腓神经损伤方法：可靠检测，以确定和测试因素修复神经肌肉接头

Abstract

神经肌肉接头（NMJ）发生有害的结构和功能改变的衰老，伤害和疾病的结果。因此，必须了解涉及维护和修理NMJs的细胞和分子变化。为了这个目的，我们已开发了一种方法，以可靠地和始终如一地检查小鼠再生NMJs。这种神经损伤的方法包括，因为它经过了膝盖附近的腓肠肌肌腱外侧头粉碎腓总神经。用70天的雌性小鼠，我们证明了运动神经元轴突开始于7天粉碎后reinnervate以前的突触后目标。他们12日后完全再用他们以前的突触领域。为了确定这种损伤方法的可靠性，我们比较个人70天岁的雌性小鼠神经支配之间的比率。我们发现，神经再支配突触后的网站数量是老鼠相似的7,9，和12天粉碎后。以确定是否这种损伤测定也可用于分子变化在肌肉比较，我们检查了肌肉烟碱样受体（γ-乙酰胆碱受体）和肌肉特异性激酶（麝香）的伽玛亚基水平。伽玛乙酰胆碱受体亚单位和麝香高度上调下面去神经，并返回到以下NMJs的神经支配恢复正常水平。我们发现这些基因和肌肉神经支配的地位转录水平有密切的关系。我们认为，这种方法将加速我们的参与修复的NMJ和其它突触的细胞和分子变化的理解。

Protocol

所有实验均在由弗吉尼亚理工大学机构动物护理和使用委员会批准NIH的指导方针和动物的协议进行的。

1.准备动物外科手术

1. 麻醉小鼠用氯胺酮（90毫克/公斤），并通过皮下注射腹股沟注射甲苯噻嗪（10毫克/千克）的用无菌1毫升胰岛素注射器的混合物中。载体溶液含有0.9％的盐水，17.4毫克/毫升氯胺酮，和2.6毫克/毫升甲苯噻嗪的混合物。将动物放回笼子在等待的药物才能生效。
   注意：如果该负荷剂量不会对过程的持续时间提供了足够的麻醉，负荷剂量的额外的25％可以被注入。
2. 监控动物注射后，检查呼吸平稳率和觉醒水平适当的抑郁症。请与一个后足捏，这应该引起无反应时，充分麻醉唤醒水平。
   注：这通常需要3-5分对于一个年轻的成年小鼠平均25至30g。如果动物仍10分钟后注射后响应，麻醉负荷剂量的额外的25％可以被注入。
3. 应用凡士林和轻矿物油眼药膏的动物的眼睛，以防止干燥。在干净，平坦的表面上取下笼和地方的动物。剃从足所需的后肢使用的电动毛发修剪器骨盆，只露出肢的外侧面。
4. 应用化学毛发去除的剃光部位1分钟。使用手动实验室抹布去除毛。干净，实验室面积脱毛浸抹在乙醇中。

2.手术过程

1. 通过消毒高压灭菌器或其他适当的方法手术器械。清洁外科手术部位和手术板用80％的乙醇/ H ₂ O。消毒手术部位与proviodine。放置在手术板上的鼠标和肢体约束对齐。保持与膝关节解剖学自然位置目标后肢稍微延伸而不内部或外部的转动。
2. 将动物和板手术显微镜下。东方通过肤浅的标志性建筑，特别是骨性膝关节和胫骨前肌和腓肠肌之间的山脊触诊适当的切口部位。
3. 使通过皮肤使用解剖刀或弹簧剪刀，而使用一般的镊子用于夹持一个大约3厘米的切口。使切口在垂直于共同腓骨神经的基本过程。
4. 通过浅筋膜继续切口，暴露股二头肌和股外侧肌肉。通过连接深筋膜切割分开这些肌肉。 1-2厘米的切口就足够了。
5. 缩回二头肌尾部采用机械拉钩，揭示了腓总神经肌肉股四头肌。
6. 近端跟踪神经，直到它的内部与腓肠肌外侧头的腱部分被找到。注意：曝光可能需要缩回皮肤和肌肉的额外的操作。该交点被用作神经损伤的稳定的地标。
7. 抓住神经用细镊子，对准以并行的方式提示腓肠肌肌腱外侧缘。通过施加持续的，硬压5秒粉碎常见的腓骨神经。
8. 通过手术范围证实通过目测的神经完全粉碎。它将在损伤部位出现半透明的。如果使用的是表达在轴突末梢荧光蛋白的小鼠，荧光就会消失，从受伤的部位。
9. 除去拉钩并在他们的解剖位置重新调整肌肉。关闭切口部位用6-0丝线缝合。 1-3简单间断缝合就足够了。放在一个干净的笼子里加热垫鼠标休养。
10. 监控所有的动物2小时后戏重刑检查呼吸和麻醉任何不良反应。经由皮下腹股沟注射给药的丁丙诺啡0.05-0.10毫克/千克的初始剂量立即从手术恢复以下。给另外3个剂量，每12小时在接下来的48小时。完全恢复后，返回小鼠动物护理设施。

3.隔离和伸肌染色趾长肌（EDL）肌肉

1. 使用异氟醚牺牲动物。分配0.5毫升液体异氟烷到50毫升管中填充有吸收性labwipes。放置不封顶管在一个密封2500厘米³室中的动物。曝光中的至少4分钟就足够了。测试双边眼睑，脚趾捏，和尾掐反射的损失，以确保每个动物灌注继续之前不省人事。
2. Transcardially第一用10ml 0.1M的PBS灌注¹⁶动物，则25毫升4-％多聚甲醛的0.1M PBS（pH 7.4）中。肝素（30单位/ 20克动物体重）可以与PBS被加入（10单位/ ml），以防止血液凝固的小毛细血管床，改进灌注的结果。
3. 通过使用剪刀通过腹部周围的周长皮肤横向切割除去覆盖后肢皮肤。过去的后肢和脚使用镊子剥离下来的皮肤。
4. 抓住并用钳子取出剥皮后肢浅筋膜。如果使用荧光表达蛋白的轴突末梢小鼠，一夜之间在4％PFA 50毫升管后修复整个小鼠。用PBS冲洗三次。
   注：固定的小鼠可在4℃储存于PBS中。如果没有，请跳过此步骤并继续执行步骤无3.6定影后的动物。
5. 从解剖小鼠后肢肌肉EDL ^18，是一定要保持近端和远端肌腱作为完整越好。
6. 孵育在封闭缓冲液EDL肌肉（含有0.5％的Triton X-100，3％BSA和5％山羊血清1×PBS中）至少1小时。
7. 染色没有受伤EDL为完整的NMJ神经支配的阳性对照对侧。阴性对照应包括以4天损伤后，一时间点，其中NMJ是完全失神经获得的EDL，以及与只用二抗染色一个EDL。
8. 孵育肌肉用适当的荧光标记的第二抗体来检测神经丝和突触结合蛋白2 1天。洗肌肉用1×PBS清洗3次，每次10分钟。注意：此步骤可以与步骤3.10进行。如果使用的表达在轴突末梢荧光蛋白的小鼠跳过此步骤。
9. 以可视化的postsy所述NMJ的naptic区，孵化肌肉用5微克/毫升的Alexa-555缀合的α-银环蛇毒素在至少2小时的封闭缓冲液中稀释。洗肌肉用1×PBS清洗3次，每次10分钟。
10. 为安装在带正电荷的载玻片整个肌肉，直接放置在肌肉上滑动，添加基于安装在滑动介质甘油几滴并用盖玻片覆盖。按盖玻片对幻灯片拼合肌肉。从幻灯片和盖玻片使用实验室湿巾的周边浸泡过的安装介质。应用指甲油密封盖玻片和幻灯片之间的边缘。

4.成像和数据分析

1. 分析NMJs，图像使用装有激发488，555和633纳米的光，用20X和40X目标捕获所发射的光的共焦激光扫描显微镜的EDL肌肉的结构。
2. 为了形象化整个NMJs，创造光秒的最大强度投影图像系统蒸发散间隔1至2微米从最低NMJ来最高可见区域外扩展。创建使用市售的图像处理软件的最大强度的预测。
3. 为了确定神经再生率，分类NMJs为：1）完全失神经突触后=站点是完全没有轴突和乙酰胆碱受体之间有轴突的接触，不到5％的共定位。 2）部分支配=轴突部分重叠轴突和乙酰胆碱受体之间的postsynapse，5-95％的共定位。 3）全支配=前和后突触之间近乎完美的同位语，轴突和乙酰胆碱受体之间的大于95％的共定位。排除位于垂直于成像平面或没有在图象中完全显现NMJs。注：在所有这些实验中，进行了检查，至少3只动物和动物每50 NMJs。结果使用学生t检验具有小于0.05的P值视为显著。
4. 盲操作，独立的个体可以执行手术和图像分析。未经治疗组的知识，分析仪可与NMJ得分目标。可替代地，图像可以被随机化，并呈现给操作者用于分析没有源动物的知识。

5.定量PCR

1. 用牺牲异氟醚和颈椎脱位动物。去除皮肤和浅筋膜覆盖按照步骤3.3腿部肌肉。解剖前胫骨和根据步骤3.4 EDL肌肉。
2. 闪光灯冻结在1.5ml管上液氮整个胫骨前和EDL肌肉。在预冷的研钵在液氮部分淹没移除管和地方组织。冷冻研磨成肌肉用迫击炮和杵细粉。
3. 溶解冷冻肌肉粉末到市售的RNA提取试剂和根据制造商的我市售的试剂盒进行RNA提取和基因组DNA去除nstructions。
4. 利用根据制造商的说明可商购的逆转录酶混合进行逆转录。
5. 执行使用市售的试剂盒，使用适当的看家基因的qPCR（见材料表）。使用市售的定量PCR仪进行PCR（见材料表）。
6. 设置退火温度至58℃。调整附加循环参数到Taq聚合酶/ SYBR绿色混合物的制造商的规范。包括在由以0.5℃逐渐增加从65℃至95℃，以测试引物的特异性和引物二聚体形成的热循环仪程序最终熔解曲线的步骤。
7. 确定由2相对mRNA表达水平^-使用18S RNA作为对照基因^ΔΔCT方法^21。

Representative Results

共同腓骨神经，也称为腓总神经，从坐骨神经腘窝上面，在那里它摆动围绕腓骨头到腿部（ 图1A）的前方面就产生了。在那里，它分支到浅层和深层腓骨神经，同时供给的脚和脚趾的背伸（胫前肌，趾长伸肌和短，和伸halluces长肌的肌肉），而脚的everters（腓骨肌）。这种神经还携带投射到脚和腿的下半部的外侧面的背部感觉纤维。它是运动和感觉轴突构成的相对薄的结构。这种神经支遵循一个可预见的解剖课程。外侧到膝盖，神经主要是肤浅的，因为它运行在腓肠肌（ 图1和图2）的横向头肌腱。钍是位置作为能够与一个小切口很容易地到达，限制到皮肤和筋膜（ 图1A）损害稳定的地标。这种神经的较小直径，相对于坐骨神经和胫神经时，使得有可能使用更小的力，减少的完全切断的更浅的轴突的可能性粉碎所有轴突。

只表达在神经元¹⁷黄色荧光蛋白（YFP）小鼠用于优化在共用腓骨神经的粉碎过程和明确地显现再生轴突。神经在腓肠肌腱因为这个网站是从切口的位置更容易获得最接近目标肌肉的边缘粉碎。这个网站还用作可靠解剖标志，使得能够比较相同年龄和性别的动物之间NMJs的再生。用细镊子资源压缩神经，持续5秒ULTS在YFP从损伤部位（ 图2B）的消失。然而，结缔组织和居住在外膜细胞保持连续的，作为用于轴突到它们的原始目标（ 图2B）的快速和精确的再生的导管。 70日龄的雌性小鼠，这种损伤是足以引起来自神经元胞体（ 图4B）远侧所有轴突段的变性。

为了确定这种损伤方法的可靠性和可重复性，检测趾长伸肌（EDL）肌肉的神经支配恢复。这种肌肉被选为以下几个原因：1）这是近尚未从切口处和神经损伤部位（ 图3A）物理分离。因此，肌肉仅通过切断支配轴突变性改变。它靠近粉碎网站最大限度地减少需要它被再支配和肌肉萎缩性胃炎时年。 2）主要由快速型骨骼肌纤维，这是老化和疾病更容易的。 3）它的NMJs发生的疾病和衰老的进程，可以通过运动和热量限制衰减过程中显著的结构性变化。 4）它是实时成像和分子操纵（ 图3D）容易获得。 5）能够容易地分离成它的四个指骨组件，可以是整体式安装使得能够充分图象所有使用光学显微镜（ 图3B）其支配轴突和它们的连接的。

破碎右腿腓骨神经后腾空以前突触后站点神经再支配，在运动神经元轴突表达YFP 370天老雌性小鼠进行了评估。突触后位点用荧光标记的α-银环蛇毒素（BTX），其选择性结合并以高亲和力与肌肉NAC可视小时。肌当作去神经，部分或完全再支配下列标准：1）在去神经的肌肉纤维，运动轴突被完全从后突触位点缺失和轴突和观察乙酰胆碱受体之间小于5％的共定位。 2）部分神经支配的肌肉纤维是由一些，但运动神经元轴突的不完整的并置与轴突和观察到乙酰胆碱受体之间的突触后站点和5-95％的共定位分类。 3）在充分神经支配的肌肉纤维，有轴突和观察乙酰胆碱受体之间运动神经末梢和突触后的网站和大于95％的共定位之间几乎完美并置。个别NMJs从计数中排除，如果他们的端板垂直放置于成像平面或整个NMJ没有可视化。使用这些标准，检查了所有的小鼠中观察到的速率和再支配的程度高的一致性。在4天粉碎后，肌肉被发现失神经完全在所有动物中EXA开采（ 图4B）。这一发现表明，粉碎的共同腓骨神经，持续5秒，如上所述，足以切断所有轴突。 7天后粉碎，神经末梢均重新占领先前腾空后突触位点（ 图4C，4E-F）的过程。然而，大部分的肌肉纤维仍然发现只有部分支配。额外的天粉碎后，神经末梢继续分化成突触前部位和NMJs发现了12天（ 图4D，4E-F）完全神经支配。重要的是，有去神经为相同长度的时间（ 图4E-F）的小鼠中很小的变化，这表明破碎腓骨神经可被用作测定以比较相同年龄和性别的动物之间的肌肉的神经支配恢复。

动物间的比较忠实再生NMJs的能力提供了机会理解与全面修复此突触所需的每个步骤相关的细胞特征。审查从上述用于比较神经支配率70日龄小鼠去神经和再生NMJs的体系结构，得到NMJs高分辨率共焦显微镜图像。正如预期的那样，这种分析揭示了一些，因为他们reinnervate肌纤维（ 图4G-I）发生在α- ​​运动轴突神经末梢的变化。轴突生长锥出现扩大，并开始另辟蹊径，因为他们接触突触后的网站（ 图 4G）。这些轴突分支然后生长在特定区域的postsynapse的，与突触后的网站（ 图4H-Ⅰ）结束轴突神经的近完全并列高潮。在再生运动神经末梢非常类似于那些在开发过程中发现，观察，其中包括多个轴突为氏其他竞争结构特点AME目标（ 图4H），只有一个轴突支配最终以12天后，各个击破肌纤维。此外，超出突触后网站的轴突分支，此被称为豆芽，伤后观察（ 图4I）的所有阶段。这些豆芽都是非常普遍，即使是在完全支配NMJs表明轴突修复的最后阶段涉及extrajunctional轴突分支回缩。尽管在神经末梢这些明显的变化，突触后的网站相比，那些在没有受伤的肌肉，包括在后4天，粉碎时被发现的肌纤维失神经完全保持在各个阶段损伤后大多没有什么区别。有碎片或显著的损失和再分配到乙酰胆碱受体的超突触地区没有明显的迹象。这些结果强烈表明，腓骨神经挤压方法可以用作测定，以确定和测试分子，药理和生活方式干预吨帽子促进神经末梢修复突触，其中包括NMJ。

尽管最新进展，进展甚微已确定维护和修理所需的NMJ和足够的肌源性因素的。因此，我们提出，如果共同腓骨神经损伤的方法可以被用于识别在神经再生过程的特定阶段，并与修复NMJ潜在作用改变分子。作为主要，两个NMJ相关基因表达分析证明，乙酰胆碱受体的γ亚基和肌肉特异性激酶，麝香¹⁸进行。与定量PCR证实，这些基因增加以下去神经和减少作为NMJs被神经支配（ 图5a-b）中 。这些基因在4天粉碎后上调，因为以前使用完全失神经支配的肌肉^19日报道。作为神经reinnervate肌纤维，这些基因的水平降​​低和RAPIDLY回到基线。在检查动物，表达了两个基因的模式几乎是相同的，这表明在再生NMJs分子和细胞的变化密切相关。因此，这种方法提供了独特的机会，以确定与NMJ再生的不同阶段相关的分子变化。

图 1： 腓总神经解剖 （ 一 ）示意图详细介绍了坐骨神经的过程中，并在其相关终末支肤浅和骨性标志。 SCN =坐骨神经，TN =胫神经，SRN =腓肠神经，CPN =腓总神经，SPN =腓浅神经，DPN =深腓骨神经。所需的切口部位被指示。常见腓骨神经的位置（B）的图相对于周围的肌肉去除皮肤。相对切口部位显示覆投资筋膜。 TA =胫骨前肌EDL =趾长伸肌。 （C）裸露坐骨神经和腓总神经。驻地网跨越在膝盖的水平腓肠肌（GN）肌腱。粉碎网站相对于肌腱所示。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2：腓总神经损伤手术 （ 一 ）初始切口只需要在长几厘米。通过皮肤和浅筋膜渗透后，切口必须通过投资/深筋膜股二头肌和TA之间的肌肉躺在继续进行。 （A1）的腓总神经轻松无镜牛逼可视化hrough切口（GN =腓肠肌）。 （A2）的腓神经和肌腱腓肠肌的交集可如果切口扩大（只需要照相的目的）很容易显现。粉碎应在由红线标记的位置被放置在垂直于神经并平行于在Gn肌腱。 （B）的尼共与YFP的转基因小鼠在荧光解剖范围更容易地可视化。 （B1）的神经在挤压的部位失去荧光，允许一个完整的挤压伤的确认。 （B2）的完整CPN美眉仍然可以用肉眼和室内照明的可视化。神经会变得透亮。此图片突出了一个事实，即CPN的神经外膜和上层建筑保持不变的同时，限制到附近的组织和血管的损伤。请点击此处查看该图的放大版本。

图 3： 趾长伸肌（EDL）肌肉剖析 （A）相对于鼠标后肢骨骼的EDL的三维图像。使用JAtlasView（B）部分解剖EDL肌肉分为四个指骨部门和标记由每个部门控制的数字产生。 （C）YFP标记深腓神经的分支，因为它支配的EDL分裂调控第二位的端板带。 （D）轴突分支和他们的联系网站可以很容易识别，允许选择NMJs一致的审查。 请点击此处查看大版本OF该数字。

图4： 神经再支配率相似的EDL肌肉相同年龄和 NMJs的性别分析动物之间破碎腓骨神经后。 （A）突触后的网站完全由未受伤的小鼠轴突占领。 （B）在第4天粉碎后，肌肉得到完全发现失神经支配。 （C）轴突开始reinnervate肌肉后7天粉碎和（D）12日后完全再用突触后网站。 （E - F）NMJ再入住率几乎是没有区别的动物失神经支配的时间长度相同。 （G - I）再分化轴突神经末梢的代表图像转换成成熟的突触前部位。突触后的网站重新占领遵循可预测的模式，从生长锥发展分支，最终完全占据突触后网站没有超出NMJ region.Similar延伸到发展，突触后点最初由多个重轴突生长受神经支配，但只有一个轴突仍然一旦NMJ已经完全再生。 （H），而不会被显示多个轴突前和突触后装置和支配之间完全重叠旺盛轴突出芽，部分神经支配的例子。 70天岁的雌性小鼠进行了检查;比例尺=50μm的 （AD），20微米（GI）。错误吧= SEM。 N = 3只小鼠。 请点击此处查看该图的放大版本。

图5： 腓骨神经挤压方法作为ñ检测，以确定修复NMJ参与候选基因（A - B）两种NMJ相关基因，乙酰胆碱受体伽马亚基和麝香的mRNA水平，在小鼠TA肌肉也同样改变失神经支配的时间长度相同。随着时间的后神经损伤，这两种转录物的水平降低，恢复到基准线，证实了组织学分析显示NMJs渐进神经再支配。每行代表一个单独的鼠标。错误吧=技术重复的平均值的标准误差。 请点击此处查看该图的放大版本。

Discussion

在这个手稿提出的方法提供了鉴定参与修复神经肌肉接头（NMJ）机制的独特的机会。此方法涉及，因为它经过了膝盖附近的腓肠肌腱破碎的腓总神经。我们表明，只有5用镊子神经压迫秒钟后，完成变性的伤害后4天指出。在年轻的成年小鼠，α-运动神经元轴突开始以7天reinnervate在趾长伸肌（EDL）以前的突触部位损伤后，突触前部位是由12天那些未受伤的小鼠没有区别的改革高潮。此外，我们证明了选择NMJ相关分子水平的NMJ神经支配的地位密切相关。重要的是，这些细胞和分子变化是相同的性别和年龄（ 图5a-b）的动物之间的高度重现，提供机会，以确定和TESŧ因素采取措施，修复NMJ。在外科手术方面，腓总神经分支是非常方便的，因为它经过腓肠肌腱，只需要一小切口导致到周围的肌肉和血管损伤小。

有许多的使用公共腓骨神经检查与再生NMJs相关的细胞和分子变化的优点。腓肠肌腱用作稳定解剖标志始终如一伤害上从目标肌肉相同的位置和距离的共同腓骨神经。这使得能够可靠地比较轴突再生的肌肉的相同年龄和性别的动物之间的速率和再支配。这种成功的关键步骤包括确保损伤部位为手术之间是一致的，在每个动物得到充分神经挤压，和最小的伤害持续到周围结构。其中由C支配肌肉ommon腓骨神经，胫骨前（TA）和趾长伸肌（EDL）的肌肉是评估NMJ修理优良的目标。这两种肌肉主要由那些受到严重影响损伤，衰老和疾病的⁵速型肌纤维。对于NMJ分析中，EDL肌肉是特别有吸引力的，因为它可以是整体式安装到图像所有NMJs没有扭曲。这也使得有可能以NMJs与其他地方的肌纤维，运动轴突和周围的细胞的变化相关的变化。

在TA和EDL肌肉已被广泛用于评估肌肉和NMJ修复不同的分子和生活方式干预措施的影响，因为他们的解剖位置^20。然而，长期去神经改变基因的关键功能的表达在atrophying肌肉纤维，活化免疫细胞和卫星细胞^12-14，使之更难以评估细胞和分子通道安格斯专门促进NMJs的再生所需。在这里所描述的方法腓骨神经压在靠近TA和EDL肌肉，可让神经在年轻的成年小鼠于7天内达到这些目标，粉碎后。因此，这种方法应尽量减少肌肉质量并与在TA和EDL肌肉atrophying肌纤维相关的分子的变化的损失。

腓骨神经挤压协议可以在多个不同的时装进行修改。神经损伤切可以很容易地取代美眉，允许在周围神经再生的体内成像较好的实时性。经切割去除死皮轴突材料为再生障碍并确保神经内膜管内的每一个轴突的同质损坏。

当正确执行腓骨神经挤压几乎没有相关的并发症。可能会遇到的一个问题是神经未能reinnervate原始NMJ目标。这可以通过ACC引起idental在手术中切伤到神经。一定要检查的细尖镊子粉碎任何锋利的边缘。如果在手术过程中的任何点一个神经挤压的质量是有问题的，原切口可以加宽，以更好地可视化的神经。而这增加了伤口的尺寸，并能损害附加结构，它可以与正确识别腓骨神经和评估的完整挤压是否达到帮助。

此处所描述的技术不具有一些限制。首先，如在这些动物中的结构是大到足以操纵它主要是有用在成年小鼠。新生儿和青春期的老鼠要小得多，显著增加了手术的难度。第二，腓骨神经包含感觉和运动轴突，从而可能影响NMJ再生率靶组织的去神经。

在NMJ是公认的病理学肌萎缩性纬度的焦点网站全部擦除硬化症（ALS）和老化。它也有以下损伤周围神经，以避免损害运动技能，失去肌肉质量被修复。腓骨神经挤压方法应该在识别并与修复NMJ重要作用的分子测试帮助。在一种方法中，这种方法可用于分析mRNA和微小RNA与在使用RNA序列分析NMJ再生的不同阶段的关键角色。它也可以适用于有选择地确定引入并从肌肉中删除的候选基因的功能。此外，这种方法很适合于测试外源性分子的使用静态和实时成像以加快神经和NMJ再生的能力。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketamine	VetOne	501072
Xylazine	Lloyd Inc.	003437
Buprenorphine	Zoopharm	1Z-73000-150910
Nair	Nair
Kim-wipes	Kimtech	34155
Electric Razor	Braintree Scientific	CLP-64800
80% EtOH/H20
10% Proviodine
1 ml Insulin Syringe
Spring Scissors	Vannas	91500-09
No. 15 scalpel	Braintree Scientific	SSS 15
#5 Forceps	Dumont	11252-00
6-0 silk suture on reverse cutting needle	Suture Express	752B
Rodent Heating Pad	Braintree Scientific	AP-R-18.5
Alexa 555 conjugated alpha-BTX	Molecular Probes	B35451
Vectashield	Vector Labs	H-1000
Olympus Stereo Zoom Microscope	Olympus	562037192
Zeiss 700 Confocal Microscope	Zeiss
Variable-flow peristaltic perfusion pump	Fisher Scientific	13-876-3
Aurum Total RNA Mini Kit	Bio-Rad	7326820
Bio-Rad iScript RT Supermix	Bio-Rad	1708840
SsoFast Evagreen Supermix	Bio-Rad	1725200
Bio-Rad CFX96	Bio-Rad	1855196
Puralube Vet ointment	Puralube	1621
Synaptotagmin-2 antibody	Antibodies-Online	ABIN401605
Neurofilament antibody	Antibodies-Online	ABIN2475842