Abstract
Nevromuskulære krysset (NMJ) gjennomgår skadelige strukturelle og funksjonelle endringer som følge av aldring, skade og sykdom. Derfor er det viktig å forstå de cellulære og molekylære endringer som er involvert i å opprettholde og reparere NMJs. For dette formålet, har vi utviklet en metode for å pålitelig og konsekvent undersøke gjenoppfriske NMJs hos mus. Dette nerveskade metoden innebærer å knuse vanlige fibular nerve som det passerer over det laterale hodet på gastrocnemius muskelen sene nær kneet. Bruke 70 dag gamle hunnmus, viser vi at motoriske aksoner begynner å reinnervate tidligere postsynaptiske mål innen 7 dager etter knuse. De helt reoccupy sine tidligere synaptiske områder av 12 dager. For å bestemme påliteligheten av denne skaden metoden, vi sammenlignet reinnervation priser mellom enkelt 70 dager gamle hunnmus. Vi fant at antall reinnervated postsynaptiske nettsteder var lik mellom mus på 7, 9, og 12 dager etter knuse. For å avgjøre omdenne skaden Målingen kan også brukes til å sammenligne molekylære endringer i muskler, vi undersøkte nivåene av gamma-subenheten av muskelen nikotinreseptoren (gamma-AChR) og muskel-spesifikke kinase (moskus). Den gamma-AChR subenheten og moskus til er sterkt oppregulert etter denervering og gå tilbake til normale nivåer etter reinnervation av NMJs. Vi fant en nær sammenheng mellom transkripsjonsnivåer for disse genene og innervation status av muskler. Vi mener at denne metoden vil akselerere vår forståelse av cellulære og molekylære endringer som er involvert i å reparere den NMJ og andre synapser.
Protocol
Alle forsøkene ble utført under NIH retningslinjer og dyre protokoller godkjent av Virginia Tech Institutional Animal Care og bruk komité.
1. Klar Dyr for kirurgi
- Bedøve mus med en blanding av ketamin (90 mg / kg) og xylazin (10 mg / kg) via subkutan injeksjon lyske med en steril 1 ml insulinsprøyte. Carrier oppløsning inneholder en blanding av 0,9% saltvann, 17,4 mg / ml ketamin, og 2,6 mg / ml xylazin. Plasser dyrene tilbake i bur mens de venter på medisiner for å tre i kraft.
MERK: Hvis startdosen ikke gir tilstrekkelig anestesi under hele prosedyren, kan ytterligere 25% av startdosen injiseres. - Monitor dyr etter injeksjonen for å sjekke for jevn luftveiene priser og hensiktsmessig depresjon av opphisselse nivåer. Sjekk opphisselse nivå med en bakfot klype, som skal lokke fram noen respons når tilstrekkelig bedøvet.
MERK: Dette tar vanligvis 3-5min for en ung voksen mus gjennomsnitt 25 til 30 g. Hvis dyret fremdeles er responsiv etter 10 min post-injeksjon, kan en ytterligere 25% av bedøvelse startdose injiseres. - Påfør vaselin og lett mineralolje oftalmisk salve til dyrets øyne for å hindre tørrhet. Fjern dyr fra buret og sted på en ren, flat overflate. Barbere ønsket bakben fra fot til bekkenet ved hjelp av en elektrisk hår trimmer, utsette bare lateral aspekt av lem.
- Påfør en kjemisk hår remover til det barberte området for en min. manuelt fjerne hår ved hjelp av laboratorie våtservietter. Rengjør hårfrie område med laboratorie tørk dynket i etanol.
2. Kirurgisk prosedyre
- Sterilisere kirurgiske instrumenter via autoklav eller annen egnet metode. Rengjør kirurgiske området og operasjonsbord med 80% etanol / H 2 0. Desinfisere operasjonsstedet med proviodine. Plasser musen på kirurgisk styre og justere med lem begrensninger. Beholdemålet hind lem i en anatomisk naturlig stilling med kneleddet litt utvidet uten intern eller ekstern rotasjon.
- Plasser dyr og bord under kirurgisk mikroskop. Orient til riktig innsnitt området via palpasjon av overfladiske landemerker, spesielt benete kneleddet og ryggen mellom tibialis anterior og gastrocnemius muskler.
- Lag en ca 3 cm snitt gjennom huden ved hjelp av en skalpell eller våren saks mens du bruker generelle tang for gripende. Gjør snittet vinkelrett på den underliggende løpet av felles fibular nerve.
- Fortsett snittet gjennom overfladiske fascia, utsette biceps femoris og vastus lateralis muskler. Skill disse musklene ved å skjære gjennom tilsluttede dype fascia. En 1-2 cm kutt bør være tilstrekkelig.
- Trekk biceps femoris muskler caudally bruker mekaniske Saker, avslører den felles fibular nerve.
- Trace nerven proksimalt til sin interseksjon med sene av den laterale hodet av gastrocnemius muskelen er funnet. Merk: Eksponering kan kreve ytterligere manipulering av den tilbaketrukne hud og muskel. Dette krysset er brukt som stabil landemerke for nerveskade.
- Ta tak i nerve med en fin pinsett, og still inn tips i en parallell måte til den laterale grensen av gastrocnemius sene. Knus felles fibular nerve ved å påføre jevnt, hardt press i 5 sek.
- Bygge fullt knuse av nerve ved visuell inspeksjon gjennom kirurgisk omfang. Det vises gjennomskinnelig på stedet av skader. Hvis du bruker mus som uttrykker fluorescens proteiner i perifere aksoner, vil fluorescens forsvinne fra stedet av skader.
- Fjern Saker og omstille muskler i sine anatomiske stillinger. Lukk snittet området med 6-0 silke sting. 1-3 enkle avbrutte suturer er tilstrekkelig. Plasser restituerte musen på en varmepute på et rent bur.
- Overvåke alle dyr for to timer etter operasjon kontrollere pust og eventuelle bivirkninger av anestesi. Administrere en startdose på buprenorfin 0,05-0,10 mg / kg ved subkutan lyske injeksjon umiddelbart etter utvinning fra kirurgi. Gi ytterligere 3 doser hver 12. time i løpet av de neste 48 timer. Etter full gjenoppretting, returnerer mus til dyret omsorg anlegget.
3. Isolering og Farging av Extensor digitorum longus (EDL) Muskler
- Ofre dyr ved hjelp av isofluran. Tilsett 0,5 ml væske isofluran i en 50 ml tube fullpakket med absorberende labwipes. Plasser den ukorkede rør med dyret i et forseglet 2500 cm3 kammer. Minst 4 min eksponering er tilstrekkelig. Test for tap av bilateral palpebral, toe-klemme, og hale klype reflekser for å sikre at hvert dyr er bevisstløs før du fortsetter med perfusjon.
- Tran perfuse 16 dyr først med 10 ml 0,1 M PBS, deretter 25 ml av 4% paraformaldehyd i 0,1 M PBS (pH 7,4). Heparin (30 enheter / 20g dyrevekt) kan tilsettes med PBS (10 enheter / ml) for å forhindre blodkoagulasjon i små kapillære senger, bedre perfusjon resultater.
- Fjerne hud som dekker baklemmene ved å bruke saks for å klippe tvers gjennom huden rundt omkretsen av buken. Skrelle ned huden forbi baklemmene og føtter ved hjelp av tang.
- Fjern overfladiske fascia av bakben ved å ta tak og peeling med pinsett. Hvis du bruker mus som uttrykker fluorescens proteiner i perifere aksoner, post-fikse hele mus over natten i 4% PFA i 50 ml rør. Skyll tre ganger med PBS.
MERK: Fast mus kan lagres i PBS ved 4 ° C. Hvis ikke, hopper du over dette trinnet og gå til trinn 3.6 uten etter fikse dyr. - Dissekere ut EDL muskler 18 fra mus baklemmene, være sikker på å holde nære og fjerne sener så intakt som mulig.
- Inkuber EDL-muskler i blokkeringsbuffer (1 x PBS inneholdende 0,5% Triton X-100, 3% BSA og 5% geiteserum) i minst 1 time.
- Flekk kontralateral uskadet EDL som en positiv kontroll for fullstendig NMJ innervasjon. Negative kontroller burde omfatte en EDL erholdt ved 4 dager etter skade, et tidspunkt hvor den NMJ er helt denerveres, samt en EDS farget med sekundært antistoff bare.
- Inkuber muskler med passende fluorescens-merket sekundære antistoffer til å oppdage neurofilament og synaptotagmin-2 for en dag. Vask muskler tre ganger med 1x PBS og 10 minutter hver gang. Merk: Dette trinnet kan utføres sammen med trinn 3,10. Hopp over dette trinnet hvis du bruker mus som uttrykker fluorescens proteiner i perifere aksoner.
- For å visualisere postsynaptic region av NMJ, inkuberes muskler med 5 ug / ml Alexa 555-konjugert alfa-bungarotoxin fortynnet i blokkeringsbuffer i minst 2 timer. Vask muskler tre ganger med 1x PBS og 10 minutter hver gang.
- For å montere hele musklene på positivt ladede glassplater, plasserer muskelen direkte på lysbildet, tilsett noen dråper glyserol basert montering medium på lysbildet og dekk med et dekkglass. Trykk på dekk mot lysbildet å flate muskelen. Sug av monteringsmateriale fra omkretsen av lysbildet og dekk bruker laboratorie våtservietter. Påfør neglelakk for å forsegle kantene mellom dekkglass og lysbilde.
4. Bildebehandling og dataanalyse
- For å analysere strukturen i NMJs, bilde EDL muskelen ved hjelp av et konfokal laser scanning mikroskop utstyrt for å opphisse 488, 555 og 633 nm lys og fange det utsendte lyset med 20X og 40X mål.
- For å visualisere hele NMJs, skape maksimal intensitet projeksjon bilder av optisk seksjoner i avstand 1 til 2 um fra hverandre som strekker seg fra det laveste til høyeste synlige regioner av NMJ. Lag maksimal intensitet projeksjoner bruker kommersielt tilgjengelig bildebehandlingsprogrammer.
- For å finne ut priser av reinnervation, kategorisere NMJs som: 1) helt denerveres = postsynaptiske siden er helt blottet for kontakt med axon, mindre enn 5% colocalization mellom axon og AChRs. 2) Delvis innervert = axon delvis overlapper postsynapse, 5-95% colocalization mellom axon og AChRs. 3) Full innervation = nesten perfekt apposition mellom pre- og post-synapsen, mer enn 95% colocalization mellom axon og AChRs. Utelukke NMJs som ligger vinkelrett på avbildningsplanet, eller er ikke fullt ut visualiseres i bildet. Merk: I alle disse forsøk ble minst 3 dyr og 50 NMJs per dyr undersøkt. Resultatene ble ansett som signifikante ved bruk av en student t-test med en P-verdi på mindre enn 0,05.
- Til blind operatøren, kan separate enkeltpersoner utførerkirurgi og bildeanalyse. Uten kunnskap om behandlingsgruppene, kan analysatoren være objektiv med NMJ scoring. Alternativt kan bildene randomisert og presenteres for operatøren for analyse uten kjennskap til kilden dyret.
5. Kvantitativ PCR
- Ofre dyr med isofluran og halshugging. Fjern skinnet og overfladiske fascia dekker beinmuskulaturen i henhold til punkt 3.3. Dissekere tibialis anterior og EDL-muskler i henhold til punkt 3.4.
- Flash fryse hele tibialis anterior og EDL-muskler i en 1,5 ml tube i løpet av flytende nitrogen. Fjerne vev fra rør og plasser i en pre-kjølt mørtel delvis nedsenket i flytende nitrogen. Grind frosne muskler til et fint pulver ved hjelp av en morter.
- Oppløs frosset muskel pulver inn i en kommersielt tilgjengelig RNA-ekstraksjon reagens og utfører RNA-ekstraksjon og genomisk DNA fjernelse med et kommersielt tilgjengelig kit ifølge produsentens jeginstruksjonene angis.
- Utfør revers transkripsjon med en kommersielt tilgjengelig revers transkriptase blanding i henhold til produsentens instruksjoner.
- Utfør qPCR ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig sett ved hjelp av egnede husholdningsgener (se tabell av materialer). Bruke et kommersielt tilgjengelig kvantitativ PCR thermal cycler for å utføre PCR (se tabell av materialer).
- Still glødetemperatur til 58 ° C. Juster flere sykkel parametre til spesifikasjonene til produsenten av Taq polymerase / SYBR grønn mix. En sluttsmeltekurve trinnet i termosykler program bestående av 0,5 ° C trinnvise økninger fra 65 ° C til 95 ° C for å teste for primer spesifisitet og primer-dimer-dannelse.
- Bestem relative mRNA uttrykk nivåer ved 2 - ΔΔCT metode 21 ved hjelp av 18S RNA som kontroll genet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den vanlige fibular nerve, også kalt felles peroneal nerve, oppstår fra isjiasnerven over popliteal fossa, hvor det svinger rundt hodet av fibula til fremre del av benet (figur 1A). Der grener i overfladiske og dype fibular nerver, sammen leverer dorsiflexors av foten og tærne (anterior tibialis, extensor digitorum longus og brevis, og extensor halluces longus muskler), og everters i foten (peroneus muskler). Denne nerve bærer også sensoriske fibre som stikker til dorsum av foten og laterale del av den nedre halvdel av benet. Det er en forholdsvis tynn struktur sammensatt av motoriske og sensoriske axoner. Dette nerve grenen følger en forutsigbar anatomisk kurs. Lateral til kneet, er det for det meste nerve overfladisk mens den kjøres over sene av det laterale hodet av gastrocnemius muskel (figur 1 og figur 2). ther stedet fungerer som en stabil landemerke som lett kan nås med et lite snitt, begrense skade på hud og fascia (figur 1A). Den mindre diameter av denne nerve, i forhold til hofte og tibial nerver, som gjør det mulig å knuse alle aksoner ved bruk av mindre kraft, noe som reduserer sannsynligheten for fullstendig kutte de mer overfladiske aksonene.
Mus som uttrykker gul fluorescens protein (YFP) bare i neuroner 17 ble brukt til å optimalisere knuse prosedyren på den felles fibular nerve og utvetydig visualisere regenererende axonene. Den nerve ble knust på kanten av gastrocnemius sene mest proksimale til målet muskler fordi dette området er mer tilgjengelig fra plasseringen av snittet. Dette nettstedet fungerer også som en pålitelig anatomisk landemerke, noe som gjør det mulig å sammenligne regenerering av NMJs blant dyr av samme alder og kjønn. Komprimere nerve i 5 sek ved hjelp av en fin pinsett results i forsvinningen av YFP fra skadestedet (figur 2B). Imidlertid bindevevet og celler som oppholder seg i epineurium forbli sammenhengende, som tjener som en ledning for rask og nøyaktig regenerering av aksoner til de opprinnelige mål (figur 2B). I 70 dager gamle hunn-mus, er denne skade tilstrekkelig til å forårsake degenerering av alle aksonal segmenter distale fra neuronal soma (figur 4B).
For å bestemme pålitelighet og reproduserbarhet av denne skaden metoden, reinnervation av extensor digitorum longus (EDL) muskler ble undersøkt. Denne muskelen ble valgt av flere grunner: 1) Det er proksimale ennå fysisk adskilt fra snittet og nerveskade områder (figur 3A). Derfor er den muskelen bare endres av degenerasjon av avkuttede innervating aksoner. Sin nærhet til trengselen nettstedet minimerer tiden som er nødvendig for at det skal reinnervated og muskel atrophy. 2) Den er hovedsakelig sammensatt av hurtig typen skjelettmuskelfibre, som er mer utsatt for aldring og sykdommer. 3) De NMJs gjennomgå betydelige strukturelle endringer i løpet av utviklingen av sykdommer og aldring som kan dempes ved trening og kalori begrensning. 4) Det er lett tilgjengelig for live bildebehandling og molekylær manipulering (figur 3D). 5) Det kan lett deles inn i sine fire falangeale komponenter som kan være hel montert noe som gjør det mulig å fullt bilde alle sine innervating axoner og deres tilkoblinger ved hjelp av lysmikroskopi (figur 3B).
Reinnervation av tidligere fraflyttede postsynaptiske nettsider etter knusing fibular nerve på høyre ben ble vurdert i tre 70 dager gamle hunnmus uttrykker YFP i motor aksoner. Postsynaptiske nettsider ble visualisert ved hjelp av fluorescens-merket alfa-bungarotoxin (BTX), som binder seg selektivt og med høy affinitet til muskler nACHRS. Muskler ble ansett å være denervert, delvis eller fullt reinnervated følge disse kriteriene: 1) I denerveres muskelfibre, ble motor aksoner helt mangler fra post-synaptiske områder og mindre enn 5% colocalization mellom axon og AChRs ble observert. 2) Delvis innervated muskelfibre ble kategorisert etter noen, men ufullstendig apposition av motoriske aksoner med post-synaptiske områder og 5-95% colocalization mellom axon og AChRs ble observert. 3) I fullt innervated muskelfibre, det var nesten perfekt apposition mellom motoriske nerveender og postsynaptiske nettsteder og mer enn 95% colocalization mellom axon og AChRs ble observert. Individuelle NMJs ble ekskludert fra tellinger om deres gavler lå vinkelrett på bildeplanet eller hele NMJ ble ikke visualisert. Ved hjelp av disse kriteriene, ble høy konkordans i prisen, og graden av reinnervation observert blant alle mus undersøkt. På 4 dager etter forelsket, ble musklene funnet helt denerveres i alle dyr exautvunnet (figur 4B). Dette funnet viser at knuse den felles fibular nerve i 5 sekunder, som beskrevet ovenfor, er tilstrekkelig til å bryte alle aksoner. Ved 7 dager etter knuse, nerveender var i ferd med å reoccupying tidligere fraflyttede postsynaptiske områder (figur 4C, 4E-F). Men de fleste muskelfibrene ble likevel funnet bare delvis innervated. Med flere dager etter knuse, nerveender fortsatte å differensiere i presynaptiske nettsteder og NMJs ble funnet fullt reinnervated etter 12 dager (figur 4D, 4E-F). Viktigere var det liten variasjon mellom mus denerveres for samme tidsrom (figur 4E-F), som viser at knusing fibular nerve kan brukes som en analyse for å sammenligne reinnervation av muskler mellom dyr av samme alder og kjønn.
Evnen til å trofast sammenligne regenererende NMJs mellom dyr gir muligheterå forstå de cellulære funksjoner knyttet til hvert trinn som kreves for å full reparere dette synapse. For å undersøke arkitektur denerveres og regenererende NMJs fra 70 dager gamle mus brukes ovenfor for å sammenligne priser av reinnervation, ble høyoppløselige konfokalmikroskopi bilder av NMJs oppnådd. Som forventet, denne analysen avdekket en rekke endringer som oppstår i α-motor axon nerveender som de reinnervate muskelfibre (figur 4G-I). Aksonal vekst kjegler ser ut til å utvide og begynne å grenen ut som de kontakte postsynaptiske områder (Figur 4G). Disse aksonal grener da vokse over bestemte områder av postsynapse, som kulminerte i nær komplett sammenstilling av aksonet nerve slutter med den postsynaptiske området (Figur 4H-I). Andre strukturelle trekk i regenererende motoriske nerveender som sterkt ligner de som finnes under utvikling ble observert, inkludert flere aksoner konkurrerer om same mål (figur 4 H), som kulminerte i bare ett akson innervating en muskel fiber av 12 dager etter knuse. I tillegg aksonale grener som strekker seg utover postsynaptiske områder, omtalt her som spirer, i alle faser ble observert etter skade (figur 4I). Disse spirer var svært utbredt, selv i fullt innervated NMJs som tyder på at siste fase av aksonal reparasjon innebærer tilbaketrekking av extrajunctional aksonal grener. Til tross for disse åpenbare endringer i nerveender, post-synaptiske områder forble stort sett utvisket i alle ledd etter skade i forhold til de i uskadde muskler, inkludert 4 dager etter klem når muskelfibre er funnet helt denerveres. Det var ingen åpenbare tegn på fragmentering eller betydelig tap og omfordeling til ekstra-synaptiske regioner i AChRs. Disse funnene indikerer sterkt at fibular nerve knusemetode kan brukes som en analyse for å identifisere og teste molekylære, farmakologiske og livsstil intervensjoner that fremme reparasjon av nerveender ved synapser, inkludert NMJ.
Til tross for nylige fremskritt, har svært liten fremgang blitt gjort for å identifisere muskel-avledet faktorer som kreves og tilstrekkelig til å opprettholde og reparere NMJ. Spurte vi derfor hvis den felles fibular nerveskade metode kan anvendes for å identifisere molekyler forandres i bestemte trinn i prosessen reinnervation og med mulige roller i å reparere NMJ. Som et bevis på rektor, uttrykk analyse av to NMJ-assosierte gener, det AChR gamma subenhet og muskel-spesifikke kinase, musk 18 ble utført. Som demonstrert med kvantitativ PCR, er disse genene økt etter denervering og redusert som NMJs er reinnervated (figur 5a-b). Disse genene er oppregulert i 4 dager etter knuse, som tidligere rapportert via helt denerveres muskler 19. Som nerver reinnervate muskelfibre, nivåer av disse genene minske og rapidly tilbake til baseline. Blant dyrene som ble undersøkt, er mønsteret av uttrykket for begge genene nesten identisk, viser en nær sammenheng mellom molekylære og celleforandringer på regenererende NMJs. Denne metoden gir derfor en unik mulighet til å identifisere molekylære endringer knyttet til ulike stadier av NMJ regenerering.
Figur 1:. Nervus peroneus communis Anatomy (A) Skjematisk detaljering løpet av isjiasnerven og dens terminal grener i forhold til overfladiske og benete landemerker. SCN = isjiasnerven, TN = tibial nerve, SRN = Sural Nerve, CPN = nervus peroneus communis, SPN = Overfladisk fibular nerve, DPN = Deep fibular nerve. Ønsket innsnitt området er indikert. (B) Diagram av felles fibular nerve beliggenhet i forhold til omkringliggende muskler med huden fjernet.Relativ innsnitt området er vist overliggende investere konseptet. TA = tibialis anterior muskelen EDL = Extensor digitorum longus muskel. (C) Exposed hofte og felles fibular nerve. CPN krysser over gastrocnemius muskelen (GN) sene på nivå med kneet. Crush området i forhold til sene vist. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2:. Nervus peroneus communis Crush Surgery (A) Det første snittet behøver bare være noen få cm i lengde. Etter trenger gjennom huden og overfladiske fascia, må snittet videreføres gjennom å investere / deep fascia som ligger mellom biceps femoris og TA muskler. (A1) Den felles fibular nerve enkelt visualisert uten mikros through snittet (GN = Gastrocnemius muskel). (A2) Skjæringspunktet av den felles fibular nerve og gastrocnemius sene lett kan visualiseres hvis snittet er utvidet (bare nødvendig for fotografiske formål). Knuse skal plasseres på det sted som er merket med den røde linje vinkelrett på nerve og parallelt med Gn sene. (B) Den CPN er enda lettere visualisert med YFP transgene mus under et fluorescerende dissekere omfang. (B1) The nerve mister fluorescens på stedet av knuse, noe som åpner for bekreftelse av en full klemskade. (B2) En full CPN forelsket kan fortsatt bli visualisert med det blotte øye og belysning. Den nerve blir gjennomsiktig. Dette bildet fremhever det faktum at epineurium og overbygning CPN forbli intakt og samtidig begrense skade på nærliggende vev og blodkar.Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3:. Anatomy av Extensor digitorum longus (EDL) Muscle (A) 3-dimensjonal bilde av EDL i forhold til bein av musen bakben. Generert ved hjelp JAtlasView (B) Delvis dissekert EDL muskel separert i sine fire falangeale divisjoner og merking sifrene kontrolleres av hver divisjon. (C) YFP merket gren av den dype fibular nerve som det innervates slutt plate band av EDL divisjon kontrollere andre siffer. (D) aksonal grener og deres kontaktsider lett kan identifiseres, slik at for konsekvente undersøkelse av utvalgte NMJs. Klikk her for å se en større versjon of denne figuren.
Figur 4: Lignende Utbredelsen av reinnervation mellom dyr av samme alder og kjønn Analyse av NMJs i EDL muskelen etter knusing fibular nerve.. (A) Post-synaptiske områder er fullstendig okkupert av axoner i uskadde mus. (B) På 4 dager etter forelsket, blir musklene funnet helt denerveres. (C) Axoner begynne å reinnervate muskler 7 dager etter knuse og (D) helt reoccupy postsynaptiske områder av 12 dager. (E - F) Satsen for NMJ re-belegget er nesten umulig å skille mellom dyr denervert for samme tidsrom. (G - I) Representative bilder av re-differensierende aksonal nerveender i modnet presynaptiske nettsteder. Gjenerobring av postsynaptiske nettsteder følger enforutsigbart mønster, som starter med veksten kjegle utvikle grener som til slutt fullt opptar postsynaptiske nettsider uten å utvide utover NMJ region.Similar til utvikling, postsynaptiske nettsteder er i utgangspunktet innervated av flere re-voksende axoner men bare en axon gjenstår når NMJ har helt regenerert. (H) Eksempler på frodig aksonal spirende, delvis innervasjon uten full overlapping mellom pre og postsynaptisk apparater, og innervasjon av flere axoner indikert. 70 dager gammel hunnmus ble undersøkt; Scale Bar = 50 mikrometer (AD), 20 um (GI). Feil bar = SEM. N = 3 mus. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: fibular Nerve Knus metode somn analyse for å identifisere kandidat gener involvert i Reparere NMJ (A - B). Den mRNA nivået på to NMJ-assosierte gener, AChR gamma subenheten og moskus, er tilsvarende endret i TA muskel av mus denervert for samme tidsrom . Med økende tid etter nerveskade, nivåer av både transkripsjoner avta, tilbake til baseline, bekreftende histologisk analyse viser progressive reinnervation av NMJs. Hver linje representerer en individuell mus. Feil bar = standard feil av gjennomsnittet av tekniske replikater. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoden som presenteres i dette manuskriptet gir unike muligheter til å identifisere mekanismene som er involvert i å reparere nevromuskulære veikryss (NMJ). Denne metoden innebærer å knuse den felles fibular nerve når den passerer over gastrocnemius sene nær kneet. Vi viser at etter bare fem sekunder av nerver med en pinsett, er fullstendig degenerasjon bemerket av 4 dager etter skade. Hos unge voksne mus, alfa-motoriske aksoner begynne å reinnervate tidligere synaptiske områder i extensor digitorum longus muskel (EDL) 7 dager etter skade, som kulminerte i reformasjonen av presynaptiske nettsteder som er umulig å skille fra de i uskadd mus med 12 dager. I tillegg viser vi at nivåene av utvalgte NMJ-assosierte molekyler nært korrelert med innervasjon status for NMJ. Viktigere, disse cellulære og molekylære endringer er svært reproduserbare mellom dyr av samme kjønn og alder (figur 5a-b), som gir muligheter for å identifisere og test faktorer som virker å reparere NMJ. I form av kirurgiske prosedyrer, er det vanlig fibular nerve grenen svært tilgjengelig når den passerer over gastrocnemius senen, krever bare et lite snitt som resulterer i lite skade på omliggende muskler og blodkar.
Det er en rekke fordeler ved å bruke vanlige fibular nerve for å undersøke cellulære og molekylære forandringer assosiert med regenererende NMJs. Gastrocnemius sene fungerer som en stabil anatomisk landemerke å konsekvent skade felles fibular nerve på samme sted og avstand fra målet muskler. Dette gjør det mulig å sikkert sammenligne frekvensen av regenerering av axoner og reinnervation av muskler mellom dyr av samme alder og kjønn. Trinnene kritiske til en slik suksess inkluderer å sikre at skadestedet er konsistent mellom operasjoner, er full nerve knuse fås i alle dyr, og minimal skade er påført til omkringliggende strukturer. Blant muskler innervated av common fibular nerve, tibialis anterior (TA) og extensor digitorum longus (EDL) muskler er gode mål for å vurdere NMJ reparasjon. Disse to musklene er hovedsakelig består av raske typen muskelfibre som er alvorlig rammet av skader, aldring og sykdommer 5. For NMJ analyse, er EDL muskelen spesielt attraktiv fordi det kan være hel-montert til bilde alle NMJs uten forvrengninger. Det gjør det også mulig å korrelere endringer på NMJs med endringer andre steder i muskelfibre, motor axoner og omkringliggende celler.
TA og EDL-musklene har blitt mye brukt til å vurdere effekten av ulike molekylære og livsstil intervensjoner på muskel og NMJ reparasjon på grunn av deres anatomiske plassering 20. Men endrer langsiktig denervering uttrykket av gener med kritisk funksjon i atrophying muskelfibre, aktiverte immunceller og satellittceller 12-14, noe som gjør det vanskeligere å vurdere cellulært og molekylært changes nødvendig å spesifikt fremme regenerering av NMJs. I fremgangsmåten som er beskrevet her fibular nerve blir knust i umiddelbar nærhet til TA og EDL-muskler, slik at nerve for å nå dem innen 7 dager etter knuse hos unge voksne mus. Derfor bør denne metoden minimalisere tap av muskelmasse og molekylære forandringer assosiert med atrophying muskelfibrene i TA og EDL-muskler.
Fibular nerve knuse protokollen kan endres på flere forskjellige moter. Nerve kutt skader kan lett byttes ut med klem, noe som åpner for bedre sanntid in vivo avbildning av perifer nerve gjenfødelse. Et kutt fjerner død axon materialet som et hinder for gjenvekst og sikrer homogen skade av hver axon innenfor endoneurial røret.
Når utført riktig fibular nerve knuse har noen tilknyttede komplikasjoner. Et problem som kan oppstå er svikt i nerve å reinnervate originale NMJ mål. Dette kan være forårsaket av accidental kutte skade på nerve under operasjonen. Husk å sjekke de fine-tipped knusing tang for noen skarpe kanter. Hvis du på noe tidspunkt under operasjonen kvaliteten på en nerve forelskelsen er tvilsom, kan den opprinnelige snitt utvides til bedre visualisere nerve. Selv om dette øker størrelsen på såret og kan skade andre strukturer, kan det hjelpe med korrekt identifisere fibular nerve og vurdere hvorvidt en fullstendig forelsket ble oppnådd.
Teknikken er beskrevet her gjør besitte noen begrensninger. For det første er det først og fremst nyttig i voksne mus som strukturene i disse dyrene er store nok til å manipulere. Nyfødte og unge mus er mye mindre, betydelig øke vanskelighetsgraden av operasjonen. For det andre inneholder fibular nerve sensoriske og motoriske aksoner, noe som resulterer i denervering av målet vev som kan påvirke utbredelsen av NMJ regenerering.
Den NMJ er anerkjent som et samlingsstedet patologi i amyotrofisk lattater sklerose (ALS) og aldring. Det har også å bli reparert etter skade til perifere nerver for å unngå at det går motoriske ferdigheter og å miste muskelmasse. Fibular nerve knuse metoden skal hjelpe til med identifisering og testing av molekyler med viktige roller i å reparere NMJ. I en tilnærming, kan denne metoden brukes til å profilere mRNA og mikroRNA med sentrale roller på ulike stadier av NMJ regenerering ved hjelp av RNA-sekvens analyse. Den kan også anvendes for selektivt å bestemme funksjonen av kandidatgener innført og slettet fra muskler. I tillegg gir denne metoden seg godt til å teste muligheten for eksogene molekyler for å få fart nerve og NMJ regenerering ved hjelp av statisk og live bildebehandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine | VetOne | 501072 | |
| Xylazine | Lloyd Inc. | 003437 | |
| Buprenorphine | Zoopharm | 1Z-73000-150910 | |
| Nair | Nair | ||
| Kim-wipes | Kimtech | 34155 | |
| Electric Razor | Braintree Scientific | CLP-64800 | |
| 80% EtOH/H20 | |||
| 10% Proviodine | |||
| 1 ml Insulin Syringe | |||
| Spring Scissors | Vannas | 91500-09 | |
| No. 15 scalpel | Braintree Scientific | SSS 15 | |
| #5 Forceps | Dumont | 11252-00 | |
| 6-0 silk suture on reverse cutting needle | Suture Express | 752B | |
| Rodent Heating Pad | Braintree Scientific | AP-R-18.5 | |
| Alexa 555 conjugated alpha-BTX | Molecular Probes | B35451 | |
| Vectashield | Vector Labs | H-1000 | |
| Olympus Stereo Zoom Microscope | Olympus | 562037192 | |
| Zeiss 700 Confocal Microscope | Zeiss | ||
| Variable-flow peristaltic perfusion pump | Fisher Scientific | 13-876-3 | |
| Aurum Total RNA Mini Kit | Bio-Rad | 7326820 | |
| Bio-Rad iScript RT Supermix | Bio-Rad | 1708840 | |
| SsoFast Evagreen Supermix | Bio-Rad | 1725200 | |
| Bio-Rad CFX96 | Bio-Rad | 1855196 | |
| Puralube Vet ointment | Puralube | 1621 | |
| Synaptotagmin-2 antibody | Antibodies-Online | ABIN401605 | |
| Neurofilament antibody | Antibodies-Online | ABIN2475842 |
References
- Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Induction, assembly, maturation and maintenance of a postsynaptic apparatus. Nat. Rev. Neurosci. 2 (11), 791-805 (2001).
- Moloney, E. B., de Winter, F., Verhaagen, J. ALS as a distal axonopathy: molecular mechanisms affecting neuromuscular junction stability in the presymptomatic stages of the disease. Front. Neurosci. 8, 252 (2014).
- Apel, P. J., Alton, T., et al. How age impairs the response of the neuromuscular junction to nerve transection and repair: An experimental study in rats. J Orthop Res. 27 (3), 385-393 (2009).
- Balice-Gordon, R. J. Age-related changes in neuromuscular innervation. Muscle Nerve Suppl. 5, S83-S87 (1997).
- Valdez, G., Tapia, J. C., Lichtman, J. W., Fox, M. A., Sanes, J. R. Shared resistance to aging and ALS in neuromuscular junctions of specific muscles. PloS one. 7 (4), e34640 (2012).
- Nguyen, Q. T., Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Pre-existing pathways promote precise projection patterns. Nat. Neurosci. 5 (9), 861-867 (2002).
- Küry, P., Stoll, G., Müller, H. W. Molecular mechanisms of cellular interactions in peripheral nerve regeneration. Curr Opin Neurol. 14 (5), 635-639 (2001).
- Gaudet, A. D., Popovich, P. G., Ramer, M. S. Wallerian degeneration: gaining perspective on inflammatory events after peripheral nerve injury. J Neuroinflammation. 8, 110 (2011).
- Chen, P., Piao, X., Bonaldo, P. Role of macrophages in Wallerian degeneration and axonal regeneration after peripheral nerve injury. Acta Neuropathol. 130 (5), 605-618 (2015).
- Chen, Z. -L., Yu, W. -M., Strickland, S. Peripheral regeneration. Annu Rev Neurosci. 30, 209-233 (2007).
- Darabid, H., Perez-Gonzalez, A. P., Robitaille, R. Neuromuscular synaptogenesis: coordinating partners with multiple functions. Nat. Rev. Neurosci. 15 (11), 703-718 (2014).
- Geuna, S. The sciatic nerve injury model in pre-clinical research. J. Neurosci. Methods. 243, 39-46 (2015).
- Batt, J. A. E., Bain, J. R. Tibial nerve transection - a standardized model for denervation-induced skeletal muscle atrophy in mice. J. Vis. Exp. (81), e50657 (2013).
- Savastano, L. E., Laurito, S. R., Fitt, M. R., Rasmussen, J. A., Gonzalez Polo, V., Patterson, S. I. Sciatic nerve injury: a simple and subtle model for investigating many aspects of nervous system damage and recovery. J. Neurosci. Methods. 227, 166-180 (2014).
- Kang, H., Lichtman, J. W. Motor axon regeneration and muscle reinnervation in young adult and aged animals. J Neurosci. 33 (50), 19480-19491 (2013).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J. Vis. Exp. (65), e3564 (2012).
- Feng, G., Mellor, R. H., et al. Imaging Neuronal Subsets in Transgenic Mice Expressing Multiple Spectral Variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).
- Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Development of the vertebrate neuromuscular junction. Annu Rev Neurosci. 22, 389-442 (1999).
- Bowen, D. C., Park, J. S., et al. Localization and regulation of MuSK at the neuromuscular junction. Dev Biol. 199 (2), 309-319 (1998).
- Gay, S., Jublanc, E., Bonnieu, A., Bacou, F. Myostatin deficiency is associated with an increase in number of total axons and motor axons innervating mouse tibialis anterior muscle. Muscle Nerve. 45 (5), 698-704 (2012).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), San Diego, Calif. 402-408 (2001).
