cuidado y Uso de Animales Institucional de Virginia Tech.
1. Los animales se preparan para la cirugía
- Anestesiar los ratones con una mezcla de ketamina (90 mg / kg) y xilazina (10 mg / kg) mediante inyección subcutánea inguinal con un 1 ml jeringa de insulina estéril. solución portadora contiene una mezcla de 0,9% de solución salina, 17,4 mg / ml de ketamina, y 2,6 mg / ml de xilazina. Coloque de nuevo los animales en jaulas a la espera de la medicación surta efecto.
NOTA: Si la dosis de carga no proporciona anestesia suficientes para la duración del procedimiento, un 25% adicional de la dosis de carga se puede inyectar. - Seguir los animales después de la inyección para comprobar la frecuencia respiratoria y la depresión constante adecuada de los niveles de excitación. Comprobar el nivel de excitación con una pizca pata trasera, lo que debería provocar ninguna respuesta cuando anestesiado suficientemente.
NOTA: Esto suele tardar 3-5min para un ratón adulto joven con un promedio de 25 a 30 g. Si el animal es todavía sensible después de la inyección posterior 10 min, un 25% adicional de la dosis de carga anestésico se puede inyectar. - Aplicar vaselina y aceite mineral ligero pomada oftálmica a los ojos del animal para evitar la sequedad. Retirar los animales de la jaula y el lugar sobre una superficie limpia y plana. Afeitar el miembro posterior deseada del pie a la pelvis usando un cortador de pelo eléctrico, exponiendo sólo el aspecto lateral de la extremidad.
- Aplique un removedor de pelo química al sitio afeitado durante 1 min. quitar manualmente el cabello utilizando toallitas de laboratorio. Limpiar la zona depilada con el laboratorio trapo empapado en etanol.
2. Procedimiento Quirúrgico
- Esterilizar instrumentos quirúrgicos a través de autoclave u otro método apropiado. Limpiar la zona quirúrgica y tabla quirúrgica con un 80% de etanol / H 2 0. Desinfectar el sitio quirúrgico con proviodine. Coloque el ratón a bordo quirúrgica y se alinean con las restricciones de las extremidades. Guardarla extremidad posterior de destino en una posición anatómicamente natural con la articulación de la rodilla ligeramente extendida sin rotación interna o externa.
- Lugar de los animales y la tabla bajo el microscopio quirúrgico. Orientar al sitio de la incisión adecuada mediante palpación de puntos superficiales, específicamente la articulación de la rodilla y de la cresta ósea entre los músculos gemelos y tibial anterior.
- Hacer una incisión de aproximadamente 3 cm a través de la piel con un bisturí o tijeras de primavera, mientras que el uso de fórceps generales para el agarre. Hacer la incisión perpendicular al supuesto subyacente del nervio peroneo común.
- Continuar la incisión a través de la fascia superficial, exponiendo el bíceps femoral y los músculos vasto lateral. Separar estos músculos mediante el corte a través de la fascia profunda conexión. Un 1-2 cm de corte debe ser suficiente.
- Repliegue del músculo bíceps femoral caudal utilizando retractores mecánicos, dejando al descubierto el nervio peroneo común.
- Trace el nervio proximal hasta su intersección con el tendón de la cabeza lateral del músculo gastrocnemio se encuentra. Nota: La exposición puede requerir la manipulación adicional de la piel y el músculo retraído. Esta intersección se usa como punto de referencia estable para la lesión del nervio.
- Agarre el nervio con unas pinzas finas, alineando la punta de un modo paralelo al borde lateral del tendón del gastrocnemio. Aplastar el nervio peroneo común mediante la aplicación de presión constante, dura durante 5 segundos.
- Corroborar completo aplastamiento del nervio mediante inspección visual a través del ámbito quirúrgico. Se aparecerá translúcida en el sitio de la lesión. Si el uso de ratones que expresan proteínas de fluorescencia en los axones periféricos, la fluorescencia desaparece del lugar de la lesión.
- Retire retractores y realinear los músculos en sus posiciones anatómicas. Cerrar el sitio de la incisión con suturas de seda 6-0. 1-3 suturas interrumpidas simples son suficientes. Coloque recuperación del ratón sobre una almohadilla térmica en una jaula limpia.
- Supervisión de todos los animales de 2 horas después de la óperación para comprobar la respiración y cualquier reacción adversa a la anestesia. Administrar una dosis inicial de buprenorfina 0,05-0,10 mg / kg mediante inyección subcutánea inguinal inmediatamente después de la recuperación de la cirugía. Dar a 3 dosis adicionales cada 12 h durante las siguientes 48 horas. Después de la recuperación total, los ratones regresar a las instalaciones de cuidado de animales.
3. El aislamiento y la tinción de extensor largo de los dedos (EDL) Músculos
- Sacrificar animales utilizando isoflurano. Coloque 0.5 ml isoflurano líquido en un tubo de 50 ml lleno de labwipes absorbentes. Se coloca el tubo destapado con el animal en una cámara de 2.500 cm 3 sellada. Al menos 4 min de exposición es suficiente. Prueba para la pérdida de palpebral bilateral, dedo del pie para los dedos, y los reflejos de estricción de rabo para asegurar que cada animal está inconsciente antes de proceder con la perfusión.
- Transcardially perfundir 16 animales primero con 10 ml 0,1 M PBS, a continuación, 25 ml de paraformaldehído al 4% en PBS 0,1 M (pH 7,4). Heparina (30 unidades / 20g de peso del animal) se puede añadir con PBS (10 unidades / ml) para prevenir la coagulación de la sangre en pequeños lechos capilares, mejorar los resultados de perfusión.
- Retire la piel que cubre extremidades traseras mediante el uso de tijeras para cortar transversalmente a través de la piel alrededor de la circunferencia del abdomen. Pelar abajo la piel más allá de las extremidades traseras y los pies con unas pinzas.
- Retire la fascia superficial de las extremidades traseras agarrando y se pela con un fórceps. Si el uso de ratones que expresan proteínas de fluorescencia en los axones periféricos, posterior a solucionar los ratones toda la noche en PFA al 4% en tubos de 50 ml. Enjuague tres veces con PBS.
NOTA: Se ha corregido los ratones pueden ser almacenados en PBS a 4 ° C. Si no es así, omita este paso y vaya al paso 3.6 y sin animales de arreglo de correos. - Diseccionar los músculos EDL 18 de las patas traseras del ratón, asegurándose de mantener proximal y distal tendones lo más intacta posible.
- Incubar músculos EDL en tampón de bloqueo (1x PBS que contenía 0,5% de Triton X-100, 3% de BSA y suero de cabra al 5%) durante al menos 1 hr.
- Manchar el contralateral ileso EDL como un control positivo para la completa inervación NMJ. Los controles negativos deben incluir un EDL obtenida a los 4 días después de la lesión, un punto de tiempo en el que el NMJ es completamente denervado, así como un EDL se tiñeron con anticuerpo secundario solamente.
- Incubar los músculos con anticuerpos secundarios marcados con fluorescencia apropiados para detectar los neurofilamentos y sinaptotagmina-2 por 1 día. Lavar los músculos tres veces con PBS 1x y 10 minutos cada vez. Nota: Este paso puede llevarse a cabo en conjunto con el paso 3,10. Omitir este paso si el uso de ratones que expresan proteínas de fluorescencia en los axones periféricos.
- Para visualizar el postsyregión Naptic de la NMJ, incubar músculos con 5 mg / ml Alexa-555 conjugado de alfa-bungarotoxina diluido en tampón de bloqueo durante al menos 2 hr. Lavar los músculos tres veces con PBS 1x y 10 minutos cada vez.
- Para montar músculos enteros en portaobjetos de vidrio cargados positivamente, colocar el músculo directamente en la diapositiva, añadir unas gotas de glicerina basado en la diapositiva medio de montaje y cubrir con un cubreobjetos. Pulse el cubreobjetos contra la corredera para aplanar el músculo. Empapa del medio de montaje desde el perímetro de la diapositiva y cubreobjetos utilizando toallitas de laboratorio. Aplicar esmalte de uñas para sellar los bordes entre el cubreobjetos y portaobjetos.
4. Análisis de los datos de imagen y
- Para analizar la estructura de NMJs, la imagen del músculo EDL utilizando un microscopio láser confocal de barrido equipado para excitar a 488, 555 y 633 nm de luz y capturar la luz emitida con 20X y 40X.
- Para visualizar NMJs conjunto, crear imágenes de proyección de intensidad máxima de seg ópticaciones espaciadas 1 a 2 micras se extiende aparte de los más bajos a regiones más altas visibles de la UNM. Crear proyecciones de máxima intensidad utilizando software de imagen disponible en el mercado.
- Para determinar las tasas de reinervación, clasificar NMJs como: 1) completamente denervado = sitio postsináptica está completamente desprovisto de contacto con axón, a menos de 5% colocalización entre el axón y AChR. 2) parcialmente inervado = el axón se solapa parcialmente el postsynapse, 5-95% colocalización entre el axón y AChR. 3) inervación completa = casi perfecta aposición entre el pre y post-sinapsis, más de un 95% colocalización entre el axón y AChR. Excluir NMJs que se encuentran perpendiculares al plano de la imagen o no se visualizan totalmente en la imagen. Nota: En todos estos experimentos, al menos 3 animales y 50 NMJs por animal fueron examinados. Los resultados se consideraron significativos utilizando un test t de Student con un valor de p menor de 0,05.
- Para cegar el operador, los individuos pueden realizar por separadola cirugía y análisis de imágenes. Sin el conocimiento de los grupos de tratamiento, el analizador puede ser objetivo con NMJ de puntuación. Alternativamente, las imágenes pueden ser asignados al azar y se presentan al operador para el análisis sin el conocimiento del animal fuente.
5. PCR cuantitativa
- Sacrificar los animales, utilizando isoflurano y dislocación cervical. Retire la piel y fascia superficial que cubre músculos de la pierna según la etapa 3.3. Diseccionar músculos EDL según la etapa 3.4 tibial anterior y.
- Flash congelar todo el tibial anterior y los músculos EDL en un tubo de 1,5 ml de nitrógeno líquido. Extraer tejido del tubo y colocar en un mortero previamente enfriado parcialmente sumergido en nitrógeno líquido. Moler músculo congelado en un polvo fino usando un mortero y mano de mortero.
- Disuelva el polvo músculo congelado en un reactivo de extracción de ARN comercialmente disponible y realizar la extracción de ARN y la extracción de ADN genómico con un kit disponible comercialmente de acuerdo con i del fabricanterecauciones.
- Realizar la transcripción inversa con una mezcla de transcriptasa inversa disponible en el mercado de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Realizar qPCR utilizando un kit disponible comercialmente usando genes de limpieza adecuados (véase el cuadro de materiales). Use un termociclador de PCR cuantitativa disponible en el mercado para llevar a cabo la PCR (véase la tabla de materiales).
- Ajuste la temperatura de recocido a 58 ° C. Ajustar parámetros de los ciclos adicionales en las especificaciones del fabricante de la mezcla verde taq polimerasa / SYBR. Incluir un paso final curva de fusión en el programa de termociclador que consiste en 0,5 ° C aumentos incrementales de 65 ° C a 95 ° C para probar la especificidad del cebador y el cebador formación de dímeros.
- Determinar los niveles de expresión del ARNm de la 2 - método ΔΔCT 21 usando ARN 18S como gen de control.
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Representative Results
El nervio peroneo común, también llamado nervio peroneo común, surge del nervio ciático por encima de la fosa poplítea, donde se hace pivotar alrededor de la cabeza del peroné a la cara anterior de la pierna (Figura 1A). No se ramifica en los nervios peroneo superficial y profunda, junto suministro de los flexores dorsales del pie y los dedos (tibial anterior, extensor largo de los dedos y corto, y halluces músculos extensores largo del dedo gordo), y los everters del pie (músculos peroneos). Este nervio también lleva fibras sensoriales que se proyectan hacia el dorso del pie y la cara lateral de la mitad inferior de la pierna. Es una estructura relativamente delgada compuesta de motor y los axones sensoriales. Esta rama del nervio sigue un curso predecible anatómica. Lateral a la rodilla, el nervio es principalmente superficial ya que se ejecuta sobre el tendón de la cabeza lateral del músculo gastrocnemio (Figura 1 y Figura 2). Thes la ubicación sirve como un punto de referencia estable que se puede llegar fácilmente con una pequeña incisión, lo que limita el daño a la piel y la fascia (Figura 1A). El diámetro más pequeño de este nervio, en comparación con el nervios ciático y tibial, hace que sea posible para aplastar todos los axones usando menos fuerza, lo que reduce la probabilidad de cortar completamente los axones más superficiales.
Los ratones que expresan la proteína fluorescente amarilla (YFP) sólo en las neuronas 17 se utilizaron para optimizar el procedimiento de aplastamiento en el nervio peroneo común y sin ambigüedades visualizar regeneración de los axones. El nervio se aplastó en el borde del tendón gastrocnemio más proximal de los músculos objetivo porque este sitio es más accesible desde la ubicación de la incisión. Este sitio también sirve como un punto de referencia anatómica fiable, por lo que es posible la comparación de regeneración de NMJs entre animales de la misma edad y sexo. La compresión del nervio durante 5 segundos usando unas pinzas finas resULTS en la desaparición de YFP desde el sitio de la lesión (Figura 2B). Sin embargo, el tejido conectivo y las células que residen en el epineurio permanecen contiguos, que sirve como un conducto para la regeneración rápida y precisa de los axones a sus objetivos originales (Figura 2B). En ratones hembra de 70 días de edad, esta lesión es suficiente para causar la degeneración de todos los segmentos axonales distales del soma neuronal (Figura 4B).
Para determinar la fiabilidad y reproducibilidad de este método lesión, se examinó la reinervación del músculo extensor largo de los dedos (EDL). Este músculo se eligió por varias razones: 1) Es proximal todavía separados físicamente de los sitios de lesión de incisión y de los nervios (Figura 3A). Por lo tanto, el músculo solamente se altera por la degeneración de los axones que inervan cortadas. Su proximidad al sitio de aplastamiento minimiza el tiempo necesario para que se reinervado y atroph musculary. 2) Se compone principalmente de tipo rápido fibras del músculo esquelético, que son más susceptibles al envejecimiento y las enfermedades. 3) Sus NMJs sufren cambios estructurales significativos durante la progresión de las enfermedades y el envejecimiento que puede ser atenuada por el ejercicio y la restricción calórica. 4) Es de fácil acceso para imágenes en vivo y manipulación molecular (Figura 3D). 5) Se puede separar fácilmente en sus cuatro componentes de las falanges que puede ser-todo ello montado por lo que es posible completamente imagen todos sus axones que inervan y sus conexiones utilizando microscopía de luz (Figura 3B).
Reinervación de los sitios postsinápticos previamente abandonada después de aplastamiento del nervio peroneo de la pierna derecha se evaluó en tres 70 días de edad ratones femeninos que expresan YFP en los axones motores. sitios postsinápticos se visualizaron utilizando etiquetados fluorescentemente alfa-bungarotoxina (BTX), que se une selectivamente y con alta afinidad a los músculos nAChoras. Los músculos se considerará que se denervado, parcial o totalmente reinervado siguiendo estos criterios: 1) En las fibras musculares sin nervios, los axones motores estaban completamente ausentes en los sitios postsinápticos y menos del 5% de colocalización entre el axón y se observó AChR. 2) las fibras musculares inervadas parcialmente fueron clasificados por algunos, pero la aposición incompleta de axones motores con los sitios postsinápticos y 5-95% colocalización entre el axón y se observó AChR. 3) en las fibras musculares inervadas completamente, no había casi perfecta aposición entre las terminaciones nerviosas motoras y sitios postsinápticos y mayor que 95% colocalización entre el axón y se observó AChR. NMJs individuales fueron excluidas de los recuentos de si sus placas terminales ponen perpendicular al plano de la imagen o toda la NMJ no se visualizó. Utilizando estos criterios, se observó una elevada concordancia en la velocidad y el grado de reinervación entre todos los ratones examinados. A los 4 días post-aplastamiento, los músculos se encontraron completamente denervado en todos los animales examinada (Figura 4B). Este hallazgo muestra que aplastar el nervio peroneo común durante 5 segundos, como se describió anteriormente, es suficiente para cortar todos los axones. A los 7 días post-aplastamiento, las terminaciones nerviosas estaban en el proceso de volver a ocupar previamente desocupadas sitios postsinápticos (Figura 4C, 4E-F). Sin embargo, la mayoría de las fibras musculares fueron todavía se encuentran sólo parcialmente inervados. Con días adicionales post-aplastamiento, continuaron las terminaciones nerviosas de diferenciarse en los sitios presinápticos y NMJs fueron encontrados totalmente reinervados por 12 días (Figura 4D, 4E-F). Es importante destacar que hubo poca variabilidad entre los ratones denervado para el mismo período de tiempo (Figura 4E-F), lo que demuestra que la trituración del nervio peroneo se puede utilizar como un ensayo para comparar la reinervación de los músculos entre animales de la misma edad y sexo.
La capacidad de comparar fielmente NMJs de regeneración entre los animales ofrece oportunidadespara comprender las características celulares asociados con cada paso necesario para reparar plenamente esta sinapsis. Para examinar la arquitectura de NMJs denervado y regeneradoras de la 70 días de edad ratones utilizados anteriormente para la comparación de las tasas de reinervación, se obtuvieron imágenes de alta resolución de microscopía confocal de NMJs. Como era de esperar, este análisis reveló una serie de cambios que se producen en α-motor terminaciones axón del nervio, ya que reinervar fibras musculares (Figura 4G-I). Conos de crecimiento axonal parecen expandirse y comenzar a expandirse a medida que ponerse en contacto con los sitios postsinápticos (Figura 4G). Estas ramas axonales luego crecen sobre regiones específicas del postsynapse, culminando en el corto yuxtaposición completa del nervio axón termina en el sitio postsináptica (Figura 4H-I). características estructurales adicionales en la regeneración de las terminaciones nerviosas altamente motor que se asemejan a los encontrados durante el desarrollo se observaron, incluyendo múltiples axones que compiten por el sAME diana (Figura 4H), culminando en un solo axón que inervan una fibra muscular a los 12 días post-aplastamiento. Además, ramas axonales que se extienden más allá de los sitios postsinápticos, se hace referencia en el presente documento como coles, en todas las etapas se observaron después de la lesión (Figura 4E). Estos brotes fueron altamente prevalente, incluso en NMJs totalmente inervados lo que sugiere que la fase final de la reparación axonal implica la retracción de las ramas axonales extrajunctional. A pesar de estos cambios evidentes en las terminaciones nerviosas, los sitios postsinápticos se mantuvieron en general indistinguibles en todas las etapas posteriores a la lesión en comparación con aquellos en los músculos no lesionados, incluyendo a los 4 días post-aplastamiento cuando las fibras musculares se encuentran completamente denervado. No había ninguna señal obvia de fragmentación o pérdida significativa y redistribución de regiones extra-sinápticos de AChR. Estos hallazgos indican fuertemente que el método fibular aplastamiento del nervio se puede usar como un ensayo para identificar y probar intervenciones molecular, farmacológicos y de estilo de vida tsombrero de promover la reparación de las terminaciones nerviosas en las sinapsis, incluida la NMJ.
A pesar de los avances recientes, se ha avanzado muy poco en la identificación de factores derivadas de músculo necesarias y suficientes para mantener y reparar la UNM. Por ello, pregunta si el método lesión nervio peroneo común se puede utilizar para identificar moléculas alteradas en etapas específicas del proceso de reinervación y con posibles funciones en la reparación de la UNM. Como prueba de principal, el análisis de la expresión de dos genes asociados a NMJ, la subunidad gamma CADH y la quinasa específica de músculo, se realizó MuSK 18. Como se ha demostrado con PCR cuantitativa, estos genes se incrementan después de la denervación y disminuyeron a medida que se NMJs reinervadas (Figura 5a-b). Estos genes están regulados por incremento a los 4 días post-aplastamiento, como se informó anteriormente usando los músculos completamente denervado 19. Como fibras musculares nervios reinervar, los niveles de estos genes disminuyen y rapiDLY volver a la línea de base. Entre los animales examinados, el patrón de expresión de ambos genes es casi idéntica, lo que demuestra una estrecha correlación entre los cambios moleculares y celulares en NMJs regeneración. Por lo tanto, este método ofrece oportunidades únicas para identificar los cambios moleculares asociados a las diferentes etapas de la regeneración NMJ.
Figura 1: Común. Peroné Anatomía del nervio (A) Esquema que detalla el trayecto del nervio ciático y sus ramas terminales en relación con los puntos de referencia superficiales y óseas. SCN = nervio ciático, nervio tibial = TN, SRN = nervio sural, nervio peroneo común PCN =, nervio peroneo superficial = SPN, nervio peroneo profundo DPN =. El sitio de la incisión deseada se indica. (B) Esquema de ubicación nervio peroneo común en relación con los músculos que rodean al quitarles la piel.sitio de la incisión relativa se muestra superpuesta a la fascia de revestimiento. TA = tibial anterior del músculo EDL = músculo extensor de los dedos Longo. (C) ciático expuesto y nervio peroneo común. CPN cruza sobre el tendón del músculo gastrocnemio (Gn) a nivel de la rodilla. Sitio de aplastamiento en relación con el tendón se muestra. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Común. Peroné cirugía de los nervios de aplastamiento (A) La incisión inicial necesita ser solamente unos pocos cm de longitud. Después de penetrar a través de la piel y la fascia superficial, la incisión debe ser continuado a través de la inversión de la fascia profunda / que se extiende entre los músculos bíceps femoral y de asistencia técnica. (A1) El nervio peroneo común se visualiza fácilmente sin microscopía de tediante la incisión (Gn = músculo gastrocnemio). (A2) La intersección del nervio y gastrocnemio tendón peroneo común puede ser visualizado fácilmente si se ensancha (necesarios sólo para fines fotográficos) de la incisión. La aglomeración se debe colocar en la posición marcada por la línea roja perpendicular al nervio y paralelo al tendón Gn. (B) El PCN es aún más fácilmente visualizado con ratones transgénicos YFP bajo un microscopio de disección fluorescente. (B1) El nervio pierde fluorescencia en el sitio de aplastamiento, lo que permite la confirmación de una lesión por aplastamiento completo. (B2) Una manga llena PCN todavía se puede visualizar con la iluminación del ojo y la sala desnuda. El nervio se convertirá translúcido. Esta imagen pone de relieve el hecho de que el epineuro y la superestructura del PCN permanecen intactos mientras se limita al mismo tiempo el daño a los tejidos y los vasos sanguíneos cercanos.Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3:. Anatomía del músculo extensor digitorum longus (EDL) (A) 3 imagen tridimensional de la EDL en relación con los huesos de la extremidad posterior del ratón. Generada usando JAtlasView (B) parcialmente diseccionado músculo EDL separó en sus cuatro divisiones de las falanges y marcar los dígitos controlados por cada división. (C) YFP etiquetados rama del nervio peroneo profundo, ya que inerva la banda de la placa final de la división EDL controlar el segundo dígito. (D) ramas axonales y sus sitios de contacto pueden identificarse fácilmente, lo que permite un examen constante de NMJs seleccionados. Haga clic aquí para ver una versión más grande of esta figura.
Figura 4: tasas similares de reinervación entre animales de la misma edad y sexo Análisis de NMJs en el músculo EDL después de aplastamiento del nervio peroneo.. Sitios (A) post-sinápticos están completamente ocupados por los axones en ratones no lesionados. (B) A los 4 días post-aplastamiento, los músculos se encuentran completamente denervado. (C) Los axones comienzan a reinervar músculos 7 días post-aplastamiento y (D) volver a ocupar por completo los sitios postsinápticos por 12 días. (E - F) La tasa de NMJ volver a ser ocupada es casi indistinguible entre los animales Denervado para el mismo período de tiempo. (G - I) Imágenes representativas de re-diferenciación de las terminaciones nerviosas axonales en sitios presinápticos madurado. Reocupación de sitios postsinápticos sigue unapatrón predecible, comenzando con el cono de crecimiento en desarrollo ramas que ocupan finalmente completamente sitios postsinápticos sin extender más allá de la NMJ region.Similar al desarrollo, sitios postsinápticos están inervados inicialmente por re-crecimiento múltiples axones pero sólo un axón permanece una vez que la NMJ ha regenerado completamente. (H) Los ejemplos de brotes axonales exuberantes, inervación parcial sin plena coincidencia entre pre y post-sinápticas aparatos, y la inervación de múltiples axones indicados. Se examinaron 70 ratones hembras de un día; Barra de escala = 50 micras (AD), 20 micras (GI). barra de error = SEM. N = 3 ratones. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: El nervio peroneo Crush Método comon Ensayo para identificar genes candidatos involucrados en la reparación de la UNM (A - B). El nivel de ARNm de dos genes asociados a NMJ, la subunidad gamma AChR y almizcle, se alteran de manera similar en el músculo TA de los ratones denervado para el mismo período de tiempo . Con el aumento después de la lesión del nervio tiempo, los niveles de ambas transcripciones disminuyen, volviendo a la línea de base, lo que corrobora el análisis histológico que muestra la reinervación progresiva de NMJs. Cada línea representa un ratón individual. Barra de error = error estándar de la media de repeticiones técnica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El método presentado en este manuscrito ofrece oportunidades únicas para identificar los mecanismos implicados en la reparación de las uniones neuromusculares (NMJ). Este método implica la trituración el nervio peroneo común a medida que pasa sobre el tendón gastrocnemio cerca de la rodilla. Se demuestra que después de sólo 5 segundos de compresión de los nervios con una pinza, una degeneración completa se observó por 4 días después de la lesión. En los ratones adultos jóvenes, los axones alfa-motoras comienzan a reinervar sitios sinápticos anteriores en el músculo extensor largo de los dedos (EDL) a los 7 días después de la lesión, que culminó con la reforma de los sitios presinápticos que son indistinguibles de los de los ratones no lesionada por 12 días. Además, se demuestra que los niveles de moléculas asociadas selectas-NMJ estrechamente correlacionados con el estado de la inervación de la UNM. Es importante destacar que estos cambios celulares y moleculares son altamente reproducible entre animales de la misma edad y sexo (Figura 5a-b), proporcionando oportunidades para identificar y TESfactores de T que actúan para reparar la NMJ. En términos de los procedimientos quirúrgicos, la rama del nervio peroneo común es muy accesible a medida que pasa sobre el tendón gastrocnemio, requiriendo sólo una pequeña incisión que ocasiona poco daño a los músculos que rodean y la vasculatura.
Hay un número de ventajas de usar el nervio peroneo común para examinar los cambios celulares y moleculares asociados con NMJs regeneración. El tendón gastrocnemio sirve como un punto de referencia anatómica estable para dañar constantemente el nervio peroneo común en el mismo lugar y la distancia de músculos en cuestión. Esto hace que sea posible comparar de forma fiable la velocidad de regeneración de los axones y la reinervación de los músculos entre animales de la misma edad y sexo. Los pasos críticos para tal éxito incluyen asegurarse de que el sitio de la lesión es coherente entre cirugías, aplastamiento del nervio completo se obtiene en cada animal, y un daño mínimo se mantiene a las estructuras circundantes. Entre los músculos inervados por el común nervio peroneal, tibial anterior (TA) y los músculos extensor largo de los dedos (EDL) son excelentes objetivos para evaluar la reparación NMJ. Estos dos músculos están compuestos principalmente de fibras musculares rápidas tipo que se ven gravemente afectados por lesiones, enfermedades y envejecimiento 5. Para el análisis NMJ, el músculo EDL es particularmente atractivo porque puede ser-todo ello montado a la imagen todos los NMJs sin distorsiones. También hace que sea posible para correlacionar alteraciones en NMJs con los cambios en otras partes de las fibras musculares, los axones motores y las células circundantes.
Los músculos EDL TA y se han utilizado ampliamente para evaluar el impacto de diferentes intervenciones moleculares y de estilo de vida en el músculo y la reparación NMJ debido a su localización anatómica 20. Sin embargo, la denervación largo plazo altera la expresión de los genes con función crítica en atrofia fibras musculares, las células inmunes activadas y células satélite 12-14, lo que hace más difícil evaluar ch celular y molecularanges necesaria para promover específicamente la regeneración de NMJs. En el método descrito aquí el nervio peroneo es aplastado en las proximidades de los músculos TA y EDL, permitiendo que el nervio para llegar a ellos dentro de los 7 días posteriores a aplastar en ratones adultos jóvenes. Por lo tanto, este método debe minimizar la pérdida de masa muscular y cambios moleculares asociados con la atrofia fibras musculares en los músculos TA y EDL.
El protocolo de aplastamiento del nervio peroneo se puede modificar de múltiples maneras distintas. lesión del nervio de corte puede ser fácilmente sustituido por aplastamiento, lo que permite un mejor tiempo real de imágenes in vivo de la regeneración del nervio periférico. Un corte elimina material axón muertos como un obstáculo para la regeneración y asegura daños homogénea de cada axón dentro del tubo endoneurial.
Cuando se realiza correctamente el aplastamiento del nervio peroneo tiene pocas complicaciones asociadas. Un problema que se podría encontrar es el fracaso del nervio a reinervar objetivos NMJ originales. Esto puede ser causado por el CACidental cortó la lesión del nervio durante la cirugía. Asegúrese de revisar las pinzas de punta fina de trituración para los bordes afilados. Si en cualquier momento durante la cirugía de la calidad de un aplastamiento del nervio es cuestionable, la incisión original se puede ampliar para visualizar mejor el nervio. Mientras que esto aumenta el tamaño de la herida y puede dañar las estructuras adicionales, puede ayudar a identificar correctamente el nervio peroneo y evaluar si es o no se logró un aplastamiento completo.
La técnica descrita aquí sí posee algunas limitaciones. En primer lugar, es útil principalmente en ratones adultos como las estructuras en estos animales son lo suficientemente grandes para manipular. Recién Nacido y ratones adolescentes son mucho más pequeños, aumentando significativamente la dificultad de la cirugía. En segundo lugar, el nervio peroneo contiene los axones sensoriales y motores, lo que resulta en la denervación de los tejidos diana que pueden afectar las tasas de regeneración NMJ.
El NMJ es reconocido como un sitio focal de la patología en amiotrófica latLa esclerosis ral (ELA) y el envejecimiento. También tiene que ser reparado después de la lesión a los nervios periféricos para evitar comprometer las habilidades motoras y la pérdida de masa muscular. El método de aplastamiento del nervio peroneo debe ayudar en la identificación y prueba de moléculas con funciones importantes en la reparación de la UNM. En un método, este método se podría utilizar para el perfil mRNA y microRNA con papeles clave en diferentes etapas de NMJ regeneración utilizando análisis de la secuencia de ARN. También se puede aplicar para determinar selectivamente la función de los genes candidatos introducidos y eliminados de los músculos. Además, este método se presta bien a prueba la capacidad de las moléculas exógenas para acelerar nervio y NMJ regeneración utilizando imágenes estáticas y en vivo.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine | VetOne | 501072 | |
| Xylazine | Lloyd Inc. | 003437 | |
| Buprenorphine | Zoopharm | 1Z-73000-150910 | |
| Nair | Nair | ||
| Kim-wipes | Kimtech | 34155 | |
| Electric Razor | Braintree Scientific | CLP-64800 | |
| 80% EtOH/H20 | |||
| 10% Proviodine | |||
| 1 ml Insulin Syringe | |||
| Spring Scissors | Vannas | 91500-09 | |
| No. 15 scalpel | Braintree Scientific | SSS 15 | |
| #5 Forceps | Dumont | 11252-00 | |
| 6-0 silk suture on reverse cutting needle | Suture Express | 752B | |
| Rodent Heating Pad | Braintree Scientific | AP-R-18.5 | |
| Alexa 555 conjugated alpha-BTX | Molecular Probes | B35451 | |
| Vectashield | Vector Labs | H-1000 | |
| Olympus Stereo Zoom Microscope | Olympus | 562037192 | |
| Zeiss 700 Confocal Microscope | Zeiss | ||
| Variable-flow peristaltic perfusion pump | Fisher Scientific | 13-876-3 | |
| Aurum Total RNA Mini Kit | Bio-Rad | 7326820 | |
| Bio-Rad iScript RT Supermix | Bio-Rad | 1708840 | |
| SsoFast Evagreen Supermix | Bio-Rad | 1725200 | |
| Bio-Rad CFX96 | Bio-Rad | 1855196 | |
| Puralube Vet ointment | Puralube | 1621 | |
| Synaptotagmin-2 antibody | Antibodies-Online | ABIN401605 | |
| Neurofilament antibody | Antibodies-Online | ABIN2475842 |
References
- Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Induction, assembly, maturation and maintenance of a postsynaptic apparatus. Nat. Rev. Neurosci. 2 (11), 791-805 (2001).
- Moloney, E. B., de Winter, F., Verhaagen, J. ALS as a distal axonopathy: molecular mechanisms affecting neuromuscular junction stability in the presymptomatic stages of the disease. Front. Neurosci. 8, 252 (2014).
- Apel, P. J., Alton, T., et al. How age impairs the response of the neuromuscular junction to nerve transection and repair: An experimental study in rats. J Orthop Res. 27 (3), 385-393 (2009).
- Balice-Gordon, R. J. Age-related changes in neuromuscular innervation. Muscle Nerve Suppl. 5, S83-S87 (1997).
- Valdez, G., Tapia, J. C., Lichtman, J. W., Fox, M. A., Sanes, J. R. Shared resistance to aging and ALS in neuromuscular junctions of specific muscles. PloS one. 7 (4), e34640 (2012).
- Nguyen, Q. T., Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Pre-existing pathways promote precise projection patterns. Nat. Neurosci. 5 (9), 861-867 (2002).
- Küry, P., Stoll, G., Müller, H. W. Molecular mechanisms of cellular interactions in peripheral nerve regeneration. Curr Opin Neurol. 14 (5), 635-639 (2001).
- Gaudet, A. D., Popovich, P. G., Ramer, M. S. Wallerian degeneration: gaining perspective on inflammatory events after peripheral nerve injury. J Neuroinflammation. 8, 110 (2011).
- Chen, P., Piao, X., Bonaldo, P. Role of macrophages in Wallerian degeneration and axonal regeneration after peripheral nerve injury. Acta Neuropathol. 130 (5), 605-618 (2015).
- Chen, Z. -L., Yu, W. -M., Strickland, S. Peripheral regeneration. Annu Rev Neurosci. 30, 209-233 (2007).
- Darabid, H., Perez-Gonzalez, A. P., Robitaille, R. Neuromuscular synaptogenesis: coordinating partners with multiple functions. Nat. Rev. Neurosci. 15 (11), 703-718 (2014).
- Geuna, S. The sciatic nerve injury model in pre-clinical research. J. Neurosci. Methods. 243, 39-46 (2015).
- Batt, J. A. E., Bain, J. R. Tibial nerve transection - a standardized model for denervation-induced skeletal muscle atrophy in mice. J. Vis. Exp. (81), e50657 (2013).
- Savastano, L. E., Laurito, S. R., Fitt, M. R., Rasmussen, J. A., Gonzalez Polo, V., Patterson, S. I. Sciatic nerve injury: a simple and subtle model for investigating many aspects of nervous system damage and recovery. J. Neurosci. Methods. 227, 166-180 (2014).
- Kang, H., Lichtman, J. W. Motor axon regeneration and muscle reinnervation in young adult and aged animals. J Neurosci. 33 (50), 19480-19491 (2013).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J. Vis. Exp. (65), e3564 (2012).
- Feng, G., Mellor, R. H., et al. Imaging Neuronal Subsets in Transgenic Mice Expressing Multiple Spectral Variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).
- Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Development of the vertebrate neuromuscular junction. Annu Rev Neurosci. 22, 389-442 (1999).
- Bowen, D. C., Park, J. S., et al. Localization and regulation of MuSK at the neuromuscular junction. Dev Biol. 199 (2), 309-319 (1998).
- Gay, S., Jublanc, E., Bonnieu, A., Bacou, F. Myostatin deficiency is associated with an increase in number of total axons and motor axons innervating mouse tibialis anterior muscle. Muscle Nerve. 45 (5), 698-704 (2012).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), San Diego, Calif. 402-408 (2001).
