Abstract
De neuromusculaire junctie (NMJ) ondergaat schadelijke structurele en functionele veranderingen als gevolg van de vergrijzing, letsel en ziekte. Derhalve is het noodzakelijk om de cellulaire en moleculaire veranderingen die samenhangen onderhoud en reparatie NMJs begrijpen. Hiervoor hebben we een methode ontwikkeld om op betrouwbare en consistente onderzoeken regenereren NMS bij muizen. Deze methode zenuwletsel omvat het breken van de gemeenschappelijke fibularis zenuw als het gaat over de laterale kop van de gastrocnemius spier pees in de buurt van de knie. Met behulp van 70 dagen oude vrouwelijke muizen, tonen we aan dat de motor axonen beginnen te eerdere postsynaptische targets reinnervate binnen 7 dagen na de crush. Ze volledig opnieuw te bezetten hun eerdere synaptische gebieden met 12 dagen. Om de betrouwbaarheid van deze methode schade vast te stellen, vergeleken we reinnervation tarieven tussen individuele 70 dagen oude vrouwelijke muizen. We vonden dat het aantal reinnervated postsynaptische plaatsen vergelijkbaar tussen muizen 7, 9 en 12 dagen na de crush. Om te bepalen ofDeze schade test kan ook worden gebruikt om moleculaire veranderingen vergelijken spieren onderzochten we de niveaus van gamma-subeenheid van de spier nicotinerge receptor (gamma-AChR) en de spier-specifieke kinase (MuSK). De gamma-AChR subunit en muskus om zijn zeer opgereguleerd na denervatie en terug te keren naar een normaal niveau na reïnnervatie van NMJs. We hebben een nauwe relatie tussen transcript niveaus voor deze genen en innervatie status van de spieren. Wij geloven dat deze methode ons begrip van de cellulaire en moleculaire veranderingen voor herstelling van de NMJ en andere synapsen versnellen.
Protocol
Alle experimenten werden uitgevoerd in het kader van de NIH richtlijnen en protocollen dier door de Tech Institutional Animal Care en gebruik Comite Virginia goedgekeurd uitgevoerd.
1. Voorbereiding Dieren voor Heelkunde
- Verdoven muizen met een mengsel van ketamine (90 mg / kg) en xylazine (10 mg / kg) via subcutane injectie inguinale met een steriele 1 ml insulinespuit. Drageroplossing bevat een mengsel van 0,9% zoutoplossing, 17,4 mg / ml ketamine en 2,6 mg / ml xylazine. Plaats de dieren terug in kooien in afwachting van medicatie door te voeren.
Opmerking: Als de aanvangsdosis onvoldoende verdoving biedt voor de duur van de procedure, kan een extra 25% van de aanvangsdosis injecteren. - Monitor dieren na de injectie om te controleren op regelmatige respiratoire tarieven en passende verlaging van opwinding niveaus. Controleer opwinding niveau met een achterpoot snuifje, waarvoor geen reactie mag wekken indien voldoende verdoofd.
OPMERKING: Dit duurt meestal 3-5min voor een jong volwassen muis van gemiddeld 25 tot 30 g. Als het dier is nog steeds reageert na 10 minuten na de injectie, kan een extra 25% van het verdovingsmiddel oplaaddosis worden geïnjecteerd. - Toepassen vaseline en lichte minerale olie oogzalf ogen van het dier te voorkomen droogheid. Verwijder dieren uit de kooi en plaats op een schone, vlakke ondergrond. Scheer de gewenste achterste ledematen van voet naar het bekken met een elektrische tondeuse, het blootstellen van alleen de laterale aspect van het ledemaat.
- Breng een chemische haar remover op de geschoren site voor 1 min. Handmatig het haar te verwijderen met behulp van laboratorium doekjes. Maak de onthaarde met laboratorium doekje gedrenkt in ethanol.
2. Chirurgische Procedure
- Steriliseren chirurgische instrumenten via autoclaaf of een andere geschikte methode. Maak de operatiewond en chirurgische bord met 80% ethanol / H 2 0. Ontsmet de chirurgische site met proviodine. Plaats de muis op chirurgische boord en af te stemmen op de ledematen hoofdsteunen. Houdenhet doel achterste ledematen in een anatomisch natuurlijke positie met het kniegewricht iets verlengd zonder interne of externe rotatie.
- Plaats dier en bord onder de chirurgische microscoop. Oriënteren de goede incisie via palpatie oppervlakkige oriëntatiepunten bijzonder de benige kniegewricht en de kam tussen de tibialis anterior en gastrocnemius spieren.
- Maak een ongeveer 3 cm incisie door de huid met behulp van een scalpel of lente schaar tijdens het gebruik van algemene tang voor het grijpen. Maak de incisie loodrecht op het onderliggende verloop van de gemeenschappelijke fibulaire zenuw.
- Ga door met de incisie door de oppervlakkige fascia, waardoor de biceps femoris en vastus lateralis spieren. Scheid deze spieren door het doorsnijden van de verbindende diepe fascia. Een 1-2 cm gesneden moet voldoende zijn.
- Trek de biceps femoris caudaal met behulp van mechanische oprolmechanismen, het openbaren van de gemeenschappelijke fibulaire zenuw.
- Trace de zenuw proximaal tot haar interdeel met de pees van de laterale kop van de gastrocnemius spier wordt gevonden. Opmerking: Blootstelling kan additionele manipulatie van de teruggetrokken huid en spieren nodig. Deze kruising wordt gebruikt als de stabiele mijlpaal voor de zenuwletsel.
- Pak de zenuw met een fijne tang, het afstemmen van de tips in een parallelle wijze aan de laterale rand van de gastrocnemius pees. Plet de gemeenschappelijke fibularis zenuw door het toepassen van constante, harde druk gedurende 5 sec.
- Bevestigen volledige verpletteren van de zenuw door visuele inspectie door de chirurgische scope. Het zal verschijnen doorzichtige op de plaats van verwonding. Bij gebruik van muizen die fluorescentie eiwitten in perifere axonen zal de fluorescentie verdwijnt uit de plaats van verwonding.
- Verwijder oprolmechanismen en lijnt de spieren in hun anatomische posities. Sluit de incisie met 6-0 zijden hechtingen. 1-3 eenvoudige onderbroken hechtingen worden volstaan. Plaats recupereren muis op een verwarmingselement in een schone kooi.
- Monitor alle dieren gedurende 2 uur post-operatie om te controleren op de ademhaling en de eventuele bijwerkingen van de narcose. Dien een initiële dosis van buprenorfine 0,05-0,10 mg / kg via subcutane injectie lies onmiddellijk na herstel van een operatie. Geef 3 extra doses elke 12 uur in de komende 48 uur. Na volledig herstel, terug muizen om het dier zorginstelling.
3. Isolatie en kleuring van Extensor digitorum Longus (EDL) Spieren
- Sacrifice dieren met behulp van isofluraan. Verdeel 0,5 ml vloeistof isofluraan in een 50 ml buis gevuld met absorberend labwipes. Plaats de afgetopte buis met het dier in een afgesloten 2.500 cm 3 kamer. Tenminste 4 min van blootstelling voldoende. Test voor het verlies van de bilaterale oogleden, teen-snuifje, en de staart-knijpen reflexen om ervoor te zorgen dat elk dier bewusteloos is alvorens met perfusie.
- Transcardially perfuseren 16 dieren eerst met 10 ml 0,1 M PBS, vervolgens 25 ml van 4% paraformaldehyde in 0,1 M PBS (pH 7,4). Heparine (30 eenheden / 20g dier gewicht) kan worden toegevoegd met de PBS (10 eenheden / ml) om de bloedstolling te voorkomen in kleine capillaire bedden, het verbeteren van perfusie resultaten.
- Verwijder de huid die achterpoten met een schaar om dwars doorsnijden de huid rond de omtrek van de buik. Schil beneden de huid langs de achterpoten en voeten behulp van een tang.
- Verwijder oppervlakkige fascia van de achterpoten door vast te pakken en peeling met een pincet. Bij gebruik van muizen die fluorescentie eiwitten in perifere axonen, 's nachts post-fix hele muizen in 4% PFA in 50 ml buizen. Spoel driemaal met PBS.
OPMERKING: Vaste muizen kunnen worden opgeslagen in PBS bij 4 ° C. Zo niet, dan slaat u deze stap en ga dan naar stap 3.6, zonder na de vaststelling van dieren. - Ontleden EDL spieren 18 uit muis achterpoten, en zorg ervoor dat proximale en distale pezen zoveel mogelijk intact te houden.
- Incubeer EDL spieren in blokkerende buffer (1x PBS dat 0,5% Triton X-100, 3% BSA en 5% geit serum) gedurende ten minste 1 uur.
- Vlekken op de contralaterale ongedeerd EDL als een positieve controle voor complete NMJ innervatie. Negatieve controles dient een EDL verkrijgen op 4 dagen na het letsel, een tijdstip waar de NMJ volledig gedenerveerde, en een EDL gekleurd met alleen secundair antilichaam omvatten.
- Incubate spieren met de juiste fluorescent gelabeld secundaire antilichamen tegen neurofilament en synaptotagmin-2 sporen voor 1 dag. Was spieren driemaal met 1x PBS en 10 minuten per keer. Opmerking: Deze stap kan worden uitgevoerd samen met stap 3.10 worden uitgevoerd. Sla deze stap over als het gebruik van muizen die fluorescentie eiwitten in perifere axonen.
- Om de postsy visualiserennaptic gebied van de NMJ, incubeer spieren met 5 ug / ml Alexa-555 geconjugeerd a-bungarotoxine verdund in blokkerende buffer gedurende ten minste 2 uur. Was spieren driemaal met 1x PBS en 10 minuten per keer.
- Om hele spieren op glasplaatjes positief geladen te monteren, plaatst u de spier rechtstreeks op de dia, voeg een paar druppels van glycerol op basis montage medium op de dia en bedek met een dekglaasje. Druk op de dekglaasje tegen de dia om de spier af te vlakken. Losweken montage media uit de omtrek van de glijbaan en dekglaasje met behulp van laboratorium doekjes. Solliciteer nagellak aan de randen tussen het dekglaasje en de glijbaan af te dichten.
4. Imaging en Data-analyse
- Om de structuur van NMJs, imago van de EDL spier met behulp van een confocale laser scanning microscoop uitgerust om 488, 555 en 633 nm licht prikkelen en vastleggen van het uitgezonden licht met 20X en 40X doelstellingen te analyseren.
- Om hele NMJs visualiseren, creëren maximale intensiteit projectie beelden van optische secties afstand 1-2 urn afgezien uitstrekt van de laagste tot de hoogste zichtbare gebieden van de NMJ. Maak een maximale intensiteit projecties met behulp van commercieel verkrijgbare imaging software.
- Om de tarieven van de reïnnervatie bepalen, categoriseren NMJs als: 1) volledig gedenerveerde = postsynaptische site is volledig verstoken van contact met de axon, minder dan 5% colocalization tussen de axon en AChRs. 2) Half geprikkeld = de axon overlapt gedeeltelijk postsynapse, 5-95% colocalization tussen de axon en AChRs. 3) Volledige innervatie = bijna perfect appositie tussen de pre- en post-synaps, meer dan 95% colocalization tussen de axon en AChRs. Uitsluiten NMJs dat loodrecht op het beeldvlak liggen of niet volledig zichtbaar in het beeld. Opmerking: In al deze experimenten werden ten minste 3 dieren en 50 NMJs per dier wordt. De resultaten werden significant geacht met een student t-test met een p-waarde van minder dan 0,05.
- Om de operator te verblinden, kan afzonderlijke individuen uit te voerende operatie en beeldanalyse. Zonder kennis van de behandelingsgroepen, kan de analysator doelstelling met NMJ scoren zijn. Als alternatief, kunnen de beelden worden gerandomiseerd en voorgelegd aan de exploitant voor de analyse zonder kennis van de dierlijke bron.
5. Kwantitatieve PCR
- Sacrifice dieren met behulp van isofluraan en cervicale dislocatie. Verwijder het vel en oppervlakkige fascia die beenspieren volgens stap 3.3. Ontleden tibialis anterior spieren en EDL volgens stap 3,4.
- Flash bevriezen de hele tibialis anterior en EDL spieren in een 1,5 ml buis over vloeibare stikstof. Verwijder weefsel van de buis en plaats in een pre-gekoelde mortel gedeeltelijk ondergedompeld in vloeibare stikstof. Grind bevroren spier tot een fijn poeder met behulp van een mortier en een stamper.
- Lossen ingevroren spier poeder in een commercieel verkrijgbare RNA-extractie reagens en uitvoeren RNA extractie en genomisch DNA verwijderen met een commercieel verkrijgbare kit volgens i fabrikantNSTRUCTIES.
- Voeren reverse transcriptie met een commercieel verkrijgbaar mengsel reverse transcriptase volgens de instructies van de fabrikant.
- Voer qPCR met behulp van een commercieel verkrijgbare kit met behulp van geschikte housekeeping genen (zie tabel van materialen). Gebruik een los verkrijgbare kwantitatieve PCR thermische cycler voor het uitvoeren van PCR (zie tabel van materialen).
- Stel annealing temperatuur 58 ° C. Pas extra fietsen parameters om de specificaties van de fabrikant van Taq-polymerase / SYBR groen mix. Onder een smelteindtemperatuur kromme stap in thermocycler programma dat bestaat uit 0,5 ° C incrementeel verhoogd van 65 ° C tot 95 ° C om te testen op specificiteit primer en primer dimeer vorming.
- Bepaal relatieve mRNA-expressieniveaus door 2 - ΔΔCT werkwijze 21 gebruikt 18S RNA als controle gen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De gemeenschappelijke fibulaire zenuw, ook wel de gemeenschappelijke peroneus, vloeit voort uit de heupzenuw boven de knieholte, waar zwaait rond het hoofd van de fibula het anteriore gedeelte van de poot (Figuur 1A). Daar takken in de oppervlakkige en diepe fibulaire zenuwen, samen leveren van de dorsiflexors van de voet en tenen (anterior tibialis, extensor digitorum longus en brevis en extensor halluces longus spieren) en de everters van de voet (peroneus spieren). Deze zenuw voert ook sensorische vezels die uitsteken in het dorsale gedeelte van de voet en laterale aspect van de onderste helft van het been. Het is een relatief dunne structuur bestaande uit motorische en sensorische axons. Deze zenuw tak volgt een voorspelbare anatomische cursus. Lateraal van de knie, de zenuw vrij oppervlakkig als het loopt over de pees van de laterale kop van de gastrocnemius spier (Figuur 1 en Figuur 2). this locatie dient als een stabiele plaatsbepalingscategorie gemakkelijk bereikbaar met een kleine incisie, zodat nadelige effecten voor de huid en fascia (Figuur 1A). De kleinere diameter van deze zenuw in vergelijking met de nervus en scheenbeenzenuw, maakt het mogelijk om alle axonen vernietigen met minder kracht, waardoor de kans op volledig doorsnijden van de meer oppervlakkige axonen.
Muizen die gele fluorescentie eiwit (YFP) alleen in neuronen 17 werden gebruikt om de crush procedure optimaliseren gemeenschappelijke fibularis zenuw en duidelijk zichtbaar regenererende axons. De zenuw werd gekreukeld met de rand van de gastrocnemius pees proximale naar het doel spieren omdat deze site is toegankelijk vanaf de plaats van de incisie. Deze site dient ook als een betrouwbare anatomisch herkenningspunt, waardoor regeneratie van NMJs vergelijking tussen dieren van dezelfde leeftijd en geslacht. Het comprimeren van de zenuw gedurende 5 sec met behulp van een fijne tang resULT in het verdwijnen van YFP van de plaats van het letsel (figuur 2B). De bindweefsel en cellen die in de epineurium blijven aaneengesloten, dient als kanaal voor snelle en nauwkeurige regeneratie van axonen naar hun oorspronkelijke doelen (Figuur 2B). In 70 dagen oude vrouwelijke muizen, dit letsel is voldoende om degeneratie van alle axonale segmenten distaal van de neuronale soma (Figuur 4B) veroorzaken.
Om de betrouwbaarheid en reproduceerbaarheid van deze methode schade vast te stellen, reïnnervatie extensor digitorum longus (EDL) spier werd onderzocht. Deze spier werd gekozen om verschillende redenen: 1) het proximaal is nog fysiek gescheiden van de incisie en zenuwletsel plaatsen (Figuur 3A). Derhalve is de spier alleen veranderd door degeneratie van afgesneden axonen innerveren. De nabijheid van de crush website minimaliseert de tijd die nodig is om te kunnen worden reinnervated en spier atrophy. 2) Het is hoofdzakelijk samengesteld uit snel typen skeletspieren vezels, die gevoeliger zijn voor veroudering en ziekten. 3) De NMJs ondergaan grote structurele veranderingen in de loop van de progressie van ziektes en veroudering die kunnen worden verzwakt door oefening en caloriebeperking. 4) Het is gemakkelijk toegankelijk voor live-beeldvorming en moleculaire manipulatie (figuur 3D). 5) Het kan gemakkelijk worden gescheiden in de vier falangeale componenten die geheel gemonteerd waardoor het mogelijk kan zijn om volledig beeld al zijn innerveren axons en hun verbindingen met behulp van lichtmicroscopie (Figuur 3B).
Reïnnervatie van eerder vrijgekomen post-synaptische plaatsen na het breken van de fibulaire zenuw aan het rechterbeen werd onderzocht in drie 70 dagen oude vrouwelijke muizen die YFP in motorische axonen. Postsynaptische plaatsen werden gevisualiseerd met behulp van fluorescent gelabeld a-bungarotoxine (BTX), dat selectief bindt met hoge affiniteit aan spieren NacHRS. Spieren geacht met gedenerveerde, gedeeltelijk of volledig reinnervated de volgende criteria: 1) In gedenerveerde spiervezels werden motorische axons volledig ontbreken postsynaptische plaatsen en minder dan 5% colocalization tussen het axon en AChRs waargenomen. 2) Half geïnnerveerde spiervezels werden ingedeeld door sommige, maar incomplete bijstelling van de motor axonen met post-synaptische sites en 5-95% colocalisatie tussen de axon en AChRs werd waargenomen. 3) In volledig geïnnerveerde spiervezels, was er bijna perfect appositie tussen motorische zenuwuiteinden en postsynaptische plaatsen en meer dan 95% colocalization tussen het axon en AChRs waargenomen. Individuele NMJs werden uitgesloten van tellingen als hun eindplaten loodrecht stellen naar het beeldvlak of het hele NMJ niet werd gevisualiseerd. Met behulp van deze criteria, hoge concordantie in de snelheid en de mate van reïnnervatie werd waargenomen bij alle muizen onderzocht. Op 4 dagen na de verbrijzeling, werden de spieren gevonden volledig gedenerveerde in alle dieren EXAbepaald (Figuur 4B). Deze bevinding toont aan dat het neerslaan van de gemeenschappelijke nervus fibularis voor 5 seconden, zoals hierboven beschreven, is voldoende om alle axonen verbreken. Door 7 dagen na de verbrijzeling, zenuwuiteinden waren in het proces van het opnieuw te bezetten eerder vrijgekomen post-synaptische sites (Figuur 4C, 4E-F). Echter, de meeste spiervezels werden vond nog slechts gedeeltelijk geprikkeld. Met extra dagen na de verbrijzeling, zenuwuiteinden verder te differentiëren in presynaptische sites en NMJs bleken volledig reinnervated met 12 dagen (figuur 4D, 4E-F). Belangrijk is dat er weinig variatie tussen muizen gedenerveerde voor dezelfde periode (figuur 4E-F), waaruit blijkt dat het breken van de nervus fibularis kan worden gebruikt als een assay voor het vergelijken reïnnervatie spieren tussen dieren van dezelfde leeftijd en geslacht.
De mogelijkheid om te regenereren NMJs trouw te vergelijken tussen dieren biedt kansende cellulaire functies die bij elke stap vereist om deze synaps volledig herstellen begrijpen. Om de architectuur van gedenerveerde en regenererende NMJs van de 70 dagen oude muizen bovenstaande gebruikte voor het vergelijken van de tarieven van de reïnnervatie onderzoeken, hoge-resolutie confocale microscopie beelden van NMS werden verkregen. Zoals verwacht, deze analyse bracht een aantal veranderingen die optreden in α-motorische axon zenuwuiteinden mocht reinnervate spiervezels (Figuur 4G-I). Axonale groei kegels lijken uit te breiden en beginnen te vertakken als zij contact opnemen met postsynaptische sites (figuur 4G). Deze axonen takken groeien dan over specifieke regio's van de postsynapse, culminerend in de buurt van volledige juxtapositie van de axon zenuw eindigend met de postsynaptische (figuur 4H-I). Aanvullende structurele functies in het regenereren motorische zenuwuiteinden die sterk lijken op die gevonden tijdens de ontwikkeling werden waargenomen, waaronder meerdere axonen strijden om de same target (figuur 4H), culminerend in slechts één axon innerveren één spiervezels met 12 dagen na de crush. Daarnaast axonale takken die verder reikt dan de post-synaptische sites, aangeduid hierin als spruiten, in alle stadia na het letsel werden waargenomen (Figuur 4I). Deze spruiten waren veel voorkomende, zelfs in volledig geprikkeld NMJs suggereert dat de laatste fase van axonale reparatie gaat terugtrekken van extrajunctional axonale takken. Ondanks deze duidelijke veranderingen in zenuwuiteinden, postsynaptische plaatsen bleef meestal onderscheiden in elk stadium na het letsel vergeleken met die in niet-verwonde spieren, ook op 4 dagen na verbrijzeling wanneer spiervezels volledig gedenerveerde gevonden. Er was geen duidelijke tekenen van fragmentatie of aanzienlijk verlies en herverdeling om extra-synaptische regio's van AChRs. Deze bevindingen zijn sterke aanwijzingen dat de fibularis zenuwknelling methode kan worden gebruikt als een assay voor het identificeren en testen moleculaire, farmacologische en levensstijl interventies that bevorderen reparatie van zenuwuiteinden bij synapsen, met inbegrip van de NMJ.
Ondanks de recente vooruitgang, is zeer weinig vooruitgang geboekt bij het identificeren van spier-afgeleide factoren die nodig en voldoende zijn om te behouden en te herstellen van de NMJ. Daarom vraagt of de gemeenschappelijke fibularis zenuwletsel methode kan worden gebruikt om moleculen veranderd in specifieke fasen van de reïnnervatie proces met potentiële rol bij het herstel van de NMJ identificeren. Als bewijs van de hoofdsom, expressie analyse van twee NMJ-geassocieerde genen, de AChR gamma subunit en de spier-specifieke kinase, muskus 18 werd uitgevoerd. Zoals gedemonstreerd met kwantitatieve PCR, zijn deze genen verhoogd na denervatie en gedaald NMJs worden reinnervated (figuur 5a-b). Deze genen zijn opgereguleerd op 4 dagen na de verbrijzeling, zoals eerder gemeld via volledig gedenerveerde spieren 19. Zoals zenuwen reinnervate spiervezels, niveaus van deze genen te verminderen en rapiDLY terug te keren naar de uitgangswaarde. Onder dieren onderzocht, het patroon van expressie van beide genen is bijna identiek, waaruit een nauwe correlatie tussen moleculaire en cellulaire veranderingen op NMJs regenereren. Deze werkwijze geeft daarom unieke mogelijkheden om moleculaire veranderingen geassocieerd met verschillende stadia van NMJ regeneratie identificeren.
Figuur 1:. Common fibulaire Nerve Anatomie (A) Schematische detaillering het verloop van de nervus vagus en haar terminal takken in relatie tot oppervlakkig en benige oriëntatiepunten. SCN = heupzenuw, TN = scheenbeenzenuw, SRN = Sural Nerve, CPN = Algemeen fibulaire Nerve, SPN = Oppervlakkige fibulaire Nerve, DPN = Deep fibulaire Nerve. De gewenste insnijding wordt aangegeven. (B) Schematische weergave van de gemeenschappelijke fibular zenuw ligging ten opzichte van de omliggende spieren met de huid verwijderd.Relatieve incisie wordt getoond bovenop de beleggen fascia. TA = tibialis anterior EDL = Extensor digitorum longus. (C) Exposed ischias en gemeenschappelijke fibulaire zenuw. CPN kruist over de gastrocnemius spier (Gn) pees aan het niveau van de knie. Crush terrein ten opzichte van de pees getoond. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2:. Common fibular Nerve Crush Surgery (A) De eerste incisie hoeft alleen maar een paar cm in lengte. Na het penetreren door de huid en oppervlakkige fascia, moet de snede worden voortgezet door middel van het beleggend / diepe fascia ligt tussen de biceps Femoris en TA spieren. (A1) Het gemeenschappelijk fibularis zenuw is eenvoudig gevisualiseerd zonder microscopie through de incisie (Gn = Gastrocnemius Muscle). (A2) Het snijpunt van de gemeenschappelijke fibular zenuw- en gastrocnemius pees kan gemakkelijk worden gevisualiseerd als de incisie (alleen nodig voor fotografische doeleinden) wordt verbreed. Verluchtings moet op de plaats aangegeven door de rode lijn geplaatst loodrecht op de zenuw en parallel aan de Gn pees. (B) De CPN zelfs gemakkelijker zichtbaar gemaakt met YFP transgene muizen onder een fluorescerende dissectie scope. (B1) De zenuw verliest fluorescentie op de site van verpletteren, waardoor de bevestiging van een volledige crush. (B2) Een volledige CPN verliefd kan nog steeds worden zichtbaar met het blote oog en verlichting. De zenuw wordt doorzichtig geworden. Dit beeld wijst op het feit dat de epineurium en bovenbouw van de CPN intact blijven, terwijl tegelijkertijd het beperken van schade aan het omliggende weefsel en bloedvaten.Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3:. Anatomie van de extensor digitorum Longus (EDL) spier (A) 3 dimensionale afbeelding van de EDL ten opzichte van de botten van de muis achterste lidmaat. Gegenereerd met behulp van JAtlasView (B) gedeeltelijk ontleed EDL spier gescheiden in zijn vier phalangeal divisies en het markeren van de cijfers gecontroleerd door elke divisie. (C) YFP gelabeld tak van de diepe fibulaire zenuw als het innerveert eind-plaat band van de EDL divisie besturen van het tweede cijfer. (D) Axonale takken en hun contactgegevens sites kunnen gemakkelijk worden geïdentificeerd, waardoor consistente onderzoek van geselecteerde NMJs. Klik hier om een grotere versie te bekijken of dit cijfer.
Figuur 4: Vergelijkbare tarieven van reïnnervatie tussen dieren van dezelfde leeftijd en geslacht Analyse van NMJs in de EDL spier na het breken van de fibulaire zenuw.. (A) Post-synaptische sites worden volledig ingenomen door axonen in ongedeerd muizen. (B) op 4 dagen na verpletteren, worden de spieren gevonden volledig gedenerveerde. (C) Axons beginnen om spieren reinnervate 7 dagen na verpletteren en (D) postsynaptische plaatsen volledig opnieuw te bezetten met 12 dagen. (E - F) Het tarief van de NMJ re-bezetting is bijna niet te onderscheiden tussen dieren gedenerveerde voor dezelfde tijdsduur. (G - I) Vertegenwoordiger beelden van re onderscheidende axonen zenuwuiteinden in gerijpt presynaptische sites. Herbezetting van postsynaptische plaatsen volgt eenvoorspelbaar patroon, te beginnen met de groeikegel ontwikkelen takken die postsynaptische plaatsen uiteindelijk volledig zonder toezicht uitstrekt voorbij de NMJ region.Similar ontwikkeling, postsynaptische plaatsen worden initieel geïnnerveerd door meerdere opnieuw groeiende axons maar slechts een axon blijft nadat de NMJ volledig geregenereerd. (H) Voorbeelden van uitbundige axonale kiemen, gedeeltelijke innervatie zonder volledige overlap tussen pre-en postsynaptische apparaten, en innervatie door meerdere axonen aangegeven. 70 dagen oude vrouwelijke muizen werden onderzocht; Scale Bar = 50 pm (AD), 20 pm (GI). Fout bar = SEM. N = 3 muizen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: De fibular Nerve Crush Method als eenn Assay aan kandidaat-genen betrokken bij het herstel van de NMJ Identificeer (A - B). Het mRNA niveau van twee NMJ-geassocieerde genen, de AChR gamma subunit en muskus, worden op dezelfde wijze veranderd in de TA spier van muizen gedenerveerde voor dezelfde tijdsduur . Met de toenemende tijd na zenuwletsel, het niveau van beide transcripten te verminderen, terug te keren naar de uitgangswaarde, bevestigende histologische analyse waaruit geleidelijke reïnnervatie van NMJs. Elke lijn vertegenwoordigt een individuele muis. Fout bar = standaardafwijking van het gemiddelde van de technische herhalingen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De methode die in dit handschrift biedt unieke mogelijkheden om mechanismen die betrokken zijn bij het herstel van neuromusculaire verbindingen (NMJ) te identificeren. Deze methode omvat het malen van gemeenschappelijke fibularis zenuw terwijl deze over de gastrocnemius pees bij de knie. We tonen aan dat na slechts 5 seconden van een beknelde zenuw met een tang, compleet degeneratie wordt opgemerkt door 4 dagen na het letsel. Bij jonge volwassen muizen, alpha-motor axonen beginnen te eerdere synaptische sites in de extensor digitorum longus (EDL) reinnervate na 7 dagen na het letsel, culminerend in de reformatie van presynaptische sites die niet te onderscheiden van die in uninjured muizen door 12 dagen zijn. Verder tonen we aan dat niveaus van geselecteerde NMJ-geassocieerde moleculen nauw correleren met de innervatie status van de NMJ. Belangrijk is dat deze cellulaire en moleculaire veranderingen zijn zeer reproduceerbaar tussen dieren van hetzelfde geslacht en leeftijd (figuur 5a-b) en verschaft daarmee mogelijkheden te identificeren en test factoren die werken om de NMJ herstellen. In termen van chirurgische procedures, de gemeenschappelijke fibulaire zenuwtak is zeer toegankelijk terwijl deze over de gastrocnemius pees, die slechts een kleine incisie die resulteert in weinig schade aan omringende spieren en bloedvaten.
Er zijn een aantal voordelen van de gemeenschappelijke fibularis zenuw cellulaire en moleculaire veranderingen geassocieerd met regenererend NMJs onderzoeken. De gastrocnemius pees dient als een stabiele anatomische mijlpaal om consequent te verwonden de gemeenschappelijke fibulaire zenuw op dezelfde locatie en de afstand van het doel spieren. Dit maakt het mogelijk om een betrouwbare vergelijken de mate van regeneratie van axons en reïnnervatie spieren tussen dieren van dezelfde leeftijd en geslacht. De stappen van cruciaal belang voor een dergelijk succes onder meer ervoor te zorgen dat de schade site is in overeenstemming tussen de operaties, is de volledige zenuw verliefd verkregen in elk dier, en minimale schade is ontstaan aan de omliggende structuren. Onder de spieren geïnnerveerd door de cEMEENSCHAPPELIJKE fibulaire zenuw, de tibialis anterior (TA) en extensor digitorum longus (EDL) spieren zijn uitstekende doelwitten voor de beoordeling van NMJ reparatie. Deze twee spieren zijn voornamelijk samengesteld uit snel typen spiervezels die zwaar zijn getroffen door de schade, veroudering en ziekten 5. Voor NMJ analyse, de EDL spier is vooral aantrekkelijk omdat het geheel gemonteerd op de foto om alle NMJs zonder vervormingen kan zijn. Het maakt het ook mogelijk om veranderingen correleren aan NMJs veranderingen elders in spiervezels, motorische axons en omringende cellen.
De TA en EDL spieren zijn uitgebreid gebruikt om de impact van verschillende moleculaire en leefstijlinterventies op spier- en NMJ reparatie beoordelen vanwege hun anatomische plaats 20. Echter, langdurige denervatie verandert expressie van genen met kritische functie in atrophying spiervezels, geactiveerde immuuncellen en satelliet-cellen 12-14, waardoor het moeilijker cellulaire en moleculaire ch beoordelenanges nodig om specifiek te bevorderen regeneratie van NMJs. In de hier beschreven methode wordt de fibularis zenuw wordt verpletterd in de nabijheid van de TA en EDL spieren, waardoor het lef om ze binnen 7 dagen te bereiken na de verbrijzeling bij jonge volwassen muizen. Daarom moet deze methode verlies van spiermassa en moleculaire veranderingen geassocieerd met atrophying spiervezels in de TA en EDL spieren minimaliseren.
De fibulaire zenuw verliefd protocol kan in meerdere verschillende manieren worden gewijzigd. Nerve cut letsel kan gemakkelijk worden vervangen door verbrijzeling, waardoor voor een betere real-time in vivo beeldvorming van perifere zenuwen regeneratie. Een cut verwijdert dode axon materiaal als een obstakel voor de hergroei en zorgt voor homogene schade van elke axon binnen de endoneurial buis.
Wanneer correct uitgevoerd de nervus fibularis oogje heeft weinig bijbehorende complicaties. Een probleem dat kan worden aangetroffen is het falen van de zenuw naar de oorspronkelijke NMJ targets reinnervate. Dit kan worden veroorzaakt door accidental gesneden schade aan de zenuw tijdens de operatie. Zorg ervoor dat u de fijne punt verpletterende tang controleren of er geen scherpe randen. Als op enig moment tijdens de operatie van de kwaliteit van een zenuw verliefd is twijfelachtig, kan de oorspronkelijke incisie worden uitgebreid om beter te visualiseren de zenuw. Hoewel dit de grootte van de wond verhoogt en kan extra structuren beschadigen, kan het helpen met de juiste identificatie van de nervus fibularis en de beoordeling van de vraag of een volledige verliefd werd bereikt.
De hier beschreven techniek heeft een aantal beperkingen hebben. Ten eerste is vooral nuttig bij volwassen muizen de structuren in deze dieren groot genoeg te manipuleren. Pasgeboren muizen en adolescent zijn veel kleiner, aanzienlijk verhogen van de moeilijkheidsgraad van de operatie. Ten tweede, de fibulaire zenuw bevat sensorische en motorische axonen, resulterend in denervatie van target weefsels die de tarieven van de NMJ regeneratie van invloed kunnen zijn.
De NMJ wordt erkend als een centraal plaats van pathologie in amyotrofische latmene sclerose (ALS) en veroudering. Het heeft ook te worden gerepareerd na letsel aan perifere zenuwen om te voorkomen dat afbreuk te doen aan de motorische vaardigheden en het verlies van spiermassa. De fibulaire zenuw verliefd methode moet helpen bij de identificatie en het testen van moleculen met een belangrijke rol in het herstel van de NMJ. In één benadering kan deze methode worden gebruikt om het profiel mRNA en microRNA met belangrijke rollen in verschillende stadia van NMJ regeneratie middels RNA sequentieanalyse. Het kan ook worden toegepast om selectief de functie van kandidaatgenen ingevoerd en verwijderd uit spieren bepalen. Daarnaast is deze methode leent zich goed voor testen of exogene moleculen zenuw regeneratie NMJ snelheid gebruikmaking van statische en levende imaging.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine | VetOne | 501072 | |
| Xylazine | Lloyd Inc. | 003437 | |
| Buprenorphine | Zoopharm | 1Z-73000-150910 | |
| Nair | Nair | ||
| Kim-wipes | Kimtech | 34155 | |
| Electric Razor | Braintree Scientific | CLP-64800 | |
| 80% EtOH/H20 | |||
| 10% Proviodine | |||
| 1 ml Insulin Syringe | |||
| Spring Scissors | Vannas | 91500-09 | |
| No. 15 scalpel | Braintree Scientific | SSS 15 | |
| #5 Forceps | Dumont | 11252-00 | |
| 6-0 silk suture on reverse cutting needle | Suture Express | 752B | |
| Rodent Heating Pad | Braintree Scientific | AP-R-18.5 | |
| Alexa 555 conjugated alpha-BTX | Molecular Probes | B35451 | |
| Vectashield | Vector Labs | H-1000 | |
| Olympus Stereo Zoom Microscope | Olympus | 562037192 | |
| Zeiss 700 Confocal Microscope | Zeiss | ||
| Variable-flow peristaltic perfusion pump | Fisher Scientific | 13-876-3 | |
| Aurum Total RNA Mini Kit | Bio-Rad | 7326820 | |
| Bio-Rad iScript RT Supermix | Bio-Rad | 1708840 | |
| SsoFast Evagreen Supermix | Bio-Rad | 1725200 | |
| Bio-Rad CFX96 | Bio-Rad | 1855196 | |
| Puralube Vet ointment | Puralube | 1621 | |
| Synaptotagmin-2 antibody | Antibodies-Online | ABIN401605 | |
| Neurofilament antibody | Antibodies-Online | ABIN2475842 |
References
- Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Induction, assembly, maturation and maintenance of a postsynaptic apparatus. Nat. Rev. Neurosci. 2 (11), 791-805 (2001).
- Moloney, E. B., de Winter, F., Verhaagen, J. ALS as a distal axonopathy: molecular mechanisms affecting neuromuscular junction stability in the presymptomatic stages of the disease. Front. Neurosci. 8, 252 (2014).
- Apel, P. J., Alton, T., et al. How age impairs the response of the neuromuscular junction to nerve transection and repair: An experimental study in rats. J Orthop Res. 27 (3), 385-393 (2009).
- Balice-Gordon, R. J. Age-related changes in neuromuscular innervation. Muscle Nerve Suppl. 5, S83-S87 (1997).
- Valdez, G., Tapia, J. C., Lichtman, J. W., Fox, M. A., Sanes, J. R. Shared resistance to aging and ALS in neuromuscular junctions of specific muscles. PloS one. 7 (4), e34640 (2012).
- Nguyen, Q. T., Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Pre-existing pathways promote precise projection patterns. Nat. Neurosci. 5 (9), 861-867 (2002).
- Küry, P., Stoll, G., Müller, H. W. Molecular mechanisms of cellular interactions in peripheral nerve regeneration. Curr Opin Neurol. 14 (5), 635-639 (2001).
- Gaudet, A. D., Popovich, P. G., Ramer, M. S. Wallerian degeneration: gaining perspective on inflammatory events after peripheral nerve injury. J Neuroinflammation. 8, 110 (2011).
- Chen, P., Piao, X., Bonaldo, P. Role of macrophages in Wallerian degeneration and axonal regeneration after peripheral nerve injury. Acta Neuropathol. 130 (5), 605-618 (2015).
- Chen, Z. -L., Yu, W. -M., Strickland, S. Peripheral regeneration. Annu Rev Neurosci. 30, 209-233 (2007).
- Darabid, H., Perez-Gonzalez, A. P., Robitaille, R. Neuromuscular synaptogenesis: coordinating partners with multiple functions. Nat. Rev. Neurosci. 15 (11), 703-718 (2014).
- Geuna, S. The sciatic nerve injury model in pre-clinical research. J. Neurosci. Methods. 243, 39-46 (2015).
- Batt, J. A. E., Bain, J. R. Tibial nerve transection - a standardized model for denervation-induced skeletal muscle atrophy in mice. J. Vis. Exp. (81), e50657 (2013).
- Savastano, L. E., Laurito, S. R., Fitt, M. R., Rasmussen, J. A., Gonzalez Polo, V., Patterson, S. I. Sciatic nerve injury: a simple and subtle model for investigating many aspects of nervous system damage and recovery. J. Neurosci. Methods. 227, 166-180 (2014).
- Kang, H., Lichtman, J. W. Motor axon regeneration and muscle reinnervation in young adult and aged animals. J Neurosci. 33 (50), 19480-19491 (2013).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J. Vis. Exp. (65), e3564 (2012).
- Feng, G., Mellor, R. H., et al. Imaging Neuronal Subsets in Transgenic Mice Expressing Multiple Spectral Variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).
- Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Development of the vertebrate neuromuscular junction. Annu Rev Neurosci. 22, 389-442 (1999).
- Bowen, D. C., Park, J. S., et al. Localization and regulation of MuSK at the neuromuscular junction. Dev Biol. 199 (2), 309-319 (1998).
- Gay, S., Jublanc, E., Bonnieu, A., Bacou, F. Myostatin deficiency is associated with an increase in number of total axons and motor axons innervating mouse tibialis anterior muscle. Muscle Nerve. 45 (5), 698-704 (2012).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), San Diego, Calif. 402-408 (2001).
