Abstract
Die neuromuskulären Synapse (NMJ) erfährt schädliche strukturelle und funktionelle Veränderungen als Folge des Alterns, Verletzungen und Krankheiten. Daher ist es zwingend notwendig, um die zellulären und molekularen Veränderungen bei der Aufrechterhaltung und der Reparatur NMJs beteiligt zu verstehen. Zu diesem Zweck haben wir eine Methode entwickelt, um zuverlässig und konsistent untersuchen NMJs in Mäusen zu regenerieren. Diese Nervenverletzung Verfahren umfasst das Zerkleinern des N. fibularis communis, wie es der lateralen Kopf des M. gastrocnemius Sehne in der Nähe des Knies verläuft. vorherige postsynaptischen Ziele innerhalb von 7 Tagen nach reinnervate Post-crush unter Verwendung von 70 Tage alten weiblichen Mäusen zeigen wir, dass Motoraxonen beginnen. Sie reoccupy vollständig ihre vorherigen synaptischen Bereiche von 12 Tagen. Um die Zuverlässigkeit dieser Verletzung Methode bestimmen, verglichen wir reinnervation Raten zwischen den einzelnen 70 Tage alten weiblichen Mäusen. Wir fanden, dass die Anzahl der postsynaptischen reinnervated Stellen zwischen Mäusen ähnlich war bei 7, 9 und 12 Tage nach-crush. Um festzustellen, obDiese Verletzungs Assay kann auch zum Vergleich molekularen Veränderungen in Muskeln verwendet werden, untersuchten wir Ebenen der gamma-Untereinheit des nikotinischen Rezeptors Muskel (gamma-AChR) und der muskelspezifische Kinase (MuSK). Die Gamma-AChR-Untereinheit und MuSK zu folgen Denervierung hoch oben reguliert und zurück auf ein normales Niveau folgende reinnervation von NMJs. Wir fanden eine enge Beziehung zwischen Transkriptniveaus für diese Gene und Innervation Zustand der Muskeln. Wir glauben, dass diese Methode das Verständnis der zellulären und molekularen Veränderungen bei der Reparatur der NMJ und anderen Synapsen beteiligt beschleunigen wird.
Protocol
Alle Experimente wurden unter NIH-Richtlinien und Tier Protokolle, die von der Virginia Tech Institutional Animal Care und Use Committee genehmigt durchgeführt.
1. Vorbereiten Tiere für Chirurgie
- Anästhesieren Mäuse mit einem Gemisch aus Ketamin (90 mg / kg) und Xylazin (10 mg / kg) über eine subkutane Injektion inguinal mit einer sterilen 1 ml Insulinspritze. Trägerlösung enthält eine Mischung aus 0,9% Kochsalzlösung, 17,4 mg / ml Ketamin und 2,6 mg / ml Xylazin. Legen Sie Tiere zurück in Käfigen, während für Medikamente warten zu übernehmen.
HINWEIS: Wenn die Ladungsdosis nicht ausreichend Anästhesie für die Dauer des Verfahrens vorsieht, eine zusätzliche 25% der Initialdosis injiziert werden kann. - Monitor-Tiere der Injektion für den stationären Atemfrequenz und entsprechende Depression von Erregungsniveau zu überprüfen. Überprüfen Sie Erregungsniveau mit einem Hinterfuß Prise, die keine Antwort auslösen sollte, wenn ausreichend narkotisiert.
HINWEIS: Dies dauert in der Regel 3-5min für einen jungen Erwachsenen Maus 25 bis 30 g im Durchschnitt. Wenn das Tier immer noch anspricht nach 10 min nach der Injektion ist eine zusätzliche 25% des Anästhetikums Dosis kann injiziert werden. - Bewerben Petrolatum und leichtes Mineralöl Augensalbe auf die Augen des Tieres Trockenheit zu verhindern. Entfernen Sie Tiere aus dem Käfig nehmen und auf eine saubere, ebene Fläche. Shave die gewünschte Hinterbein vom Fuß bis zum Becken einen elektrischen Haarschneider verwenden, werden nur die lateralen Seite des Gliedes auszusetzen.
- Tragen Sie einen chemischen Haarentferner auf die rasierte Stelle für 1 min. Entfernen Sie manuell die Haare Labortücher verwenden. Reinigen Sie die enthaarte Bereich mit Labor wipe in Ethanol getränkt.
2. Chirurgisches Verfahren
- Sterilisieren von chirurgischen Instrumenten über Autoklaven oder andere geeignete Verfahren. Reinigen Sie die Operationsstelle und chirurgische Board mit 80% Ethanol / H 2 0. Desinfizieren Sie die Operationsstelle mit proviodine. Platzieren Sie die Maus auf chirurgische Bord und richten mit Gliedmaßen Stützen. Behaltendas Ziel der hinteren Gliedmaßen in einer anatomisch natürlichen Position mit dem Kniegelenk verlängert leicht ohne interne oder externe Rotation.
- Platzieren Sie Tier- und Brett unter dem Operationsmikroskop. Orient auf den richtigen Einschnittstelle über die Palpation von oberflächlichen Sehenswürdigkeiten, speziell der knöchernen Kniegelenk und dem Grat zwischen der tibialis anterior und gastrocnemius Muskeln.
- Machen Sie einen ca. 3 cm Schnitt durch die Haut mit einem Skalpell oder Feder Schere, während allgemeine Pinzette zum Greifen. Machen Sie den Einschnitt senkrecht zur zugrunde liegenden Verlauf des N. fibularis communis.
- Fortsetzung der Einschnitt durch die oberflächliche Faszie, Freilegung der Bizeps femoris und vastus lateralis Muskeln. Trennen Sie diese Muskeln, indem sie durch die Verbindungs tiefe Faszie zu schneiden. Ein 1-2 cm geschnitten, sollte ausreichend sein.
- Fahren Sie die Bizeps femoris kaudal mechanischen Retraktoren mit der N. fibularis communis enthüllt.
- Verfolgen Sie die Nerven proximal, bis seine interAbschnitt mit der Sehne des lateralen Kopf des M. gastrocnemius gefunden wird. Hinweis: Die Belichtung kann zusätzliche Manipulation der eingezogenen Haut und Muskeln. Dieser Schnittpunkt wird als stabil Meilenstein für die Nervenverletzung verwendet.
- Fassen Sie den Nerv mit einer feinen Pinzette, die Spitzen in einer parallelen Weise an den seitlichen Rand der gastrocnemius Sehne ausrichten. Crush the N. fibularis communis durch die Anwendung stabil, harten Druck für 5 Sek.
- Corroborate voll verknallt des Nerven durch visuelle Inspektion durch den chirurgischen Umfang. Es wird transluzente an der Stelle der Verletzung auftreten. Wenn Mäuse, die Fluoreszenzproteine in peripheren Axonen verwenden, wird die Fluoreszenz von der Stelle der Verletzung verschwinden.
- Entfernen Sie Retraktoren und neu auszurichten Muskeln in ihren anatomischen Positionen. Schließen Sie die Inzisionsstelle mit 6-0 Seidennähten. 1-3 einfache Nähten ist ausreichend. Platzieren Maus recuperating auf einem Heizkissen in einen sauberen Käfig.
- Überwachen Sie alle Tiere für 2 Stunden nach der Opertion für die Atmung und keine negativen Reaktionen auf die Anästhesie zu überprüfen. Verwalten Sie eine anfängliche Dosis von Buprenorphin 0,05-0,10 mg / kg über eine subkutane Injektion Leisten- sofort von der Operation folgenden Erholung. Geben Sie 3 zusätzliche Dosen alle 12 Stunden über die nächsten 48 Stunden. Nach der vollständigen Genesung, Rückkehr Mäuse auf die Tierstation.
3. Isolierung und Färbung der Extensor communis digitorum (EDL) Muskeln
- Sacrifice Tiere mit Isofluran. Dispense 0,5 ml Flüssigkeit Isofluran in einen 50-ml-Röhrchen mit einem saugfähigen labwipes verpackt. Setzen Sie den unverschlossenen Röhrchen mit dem Tier in einem verschlossenen 2.500 cm 3 Kammer. Mindestens 4 min Expositions ausreichend. Test für den Verlust von bilateralen palpebral, toe-Pinch und Schwanz-Pinch Reflexe, um sicherzustellen, dass jedes Tier, bevor Sie mit Perfusion bewusstlos ist.
- Transkardial perfundiert 16 Tiere zuerst mit 10 ml 0,1 M PBS, dann wurden 25 ml 4% Paraformaldehyd in 0,1 M PBS (pH 7,4). Heparin (30 Einheiten / 20g Tiergewicht) mit dem PBS (10 Einheiten / ml) zu verhindern Blutgerinnung in kleinen kapillaren Betten, die Verbesserung der Perfusionsergebnisse hinzugefügt werden.
- Entfernen Sie die Haut bedeckt Hinterbeine durch Schere quer durch die Haut um den Umfang des Bauches zu schneiden. Ziehen Sie die Haut nach unten vorbei an den hinteren Gliedmaßen und Füße einer Pinzette.
- Entfernen Sie Oberflächenfaszie von Hintergliedmaßen durch Greifen und Peeling mit einer Pinzette. Wenn Mäuse, die Fluoreszenz-Proteine in peripheren Axonen mit, post-fix ganze Mäuse über Nacht in 4% PFA in 50-ml-Röhrchen. Spülen dreimal mit PBS.
HINWEIS: Fest Mäuse können in PBS bei 4 ° C gelagert werden. Wenn nicht, überspringen Sie diesen Schritt und fahren 3.6 ohne Post-fixierenden Tiere zu treten. - Präparieren aus EDL Muskeln 18 aus Maus Hinterextremitäten, sicher zu sein , proximale und distale Sehnen zu halten so intakt wie möglich.
- Inkubieren EDL Muskeln in Blocking-Puffer für mindestens 1 Stunde (1x PBS 0,5% Triton X-100, 3% BSA und 5% Ziegenserum enthielt).
- Stain die kontralaterale heil EDL als positive Kontrolle für die komplette NMJ Innervation. Negative Kontrollen sollten eine EDL erhalten bei 4 Tage nach der Verletzung, ein Zeitpunkt enthalten, in dem die NMJ vollständig denervierten ist, sowie eine EDL mit sekundären Antikörper gefärbt nur.
- Inkubieren Muskeln mit entsprechenden fluoreszierend markierten Sekundärantikörper Neurofilament und synaptotagmin-2 für 1 Tag zu erfassen. Waschen Sie Muskeln dreimal mit 1x PBS und je 10 min. Hinweis: Dieser Schritt kann durchgeführt werden, zusammen mit Schritt 3.10. Überspringen Sie diesen Schritt, wenn Mäuse, die Fluoreszenz-Proteine in peripheren Axonen verwenden.
- Zur Visualisierung der postsynaptic Bereich des NMJ inkubieren Muskeln mit 5 ug / ml Alexa 555-konjugierten alpha-Bungarotoxin verdünnten Puffer für mindestens 2 h in blockieren. Waschen Sie Muskeln dreimal mit 1x PBS und je 10 min.
- So montieren ganze Muskeln auf positiv geladene Objektträger aus Glas, legen Sie den Muskel direkt auf der Folie, ein paar Tropfen Glycerin hinzufügen basierten Montagemedium auf dem Objektträger geben und mit einem Deckglas. Drücken Sie die Deck gegen die Folie, um die Muskeln zu glätten. Tränken weg Eindeckmedien vom Umfang der Rutsche und Deckglas mit Labor wischt. Bewerben Nagellack die Kanten zwischen dem Deckglas und Folie zu versiegeln.
4. Imaging und Datenanalyse
- Zur Analyse der Struktur von NMJs, Bild der EDL Muskel eines konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop ausgerüstet 488, 555 und 633 nm Licht zur Anregung und Erfassung des emittierten Lichts mit 20X und 40X Ziele.
- Um ganze NMJs sichtbar zu machen, schaffen Maximum Intensity Projection Bilder von optischen secnen Abstand von 1 bis 2 um abgesehen von der niedrigsten zur höchsten erstreckt sichtbaren Bereich des NMJ. Erstellen Sie maximale Intensität Projektionen mit handelsüblichen Bildbearbeitungssoftware.
- Um die Preise von reinnervation bestimmen, zu kategorisieren NMJs als: 1) vollständig denervierten = postsynaptischen Seite völlig frei von Kontakt mit Axon ist, weniger als 5% Kolokalisation zwischen dem Axon und AChRs. 2) Teilweise innervated = das Axon teilweise überlappt die Postsynapse, 5-95% Kolokalisation zwischen dem Axon und AChRs. 3) Voll Innervation = nahezu perfekt Apposition zwischen Pre- und Post-Synapse, mehr als 95% Kolokalisation zwischen dem Axon und AChRs. Ausschließen NMJs, die senkrecht zu der Abbildungsebene liegen oder nicht vollständig in dem Bild sichtbar gemacht. Anmerkung: In all diesen Versuchen mindestens 3 Tieren und 50 NMJs pro Tier untersucht. Die Ergebnisse wurden mit einem P-Wert von weniger als 0,05 signifikant unter Verwendung eines Student-t-Test angesehen.
- Um blenden den Bediener können separate Individuen durchführendie Operation und Bildanalyse. Ohne Kenntnis der Behandlungsgruppen kann der Analysator mit NMJ scoring Ziel sein. Alternativ können Bilder randomisiert und den Operator für die Analyse ohne Kenntnis der Quelle Tier präsentiert.
5. Quantitative PCR
- Sacrifice Tiere mit Isofluran und Genickbruch. Entfernen Sie die Haut und oberflächliche Faszie bedeckt Beinmuskulatur nach 3.3 zu treten. Präparieren tibialis anterior und EDL Muskeln nach 3.4 zu treten.
- Blitzeis die gesamte tibialis anterior und EDL Muskeln in einem 1,5-ml-Röhrchen über flüssigem Stickstoff. Entfernen Sie Gewebe aus Rohr und in einem vorgekühlten Mörser teilweise in flüssigem Stickstoff eingetaucht. Grind gefrorenen Muskel in ein feines Pulver mit einem Mörser und Stößel.
- Man löst gefrorene Muskel Pulver in einen kommerziell erhältlichen RNA-Extraktion Reagenz und führen die RNA-Extraktion und genomische DNA Entfernung mit einem im Handel erhältlichen Kits des Herstellers i nachnweise.
- Führen der reversen Transkription mit einer im Handel erhältlichen reversen Transkriptase Mischung gemäß den Anweisungen des Herstellers.
- Führen Sie qPCR eines kommerziell erhältlichen Kits mit geeigneten Housekeeping-Gene (siehe Tabelle von Materialien). Verwenden Sie eine im Handel erhältliche quantitative PCR-Thermocycler zur Durchführung von PCR (siehe Tabelle der Materialien).
- Eingestellt Annealingtemperatur auf 58 ° C. Passen Sie zusätzliche Zyklierungsparameter den Spezifikationen des Herstellers von Taq-Polymerase / SYBR grün-Mix. Umfassen eine endgültige Schmelzkurve Schritt in der Programm Thermocycler bestehend aus 0,5 ° C inkremental erhöht sich von 65 ° C bis 95 ° C für die Primer-Spezifität zu testen und Dimerbildung Primers.
- Bestimmen Sie relativen mRNA - Expressionsniveaus durch die 2 - ΔΔCT Methode 21 unter Verwendung von 18S RNA als Kontroll - Gen.
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Representative Results
Der N. fibularis communis, auch genannt der N. peronaeus, ergibt sich aus dem Ischiasnerv oberhalb der Kniekehle, wo es um den Kopf der Fibula zur Vorderseite des Beins (1A) schwingt. Dort zweigt in die oberflächlichen und tiefen fibular Nerven, zusammen, um die Dorsalflexoren des Fußes und der Zehen Versorgung (Tibialis anterior, extensor digitorum longus und brevis und extensor Zehen longus) und die everters des Fußes (Peronaeus Muskeln). Dieser Nerv trägt auch sensorische Fasern, die mit dem Fußrücken und lateralen Seite der unteren Hälfte des Beines projizieren. Es ist eine relativ dünne Struktur, die aus motorischen und sensorischen Axonen. Dieser Nerv Zweig folgt einem vorhersagbaren anatomischen Verlauf. Lateral bis zum Knie, ist der Nerv meist oberflächlich , wie es die Sehne des lateralen Kopf des M. gastrocnemius (Abbildung 1 und Abbildung 2) läuft. thist die Lage als stabile Grenzstein dient , die leicht mit einem kleinen Einschnitt erreicht werden kann, eine Beschädigung der Haut und Faszie (1A) zu begrenzen. Der kleinere Durchmesser dieses Nerven, wenn sie auf den Ischias und tibialis verglichen, macht es möglich, alle Axone mit weniger Kraft zu vernichten, Verringerung der Wahrscheinlichkeit von vollständig die oberflächlichen Axone Trennen.
Mäuse nur gelb fluoreszierendes Protein (YFP) in Neuronen 17 exprimieren , wurden verwendet , um die Druckverfahren über die gemeinsame fibular Nerven zu optimieren und eindeutig regenerierenden Axone zu visualisieren. Der Nerv wurde am Rande des gastrocnemius Sehne am meisten proximal zu den Zielmuskeln zerquetscht, weil diese Seite besser zugänglich von der Stelle des Einschnitts ist. Diese Seite dient auch als zuverlässige anatomische Orientierungspunkt, die es ermöglichen, unter den Tieren des gleichen Alters und Geschlechts Regeneration von NMJs zu vergleichen. Komprimieren der Nerv für 5 Sekunden einer feinen Pinzette res mitults in das Verschwinden von YFP von der Stelle der Verletzung (2B). Jedoch bleiben die Bindegewebe und Zellen in dem Epineurium Wohnsitz zusammenhängenden, als eine Leitung für eine schnelle und genaue Regeneration von Axons zu ihrer ursprünglichen Ziele (2B) dient. In 70 Tage alten weiblichen Mäusen ist diese Verletzungen ausreichend Degeneration aller axonalen Segmente distal von dem neuronalen Soma (4B) zu verursachen.
Um zu ermitteln, wurde die Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit dieser Verletzung Methode, reinnervation des Extensor digitorum longus (EDL) Muskel untersucht. Dieser Muskel wurde aus mehreren Gründen gewählt: 1) Es ist noch proximal physikalisch von den Einschnitt und Nervenverletzungsstellen (3A) getrennt sind . Daher wird der Muskel nur durch Degeneration von Axonen trennt innervating verändert. Durch die Nähe zur Quetschstelle minimiert die Zeit, die benötigt es reinnervated und Muskel atroph werdeny. 2) Es ist in erster Linie von schnellen Art Skelettmuskelfasern zusammengesetzt, das sind anfälliger für Altern und Krankheiten. 3) Die NMJs laufen signifikante strukturelle Veränderungen während der Progression von Krankheiten und Alterung, die durch Bewegung und Kalorienrestriktion gedämpft werden kann. 4) Es ist leicht zugänglich für die Bildgebung und molekulare Manipulation (3D). 5) Es kann leicht in seine vier phalangeal Komponenten getrennt werden , das ganze montiert werden kann was es ermöglicht, vollständig Bild alle seine innervating Axone und deren Verbindungen unter Verwendung von Lichtmikroskopie (3B).
Reinnervation der zuvor frei gewordenen postsynaptischen Seiten, die nach der Fibula Nerv auf dem rechten Bein Brech wurde in drei 70 Tage alte weibliche Mäuse, die YFP in Motoraxonen bewertet. Postsynaptischen Stellen wurden fluoreszierend markierte alpha-Bungarotoxin (BTX) sichtbar gemacht unter Verwendung von, der Muskeln, selektiv und mit hoher Affinität bindet nAChrs. Die Muskeln wurden zu denervierten erachtet wird, teilweise oder vollständig nach diesen Kriterien reinnervated: 1) In denervierten Muskelfasern Motoraxonen vollständig von postsynaptischen Seiten fehlten und weniger als 5% Kolokalisation zwischen dem Axon und AChRs beobachtet. 2) Teilweise innervated Muskelfasern wurden von einigen, aber unvollständig Apposition Motoraxonen mit postsynaptischen Standorten und 5-95% Kolokalisation zwischen dem Axon kategorisiert und AChRs beobachtet. 3) In völlig innervated Muskelfasern, gab es nahezu perfekt Apposition zwischen Motor Nervenendigungen und postsynaptischen Seiten und mehr als 95% Kolokalisation zwischen dem Axon und AChRs beobachtet. Einzelne NMJs wurden von Zählungen ausgeschlossen, wenn ihre Endplatten auf der Bildebene oder das gesamte NMJ lag senkrecht nicht sichtbar gemacht wurde. Anhand dieser Kriterien hohe Übereinstimmung in der Geschwindigkeit und der Grad der reinnervation wurde untersucht unter allen Mäusen beobachtet. Bei 4 Tage nach der Andrang wurden Muskeln vollständig denervierten bei allen Tieren EXA gefundenabgebaut (4B). Dieser Befund zeigt, dass die gemeinsame fibular Nerv für 5 Sekunden zerkleinern, wie oben beschrieben, ausreicht, um alle Axone zu trennen. Von 7 Tage nach-crush, waren Nervenendigungen in den Prozess der zuvor frei gewordenen postsynaptischen Websites wieder zu besetzen (4C, 4E-F). Allerdings immer noch die meisten Muskelfasern nur gefunden wurden teilweise innervated. Mit zusätzlichen Tage nach der Andrang weiterhin Nervenendigungen in präsynaptischen Standorten und NMJs zu unterscheiden waren voll um 12 Tage (4D, 4E-F) reinnervated gefunden. Wichtig ist , dass es wenig Variabilität unter Mäuse für die gleiche Zeitdauer (4E-F) denerviert, was zeigt , dass die N. peronaeus Brech kann als Test verwendet werden reinnervation der Muskeln zwischen den Tieren des gleichen Alters und Geschlechts zu vergleichen.
Die Fähigkeit, treu zu regenerieren NMJs zwischen Tieren vergleichen bietet Möglichkeitendie zellulären Funktionen bei jedem Schritt benötigt, um vollständig zu reparieren diese Synapse verbunden zu verstehen. Um die Architektur von denervierten und regenerierende NMJs aus dem 70 Tage alten Mäusen untersuchen verwendet oben für Raten von reinnervation, hochauflösende konfokale Mikroskopie Bilder von NMJs Vergleich erhalten. Wie erwartet, ergab diese Analyse eine Reihe von Änderungen , die in α-Motor Axon Nervenenden auftreten , wie sie Muskelfasern (4G-I) reinnervate. Axonal Wachstumskegel erscheinen zu erweitern und beginnen heraus zu verzweigen , wie sie postsynaptischen Stellen (4G) in Verbindung. Diese axonalen Zweige wachsen dann über bestimmte Bereiche des Postsynapse, die ihren Höhepunkt in der nahezu vollständigen Nebeneinander des Axons Nerv der postsynaptischen Seite endet (4H-I). Weitere strukturelle Merkmale bei der Regeneration von motorischen Nervenenden, die sehr denen während der Entwicklung gefunden ähneln beobachtet, darunter mehrere Axone für die s im Wettbewerbame Ziel (4H), in gipfelte nur ein Axon Innervation eine Muskelfaser um 12 Tage nach der Andrang. Darüber hinaus bezeichnet axonalen Verzweigungen über postsynaptischen Standorten erstreckt, hierin als Sprossen, in allen Phasen nach der Verletzung beobachtet wurden (Abbildung 4E). Diese Sprossen waren sehr weit verbreitet, auch in voll innervated NMJs darauf hindeutet, dass die letzte Phase der axonalen Reparatur Rückzug von extrajunctional axonalen Verzweigungen beinhaltet. Trotz dieser offensichtlichen Veränderungen an Nervenenden, postsynaptischen Standorten blieben meist nicht zu unterscheiden in allen Phasen nach der Verletzung im Vergleich zu denen in unversehrten Muskeln, einschließlich bei 4 Tage nach der Andrang, wenn Muskelfasern vollständig denervierten zu finden sind. Es gab keine offensichtlichen Zeichen der Fragmentierung oder signifikanten Verlust und Umverteilung zu extra synaptischen Regionen AChRs. Diese Ergebnisse deuten stark darauf hin, dass der Fibula Nervenquetschung Verfahren als Test verwendet werden können, zu identifizieren und zu testen, pharmazeutischen und molekularLebensStilInterventionen tHut Reparatur von Nervenenden an den Synapsen zu fördern, einschließlich der NMJ.
Trotz der jüngsten Fortschritte, sehr wenig Fortschritte bei der Identifizierung von Muskel abstammenden Faktoren erforderlich und ausreichend, um Wartung und Reparatur der NMJ gemacht worden. Wir fragten daher, wenn die übliche Methode fibular Nervenverletzung verwendet werden können Moleküle in bestimmten Phasen des reinnervation Prozess und mit möglichen Rollen bei der Reparatur der NMJ geändert zu identifizieren. Als Beweis des Nennwerts Expressionsanalyse von zwei NMJ-assoziierten Gene, die AChR gamma - Untereinheit und die muskelspezifische Kinase MuSK 18 durchgeführt wurde. Wie bei den quantitativen PCR nachgewiesen werden diese Gene folgende Denervierung erhöht und verringert , wie NMJs (5a-b) reinnervated sind. Diese Gene werden bei 4 Tage nach der Andrang nach oben reguliert, wie dies zuvor mit berichtete vollständig denervierten Muskeln 19. Als Nerven reinnervate Muskelfasern, Niveaus dieser Gene zu verringern und rapiRückkehr ttlicher zum Ausgangswert. Unter untersuchten Tieren ist das Muster der Expression für beide Gene nahezu identisch, eine enge Korrelation zwischen molekularen und zellulären Veränderungen bei regenerierenden NMJs demonstrieren. Diese Methode bietet daher einzigartige Möglichkeiten molekulare Veränderungen mit unterschiedlichen Stadien der NMJ Regeneration assoziiert zu identifizieren.
Abb . 1: N. fibularis communis Anatomie (A) Schematische detailliert den Verlauf des Ischiasnervs und seine Endäste in Bezug auf oberflächliche und knöcherne Sehenswürdigkeiten. ScN = Ischiasnerv, TN = Nervus tibialis, SrN = Suralnerv, CPN = N. fibularis communis, SPN = fibularis superficialis Nerve, DPN = N. peronaeus profundus. Die gewünschte Inzisionsstelle angegeben. (B) Schematische Darstellung der N. fibularis communis Lage in Bezug auf umgebenden Muskeln mit der Haut entfernt.Relative Inzisionsstelle wird gezeigt, dass die inves Faszie liegt. TA = M. tibialis anterior EDL = extensor digitorum longus. (C) Exposed Ischias und N. fibularis communis. CPN kreuzt über den Musculus gastrocnemius (Gn) Sehne auf Höhe des Knies. Crush - Website in Bezug auf Sehne gezeigt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2:. Fibularis Nerv Crush Chirurgie (A) Der anfängliche Einschnitt braucht nur ein paar cm lang sein. Nach dem Eindringen durch die Haut und oberflächliche Faszie, muss der Schnitt durch die Investierung / tiefe Faszie fortgesetzt werden, liegen zwischen den Beinbizeps und TA Muskeln. (A1) Der N. fibularis communis ist leicht ohne Mikroskopie sichtbar gemacht turch den Einschnitt (Gn = Gastrocnemius-Muskel). (A2) Der Schnittpunkt der gemeinsamen N. peronaeus und gastrocnemius Sehne leicht sichtbar gemacht werden , wenn der Einschnitt verbreitert wird (nur notwendig für fotografische Zwecke). Der Andrang sollte durch die rote Linie, die senkrecht zu den Nerven und parallel zur Gn Sehne markiert an der Stelle platziert werden. (B) Die CPN ist noch leichter mit YFP transgenen Mäusen unter einem Fluoreszenz - Binokular visualisiert. (B1) Der Nerv verliert Fluoreszenz an der Stelle der Andrang, so dass für die Bestätigung einer Voll Quetschverletzungen. (B2) Eine vollständige CPN zerquetschen kann immer noch mit dem bloßen Auge und Raumbeleuchtung sichtbar gemacht werden. Der Nerv wird durchscheinend. Dieses Bild verdeutlicht die Tatsache, dass die epineurium und Überbau des CPN intakt bleiben, während gleichzeitig Schäden an umliegendes Gewebe und Blutgefäße zu begrenzen.Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3:. Anatomie des Extensor communis digitorum (EDL) Muskel (A) 3 dimensionales Bild der EDL in Bezug auf den Knochen der Maus Hinterbein. Generiert mit JAtlasView (B) teilweise seziert EDL Muskel getrennt in seine vier phalangeal Divisionen und die Kennzeichnung der von jeder Abteilung gesteuert Ziffern. (C) YFP Zweig des N. peronaeus profundus markiert , wie es die Endplatte Band der EDL Division steuert die zweite Ziffer innervates. (D) Axonal Filialen und deren Kontaktstellen können leicht identifiziert werden, so dass für eine konsistente Prüfung ausgewählter NMJs. Bitte hier klicken , um eine größere Version o anzuzeigenf dieser Figur.
Abbildung 4: Ähnliche Preise von Reinnervation zwischen Tieren des gleichen Alters und Geschlechts Analyse von NMJs in der EDL Muskel nach der N. peronaeus zerdrücken.. (A) postsynaptischen Stellen sind durch Axone in unversehrten Mäuse vollständig besetzt. (B) Bei 4 Tage nach der zerdrücken, werden Muskeln vollständig denervierten gefunden. (C) Axone beginnen Muskeln 7 Tage nach-crush zu reinnervate und (D) vollständig postsynaptischen Stellen durch 12 Tage reoccupy. (E - F) Die Rate der NMJ Wiederbelegung ist fast nicht zu unterscheiden zwischen Tieren , die für die gleiche Zeitdauer denerviert. (G - I) Repräsentative Bilder der Re-Differenzierung axonalen Nervenenden in gereift präsynaptischen Seiten. Wiederbesetzung der postsynaptischen Websites folgt einvorhersagbaren Muster, mit dem Wachstumskegel schließlich besetzen Entwicklungszweige beginnen, die vollständig postsynaptischen Websites, ohne den NMJ region.Similar zu Entwicklung erstrecken, sind postsynaptischen Websites zunächst durch mehrere nachwachsende Axone innervated aber nur ein Axon bleibt, sobald der NMJ vollständig regeneriert hat. (H) Beispiele für ausgelassene axonalen Sprossung, teilweise Innervation ohne vollständige Überlappung zwischen Vor- und postsynaptischen Vorrichtungen und Innervation durch mehrere Axone angezeigt. 70 Tage alte weibliche Mäuse wurden untersucht; Maßstabsbalken = 50 & mgr; m (AD), 20 & mgr; m (GI). Fehlerbalken = SEM. N = 3 Mäuse. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5: Die Fibula Nervenquetschung Methode alsn - Assay zur Identifizierung von Kandidatengenen , die an der NMJ Reparatur (A - B). Die mRNA - Ebene von zwei NMJ-assoziierten Gene, die AChR gamma - Untereinheit und MuSK, werden in ähnlicher Weise in den TA - Muskel von Mäusen verändert denerviert für die gleiche Zeitdauer . Mit zunehmender Zeit nach einer Nervenverletzung, Spiegel beider Transkripte verringern, zu den Ausgangswerten zurück, bestätigende histologische Analyse zeigt progressive reinnervation von NMJs. Jede Linie steht für eine individuelle Maus. Fehlerbalken = Standardfehler des Mittelwerts der technischen Replikaten. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Das Verfahren in diesem Manuskript präsentiert bietet einzigartige Möglichkeiten Mechanismen bei der Reparatur von neuromuskulären Verbindungen (NMJ) beteiligt zu identifizieren. Dieses Verfahren beinhaltet das Brechen des N. fibularis communis, wie es gastrocnemius Sehne in der Nähe des Knies verläuft. Wir zeigen, dass nach nur 5 Sekunden von Nervenkompression mit einer Zange, vollständige Degeneration um 4 Tage nach der Verletzung festgestellt wird. Bei jungen erwachsenen Mäusen, beginnen alpha-Motoraxonen vorherigen synaptischen Stellen im extensor digitorum longus (EDL) nach 7 Tagen nach der Verletzung zu reinnervate, in der Reformation von präsynaptischen Websites gipfelte, die sich von denen in unversehrten Mäusen durch 12 Tage nicht zu unterscheiden sind. Darüber hinaus zeigen wir, dass das Niveau der Auswahl NMJ-assoziierten Moleküle eng mit der Innervation Status der NMJ korrelieren. Wichtig ist , dass diese zellulären und molekularen Veränderungen in hohem Maße reproduzierbar zwischen den Tieren des gleichen Geschlechts und Alters (5a-b), Möglichkeiten bieten zu identifizieren und zu test Faktoren, die die NMJ zu reparieren handeln. In Bezug auf die chirurgische Verfahren, ist der gemeinsame fibular Nervenast sehr zugänglich, da sie über die gastrocnemius Sehne verläuft und erfordert nur einen kleinen Schnitt, die umgebenden Muskeln und Gefäße in den kleinen Schaden zur Folge hat.
Es gibt eine Reihe von Vorteilen der gemeinsamen N. peronaeus mit zellulären und molekularen Veränderungen mit regenerierenden NMJs assoziiert zu untersuchen. Die gastrocnemius Sehne dient als stabile anatomische Orientierungspunkt konsequent den gemeinsamen N. peronaeus an der gleichen Stelle und Entfernung von Zielmuskeln verletzen. Dies macht es möglich, zuverlässig die Rate der Regeneration von Axonen und reinnervation von Muskeln zwischen Tieren der gleichen Alters und Geschlechts zu vergleichen. Die Schritte entscheidend für einen solchen Erfolg gewährleisten, dass der Verletzungsstelle zwischen Operationen, voller Nervenquetschung konsistent ist, in jedem Tier erhalten und minimale Schäden an den umgebenden Strukturen aufrechterhalten. Unter der c innervierten Muskelnommon N. peronaeus, die tibialis anterior (TA) und extensor digitorum longus (EDL) Muskeln sind hervorragende Ziele für die Beurteilung der NMJ Reparatur. Diese beiden Muskeln sind in erster Linie der schnellen Art Muskelfasern zusammengesetzt , die stark betroffen sind , durch eine Verletzung, Alterung und Krankheiten 5. Für NMJ Analyse ist die EDL Muskel besonders attraktiv, weil es Voll montiert Bild alle NMJs ohne Verzerrungen sein kann. Es macht es auch möglich, mit den Veränderungen an anderer Stelle in Muskelfasern, Motor Axonen und umgebenden Zellen Änderungen bei NMJs zu korrelieren.
Die TA und EDL Muskeln wurden die Auswirkungen verschiedener molekularer und Lifestyle - Interventionen auf Muskel- und NMJ Reparatur zu beurteilen aufgrund ihrer anatomischen Lage 20 ausgiebig genutzt. Jedoch ändert Langzeit Denervierung Expression von Genen , mit kritische Funktion in atrophierenden Muskelfasern, aktivierten Immunzellen und Satellitenzellen 12-14, was es schwieriger macht zellulären und molekularen ch zu beurteilenanges erforderlich, um speziell die Regeneration von NMJs fördern. In dem hier beschriebenen Verfahren der N. peronaeus befindet sich in unmittelbarer Nähe zu den TA und EDL Muskeln zerkleinert, so dass der Nerv sie innerhalb von 7 Tagen nach der Andrang bei jungen erwachsenen Mäusen zu erreichen. Daher sollte diese Methode Verlust von Muskelmasse zu minimieren und molekularen Veränderungen im Zusammenhang mit Muskelfasern in den TA und EDL Muskeln verkümmern.
Die Fibula Nervenquetschung Protokoll kann in mehreren unterschiedlichen Moden geändert werden. Nerve Schnitt Verletzung kann leicht für Crush ersetzt werden, so dass für eine bessere Echtzeit-in-vivo-Bildgebung von peripheren Nervenregeneration. Ein Schnitt entfernt abgestorbene Axon Material als Hindernis für das Nachwachsen und sorgt für eine homogene Schaden jedes Axon innerhalb des endoneuralen Röhre.
Bei korrekter der Fibula Nerv durchgeführt verknallt hat nur wenige damit verbundenen Komplikationen. Ein Problem, das auftreten könnte, ist Ausfall der Nerven ursprünglichen NMJ Ziele zu reinnervate. Dies kann dadurch verursacht werden, accidental geschnitten Schädigung der Nerven während der Operation. Achten Sie darauf, die feinen bestückte Brechzange für scharfe Kanten zu überprüfen. Wenn zu irgendeinem Zeitpunkt während der Operation Crush die Qualität eines Nerven fraglich ist, kann der ursprüngliche Einschnitt verbreitert werden, um besser auf die Nerven zu visualisieren. Während dies die Größe der Wunde erhöht und zusätzliche Strukturen beschädigt werden kann, kann es mit richtig Identifizierung des N. peronaeus helfen und die Beurteilung, ob eine vollständige Crush erreicht.
Die hier beschriebene Technik hat ein paar Einschränkungen besitzen. Erstens ist es in erster Linie in erwachsenen Mäusen nützlich, da die Strukturen in diesen Tieren sind groß genug, um zu manipulieren. Neugeborene und Jugend Mäuse sind viel kleiner, deutlich die Schwierigkeit der Operation zu erhöhen. Zweitens enthält der N. peronaeus sensorischen und motorischen Axone, in Denervierung von Zielgewebe führt, die Raten von NMJ Regeneration beeinflussen können.
Die NMJ ist als Anlaufstelle der Pathologie in amyotrophe lat anerkanntrere Sklerose (ALS) und Alterung. Es hat auch an peripheren Nerven nach einer Verletzung repariert werden, um zu vermeiden, die motorischen Fähigkeiten beeinträchtigen und Muskelmasse zu verlieren. Die Fibula Nervenquetschung Methode sollte bei der Identifizierung und Prüfung von Molekülen mit wichtigen Rollen unterstützen die NMJ bei der Reparatur. In einem Ansatz, könnte dieses Verfahren verwendet werden Analyse zum Profil mRNA und microRNA mit Schlüsselrollen in verschiedenen Stadien der NMJ Regeneration unter Verwendung von RNA-Sequenz. Es kann auch selektiv angewendet werden, um die Funktion der Kandidaten-Gene bestimmen eingeführt und von Muskeln gelöscht. Darüber hinaus verleiht das Verfahren selbst auch die Fähigkeit von exogenen Molekülen zu testen Nerven und NMJ Regeneration mit statischen und die Bildgebung zu beschleunigen.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine | VetOne | 501072 | |
| Xylazine | Lloyd Inc. | 003437 | |
| Buprenorphine | Zoopharm | 1Z-73000-150910 | |
| Nair | Nair | ||
| Kim-wipes | Kimtech | 34155 | |
| Electric Razor | Braintree Scientific | CLP-64800 | |
| 80% EtOH/H20 | |||
| 10% Proviodine | |||
| 1 ml Insulin Syringe | |||
| Spring Scissors | Vannas | 91500-09 | |
| No. 15 scalpel | Braintree Scientific | SSS 15 | |
| #5 Forceps | Dumont | 11252-00 | |
| 6-0 silk suture on reverse cutting needle | Suture Express | 752B | |
| Rodent Heating Pad | Braintree Scientific | AP-R-18.5 | |
| Alexa 555 conjugated alpha-BTX | Molecular Probes | B35451 | |
| Vectashield | Vector Labs | H-1000 | |
| Olympus Stereo Zoom Microscope | Olympus | 562037192 | |
| Zeiss 700 Confocal Microscope | Zeiss | ||
| Variable-flow peristaltic perfusion pump | Fisher Scientific | 13-876-3 | |
| Aurum Total RNA Mini Kit | Bio-Rad | 7326820 | |
| Bio-Rad iScript RT Supermix | Bio-Rad | 1708840 | |
| SsoFast Evagreen Supermix | Bio-Rad | 1725200 | |
| Bio-Rad CFX96 | Bio-Rad | 1855196 | |
| Puralube Vet ointment | Puralube | 1621 | |
| Synaptotagmin-2 antibody | Antibodies-Online | ABIN401605 | |
| Neurofilament antibody | Antibodies-Online | ABIN2475842 |
References
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