Abstract
Нервно-мышечного соединения (НМС) претерпевает пагубное структурные и функциональные изменения в результате старения, травм и болезней. Таким образом, крайне важно понять, клеточные и молекулярные изменения, связанные с поддержанием и ремонтом NMJs. Для этой цели мы разработали метод, позволяющий надежно и последовательно исследовать регенерации NMJs у мышей. Этот метод включает в себя повреждение нерва дробления общий малоберцовый нерв, как она проходит по боковой головки икроножной мышцы сухожилия возле колена. Использование 70 день старых самок мышей, мы показали, что моторные аксоны начинают reinnervate предыдущие постсинаптические цели в течение 7 дней после давки. Они полностью оккупировать свои прежние синаптические области на 12 дней. Для того, чтобы определить надежность этого метода травмы, мы сравнили цены реиннервация между отдельными 70-дневных самок мышей. Мы обнаружили, что количество reinnervated постсинаптических участков была одинаковой у мышей на 7, 9 и 12 дней после давки. Для того, чтобы определить, является лиэта травма анализ также может быть использован для сравнения молекулярных изменений в мышцах, мы исследовали уровни гамма-субъединицы мышечного никотиновых рецепторов (гамма-АХР) и мышечно-специфической киназы (салицилаты). Субъединица гамма-AChR и мускус, чтобы высоко активируются следующие денервации и вернуться к нормальному уровню после реиннервации НМС. Мы обнаружили тесную взаимосвязь между уровнями транскриптов этих генов и состояния иннервации мышц. Мы считаем, что этот метод ускорит наше понимание клеточных и молекулярных изменений, участвующих в восстановлении НМС и других синапсов.
Protocol
Все эксперименты проводились в соответствии с руководящими принципами NIH и протоколов животных, утвержденных Tech Institutional Animal Care и использование комитета Вирджинии.
1. Подготовка животных для хирургии
- Обезболить мышей смесью кетамина (90 мг / кг) и ксилазина (10 мг / кг) через подкожную паховой инъекции стерильный 1 мл инсулиновый шприц. Раствор носитель содержит смесь 0,9% солевой раствор, 17,4 мг / мл кетамина и 2,6 мг / мл ксилазина. Поместите животных обратно в клетках в ожидании лекарств, чтобы вступили в силу.
Примечание: Если нагрузочной дозы не обеспечивает достаточное количество анестезии на время процедуры, дополнительные 25% от нагрузочной дозы могут быть введены. - Монитор животных после инъекции, чтобы проверить наличие устойчивых дыхательных ставок и соответствующего снижения уровня возбуждения. Проверьте уровень возбуждения с задней ноги шнура, который не должен вызывать никакого ответа, когда достаточно наркозом.
Примечание: Обычно это занимает 3-5мин для молодых взрослых мышей в среднем от 25 до 30 г. Если животное еще реагирует через 10 мин после инъекции 25% дополнительно анестетика нагрузочной дозы могут быть введены. - Применяют вазелин и минеральное масло свет офтальмологическую мазь для глаз животного, чтобы предотвратить сухость кожи. Удалить животных из клетки и поместите на чистую ровную поверхность. Бритье нужную заднюю конечность от стопы к тазу с помощью электрического триммера волос, подвергая только латеральной конечности.
- Применение химического удаления волос на бритой месте в течение 1 мин. Вручную удалить волосы с помощью лабораторных салфеток. Очистите область с лишили волос лаборатории салфетку пропитанную в этаноле.
2. Хирургические процедуры
- Стерилизовать хирургические инструменты в автоклаве или другим соответствующим способом. Очистите место операции и хирургической доски с 80% этанол / H 2 0. Лечить хирургический сайт с proviodine. Поместите мышь на хирургической доске и выравнивают с ограничениями конечностей. Держатьцель задних конечностей в анатомически естественном положении с коленного сустава слегка вытянута без внутреннего или внешнего вращения.
- Поместите животное и доску под операционным микроскопом. Восток в надлежащее место разреза через пальпации поверхностных ориентиров, в частности костную коленного сустава и гребне между передней большеберцовой и икроножной мышц.
- Сделать примерно 3 см разрез через кожу с помощью скальпеля или пружинные ножницы при использовании общих щипцов для захвата. Сделать надрез перпендикулярно к нижележащему ходу общий малоберцовый нерв.
- Продолжить разрез через поверхностной фасции, обнажая двуглавой мышцы бедра и мышцы широкой латеральной. Отделить эти мышцы путем разрезания через присоединенную глубокой фасции. 1-2 см разрез должен быть достаточным.
- Втяните двуглавая мышца бедра каудально с использованием механических преднатяжителями, раскрывая общий малоберцовый нерв.
- Трассировка не нерв проксимально до ее интерсекция с сухожилием боковой головки икроножной мышцы обнаруживается. Примечание: Воздействие может потребоваться дополнительное манипулирование убранном кожи и мышц. Это пересечение используется в качестве стабильного ориентира для повреждения нерва.
- Возьмитесь нерв с тонким пинцетом, совместив советы параллельным образом к боковой границе икроножной сухожилия. Измельчите общий малоберцовый нерв, применяя устойчивый, жесткое давление на 5 сек.
- Подкреплять полный давка нерва путем визуального осмотра через хирургической области. Он появится полупрозрачная на месте повреждения. При использовании мыши, экспрессирующие флуоресцентных белков в периферических аксонов, флуоресценция исчезает с места повреждения.
- Удалить преднатяжителями и перестраивать мышцы в их анатомических позициях. Закройте место разреза с 6-0 шелковыми швами. 1-3 простых швами достаточно. Поместите выздоравливает мышь на грелку в чистой клетке.
- Мониторинг всех животных в течение 2 часов после оперыния для проверки дыхания и каких-либо неблагоприятных реакций на анестезию. Администрирование первоначальной дозы бупренорфина 0,05-0,10 мг / кг с помощью подкожной инъекции паховой сразу после восстановления после операции. Дайте 3 дополнительные дозы каждые 12 ч в течение следующих 48 часов. После полного выздоровления, возвращение мышей к средству по уходу за животными.
3. Выделение и Окрашивание разгибатель большого пальца (EDL) Мышцы
- Жертвоприношение животных с помощью изофлуран. Разлить 0,5 мл жидкого изофлуран в 50 мл пробирку, заполненную абсорбирующим labwipes. Поместите кэппированную трубку с животным в герметичном 2500 см 3 камеры. По крайней мере, 4 мин экспозиции достаточно. Испытание на потерю двустороннего Глазные, носок-пинча и ущемление хвоста рефлексы, чтобы гарантировать, что каждое животное находится в бессознательном состоянии, прежде чем приступать к перфузии.
- Транскардиальную заливать 16 животных сначала с 10 мл 0,1 М PBS, а затем 25 мл 4% параформальдегида в 0,1 М PBS (рН 7,4). Гепарин (30 единиц / 20г веса животного) могут быть добавлены с помощью PBS (10 ед / мл), чтобы предотвратить свертывание крови в небольших капиллярных коек, улучшение результатов перфузии.
- Удалите оболочку, покрывающую задние конечности, используя ножницы, чтобы вырезать трансверсально через кожу по окружности живота. Пил вниз кожу мимо задние конечности и ноги с помощью щипцов.
- Удалить поверхностные фасции задних конечностей, схватывая и шелушение с пинцетом. При использовании мыши, экспрессирующие флуоресцентных белков в периферических аксонов, после фиксировать всю мышей в течение ночи в 4% PFA в 50 мл пробирки. Промыть три раза PBS.
Примечание: Фиксированный мыши могут быть сохранены в PBS при 4 ° С. Если нет, то пропустите этот шаг и перейдите к шагу 3.6 без почтовой фиксации животных. - Рассеките из EDL мышцы 18 от мыши задних конечностей, будучи уверенным , что держать проксимального и дистального сухожилия , как нетронутыми , насколько это возможно.
- Выдержите EDL мышцы в блокирующем буфере (1X PBS, содержащим 0,5% Тритон Х-100, 3% бычьего сывороточного альбумина и 5% сыворотки козьего) в течение по крайней мере 1 часа.
- Пятно контралатеральной неповрежденной EDL в качестве положительного контроля для полного NMJ иннервации. Отрицательные контроли должны включать EDL, полученный через 4 дня после травмы, момент времени, когда НМС полностью денервированная, а также EDL окрашивали только вторичным антителом.
- Инкубируйте мышцы с соответствующими флуоресцентно меченых вторичных антител для обнаружения нейрофиламентов и Synaptotagmin-2 в течение 1 дня. Вымойте мышцы три раза 1x PBS и 10 мин каждый раз. Примечание: Этот шаг может быть выполнена вместе с шагом 3.10. Пропустить этот шаг, если с помощью мыши, экспрессирующие флуоресцентных белков в периферических аксонов.
- Для визуализации postsynaptic область НМС, инкубировать мышцы с 5 мкг / мл Alexa-555 с сопряженными альфа-бунгаротоксина разведенного в блокирующем буфере в течение по крайней мере 2 часов. Вымойте мышцы три раза 1x PBS и 10 мин каждый раз.
- Чтобы смонтировать целые мышцы на положительно заряженных стеклах, поместите мышцы непосредственно на слайде, добавьте несколько капель глицерина на основе монтажа среды на слайде и накрыть покровным. Нажмите покровное против скольжения, чтобы сгладить мышцы. Замочить от крепежных средств массовой информации по периметру слайд и покровное с использованием лабораторных салфеток. Нанесите лак для ногтей, чтобы запечатать края между покровным и горкой.
4. визуализации и анализа данных
- Для анализа структуры НМС, изображения мышца EDL с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопа, оборудованного для возбуждения 488, 555 и 633 нм свет и захватить испускаемого света с 20x и 40х.
- Для того, чтобы визуализировать всю NMJs, создать проекция максимальной интенсивности изображения в оптическом диапазоне секции на расстоянии от 1 до 2 мкм друг от друга, простирающуюся от минимальных до максимальных видимой области НМС. Создание максимальных прогнозов интенсивности с использованием коммерчески доступного программного обеспечения для обработки изображений.
- Для определения цены реиннервации, классифицировать NMJs как: 1) полностью денервированная = постсинаптическая сайт полностью лишен контакта с аксона, менее чем в 5% колокализации между аксоном и АХР. 2) Частично иннервированы = аксона частично перекрывает postsynapse, 5-95% колокализацию между аксоном и АХР. 3) Полный иннервации = почти идеальный прилегание между до и после синапса, более чем на 95% колокализация между аксоном и АХР. Исключить NMJs, которые лежат перпендикулярно плоскости изображения или не полностью визуализированы в изображении. Примечание: Во всех этих экспериментах, были исследованы по крайней мере 3 животных и 50 NMJs на животное. Результаты были признаны значительным использованием критерия Стьюдента с P значением менее 0,05.
- Для того, чтобы ослепить оператора, отдельные лица могут выполнятьхирургия и анализа изображений. Без знания групп лечения, анализатор может быть объективным с NMJ скоринга. В качестве альтернативы, изображения могут быть случайным образом и представлены оператору для анализа без знания исходного животного.
5. Количественная ПЦР
- Жертвоприношение животных с помощью изофлуран и цервикальной дислокации. Снять кожу и поверхностные фасции, охватывающую мышцы ног в соответствии с шагом 3.3. Рассеките передней большеберцовой мышцы и EDL в соответствии со стадией 3.4.
- Флэш заморозить всю передней большеберцовой мышцы и EDL в 1,5 мл трубки над жидким азотом. Удалите ткань из трубки и поместить в предварительно охлажденную ступку частично погруженной в жидкий азот. Измельчите замороженные мышцы в мелкий порошок, используя ступку и пестик.
- Растворите замороженный порошок мышц в коммерчески доступный реагент для экстракции РНК и выполнения экстракции РНК и геномную ДНК, удаление с коммерчески доступного набора в соответствии с I-изготовителяnstructions.
- Выполнение обратной транскрипции с коммерчески доступным обратной транскриптазы смеси в соответствии с инструкциями изготовителя.
- Выполните КПЦР с использованием коммерчески доступного набора с использованием соответствующих генов домашнего хозяйства (см таблицу материалов). Используйте имеющийся в продаже количественный ПЦР амплификатор для проведения ПЦР (смотри таблицу материалов).
- Заданное значение температуры отжига до 58 ° C. Настройте дополнительные параметры велосипедного спецификациям производителя Taq полимеразы / SYBR зеленый микс. Включите последний шаг кривой плавления в тепловой программе Cycler, состоящей из 0,5 ° C постепенным увеличением от 65 ° C до 95 ° C, чтобы проверить на специфичности праймера и праймера образование димеров.
- Определить относительные уровни экспрессии мРНК с помощью 2 - метод ΔΔCT 21 с использованием 18S РНК в качестве контрольного гена.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Общий малоберцовый нерв, также называемый общий малоберцовый нерв, возникает из седалищного нерва над подколенной ямки, где он качается вокруг головки малоберцовой кости к переднему аспекту ног (рис 1А). Там она разветвляется на поверхностных и глубоких малоберцовой нервов, а также поставляет dorsiflexors стопы и пальцев ног (передней большеберцовой, разгибатель большого пальца и Brevis и разгибателей halluces LONGUS мышцы), а также everters стопы (малоберцовой мышцы). Этот нерв также несет чувствительные волокна, которые выступают на тыльной поверхности стопы и латеральной нижней части ноги. Это относительно тонкая структура, состоящая из моторных и сенсорных аксонов. Этот нерв ветвь следует предсказуемый анатомический курс. Боковое до колена, нерв в основном поверхностно , как он работает над сухожилием боковой головки икроножной мышцы (рисунок 1 и рисунок 2). Thэто расположение служит в качестве стабильного ориентира , который может быть легко достигнута с небольшой разрез, ограничивая повреждение кожи и фасции (рисунок 1А). Чем меньше диаметр этого нерва, по сравнению с седалищного и большеберцовых нервов, дает возможность подавить все аксоны, используя меньшее усилие, снижая вероятность полностью отрезая более поверхностный аксонов.
Мыши , экспрессирующие желтый флуоресцентный белок (YFP) только в нейронах 17 были использованы для оптимизации процедуры раздавливание на общей малоберцового нерва и однозначно визуализировать регенерирующие аксоны. Нерв был подавлен на краю икроножной сухожилии наиболее проксимально по отношению к целевым мышцам, так как этот сайт более доступным из места разреза. Этот сайт также служит в качестве надежного анатомического ориентира, что делает возможным сравнение регенерации NMJs среди животных одного и того же возраста и пола. Сжатие нерва в течение 5 сек используя тонкий пинцет РезULTS в исчезновении YFP от места повреждения (рис 2В). Тем не менее, соединительной ткани и клетки , проживающих в эпиневрии остаются смежными, выступающей в качестве канала для быстрой и точной регенерации аксонов к своим первоначальным целям (рис 2В). В 70 дней старых самок мышей, эта травма достаточно , чтобы вызвать дегенерацию всех сегментов аксонов дистальных от нейронного сомы (рис 4В).
Для того, чтобы определить надежность и воспроизводимость этого метода травмы, реиннервация из разгибатель большого пальца (EDL) мышцы исследовали. Эта мышца была выбрана по нескольким причинам: 1) Оно проксимально еще физически отделен от участков травмы Разрез и нерва (Фигура 3А). Таким образом, мышца изменяется только дегенерацией отрубленных иннервирующих аксонов. Его близость к месту давки сводит к минимуму время, необходимое для того, чтобы быть reinnervated и мышечной atrophу. 2) Она в основном состоит из быстрого типа скелетных мышечных волокон, которые более восприимчивы к старению и болезням. 3) Его NMJs претерпевают значительные структурные изменения в процессе прогрессирования заболеваний и старения, которые могут быть ослаблены с помощью физических упражнений и ограничение калорийности. 4) Он легко доступен для живого изображения и молекулярной манипуляции (рис 3D). 5) Он может быть легко разделена на четыре компонента фаланг , которые могут быть в целом монтажа делает возможным полностью изображение все его иннервирующих аксонов и их соединений с использованием световой микроскопии (рис 3б).
Реиннервация ранее освобождаемых постсинаптических участков после дробления малоберцового нерва на правой ноге была оценена в трех 70 дней старых самок мышей, экспрессирующих YFP в моторных аксонов. Постсинаптических сайты визуализировали с использованием флуоресцентно меченый альфа-бунгаротоксина (BTX), который селективно связывается и с высоким сродством к мышцам NACГКР. Мышцы считаются денервированная, частично или полностью reinnervated следуя этим критериям: 1) В денервированными мышечных волокон, моторные аксоны были полностью отсутствующим постсинаптических сайтов и менее 5% колокализации между аксоном и наблюдалась АХР. 2) Частично иннервируют мышечные волокна были классифицированы по некоторым, но неполным аппозицией моторных аксонов с постсинаптических сайтов и 5-95% колокализации между аксоном и наблюдалась АХР. 3) В полностью иннервируемых мышечных волокон, был почти совершенным аппозиция между двигателем нервных окончаний и постсинаптических участков и больше, чем 95% колокализации между аксоном и наблюдалась АХР. Отдельные НМС были исключены из подсчета, если их торцевые пластины лежали перпендикулярно к плоскости изображения или всего НМС не визуализировали. Используя эти критерии, наблюдалась у всех мышей обследованных с высоким конкорданс в скорости и степени реиннервации. Через 4 дня после давки, мышцы были найдены полностью денервированная у всех животных EXAдобывали (4В). Это открытие показывает, что дробление общий малоберцовый нерв в течение 5 сек, как описано выше, достаточно, чтобы разорвать все аксоны. К 7 дней после давки, нервные окончания были в процессе reoccupying ранее освобожденные постсинаптические участки (рис 4C, 4E-F). Тем не менее, большинство мышечных волокон были найдены до сих пор лишь частично иннервируется. С дополнительных дней после давки, нервные окончания продолжали дифференцироваться в пресинаптических сайтов и НМС были найдены полностью reinnervated на 12 дней (рис 4D, 4E-F). Важно то , что было немного вариабельность среди мышей денервированными по той же промежутка времени (рис 4E-F), демонстрируя , что дробление малоберцового нерва может быть использован как тест для сравнения реиннервацией мышц между животными одного и того же возраста и пола.
Способность точно сравнить регенерирующие NMJs между животными обеспечивает возможностипонять клеточные функции, связанные с каждым шагом, необходимого для полного ремонта этот синапс. Для того, чтобы изучить архитектуру денервированными и регенерирующих NMJs от 70 дней старых мышей, используемых выше для сравнения ставки реиннервации, были получены с высоким разрешением конфокальной микроскопии изображений НМС. Как и следовало ожидать, этот анализ выявил ряд изменений , которые происходят в α-двигательных аксонов нервных окончаний , как они reinnervate мышечные волокна (рис 4G-I). Аксональная конусы роста , по всей видимости расширяются и начинают ветвиться , как они контактируют с постсинаптические участки (4G) Рис. Эти аксонов ветви затем растут более конкретных регионах postsynapse, что привело к почти полному сопоставлением аксонов нервных окончаний с постсинаптической сайта (рис 4H-I). Дополнительные конструктивные особенности в регенерации двигателя нервных окончаний, которые весьма напоминают те, что в процессе развития наблюдались, в том числе несколько аксонов, конкурирующих за сAme мишень (рис 4H), что привело только один аксон иннервирующих одну мышечное волокно на 12 -й день после давки. Кроме того, филиалы аксонов , выходящих за пределы постсинаптических участков, упомянутых здесь как ростки, на всех этапах после травмы наблюдались (рис 4I). Эти ростки были широко распространены, даже в полностью иннервируемых НМС, предполагающих, что заключительная фаза аксонов ремонта включает в себя втягивание extrajunctional аксонов ветвей. Несмотря на эти очевидные изменения в нервных окончаний, постсинаптические участки оставались в основном неразличимы на всех этапах после травмы по сравнению с теми, в неповрежденных мышц, в том числе и через 4 дня после давки, когда мышечные волокна обнаруживаются полностью денервированная. Там не было никаких очевидных признаков фрагментации или значительных потерь и перераспределения в экстра-синаптических областях АХР. Эти данные убедительно свидетельствуют о том, что метод малоберцовый нерв на раздавливание может быть использован в качестве анализа для идентификации и тестирования молекулярного, фармакологические и стиль жизни меры вмешательства тшляпа способствовать восстановлению нервных окончаний в синапсах, в том числе НМС.
Несмотря на недавние успехи, очень незначительный прогресс был достигнут в определении мышечных происхождения факторы, необходимые и достаточные для обслуживания и ремонта НМС. Поэтому мы попросили, если общий малоберцовый метод повреждение нерва может быть использован для идентификации молекул измененными на конкретных этапах процесса реиннервацией и с потенциальной роли в восстановлении НМС. В качестве доказательства основного долга, анализа экспрессии двух НМС-ассоциированных генов, гамма - субъединица AChR и специфического для мышц киназа, мускус 18 была выполнена. Как было показано с количественной ПЦР, эти гены увеличены следующие денервации и уменьшается по мере НМС являются reinnervated (рисунок 5a-B). Эти гены активируются через 4 дня после давки, как сообщалось ранее , используя полностью денервированные мышцы 19. Как нервы reinnervate мышечных волокон, уровни этих генов уменьшают и RAPIжественной вернуться к исходному уровню. Среди исследованных животных, картина экспрессии для обоих генов почти идентичны, демонстрируя тесную корреляцию между молекулярных и клеточных изменений в регенерирующих НМС. Таким образом, этот метод предоставляет уникальные возможности для идентификации молекулярных изменений, связанных с различными стадиями регенерации НМС.
Рисунок 1:. Общий малоберцовый нерв Анатомия (А) Схематическое подробно ход седалищного нерва и его конечные ветви по отношению к поверхностным и костистых ориентиров. SCN = седалищный нерв, TN = большеберцового нерва, СРН = Sural Нервные, КПН = общий малоберцовый нерв, SPN = Поверхностные малоберцового нерва, DPN = Глубокий малоберцового нерва. Нужный участок надрез указано. (В) Схема общего малоберцового нерва расположение по отношению к окружающим мышц с удаленной кожей.Относительное место разреза показано, перекрывающий фасцию. TA = передней большеберцовой мышцы EDL = длинный разгибатель пальцев. (C) Выставленный седалищного и общий малоберцовый нерв. КПН пересекает икроножной мышцы (Gn) сухожилии на уровне колена. Давка сайта по отношению к сухожилию показано на рисунке. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2:. Общий малоберцовый нерв Давка хирургии (А) Первичный надрез должен быть только несколько сантиметров в длину. После проникновения через кожу и поверхностной фасции, разрез должен быть продолжен через инвестирование / глубокой фасции, заключенном между двуглавой мышцы бедра и мышц TA. (A1) Общий малоберцовый нерв легко визуализируется без микроскопии тhrough разреза (Gn = икроножной мышцы). (А2) Пересечение общий малоберцовый нерв и икроножной сухожилие можно легко визуализировать , если надрез расширен (необходимо только для фотографических целей). Давка должен быть помещен в месте, отмеченной красной линии, перпендикулярной к нерву и параллельно сухожилие Оп. (В) КПН еще более легко визуализируют с помощью YFP трансгенных мышей под флуоресцентным объема рассекает. (B1) нерв теряет флуоресценцию на месте давки, что позволяет определить полную размозжение. (B2) Полный КПН давка еще можно визуализировать невооруженным глазом и комнатном освещении. Нерв станет прозрачным. Этот образ подчеркивает тот факт, что эпиневрий и надстройкой КПН остаются нетронутыми, одновременно ограничивая повреждение близлежащих тканей и кровеносных сосудов.Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рис . 3: Анатомия разгибатель большого пальца (EDL) мышце (A) 3 двухмерное изображение ДЭС по отношению к кости задней конечности мыши. Генерируемой с использованием JAtlasView (B) Частично расчлененный EDL мышц разделяют на четыре фаланг подразделений и маркировки цифр , контролируемых каждым делением. (C) YFP маркированы ветвь глубокого малоберцового нерва , как он иннервирует концевой панели полосу разделения EDL , контролирующего вторую цифру. (D) аксональная филиалов и их контактные участки могут быть легко идентифицированы, что обеспечивает последовательное изучения отдельных НМС. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию Oе эта цифра.
Рисунок 4: аналогичные показатели реиннервация между животными того же возраста и секс Анализ НМС в мышцах EDL после дробления малоберцовой нерва.. (A) постсинаптической сайты полностью занимают аксонов в неповрежденных мышей. (B) Через 4 дня после давки, мышцы встречаются полностью денервированная. (C) Аксоны начинают reinnervate мышцы через 7 дней после наезда и (D) полностью реоккупирует постсинаптические участки на 12 дней. (E - F) Скорость NMJ повторного размещения практически неотличимы от животных денервированная для той же длины времени. (G - I) Типичные изображения повторной дифференциации аксонов нервных окончаний в созревших пресинаптических сайтов. Реоккупации постсинаптических участков следует запредсказуемый шаблон, начиная с конусом роста развивающихся отраслей, которые в конечном счете полностью занимают постсинаптические участки без выходящие за пределы NMJ region.Similar для развития, постсинаптические участки первоначально иннервируют многократного повторного растущих аксонов, но только один аксон остается после того, как НМС полностью регенерировать. (H) Примеры обильной аксонов, частичная иннервации без полного перекрытия между предварительными и постсинаптических аппаратов и иннервации по нескольким аксонов указанных. 70 дневных самок мышей исследовали; Шкала бар = 50 мкм (AD), 20 мкм (GI). бар ошибки = SEM. N = 3 мышей. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5: Нерв малоберцовой Измельчите метод какп анализа для идентификации генов - кандидатов , участвующих в Ремонт НМС (А - В). Уровень мРНК двух НМС-ассоциированных генов, гамма - субъединицы АХР и мускуса, аналогичным образом изменены в TA мышцы мышей денервированная для той же длины времени , С увеличением времени травмы пост нерва, уровни обоих транскриптов уменьшается, возвращаясь к исходному уровню, подтверждающей гистологический анализ показывает прогрессивное реиннервация НМС. Каждая строка представляет собой отдельную мышь. Бар Error = стандартная ошибка среднего значения технических повторах. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Метод, представленный в этой рукописи предоставляет уникальные возможности для выявления механизмов, участвующих в восстановлении нервно-мышечных синапсах (НМС). Этот метод включает в себя дробление общий малоберцовый нерв, как она проходит через икроножной сухожилия возле колена. Покажем, что после всего лишь 5 сек сжатия нерва с пинцетом, полное вырождение отмечена 4 дня после травмы. У молодых взрослых мышей, альфа-моторные аксоны начинают reinnervate предыдущие сайты синаптические в длинный разгибатель пальцев (EDL) в течение 7 дней после травмы, что привело к реформированию пресинаптических сайтов, которые неотличимы от тех, в неповрежденной мышей на 12 дней. Кроме того, мы показали, что уровни некоторых НМС-ассоциированных молекул тесно коррелирует со статусом иннервации НМС. Важно отметить, что эти клеточные и молекулярные изменения высокой воспроизводимостью между животными одного и того же пола и возраста (рис 5а-б), предоставляя возможности для выявления и TESт факторы, которые действуют на ремонт НМС. С точки зрения хирургических процедур, общий малоберцовый нерв ветвь очень доступна, как она проходит через икроножной сухожилие, требуя только небольшой надрез, что приводит к небольшому повреждению окружающих мышц и сосудов.
Есть целый ряд преимуществ использования общего малоберцового нерва для изучения клеточных и молекулярных изменений, связанных с регенерирующим NMJs. Икроножной сухожилие служит стабильной анатомического ориентира последовательно травмировать общий малоберцовый нерв на том же месте, и расстояние от целевых мышц. Это позволяет надежно сравнить скорость регенерации аксонов и реиннервацией мышц между животными одного и того же возраста и пола. Шаги, имеющие решающее значение для такого успеха включают в себя обеспечение того, чтобы место повреждения согласуется между операций, полный нерв давка получают в каждом животном, и минимальный ущерб выдержан окружающих структур. Среди мышц иннервируемых Common малоберцовой нерва, передней большеберцовой (TA) и разгибатель большого пальца (EDL) мышцы являются отличными мишенями для оценки NMJ ремонта. Эти две мышцы в основном состоят из быстрых мышечных волокон типа, которые серьезно пострадали от травм, старения и болезней 5. Для NMJ анализа, мышцы EDL является особенно привлекательным потому, что она может быть цельной смонтированный на изображение все НМС без искажений. Это также делает возможным соотнести изменения в NMJs с изменениями в других местах в мышечных волокнах, моторных аксонов и окружающих клеток.
Мышцы TA и EDL широко используются для оценки влияния различных молекулярных и образа жизни вмешательств на мышцы и NMJ ремонта из - за их анатомического расположения 20. Тем не менее, долгосрочный денервации изменяет экспрессию генов с критической функции в атрофирования мышечных волокон, активированные иммунные клетки и клетки - сателлиты 12-14, что делает его более трудным для оценки клеточной и молекулярной чANGES требуется специально способствуют регенерации НМС. В способе, описанном здесь малоберцовой нерва измельчается в непосредственной близости к мышцам TA и EDL, позволяя нерв достичь их в течение 7 дней после давку у молодых взрослых мышей. Таким образом, этот метод следует свести к минимуму потерю мышечной массы и молекулярных изменений, связанных с атрофировались мышечных волокон в мышцах TA и EDL.
Протокол малоберцовой нерва давка может быть изменена в нескольких различных модах. Нервные травмы порез может быть легко заменен на толчее, что позволяет лучше в режиме реального времени в естественных условиях визуализации регенерации периферических нервов. Разрез удаляет мертвые аксонов материал как препятствие для восстановления роста и обеспечивает однородное повреждение каждого аксона в пределах endoneurial трубки.
При правильном выполнении малоберцовой нерва давка имеет несколько связанных с ним осложнений. Одна из проблем, которая может столкнуться является неспособность нерва reinnervate оригинальные NMJ цели. Это может быть вызвано в соотвidental сократить травмы нерва во время операции. Обязательно проверьте остроконечный дробильно щипцов для каких-либо острых краев. Если в любой момент во время операции качество нерва давка вызывает сомнения, оригинальный разрез может быть расширен, чтобы лучше визуализировать нерв. В то время как это увеличивает размер раны и может привести к повреждению дополнительные структуры, он может помочь с правильно идентифицировать малоберцового нерва и оценки, было ли достигнуто полное раздавливание.
Техника, описанная здесь действительно обладает несколько ограничений. Во-первых, это полезно, в основном у взрослых мышей, как структуры, у этих животных достаточно велики, чтобы манипулировать. Новорожденные и мышей-подростков намного меньше, значительно увеличивая сложность операции. Во-вторых, малоберцовой нерв содержит сенсорные и моторные аксоны, что приводит к денервации тканей-мишеней, которые могут повлиять на скорость восстановления НМС.
NMJ признается в качестве координационного места патологии в амиотрофического Latрального склероз (БАС) и старение. Он также должен быть восстановлен после повреждения периферических нервов, чтобы избежать ухудшения двигательных навыков и потери мышечной массы. Метод малоберцовой нерва давка должна помочь в идентификации и тестирования молекул важных ролей в ремонте НМС. В одном подходе, этот метод может быть использован для профилирования мРНК и микроРНК с ключевыми роль на разных этапах регенерации NMJ с использованием анализа последовательности РНК. Он также может быть применен для селективного определения функции генов-кандидатов, введенных и удаленных от мышц. Кроме того, этот метод хорошо подходит для тестирования способности экзогенных молекул ускорить нерва и NMJ регенерации с помощью статического и живого изображения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine | VetOne | 501072 | |
| Xylazine | Lloyd Inc. | 003437 | |
| Buprenorphine | Zoopharm | 1Z-73000-150910 | |
| Nair | Nair | ||
| Kim-wipes | Kimtech | 34155 | |
| Electric Razor | Braintree Scientific | CLP-64800 | |
| 80% EtOH/H20 | |||
| 10% Proviodine | |||
| 1 ml Insulin Syringe | |||
| Spring Scissors | Vannas | 91500-09 | |
| No. 15 scalpel | Braintree Scientific | SSS 15 | |
| #5 Forceps | Dumont | 11252-00 | |
| 6-0 silk suture on reverse cutting needle | Suture Express | 752B | |
| Rodent Heating Pad | Braintree Scientific | AP-R-18.5 | |
| Alexa 555 conjugated alpha-BTX | Molecular Probes | B35451 | |
| Vectashield | Vector Labs | H-1000 | |
| Olympus Stereo Zoom Microscope | Olympus | 562037192 | |
| Zeiss 700 Confocal Microscope | Zeiss | ||
| Variable-flow peristaltic perfusion pump | Fisher Scientific | 13-876-3 | |
| Aurum Total RNA Mini Kit | Bio-Rad | 7326820 | |
| Bio-Rad iScript RT Supermix | Bio-Rad | 1708840 | |
| SsoFast Evagreen Supermix | Bio-Rad | 1725200 | |
| Bio-Rad CFX96 | Bio-Rad | 1855196 | |
| Puralube Vet ointment | Puralube | 1621 | |
| Synaptotagmin-2 antibody | Antibodies-Online | ABIN401605 | |
| Neurofilament antibody | Antibodies-Online | ABIN2475842 |
References
- Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Induction, assembly, maturation and maintenance of a postsynaptic apparatus. Nat. Rev. Neurosci. 2 (11), 791-805 (2001).
- Moloney, E. B., de Winter, F., Verhaagen, J. ALS as a distal axonopathy: molecular mechanisms affecting neuromuscular junction stability in the presymptomatic stages of the disease. Front. Neurosci. 8, 252 (2014).
- Apel, P. J., Alton, T., et al. How age impairs the response of the neuromuscular junction to nerve transection and repair: An experimental study in rats. J Orthop Res. 27 (3), 385-393 (2009).
- Balice-Gordon, R. J. Age-related changes in neuromuscular innervation. Muscle Nerve Suppl. 5, S83-S87 (1997).
- Valdez, G., Tapia, J. C., Lichtman, J. W., Fox, M. A., Sanes, J. R. Shared resistance to aging and ALS in neuromuscular junctions of specific muscles. PloS one. 7 (4), e34640 (2012).
- Nguyen, Q. T., Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Pre-existing pathways promote precise projection patterns. Nat. Neurosci. 5 (9), 861-867 (2002).
- Küry, P., Stoll, G., Müller, H. W. Molecular mechanisms of cellular interactions in peripheral nerve regeneration. Curr Opin Neurol. 14 (5), 635-639 (2001).
- Gaudet, A. D., Popovich, P. G., Ramer, M. S. Wallerian degeneration: gaining perspective on inflammatory events after peripheral nerve injury. J Neuroinflammation. 8, 110 (2011).
- Chen, P., Piao, X., Bonaldo, P. Role of macrophages in Wallerian degeneration and axonal regeneration after peripheral nerve injury. Acta Neuropathol. 130 (5), 605-618 (2015).
- Chen, Z. -L., Yu, W. -M., Strickland, S. Peripheral regeneration. Annu Rev Neurosci. 30, 209-233 (2007).
- Darabid, H., Perez-Gonzalez, A. P., Robitaille, R. Neuromuscular synaptogenesis: coordinating partners with multiple functions. Nat. Rev. Neurosci. 15 (11), 703-718 (2014).
- Geuna, S. The sciatic nerve injury model in pre-clinical research. J. Neurosci. Methods. 243, 39-46 (2015).
- Batt, J. A. E., Bain, J. R. Tibial nerve transection - a standardized model for denervation-induced skeletal muscle atrophy in mice. J. Vis. Exp. (81), e50657 (2013).
- Savastano, L. E., Laurito, S. R., Fitt, M. R., Rasmussen, J. A., Gonzalez Polo, V., Patterson, S. I. Sciatic nerve injury: a simple and subtle model for investigating many aspects of nervous system damage and recovery. J. Neurosci. Methods. 227, 166-180 (2014).
- Kang, H., Lichtman, J. W. Motor axon regeneration and muscle reinnervation in young adult and aged animals. J Neurosci. 33 (50), 19480-19491 (2013).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J. Vis. Exp. (65), e3564 (2012).
- Feng, G., Mellor, R. H., et al. Imaging Neuronal Subsets in Transgenic Mice Expressing Multiple Spectral Variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).
- Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Development of the vertebrate neuromuscular junction. Annu Rev Neurosci. 22, 389-442 (1999).
- Bowen, D. C., Park, J. S., et al. Localization and regulation of MuSK at the neuromuscular junction. Dev Biol. 199 (2), 309-319 (1998).
- Gay, S., Jublanc, E., Bonnieu, A., Bacou, F. Myostatin deficiency is associated with an increase in number of total axons and motor axons innervating mouse tibialis anterior muscle. Muscle Nerve. 45 (5), 698-704 (2012).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), San Diego, Calif. 402-408 (2001).
