Introduction
مغذيات تعليق القاعية تلعب أدوارا أساسية في أداء النظم الإيكولوجية البحرية 1. من خلال تصفية كميات كبيرة من المياه 2،3، وإزالة وتفرز الجسيمات (العوالق والمخلفات) والمركبات الذائبة 1 (والمراجع فيها) والتي تشكل عاملا مهما من بين القاعية البحرية اقتران 4،5 والمغذيات الدراجات 6،7. قياس بدقة الجسيمات وحلت المركبات إزالتها والتي تفرز مغذيات تعليق القاعية (مثل الإسفنج، المزقييات، الأشواك، وذوات الصدفتين) هو أمر أساسي لفهم علم وظائف الأعضاء، والتمثيل الغذائي، والبيئة التغذية الخاصة بهم. جنبا إلى جنب مع ضخ قياسات معدل، فإنه يمكن أيضا تقدير حجم تدفقات المواد الغذائية بوساطة هذه الكائنات والتأثير البيئي على نوعية المياه فضلا عن العمليات على نطاق والنظام البيئي.
اختيار الطريقة المناسبة لقياس إزالة والإنتاج معدلات الجسيمات وكوم المنحلجنيه فلتر مغذيات تعليق أمر حاسم للحصول على بيانات موثوق بها بشأن نشاط التغذية من 8. كما أشار Riisgård وغيرها، غير لائقة النتائج منهجيات التحيز وتشويه ظروف تجريبية، إنتاج تقديرات غير صحيحة من الابتلاع وإفراز مواد معينة، ويمكن أن يؤدي إلى تقدير خاطئ لتدفقات المواد الغذائية المصنعة من قبل هذه الكائنات.
طريقتين المستخدمة في معظم الأحيان لقياس جسيمات وتدفقات المغذيات الذائبة في مغذيات الترشيح تنطوي إما حضانة (تقنيات غير المباشرة) أو جمع في وقت واحد من المحيط والمياه الزفير (تقنيات المباشرة). وتعتمد تقنيات الحضانة على قياس معدل التغير في تركيز الجسيمات والمواد الغذائية الذائبة في الماء المحتضنة، وتقدير معدلات الإنتاج أو إزالة مقارنة مع الضوابط الكافية 8. ومع ذلك، أرفق كائن حي في غرفة الحضانة يمكن أن يغير feedin لهاز وضخ السلوك نتيجة للتغيرات في النظام التدفق الطبيعي، وذلك بسبب انخفاض الأكسجين و / أو في تركيز المواد الغذائية، أو بسبب تراكم مركبات افرازه في 7،9 المياه الحضانة (والمراجع فيها). بالإضافة إلى آثار الولادة وإمدادات المياه المعدلة، وجود تحيز كبير من التقنيات حضانة ينبع من آثار إعادة الترشيح (انظر على سبيل المثال 10). على الرغم من أن بعض هذه المشاكل المنهجية التي تم التغلب عليها باستخدام حجم المناسب وشكل سفينة الحضانة 11 أو مع إدخال نظام جرس جرة إعادة تدوير في الموقع 12، هذا الأسلوب غالبا ما يقلل إزالة والإنتاج أسعار الفائدة. قياس استقلاب المركبات الذائبة مثل النيتروجين المذاب العضوية (DON) والكربون (DOC) أو المواد الغذائية غير العضوية، وقد ثبت أن تكون عرضة بشكل خاص لالتحيزات الناجمة عن تقنيات الحضانة 13.
في أواخر 60s و 70s في وقت مبكر، هنري Reiswig9،14،15 رائدا في تطبيق تقنيات المباشرة لتحديد إزالة الجسيمات من الإسفنج العملاقة في منطقة البحر الكاريبي، عن طريق أخذ عينات بشكل منفصل الماء استنشاق والزفير من قبل الكائنات الحية في الموقع. نظرا لصعوبة تطبيق تقنية Reiswig على مغذيات تعليق أصغر وفي ظروف تحت الماء أكثر تحديا، واقتصر الجزء الأكبر من البحوث في هذا المجال إلى المختبر (في المختبر) استخدام تقنيات حضانة غير المباشرة في الغالب 16. أصلحت ياهيل وزملاؤه مباشرة في Reiswig في تقنية الموقع على العمل في ظروف نطاق أصغر. طريقتهم، وصف INEX 16، يقوم على أخذ العينات تحت الماء في وقت واحد من الماء استنشاقه (في) والزفير (خروج) من قبل الكائنات الحية دون عائق. وتراكيز مختلفة من مادة (على سبيل المثال، والبكتيريا) بين زوج من عينات (INEX) يوفر قدرا من الاحتفاظ (أو الإنتاج) من هذه المادة من قبل الحيوان. تقنية INEX توظف أنابيب مفتوحة وتعتمد على طائرة إفراغي التي تنتجها النشاط ضخ الكائن درس ليحل محل سلبي على المياه المحيطة في أنبوب جمع. في حين ياهيل وزملاؤه طبقت بنجاح هذه التقنية في دراسة شملت أكثر من 15 تعليق مختلف مغذيات الأصناف (على سبيل المثال، 17)، يتم تقييد طريقة من مستوى عال من الممارسة والخبرة اللازمة، حسب حجم ضئيلة من بعض فتحات إفراغي، و حالة البحر.
للتغلب على هذه العقبات، قمنا بتطوير تقنية بديلة تقوم على شفط رقابة من الماء عينات من خلال أنابيب دقيقة (القطر الخارجي <1.6 مم). وكان لدينا هدف إلى إنشاء جهاز بسيط وموثوق بها، وغير مكلفة من شأنها أن تسمح نظيفة وتسيطر عليها في عينات المياه خارج الوضع من وجهة نظر محددة جدا، مثل فتحة إفراغي من مغذيات تعليق القاعية. أن تكون فعالة، وطريقة يجب أن يكون غير تدخلية حتى لا تؤثر على نظام تدفق المحيطة أو تعديل بehavior من الكائنات التي شملتها الدراسة. ويطلق على الجهاز المعروضة هنا VacuSIP. هو تبسيط نظام SIP التي وضعتها ياهيل وآخرون. (2007) 18 لأخذ العينات نقطة أساس ROV في أعماق البحار. وVacuSIP هو أرخص بكثير من SIP الأصلي وتم تكييفه للعمل على أساس الغوص. وقد صمم هذا النظام وفقا للمبادئ التي قدمت واختبارها من قبل رايت وستيفنز (1978) 19 وMøhlenberg وRiisgård (1978) (20) لبيئة معملية.
وعلى الرغم من تصميم نظام VacuSIP لفي دراسات الموقع من عملية التمثيل الغذائي للمغذيات تعليق القاعية، ويمكن أن تستخدم أيضا لدراسات مخبرية وحيثما هو مطلوب، عينة المياه نقطة مصدر التحكم ونظيفة. هذا النظام هو مفيد خصوصا عندما يطلب من التكامل على فترات طويلة (مين ساعة) أو في الفلترة الموقع. وقد استخدم VacuSIP بنجاح في المختبر ياهيل منذ عام 2011، ولديه أيضااستخدمت في اثنين من الدراسات التي أجريت مؤخرا من تدفقات المواد الغذائية بوساطة أنواع الإسفنج البحر الكاريبي والبحر الأبيض المتوسط 21 (مورجانتي آخرون المقدمة).
استخدام عينات محددة، ومدة أخذ العينات لفترات طويلة، والظروف الميدانية، التي يتم تطبيقها VacuSIP، يستلزم بعض الانحرافات من بروتوكولات المحيطات القياسية لجمع وتصفية وتخزين العينات لمدة التحاليل الحساسة. للحد من مخاطر التلوث من قبل النظام VacuSIP أو احتمال تعديل المياه عينات من النشاط البكتيري بعد جمع، نحن اختبار مختلفة في إجراءات الترشيح وتخزين الموقع. تم فحص الأجهزة المختلفة الترشيح، والسفن جمع، وإجراءات تخزين من أجل تحقيق هذه التقنية الأكثر مناسبة لتحليل حل غير العضوية (PO 4 3-، أكاسيد النيتروجين - NH 4 +، شافي 4) والعضوية (DOC + DON) مركبات، وفائقة العوالق (<1081؛ م) والجسيمات العضوية (POC + PON) أخذ العينات. لمزيد من خفض خطر التلوث، خاصة في ظل الظروف الميدانية، تم تخفيض عدد من الخطوات التعامل إلى الحد الأدنى. يتم توجيه شكل البصرية التي يتم عرضها في طريقة لتسهيل التكاثر ويقلل من الوقت اللازم لتطبيق كفاءة هذه التقنية.
نبذة عن النظام
لأخذ عينات من الماء في الموقع التي يتم ضخها من مغذيات تعليق مع فتحات زافر صغيرة مثل 2 مم، هو تصور النشاط ضخ كل عينة لأول مرة عن طريق الإفراج عن تصفيتها فلوريسئين مصبوغ مياه البحر بالقرب من فتحة المستنشق (ق) ومراقبة التدفق من إفراغي الفتحة 16 (انظر أيضا الشكل 2B في 18). الماء استنشاق والزفير من قبل عينة الدراسة (incurrent وإفراغي) ثم يتم أخذ عينات في وقت واحد باستخدام زوج من أنابيب دقيقة مثبتة على مناور مبنية خصيصا أو على اثنين من "عالسيدة "لترايبود المحمولة مرنة رأسا على عقب (الشكل 1 والتكميلية فيديو 1). ويتم جمع المياه استنشاقه من قبل كائن الدراسة عن طريق وضع بعناية نهاية القريبة من أنبوب واحد داخل أو بالقرب من فتحة المستنشق للكائن الحي الدراسة. متطابقة ثم يتم وضع أنبوب داخل فتحة إفراغي. وتتطلب هذه العملية رعاية جيدة لتجنب الاتصال أو اضطراب الحيوان، على سبيل المثال، من خلال إعادة تعليق الرواسب. للبدء في أخذ العينات، غطاس يخترق الحاجز في وعاء جمع بإبرة حقنة تعلق على النهاية البعيدة من كل أنبوب، والسماح للضغط المياه الخارجية لإجبار المياه عينات في الإناء من خلال أنبوب أخذ العينات. وتبدأ شفط من فراغ إنشاؤها مسبقا في قارورة واختلاف الضغط بين الماء الخارجي وعاء العينة إجلاء .
لضمان جمع نظيفة من المياه الزفير وتجنب شفط عرضي AMBIوالأنف والحنجرة المياه 16، يحتاج معدل أخذ العينات الماء إلى أن يبقى على معدل أقل بكثير (<10٪) من معدل تدفق إفراغي. يتم التحكم في معدل الامتصاص من طول الأنبوب وقطره الداخلي (ID). كما يضمن القطر الداخلي صغير حجم القتلى لا يكاد يذكر (<200 ميكرولتر لكل متر من الأنابيب). أخذ العينات على فترات طويلة (دقائق إلى ساعات) يجعل من الممكن دمج patchiness المتأصل في معظم المواد المثيرة للاهتمام. للتأكد من أن العينات يتم الاحتفاظ بشكل كاف في جلسات أخذ العينات تحت الماء لفترات طويلة فضلا عن النقل إلى المختبر، وهو في الترشيح الموقع يستحب للالتحاليل الحساسة. وأملت اختيار السفن أخذ العينات، والتجمع، والترشيح، وأنابيب من الكائنات دراسة ومسألة بحثية محددة. البروتوكول هو موضح أدناه يفترض أن ملف تعريف التمثيل الغذائي الكامل هو من مصلحة (لمحة عامة انظر الشكل 2). ومع ذلك، فإن طبيعة وحدات من هذا البروتوكول يسمح وأو تعديل من السهل استيعاب مخططات أخذ العينات أبسط أو حتى مختلفة جدا. لمحة التمثيل الغذائي الكامل، ينبغي أن يتضمن بروتوكول أخذ العينات الخطوات التالية: (1) التصور التدفق. (2) التغذية أخذ العينات فائقة العوالق (العوالق <10 ميكرون). (3) أخذ العينات غير العضوية المغذيات امتصاص وإفراز (باستخدام مرشحات في خط)؛ (4) أخذ العينات حل امتصاص العضوية وإفراز (باستخدام مرشحات في خط)؛ (5) التغذية الجسيمات وإفراز (باستخدام مرشحات في خط)؛ (6) كرر الخطوة 2 (فائقة العوالق التغذية كما فحص الجودة)؛ (7) تدفق التصور.
عندما يكون ذلك ممكنا من الناحية اللوجستية، فمن المستحسن أن القياسات الشخصية الأيضية هي مجتمعة مع معدل الضخ (على سبيل المثال، الأسلوب سرعة صبغ الجبهة، في 16) وكذلك مع القياسات التنفس. من الأفضل أخذ هذه القياسات في بداية ونهاية الدورة أخذ العينات. لقياس التنفس، optodes تحت الماء أو الأقطاب الكهربائية الصغيرة هي الافضل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. خطوات التحضيرية وتنظيف إجراءات
- محلول تنظيف
- ارتداء ملابس واقية، معطف المختبر، والقفازات في جميع الأوقات. تنفيذ هذه الخطوات التحضيرية في مساحة نظيفة خالية من الغبار والدخان.
- إعداد الهيدروكلوريك حل 5-10٪ حمض (حمض الهيدروكلوريك) مع الطازجة، والجودة العالية، والماء المقطر مزدوجة.
- إعداد 5٪ مزيج الأساسي للذوبان عالية من انيوني وغير الأيونية حل السطحي (انظر قائمة المواد) مع الطازجة، والجودة العالية، والماء المقطر مزدوجة.
- تخزين جميع الحلول في نظيفة، وغسلها حمض الحاويات.
- الخطوات التحضيرية وإجراءات التنظيف (في المختبر)
ملاحظة: إذا مركبات الفوسفور ليست ذات فائدة، ويمكن استبدال غسل حمض الهيدروكلوريك من نوعية عالية من حمض الفوسفوريك (H 3 PO 4) غسل (8٪ H 3 PO 4 التركيز النهائي).- ارتداء ملابس واقية، معطف المختبر، والقفازات في جميع الأوقات.
- غسلجهاز أخذ العينات (باستثناء الفولاذ المقاوم للصدأ Swinney حامل المرشح في الخط) مع كمية وافرة من المياه عالية النقاء. ترك الجهاز تمرغ في 5-10٪ من محلول حمض الهيدروكلوريك بين عشية وضحاها. شطف الجهاز مرة أخرى مع كمية وافرة من المياه ذات الجودة العالية المقطر المزدوج.
- غسل الفولاذ المقاوم للصدأ أصحاب Swinney مرشح في خط مع كمية وافرة من المياه عالية النقاء. ترك أصحاب مرشح تمرغ في 5٪ مزيج الأساسي للذوبان عالية من أنيونية والسطحي غير أيوني الحل بين عشية وضحاها. شطف لهم مرة أخرى مع وافرة المياه ذات الجودة العالية المقطر المزدوج.
- تجف كل جهاز أخذ العينات، والانتهاء منها في رقائق الألومنيوم والاحتفاظ بها في علبة نظيفة حتى الاستخدام.
- السيطرة على معدل شفط
- السيطرة على معدل أخذ العينات عن طريق ضبط طول والقطر الداخلي للأنابيب تناول وفقا لعمق العمل المخطط له ودرجة حرارة الماء. استخدام المعادلة التالية (مشتقة من المعادلة هاجن-بوازوي تستخدم لجمعة كاملاطورت تدفق أنابيب الصفحي) كدليل:
حيث F = معدل التدفق (سم 3 دقائق -1)، ΔP = فرق الضغط (بار)، ص = أنابيب مدخل دائرة نصف قطرها الداخلي (سم)، K = 2.417 × 10 -9 (ثانية -2)، L = طول الأنبوب (سم )، V = اللزوجة المياه (ز سم -1 ثانية -1). انظر الجدول رقم 1 لمزيد من التفاصيل. - حافظ على معدل أخذ العينات أقل من 1٪ من معدل ضخ الحيوان دراستها.
ملاحظة: استخدام حاويات اجلاء، وأحيانا مع فراغ مجهول تشكل تعقيدات إضافية. لذلك، ينصح بشدة اختبار ميداني. في 10 م عمق و~ 22 درجة مئوية مياه البحر (40 PSU)، وهو الأنبوب 50 سم مدخل مع القطر الداخلي من 254 ميكرون يسلم متوسط معدل شفط ~ 26 ميكرولتر ثانية -1 (1.56 مل دقيقة -1).
- السيطرة على معدل أخذ العينات عن طريق ضبط طول والقطر الداخلي للأنابيب تناول وفقا لعمق العمل المخطط له ودرجة حرارة الماء. استخدام المعادلة التالية (مشتقة من المعادلة هاجن-بوازوي تستخدم لجمعة كاملاطورت تدفق أنابيب الصفحي) كدليل:
- سفن أخذ العينات
- للحصول على عينات صغيرة الحجم (3-20 مل، على سبيل المثال، فائقة العوالق لCYT تدفقometry) استخدام أنابيب بلاستيكية معقمة بالمكنسة الكهربائية قبل.
ويعمل ما قبل بالمكنسة الكهربائية أنابيب بلاستيكية معقمة بشكل روتيني لاختبارات الدم القياسية في البشر، ملاحظة: تأكد من استخدام أنابيب معقمة دون أي إضافات. من الأفضل أخذ عينات من هذه الأنابيب بلاستيكية معقمة بالمكنسة الكهربائية مع استخدام المعقم، حامل أنبوب تستخدم مرة واحدة مع خارج مركز لور. في حين أن هذا هو الجهاز الأكثر أمانا والأكثر كفاءة أخذ العينات، ولها حجم القتلى أكبر قليلا بالمقارنة مع إبرة بسيطة. - لعينات المياه الكبيرة مثل المواد الغذائية والمواد العضوية الذائبة، واستخدام 40 أو 60 مل قارورة من الزجاج التي تلبي معايير وكالة حماية البيئة (EPA) لتحليل العضوية المتطايرة. وتشمل هذه القوارير غطاء من مادة البولي بروبيلين مع سيليكون الحاجز تواجهها PTFE.
- لكميات أكبر من استخدام زجاجات البنسلين مع سدادات المطاط أو قوارير فراغ.
- استخدام قوارير البولي إيثيلين عالي الكثافة (HDPE قارورة) للعينات السيليكا.
- لزيادة حجم العينة والحد من خطر تهجير سدادةأثناء الصعود، إخلاء (فراغ) البنود 1.4.2-1.4.4 قبل الغوص مع مضخة فراغ. فراغ يدويا باستخدام مضخة فراغ اليد أو حتى عن طريق مص الهواء مع حقنة. ومع ذلك، لتحقيق أفضل النتائج، ينصح مضخة كهربائية جيدة. lyophilizers القياسية توفر فراغ عالية.
ملاحظة: إيلاء اهتمام خاص عند استخدام قوارير بالمكنسة الكهربائية الكبيرة لضمان أن معدل الامتصاص أسرع الأولي لن تلوث عينات المياه الزفير.
- للحصول على عينات صغيرة الحجم (3-20 مل، على سبيل المثال، فائقة العوالق لCYT تدفقometry) استخدام أنابيب بلاستيكية معقمة بالمكنسة الكهربائية قبل.
- إجراءات التنظيف سفينة
- لالعضوية الذائبة وNH 4 + تحليل، استخدم قارورة تنظيفها قبل وكالة حماية البيئة الجديدة.
- شطف قارورة (الزجاج وHDPE) لتحليل المواد المغذية الأخرى على النحو التالي:
- شطف قارورة (الزجاج وHDPE) والبولي بروبيلين والقبعات ذات جودة عالية الماء المقطر مزدوجة. تثبيت الحاجز السيليكون الجديد.
- نقع قوارير (زجاج وHDPE) في 10٪ من حمض الهيدروكلوريك لمدة 3 أيام على الأقل وشطف مع وافرة المياه ذات الجودة العالية المقطر المزدوج.
- حرق قارورة زجاجية في 450 درجة مئوية لمدة 4 ساعات والسماح لتبرد في الفرن. تثبيت الغطاء، والتفاف في رقائق الألومنيوم حتى الاستخدام.
- مرشحات
- استخدام مرشحات الألياف الزجاجية الخالية من الموثق لترشيح من جميع العينات العضوية الذائبة (على سبيل المثال، DOC، DON) ولجمع المواد العضوية الجسيمات (على سبيل المثال، POC، PON). حزمة كل مرشح الزجاج في رقائق الألومنيوم مظروف منفصل. حرق على 400 درجة مئوية لمدة 2 ساعة لتطيير المخلفات العضوية وتخزينها في وعاء نظيف وجاف حتى الاستخدام.
- استخدام إما خالية من الموثق مرشحات الألياف الزجاجية على النحو الوارد أعلاه، أو 0.2 ميكرون الأغشية البولي لأخذ عينات المواد الغذائية غير العضوية (على سبيل المثال، PO 4 3-، أكاسيد النيتروجين - NH 4 +). تنظيف الأخير مرة واحدة تركيبها في حامل مرشح كما هو موضح أدناه (1.7.3).
- استخدام 0.2 ميكرون الأغشية المرشحات البولي لأخذ العينات السيليكا. تنظيفها مرة واحدة تركيبهاد في حامل مرشح كما هو موضح أدناه (1.7.3).
- إعداد التجمع الترشيح
- تصفية المزيج الأساسي للذوبان عالية من أنيونية وحل السطحي غير الأيونية والجودة العالية الماء المقطر مزدوجة من خلال مرشح 0.2 ميكرون قبل استخدامها لتنظيف التجمع الترشيح.
- التجمع الترشيح على المواد الغذائية والمواد العضوية الذائبة أخرى من السيليكا:
- وضع حرقها مرشحات الألياف الزجاجية الخالية من الموثق داخل الفولاذ المقاوم للصدأ تصفية حامل Swinney في خط تنظيفها.
- استخدام حقنة حمض تنظيفها لتشغيل 100 مل من 5٪ مزيج الأساسي للذوبان عالية من أنيونية وحل السطحي غير الأيونية ثم 100 مل من المياه ذات الجودة العالية المقطر المزدوج من خلال التجمع بأكمله.
- التجمع الترشيح لشافي 4:
- وضع مرشح البولي داخل حامل تصفية البولي تنظيف (PC مرشح حامل).
- استخدام حقنة حمض تنظيفها لصالامم المتحدة 30 مل من 5٪ حمض الهيدروكلوريك و 30 مل من المياه ذات الجودة العالية المقطر المزدوج من خلال التجمع بأكمله.
- نظام الجمعية
- تجميع نظام للعمل تحت الماء باستخدام نظرة خاطفة (بولي الأثير كيتون) الأنابيب التي يبلغ قطرها الخارجي (OD) من 1.6 ملم وقطرها الداخلي (ID) من 254 ميكرومتر أو 177 ميكرون.
- استخدام سكين حاد أو نظرة خاطفة القاطع لقطع الأنابيب إلى الطول المطلوب.
- في النهاية البعيدة لل(عينة جانب حاوية)، وتناسب كل أنبوب مع موصل لور الذكور تعلق على إبرة حقنة. تأكد من اتباع تعليمات الشركة المصنعة ومحاذاة الجانب المسطح من اللون الأزرق الطويق flangeless مع نهاية الأنبوب قبل تشديد الجوز الأخضر.
- إرفاق أنابيب نظرة خاطفة إلى ترايبود "الأسلحة" أو تتلاعب مبنية خصيصا باستخدام الشريط العازلة.
- نعلق إبرة الحقنة إلى الموصل لور الذكور. الحفاظ على إبرة مع الغطاء الواقي لتفادي وقوع إصابات. تسمية بوضوح والعتاد أخذ العينات ورمز اللون جميع مكونات استنشاق والزفير (على سبيل المثال، أخضر = في والأحمر = السابق).
- وبالمثل رمز اللون الأوعية أخذ العينات مع مجموعات من السفن أخذ العينات يقترن مرقمة بشكل تسلسلي.
حيث F = معدل التدفق (سم 3 دقائق -1)، ΔP = فرق الضغط (بار)، ص = أنابيب مدخل دائرة نصف قطرها الداخلي (سم)، K = 2.417 × 10 -9 (ثانية -2)، L = طول الأنبوب (سم )، V = اللزوجة المياه (ز سم -1 ثانية -1). انظر الجدول رقم 1 لمزيد من التفاصيل. 2. تحت الماء العمل
- إعداد موقع العمل
- مسح أولي واختيار العينات
ملاحظة: نظرا للطبيعة المعقدة للبروتوكول أخذ العينات تحت الماء، وتكريس الوقت اللازم لإعداد وضمان الغوص أخذ العينات كفاءة.- مسح موقع العمل واتخاذ الاستعدادات اللازمة قبل الموعد المحدد.
- حدد ووضع علامة الكائنات المستهدفة المناسبة التي يمكن الوصول إليها بسهولة نسبيا. لأن ليس كل الكائنات الحية قد تكون بالضرورة نشطة في وقت الغوص أخذ العينات، وإعداد المزيد من محطات العمل مما كنت أتوقع أن عينة.
- تركيب دعامات قاعدة
- عرجن العمل على الركيزة وجهت:
- جبل الأصلي مقطع سرعة الافراج عن ترايبود مرونة في 1 الأوزان كجم الغوص ومجرد وضعه بجانب الحيوانات المستهدفة.
- عند العمل على الجدران الرأسية:
- جبل لوحات قاعدة الدعم لنظام VacuSIP، والسنانير لمعدات الإكسسوارات، والشماعات للسفينة جمع تحمل صينية أثناء مرحلة إعداد موقع العمل (2.1.1).
- عندما تستخدم حوامل المحمولة مرنة، واستخدام مسامير أو راتنجات الايبوكسي اثنين من المكونات لإصلاح اللوحات 10X10 سم PVC بجانب كل حيوان الهدف. كل لوحة يحتاج الى حفرة لنعلق لقطات الافراج عنهم بسرعة من ترايبود المحمولة مرنة.
- مرة واحدة وقد شفي الراتنج ولوحات قاعدة ترد بقوة على الحائط، والمسمار في لقطات الافراج عنهم بسرعة، بمثابة نقطة ارتباط حازمة لترايبود المحمولة مرنة لنظام VacuSIP.
- عرجن العمل على الركيزة وجهت:
- مسح أولي واختيار العينات
- تثبيت فرجينياCUSIP
- تحقق ما إذا كانت العينة يضخ عن طريق الإفراج عن تصفيتها فلوريسئين الصبغة بجانب فتحة الاستنشاق والتأكد من أن الصبغة في الظهور من خلال فتحة exhalent كما هو موضح في ياهيل وآخرون (2005) 16.
- تثبيت الجهاز VacuSIP ووضع أنبوب المستنشق (IN) أخذ العينات داخل فتحة الاستنشاق أو فقط لأنها المقبل (داخل ~ 5 ملم). تأكد من أن أنبوب نشوق ليس على مقربة من فوهة زافر آخر.
- بعناية توجيه أنبوب أخذ العينات زافر (EX) نحو فويهة / سيفون زافر وأدخله بلطف شديد، وذلك حتى يتم وضعه 1-5 ملم داخل فويهة / سيفون زافر (انظر الشكل 1 والتكميلية فيديو 1). الحرص على عدم اجراء اتصالات مع أو تعكير صفو الحي عينات.
- قبل وأثناء أخذ العينات المزدوج تحقق من موقع من كل من الأنابيب.
- بعد فحص العينات ما إذا كانت العينة لا تزال تضخ كما ديسcribed فوق (2.2.1).
ملاحظة: نظرا لأن حركة الذراع واحدة من ترايبود عند التعامل مع الآخر قد تحدث، تأكد من أن تضع أولا أنبوب أخذ العينات نشوق وثانيا أنبوب زافر، الأمر الذي يتطلب معالجة أكثر دقة. تتبع هذا النظام، حتى لو كان التلاعب في أنبوب أخذ العينات زافر قد يسبب حركة أنبوب نشوق، فإنه لن يؤثر على أخذ العينات.
- وحدات إجراءات أخذ العينات تحت الماء
ملاحظة: قيد على سؤال البحث، لا يمكن أن يؤديها كل خطوة من الخطوات التجريبية أدناه كتجربة قائمة بذاتها. بروتوكول أخذ العينات الشخصي التمثيل الغذائي الكامل هو موضح أدناه هو عملية طويلة، تتطلب ما يصل إلى 8 ساعات في العينة (لمحة عامة انظر الشكل 2 والجدول 2). كما تختلف شروط وضوابط الغوص بين مواقع أخذ العينات والمناطق والمؤسسات، لا يتم تضمين خطط الغوص في هذا البروتوكول. ومع ذلك، تكريس العناية القصوى وميتىالتخطيط culous لخطة الغوص. دفع عناية خاصة لتجنب التشبع وملامح الغوص يويو. عندما يكون ذلك ممكنا، فإنه من المستحسن لإجراء هذه التجارب على عمق ضحل (<10 م). يمكن rebreathers دائرة مغلقة يكون مفيد جدا لمثل هذه المخططات أخذ العينات لفترات طويلة.- قبل أن تبدأ المعاينة الفعلية، تأكد من تبقى أي آثار واضحة على بقايا فلوريسئين وقد تم تسويتها أن الرواسب العالقة أو قد فاحت بعيدا.
- فائقة العوالق، (يتم تثبيت أي مرشح في هذه الخطوة!)
- استخدام إبرة لاختراق IN (الاستنشاق) وEX (الزفير) بالمكنسة الكهربائية أنابيب بلاستيكية معقمة الحاجز. تحقق من أن الماء يقطر في بسعر التخطيط وجمع عينات 2-6 مل من الماء.
- على استرجاع، والحفاظ على العينات في مربع الباردة على الجليد. في المختبر، والحفاظ على 1٪ امتصاص العرق + 0.05٪ EM الصف غلوتارالدهيد (تركيز النهائي)، أو 0.2٪ EM الصف غلوتارالدهيد. تجميد cryovials في النيتروجين السائل وتخزينه في -80 &# 176؛ ج حتى التحليل.
- أخذ العينات السيليكات وتخزين
- تثبيت المقاوم للصدأ حامل المرشح الكمبيوتر قبل تنظيفها في السطر الذي يحتوي على غشاء البولي 0.2 ميكرون بين الإبرة وموصل ذكر لور في نهاية البعيدة للأنبوب.
- بيرس الغطاء الحاجز من قوارير البولي إيثيلين عالي الكثافة تنظيفها مسبقا (قارورة HDPE) لبدء أخذ العينات. تحقق من أن كل من العينات ويقطر وجمع 15 مل من الماء في كل قارورة.
- الحفاظ على عينات المبردة (4 درجة مئوية) حتى التحليل. إذا التحليل لا يمكن أن تبدأ في غضون أسبوعين، مخزن في -20 درجة مئوية. لتحليلها، تأكد من أن العينات يتم إذابة عند 50 درجة مئوية لمدة 50 دقيقة على الأقل لإذابة المواد الهلامية السيليكا.
ملاحظة: الغشاء يمكن الحفاظ عليها للفحص المجهري أو تحليل الحمض النووي حسب الحاجة.
- غير العضوي المذاب (أ ف ب 4 3-، أكاسيد النيتروجين - NH 4 +)
- استبدال رانه مرشح PC التجميع مع حامل المرشح قبل تنظيفها في خط الفولاذ المقاوم للصدأ التي تحتوي على فلتر الزجاج قبل حرقها.
- قبل أخذ العينات، وضمان أن صدرت لا يقل عن 20 مل من عينات مياه البحر من خلال نظام الترشيح بأكمله باستخدام وكالة حماية البيئة، قوارير البولي أو غيرها من السفن فراغ لبدء شفط. قياس حجم المياه التي تم جمعها قبل أن يتم التخلص منها.
- بيرس الغطاء الحاجز من قوارير زجاجية وكالة حماية البيئة المناسبة لبدء أخذ العينات، والتحقق من أن كل من العينات ويقطر، وجمع 25-30 مل النترات والفوسفات تحليل.
- التبديل إلى قارورة EPA الزجاج جديدة لتحليل الأمونيا، تحقق من أن كلا من العينات ويقطر، وجمع 20 مل في كل قارورة.
- الحفاظ على العينات في مربع البارد على الجليد ومخزن في -20 درجة مئوية حتى التحليل.
ملاحظة: إلا إذا الترشيح هو من مصلحة، والمرشحات الحقنة يمكن أن تستخدم لخطوات 2.3.3 و 2.3.4.
- العضوية المذابة (DOC + DON) أخذ العينات والحادي والعشرينأورينج
ملاحظة: الحفاظ على العينات وتستقيم ممكن في جميع أنحاء التعامل مع ذلك لا يأتي أن الماء عينة في اتصال مع الحاجز السيليكون.- الاستمرار في استخدام المقاوم للصدأ مرشح التجمع الصلب وجمع 20 مل من عينات مياه البحر في قوارير جديدة الزجاج وكالة حماية البيئة، كما هو موضح أعلاه.
- على استرجاع، والحفاظ على العينات في مربع الباردة على الجليد. في المختبر، واستخدام الزجاج ماصة باستير حرقها قبل لإصلاح عينات مع صحيح حامض الفوسفوريك (إضافة 5-6 قطرات من 25٪ المعادن النزرة حمض الصف إلى 20 مل عينة، وتركيز النهائي 0.04٪) أو حامض الهيدروكلوريك (إضافة 2 قطرات من المعادن النزرة الصف يتركز حامض إلى عينة 20 مل، وتركيز النهائي 0.1٪) ويحفظ في الثلاجة.
- الحفاظ على عينات المبردة (4 درجة مئوية) حتى التحليل. إذا لم يتم تحليل العينات في غضون أسبوع من جمع وتخزين في -20 درجة مئوية حتى التحليل.
- الجسيمات العضوية (POC، ثمة حاجة ملحة، POP)
- الاستمرار في استخدام الواحدainless مرشح التجمع الصلب ومرشح لا يقل عن 500 مل من مياه البحر إلى إجلاء 250 مل قارورة فراغ. استبدال قوارير إذا لزم الأمر.
- على استرجاع، استخدم حقنة مليئة بالهواء لاجلاء كل مياه البحر المتبقية من حامل تصفية، ألفه في رقائق الألومنيوم، وتخزينها في صندوق الباردة على الجليد. في المختبر، وإزالة مرشحات من أصحاب تصفية وتخزين في -20 درجة مئوية حتى التحليل.
- قبل أن تبدأ المعاينة الفعلية، تأكد من تبقى أي آثار واضحة على بقايا فلوريسئين وقد تم تسويتها أن الرواسب العالقة أو قد فاحت بعيدا.
الشكل 1. مثال على المنشآت الصحيحة للVacuSIP: (أ) أخذ عينات من ascidian Polycarpa mytiligera (خليج العقبة والبحر الأحمر) باستخدام مناور مبنية خصيصا لرمز اللون المستخدمة الأخضر للاستنشاق والأصفر لعينات المياه الزفير (الصورة توم Shelizenger ويوفال يعقوبي)؛ (ب) أخذ عينات من oroides الإسفنج Agelas (شمال غرب البحر الأبيض المتوسطالبحر) مع عرض فويهة من 3 ملم، وذلك باستخدام جهاز VacuSIP. رمز اللون المستخدم هو الأصفر لالاستنشاق والأحمر لعينات المياه الزفير. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. نظرة عامة على تقنية VacuSIP الموضحة في قسم البروتوكول. ويمثل العمل في المعمل في صناديق صفراء، والعمل الميداني في الصناديق الزرقاء. الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الجدول 1. الشاملة متوسط معدلات أخذ العينات (مل دقيقة -1) الحصول مع حاويات مختلفةتستخدم لجمع المياه ومستويات فراغ مختلفة: كانت قوارير لا فراغ فضاء (لا شيء)؛ والمكنسة الكهربائية وكالة حماية البيئة قوارير زجاجية وقوارير البولي نصف حجمها (نصف حجم)؛ والمكنسة الكهربائية وأنابيب بلاستيكية معقمة بالفعل من قبل الشركة المصنعة. العمل في 5-8 م في العمق، درجة حرارة الماء 18-22 درجة مئوية، وذلك باستخدام أنابيب نظرة خاطفة من طول 79 سم ومن 25 ميكرون قطرها الداخلي.
الجدول 2. نظرة عامة على السفينة أخذ العينات، مرشح التجمع تثبيتي، في خط والتخزين وطرق التحليل الموضحة في قسم البروتوكول. المركبات تحليلها هي: فائقة العوالق وفرة (العوالق <10 ميكرون)، سيليكات (شافي 4) والفوسفات (أ ف ب 4 3-) والنتريت + نترات (NO 2 - + NO 3 -)، والمواد العضوية الذائبة (DOM)، الأمونيوم (NH 4 +) والمواد العضوية الجسيمية(بوم). جميع آنية أخذ العينات تحتوي السيليكون غطاء الحاجز وبالمكنسة الكهربائية قبل أخذ العينات. ومثبتات هي: امتصاص العرق + غلوتارالدهيد (تخمة + Parafor)، صحيح حامض الفوسفوريك (H 3 PO 4) وحمض الهيدروكلوريك (حمض الهيدروكلوريك). المجالس مرشح في خط المستخدمة هي: أصحاب مرشح البولي والبولي غشاء 0.2 ميكرون مرشحات (PC تصفية حامل + غشاء PC) وأصحاب مرشح الفولاذ المقاوم للصدأ والألياف الزجاجية الخالية من الموثق مرشحات مهرجان الخليج السينمائي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تحسين أساليب جمع مياه البحر
اختيار قارورة جامع وإجراء التنظيف
يجب أن يكون السفن جمع VacuSIP المتوافقة مع الحاجز الذي يسمح أخذ العينات إلى أن تبدأ من قبل خارقة مع إبرة حقنة. يجب أن تحمل الضغط تحت الماء المرتفع (2-3 الحانات في الغوص نموذجية أعماق عمل)، وينبغي أن تعقد فراغ. كثير (ولكن ليس كل الماركات) من قارورة وافقت وكالة حماية البيئة لتحليل المواد العضوية المتطايرة تلبية هذه المعايير. قارورة قبل تنظيفها وافقت لDOC وتحليل DON وتتوفر أيضا. لاختبار مدى ملاءمة هذه قارورة لجمع وتحليل المواد الغذائية، وتحسين إجراءات التنظيف، وقد تم جمع المياه ذات الجودة العالية المقطر المزدوج في أنابيب البولي بروبلين حمض تنظيفها (أنابيب PP)، التي تم شراؤها حديثا، في قوارير البولي إيثيلين عالي الكثافة تنظيفها إدارة البحث الجنائي (قارورة HDPE)، وفي قوارير زجاجية وكالة حماية البيئة، كلها مجهزة بغطاء الحاجز تترافلوروإيثيلين (PFTE). تم تنظيف قوارير البولي وأنابيب البولي بروبلين كما هو موضح في القسم 1.5.2 أعلاه، وتم تنظيف قوارير زجاجية وكالة حماية البيئة من قبل الشركة المصنعة.
وكانت كمية NH 4 + جدت في قوارير زجاجية وكالة حماية البيئة الحد الأدنى نسبيا (≤ 0.1 مكرومول L -1) ويعتمد على جودة عالية مزدوجة المقطر معايير الجودة المياه. في المقابل، NH 4 + تركيزات زيادة كبيرة (تصل إلى 3 و 7 أضعاف، على التوالي)، وأظهرت تباينا أعلى في أنابيب البولي بروبلين حمض تنظيفها وفي قوارير البولي إيثيلين عالي الكثافة (أنوفا F (5،53) = 7.183، ف < 0.001، الشكل 3). لم يكن هناك أي تأثير جودة عالية مزدوجة ملامسة الماء المقطر مع الحاجز السيليكون على تحليل الأمونيوم.
س: المحافظة على together.within الصفحات = "1"> مقارنة بين قوارير زجاجية جديدة مقابل تنظيف قوارير زجاجية / المعاد تدويرها
لاختبار ما إذا كان يمكن استخدام قوارير الزجاج وكالة حماية البيئة لتحليل المواد الغذائية أكثر من مرة، وأكاسيد النيتروجين -، PO 4 3-، وNH قورنت 4 + التركيزات في عينات مياه البحر التي تم جمعها في قوارير جديدة الزجاج وكالة حماية البيئة لتلك التي تم جمعها في قوارير زجاجية تستخدم وكالة حماية البيئة. قارورة جديدة الزجاج وكالة حماية البيئة كانت قبل تنظيفها من قبل الشركة المصنعة، في حين تم تنظيف قوارير الزجاج المعاد تدويرها كما هو موضح أعلاه (1.5.2). كان قارورة المعاد تدويرها أعلى بكثير تركيز + NH 4، تصل إلى 1.5 أضعاف مستوى وجدت في قوارير زجاجية جديدة (ر الاختبار، ف <0.001، ن = 5). لا توجد فروق ذات دلالة إحصائية في أكاسيد النيتروجين - وPO 4 3- المحتوى بين العينات التي تم جمعها في قوارير المعاد تدويرها والعينات التي تم جمعها في الزجاج الجديدقارورة (الشكل 4).
جمع سيليكات وإجراءات تخزين
لتحديد أفضل السفينة أخذ العينات للتحليل سيليكات، تم جمع المياه ذات الجودة العالية المقطر المزدوج في (قارورة HDPE) غير تنظيفها وفي أنابيب البولي بروبلين حمض تنظيفها (أنابيب PP)، في قوارير البولي إيثيلين عالي الكثافة حمض تنظيفها، و في قوارير زجاجية وكالة حماية البيئة. وكان تركيز سيليكات المتوقع قريبة من الصفر، لذلك اعتبرت القيم التي انحرفت عن تركيز المتوقع الملوثة. تركيز سيليكات تختلف بشكل كبير بين العينات التي تم جمعها في قوارير مختلفة (أنوفا، F (3،19) = 210.047، ف <0.001)، والتي تبين أقل تركيز شافي 4 في قوارير البولي حمض تنظيفها. قوارير الزجاج البورسليكات ملوثة العينات، مع التركيز النهائي شافي 4 تزداد بنسبة تصل إلى 7 مكرومولL -1 (الشكل 5).
اختيار جهاز الترشيح لمسألة حل العضوية (DOM)، وتحليل المواد الغذائية
لتحديد أي جهاز فلتر تنتج أدنى فارغة في تحليل المنحل العضوية (DOC وDON) والمواد الغذائية غير العضوية (أكاسيد النيتروجين - NH 4 +، PO 4 3-)، وتمت مقارنة أصحاب مرشح الفولاذ المقاوم للصدأ لالبولي في خط Swinney أصحاب التصفية. مع كل نوع حامل فلتر اختبرنا كل من الغشاء البولي وقبل حرقها فلتر الألياف الزجاجية. مزيج من الفولاذ المقاوم للحامل مرشح الفولاذ وحرقها فلتر الألياف الزجاجية توفير أدنى الفراغات، في حين أن البولي Swinney مرشح حامل مجهزة غشاء البولي ملوثة بشكل واضح على عينات بنسبة تصل إلى 9 أضعاف. زيادة كميات غسل فعل لا حل هذه المشكلة (الشكل 6).
الشكل 3. تركيز الأمونيوم (مكرومول L -1، متوسط ± SD) التي تم جمعها مع قوارير مختلفة: (1) لم يتم تنظيفها الكثافة قنينة. (2) تنظيف قنينة الكثافة. (3) الكثافة تنظيفها قارورة + بارافيلم. (4) قارورة EPA الزجاج، (5) قارورة EPA الزجاج + بارافيلم. (6) تنظيف الأنبوب PP. وضعت بارافيلم لاختبار ما إذا كان الحاجز السيليكون قد تلوث عينات المياه. لكل معاملة تم تحليل 9 عينات من المياه ذات الجودة العالية المقطر المزدوج. وقد تم تحليل عينات جديدة. تم العثور على فروق ذات دلالة إحصائية بين أربع سفن أخذ العينات (أنوفا، F (5،53) = 7.183، P <0.001، اختبار القوة = 0.992). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4. الأمونيوم (NH 4 +)، والنتريت + نترات (أكاسيد النيتروجين -)، والفوسفات (أ ف ب 4 3-) تركيزات (مكرومول L -1، متوسط ± SD) من عينات مياه البحر التي تم جمعها في الجديد (الظلام) وإعادة تدويرها / تنظيف قارورة من الزجاج (أبيض) وكالة حماية البيئة. تم جمع مياه البحر في أحواض السمك المنطقة التجريبية من معهد علوم البحار وتصفيتها مع حامل مرشح الفولاذ المقاوم للصدأ والزجاج تصفية. وقد تم تحليل عينات المياه العذبة. العلامة النجمية (*) تشير إلى أن الفرق كبير (اختبار ر، ع <0.001، ن = 5، اختبار القوة = 1). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
.jpg و"/>
الرقم 5. تركيز سيليكات (مكرومول L -1، متوسط ± SD) في ذات جودة عالية الماء المقطر مزدوجة تجمع في قوارير مختلفة: أنابيب PP حمض تنظيفها، وأنابيب بولي بروبلين، والبولي قوارير حمض تنظيفها، جديدة قوارير زجاجية وكالة حماية البيئة. وجود فروق ذات دلالة إحصائية بين المواد العينات الأربع (أنوفا، F (3،19) = 210.047، ف <0.001، اختبار القوة = 1). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6. دراسة تأثير التجمعات الترشيح المختلفة، وغسل وحدات التخزين على النتريت + نترات (أكاسيد النيتروجين - مكرومول L -1). تم الحصول عليها عن طريق تصفية عينات مياه البحر مع الفولاذ المقاوم للصدأ (SS و - عينات لأكاسيد النيتروجينحامل إلتر) أو البولي في خط أصحاب Swinney فلتر (PC مرشح حامل) مجهزة إما غشاء البولي (فلتر PC) أو حرقها قبل مرشحات الألياف الزجاجية. للمرشحات الكمبيوتر، واستخدمت وحدات التخزين المختلفة (10، 30، 60، 90، و 120 مل) من 5٪ حمض الهيدروكلوريك والمياه ذات الجودة العالية المقطر المزدوج لغسل مرشح التجمع، ونظرا لحجم الغسيل بين قوسين في أسطورة الرقم. يتم التعبير عن القيم المتوسطة كما ± الانحراف المعياري (ن = 5). تم جمع مياه البحر في أحواض السمك المنطقة التجريبية من معهد علوم البحار وتم تحليل عينات جديدة بعد الترشيح. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 7. مثال على النتائج التجريبية: استنشاقه (IN، أسوددائرة) والزفير (EX، مثلث أحمر) يقترن تركيزات عينة المياه (مكرومول L -1) من المواد المختلفة التي تتم معالجتها بواسطة الاسفنجة Chondrosia كلوية الشكل في البحر الأبيض المتوسط: (A) الأمونيوم (NH 4 +)؛ (ب) نترات النتريت + (أكاسيد النيتروجين -)؛ (C) الفوسفات (أ ف ب 4 3-)؛ (D) سيليكات (شافي 4)؛ (E) الكربون العضوي المذاب (DOC)؛ (F) حل النيتروجين العضوي (DON)؛ (G) الكربون العضوي العوالق (LPOC)؛ (H) النيتروجين العضوي العوالق (LPON). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 8. مثال على cytom تدفقتحليل etry من عينات المياه يقترن استخلاصها من المياه عن طريق الاستنشاق (A، C، E، G) والزفير (B، D، F، H) عن طريق الاسفنجة Chondrosia كلوية الشكل: (A، B، C، D) السكان العوالق النباتية. (E، F، G، H) البكتيريا متغايرة. في AB و EF كانت العينات نظيفة ودقيقة (تم الإبقاء جميع الفئات العوالق بكفاءة). مؤتمر نزع السلاح وGH أمثلة من تلوث المياه الزفير، والتي تبين إزالة منخفضة من جميع الفئات العوالق. ازل: متعاقبات حبيبية ليرة سورية، بيكو: picoeukariotes ذاتي التغذي، نانو: nanoeukaryotes ذاتي التغذي، وارتفاع: البكتيريا متغايرة مع نسبة عالية من الحمض النووي، وانخفاض: البكتيريا متغايرة مع محتوى الحمض النووي منخفض الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
شملت رقم تكميليه 1. خلية كفاءة الاحتفاظ مختلفة فريسة العوالق من قبل البطلينوس شاما باسيفيكا: Prochlorococcus ليرة سورية. (برو)، متعاقبات حبيبية ليرة سورية. (اصطناعي)، بيكو حقيقيات النوى (بيكو Euk)، نانو حقيقيات النوى (نانو Euk). أشرطة الخطأ = 95٪ CI. يرجى النقر هنا لتحميل هذا الملف.
تكميلية الفيديو 1. أخذ العينات وascidian Polycarpa mytiligera باستخدام مناور مبنية خصيصا لرمز اللون المستخدمة الأخضر لالاستنشاق والأصفر لعينات المياه الزفير. يتم وضع أنابيب أخذ العينات (نظرة خاطفة، معرف 54 ميكرومتر، 75 سم) بعناية في زافر والمستنشق يمتص من ascidian. ومن سحب المياه في الأنابيب المفرغة بمعدل ~ 1 مل دقيقة -1. في هذه المظاهرة يستخدم فلوريسئين الصبغة لتصور الطائرة زافر. لاحظ أن أنبوب أخذ العينات زافر يتم وضع واي جيدرقيقة الطائرة زافر. يرجى النقر هنا لتحميل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الخطوات التحضيرية
قارورة جامعي لDOM وتحليل المواد الغذائية
منذ السفن جامع قد تتفاعل مع حل المكونات الدقيقة والجدران العينات قد تكون ركيزة لنمو البكتيريا 30-34، تم اختبار قوارير مختلفة لDOM وجمع المواد الغذائية. لا ينصح البورسليكات لالسيليكا الكمي 33،35، منذ قوارير زجاجية يمكن أن تزيد من تركيز الأولي من السيليكا بنسبة تصل إلى اثنين أضعاف إذا كانت العينات ليست تجميد بسرعة 30. نتائجنا تظهر أن استخدام قوارير وكالة حماية البيئة وتنظيفها قبل النتائج في الفراغات التركيز المنخفض للDOC، دون، والمواد الغذائية غير العضوية، وعلى الأخص لالأمونيوم.
الترشيح DOC والتخزين
الترشيح هو مطلوب، وفي كثير من الحالات، هو الخطوة الأولى تحليلية في الكيمياء البحرية وعلم الاحياء المجهري. في حين أنه من الممكن تصفية العينات بعد جمعها في المختبر، فمن غير المستحسن هذا الإجراء في الموقع العمل، حيث يتم جمع عينات الماء، وغالبا في أماكن نائية، ساعات أو أيام بعيدا عن مرافق المختبرات المناسبة. استخدام خط في، في ترشيح الموقع يقلل معالجة عينة، وبالتالي يقلل من خطر التلوث. وفي الترشيح الموقع كما يزيل معظم البكتيريا ويقلل من خطر أن تكوين عينة سيتم تعديلها من قبل التمثيل الغذائي البكتيري أثناء أخذ العينات لفترة طويلة والنقل مرة. يزيد من التجمع الترشيح لحجم القتلى من جهاز أخذ العينات ويمكن أيضا أن تكون مصدرا للتلوث. مجموعة مختارة من أصغر أصحاب الممكن تصفية (على سبيل المثال، في خط Swinney مرشح صاحب 13 ملم) وأنابيب نظرة خاطفة دقيقة (على سبيل المثال، 254 ميكرون ID) يقلل من حجم القتلى وخطر التلوث عن طريق المياه المحيطة.
إذا كان مرشح مناسب ليستتستخدم أو إذا لم يتم غسلها بعناية، والتحف وتلوث عينات المياه من المحتمل أن تحدث 32،36-39. وأظهرت الدراسات التي أجريت على تحليل DOC أن الفلاتر وأصحاب المرشحة المصنوعة من مركبات عضوية (البولي وPFA-PTFE) قد يؤدي إلى تلوث شديد DOC 32،37، وخصوصا عندما يتم مسح شامل ذات جودة عالية مزدوجة الماء المقطر 38. هذا البروتوكول والنتائج اتبع الإرشادات ويشير أيضا إلى أن أصحاب مرشح البولي يجب تجنبها.
في عمل الموقع والتشغيل المتداخل
النظام VacuSIP هو أسلوب أخذ العينات المباشرة التي يسهل دراسة عملية التمثيل الغذائي للمغذيات تعليق دون عائق في بيئتها الطبيعية، وتقدير حجم الدور البيئي في النظام. للغواصين من ذوي الخبرة والتجهيز، وتطبيق طريقة VacuSIP بسيط ويتطلب فقط آر القصيرaining. تم تصميم التجارب INEX VacuSIP ل"التحليل الإحصائي within' التصميم (أي مقترن أو المتكررة تحليل قياس)، وبالتالي السيطرة على معظم الأعمال الفنية التحليلية بما في ذلك الفراغات عالية. استخدام الشفط تسيطر يضمن معدلات أخذ العينات بطيئة وقابل للتعديل، وبالتالي منع التلوث العرضي للمياه الزفير مع المياه المحيطة. ، ويوصى حيثما أمكن اختيار مواقع العمل مع انخفاض تعكر الحالي ومنخفضة وسوف تضمن النتائج أنظف وأكثر دقة. الوقت أخذ العينات لفترات طويلة (دقائق إلى ساعات) يسمح التكامل بين patchiness العالية التي تتميز بها طبقة حدود القاع. كل هذه الميزات تضمن أنه عندما يطبق بشكل صحيح طريقة VacuSIP قوي للغاية، وتقديم نتائج موثوقة وقابلة للتكرار حتى عند العمل مع عدد صغير من مكررات. ويرد مثال لنتائج نموذجية تم الحصول عليها من اسفنجة البحر الأبيض المتوسط وأنواع البطلينوس المحيطين الهندي والهادئ في الشكل 7 والتكميليهTARY الشكل 1.
كما هو الحال مع أي تقنية، وVacuSIP لا يخلو من المخاطر المحتملة. المشكلة الأكثر شيوعا هو تلوث للعينة المياه الزفير مع المياه المحيطة. وتشمل أسباب هذه التحف ارتفاع معدل الامتصاص، dislodgments أنبوب، وسلوك الحيوان. حسن الاختيار من معدل أخذ العينات الصحيح تعتمد على تقديرات مسبقة من معدل تدفق إفراغي. هذه التقديرات يمكن الحصول عليها عن طريق استخدام صبغ الجبهة طريقة سرعة 16. من الناحية المثالية، ينبغي أن يظل معدل الامتصاص أقل من 1٪ من معدل ضخ (على سبيل المثال، 1 مل دقيقة -1 لمدة ساعة 6 L -1 معدل ضخ). لتجنب التلوث بمياه المحيط، يجب أن معدل أخذ العينات أبدا أن تكون أكبر من 10٪ من معدل الضخ.
للسيطرة على معدل أخذ العينات، ينبغي تعديل الطول والقطر الداخلي للأنابيب تناول وفقا لعمق العمل المخطط له ودرجة حرارة الماء. المعادلة هاجن-بوازوي (انظر القسم 1.3.1 أعلاه) يمكن أن تستخدم كدليل. ومع ذلك، ينبغي النظر في هذه المعادلة، كأول تقريب النظام منذ ΔP وانخفاض معدل أخذ العينات مع مرور الوقت أخذ العينات وفي خط الترشيح يضيف الشكوك. استخدام حاويات اجلاء، وأحيانا مع الضغوط فراغ غير معروفة، ويقدم المزيد من التعقيدات. مثال عن كيفية تتفاوت معدلات أخذ العينات بوصفها وظيفة من حاويات اجلاء مختلفة مع فراغ مختلفة، ويرد في الجدول 1.
خفض معدل أخذ العينات ويتحقق بسهولة عن طريق ضبط طول الأنبوب والهوية، مع عدم وجود قيود فنية في هذا الانخفاض (معدلات أخذ العينات القليلة ميكرولتر في ساعة قابلة للتنفيذ). ومع ذلك، يجب أن تكون على علم المجربون من معدل أخذ العينات بطيئة تمليه هذا القيد للحيوانات مع معدل ضخ بطيئة والكائنات الصغيرة أو العينات. ويترتب على الفور من معدل أخذ العينات البطيء هو حجم محدودة من المياه التي يمكن جمعها خلال سيسي أخذ العينات واحدعلى. وهذا انخفاض حجم تحد من عدد من التحليلات ومكررات التي يمكن تشغيلها مع هذه العينات، وبالتالي سوف يحد أيضا من المعلومات التي يمكن الحصول عليها من هؤلاء السكان.
الخلع أنبوب يمكن رصدها بسهولة وأخذ العينات يمكن إحباط أو إعادة تشغيل، شريطة أن يكون الغواص هو الحفاظ على مراقبة مستمرة. في المقابل، وقف الضخ خلال أخذ العينات ليست دائما من السهل اكتشافها. وهذا صحيح ليس فقط من أجل الإسفنج، ولكن أيضا لالزقيات، ذوات الصدفتين، والأشواك. في الواقع، خلافا للاعتقاد الشائع، وقد تم توثيق الأحداث التي وascidian أو ذوات المصراعين توقف ضخ مع أي تغيير ملحوظ في هندسة سيفون (ياهيل، بيانات غير منشورة). وعلاوة على ذلك، في بعض الحالات، يمكن أن الزقيات حفاظ على ضخ نشط مع عدم وجود إفراز شبكة (أي، لا الترشيح يجري).
السيطرة على معدل أخذ العينات أمر بالغ الأهمية. في هذا الصدد VacuSIP أفضل من الطرق الأخرى، وخاصة عند الحيوانات الدراسة اقاربهمصغيرة اعل أو عندما ضخ ببطء. المحاقن من الصعب جدا السيطرة 2. على سبيل المثال، بيريا-Blazquéz وزملاؤه (2012A) 40 يستخدم حقنة لأخذ عينات من المياه الزفير عن طريق عدة أنواع الإسفنج المعتدل والغريب لم تجد النمط العام لابتلاع / إفراز المواد الغذائية خاصة (NO 2 - NO 3 - NH 4 +، PO 4 3-، شافي 4). عدم وجود نمط واضح من المرجح أن يكون نتيجة لتلوث عينات الزفير مع المياه المحيطة بسبب استخدام المحاقن. التلوث هو واضح من منخفضة للغاية كفاءة الاحتفاظ العوالق بيكو التي أبلغ عنها بيريا-Blázquez وزملاؤه (2012b) 41 لاسفنجاتهم: 40 ± 14٪ من البكتيريا متغايرة و 54 ± 18٪ من متعاقبات حبيبية ليرة سورية. وعلى سبيل المقارنة، وذلك باستخدام VacuSIP، مولر وآخرون. (2014) 21 الإبلاغ عن كفاءة إزالة البكتيريا متغايرة من72 ± 15٪ في Siphonodictyon ليرة سورية. و 87 ± 10٪ في Cliona delitrix.
للتحقق من نوعية العينات والتأكد من عدم وجود تلوث في المياه المحيطة يحدث، ونحن نوصي بشدة لتحليل أولا العينات بيكو ونانو العوالق باستخدام التدفق الخلوي. وهذا التحليل سريع وموثوق بها، ورخيصة توفر معلومات فورية من جودة العينة. ومن الشائع جدا بالنسبة لبعض الأنواع فريسة مثل متعاقبات حبيبية ليرة سورية. إلى إزالتها عند الإغلاق إلى كفاءة 90٪ 14،42 من الإسفنج وascidian. وتشير انحرافات كبيرة من هذا المعيار أن التلوث قد حدث (الشكل 8).
لأخذ العينات موثوقة ونظيفة، وتأكد من تصميم التجربة يرضي سبع قواعد بسيطة: (1) إجراء مسح أولي (بما في ذلك ضخ تقديرات معدل) وإعداد موقع العمل بشكل جيد؛ (2) معرفة الحيوانات دراستها. (3) التحقق من أن العينة المدروسة لديها واضحة المعالم إفراغي فتحة لالثانية موقع يسهل الوصول إليه. (4) تحقق من العينة المدروسة تضخ قبل وبعد كل جمع العينات. (5) وضع أنبوب لجمع المياه الزفير قليلا داخل فتحة إفراغي (الشكل 1). (6) استخدام معدل أخذ العينات <10٪ من معدل تدفق إفراغي، 1٪ ينصح بشدة. (7) تحديد معيار الجودة وحذف يشتبه أزواج INEX.
اتباع هذه القواعد البسيطة، ونظام VacuSIP يقدم طريقة عملية وموثوق بها لقياس مدى نشاط الجسيمات عملية مغذيات تعليق والمركبات الذائبة في الظروف الطبيعية، مما يسمح للتقديرات دقيقة وقابلة للمقارنة والتي يمكن استخدامها لتقييم الدور الوظيفي للمغذيات الترشيح في مختلف النظم الايكولوجية العالم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
نشكر مانيل بوليفار لمساعدته في العمل الميداني. ونحن ممتنون لل"بارك الطبيعية ديل مونتغري، ليه ميديس ط شرم BAIX تير" على دعمهم لدينا أذونات البحوث وأخذ العينات. تم تصميم مناور تحت الماء عن طريق ايليت دادون-Pilosof وملفقة من قبل السيد Pilosof. وأيد هذا العمل من قبل مشروع الحكومة الاسبانية CSI-كورال [عدد المنح CGL2013-43106-R إلى الصليب الأحمر وMR] وزمالة فبو من "MINISTERIO دي EDUCACION، ثقافة ذ ديبورتي (MECD)" لTM. وهذه مساهمة من الكيمياء الحيوية البحرية ومجموعة التغيير الأبحاث العالمية التي تمولها الحكومة الكاتالانية [منحة عدد 2014SGR1029] وقوى الأمن الداخلي منحة 1280-1213 والبنك السعودي الفرنسي منحة 2012089 لG. ياهيل.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GorillaPod, Original | Joby | GP000001 | flexible portable tripod |
| Flangeless Ferrule | IDEX Health & Science | P-200X | 1/16" in Blue/pk |
| Male Nut | IDEX Health & Science | P-205X | 1/16" in Green/10 pk |
| Female to Female Luer | IDEX Health & Science | P-658 | |
| Female-Male Luer | IDEX Health & Science | P-655 | |
| Peek Tubing (254 µm ID) | IDEX Health & Science | 1531 | 1/16" OD x 0.01 in ID x 5 ft length. Alternative ID can be used. |
| Two component resin epoxy | IVEGOR | 9257 | Mix well the two component resin before use |
| (TOC) EPA Vials | Cole -Parmer | 03756-20 | 40 ml glass vials. Manufactured also by Thomas Scientific (ref. number 9711F09). |
| HDPE Vials | Wheaton | 986701 (E78620) | 20 ml high-density polyethylene vials |
| Vacuette Z no additive | Greiner bio-one | 455001 | pre-vacuum by the manufacturer |
| Septum Sample Bottles | Thomas Scientific | 1755C01 | 250 ml glass bottles |
| Septum Cap 1 | Wheaton | W240844SP (E7865R) | 22-400 for HDPE vials |
| Septum Cap 2 | Wheaton | W240846 (1078-5553) | 24-400 for glass vials and bottles. Also manufactured by Thermo Scientific National (ref. 03-377-42). |
| In-line stainless steel Swinney Filter holders | Pall | 516-9067 | 13 mm of diameter |
| PTFE Seal Washer | Pall | 516-8064 | ring for stainless steel filter holders |
| TCLP Glass Filters | Pall | 516-9126 | binder-free glass fiber filters, 13 mm of diameter, pore size 0.7 µm |
| Polycarbonate Filter Holders | Cole -Parmer | 17295 | 13 mm of diameter |
| Isopore Membrane Filters | Millipore | GTTP01300 | 13 mm of diameter, pore size 0.2 µm |
| Contrad 70 Solution | Decon Labs | 1002 | highly soluble basic mix of anionic and non-ionic surfactant solution |
| Sterile Syringe Filters | VWR International Eurolab S.L. | 514-0061P | 25 mm of diameter , pore size 0.2 µm |
| Fluorescein | Sigma-Aldrich | (old ref.28802) 46955-100G | 100 g |
| Holdex, disposable,sterile | Greiner bio-one | 450263 | sterile, single-use tube holder with off-center luer for Vacuette |
| Sterile Needles | IcoGammaPlus | 5160 | 0.7 mm x 30 mm |
| Cryovials Nalgene | Nalgene | V5007(Cat. No.5000-0020) | 2 ml |
| Cryobox carton | Rubilabor | M-600 | 145x145x55 mm p/microtube 1.5 ml |
| Orthophosphoric Acid | Sigma | 79617 or Alternatively use Ultra-Pure Hydrochloric acid, final concertation 0.1% | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | 500 g |
| Glutaraldehyde | Merck | 8,206,031,000 | 25%, 1 L |
| Hand Vacuum Pump | Bürkle | 5620-2181 or Alternatively use standard laboratory vacuum pump |
References
- Gili, J. M., Coma, R. Benthic suspension feeders: their paramount role in littoral marine food webs. Trends. Ecol. Evol. 13 (8), 316-321 (1998).
- Reiswig, H. In situ pumping activities of tropical Demospongiae. Mar. Bio. 9, 38-50 (1971).
- McMurray, S., Pawlik, J., Finelli, C. Trait-mediated ecosystem impacts: how morphology and size affect pumping rates of the Caribbean giant barrel sponge. Aquat. Bio. 23 (1), 1-13 (2014).
- Pile, A. J., Young, C. M. The natural diet of a hexactinellid sponge: benthic-pelagic coupling in a deep-sea microbial food web. Deep-Sea Res. Pt. I. 53 (7), 1148-1156 (2006).
- Nielsen, T., Maar, M. Effects of a blue mussel Mytilus edulis bed on vertical distribution and composition of the pelagic food web. Mar. Ecol. Prog. Ser. 339, 185-198 (2007).
- De Goeij, J. M., et al. Surviving in a marine desert: the sponge loop retains resources within coral reefs. Science. 342, 108-110 (2013).
- Maldonado, M., Ribes, M., van Duyl, F. C. Nutrient Fluxes Through Sponges. Biology, Budgets, and Ecological Implications. Advances in Marine Biology. 62, (2012).
- Riisgård, H. U. On measurement of filtration rates in bivalves - the stony road to reliable data: review and interpretation. Mar. Ecol. Prog. Ser. 211, 275-291 (2001).
- Reiswig, H. M. Water transport, respiration and energetics of three tropical marine sponges. J. Exp. Mar. Biol. Ecol. 14, 231-249 (1974).
- Jiménez, E., Ribes, M. Sponges as a source of dissolved inorganic nitrogen: nitrification mediated by temperate sponges. Limnol. Oceanogr. 52 (3), 948-958 (2007).
- Diaz, M. C., Ward, B. Sponge-mediated nitrification in tropical benthic communities. Mar. Ecol. Prog. Ser. 156, 97-107 (1997).
- Ribes, M., Coma, R., Gili, J. Natural diet and grazing rate of the temperate sponge Dysidea avara (Demospongiae, Dendroceratida) throughout an annual cycle. Mar. Ecol. Prog. Ser. 176, 179-190 (1999).
- Jiménez, E. Nutrient fluxes in marine sponges: methodology, geographical variability and the role of associated microorganisms. , Universitat Politècnica de Catalunya. Barcelona. PhD thesis (2011).
- Reiswig, H. M. Particle feeding in natural populations of three marine demosponges. Biol. Bull. 141 (3), 568-591 (1971).
- Reiswig, H. M. In situ pumping activities of tropical Demospongiae. Mar. Biol. 9 (1), 38-50 (1971).
- Yahel, G., Marie, D., Genin, A. InEx - a direct in situ method to measure filtration rates, nutrition, and metabolism of active suspension feeders. Limnol. Oceanogr-meth. 3, 46-58 (2005).
- Genin, A., Monismith, S. S. G., Reidenbach, M. A., Yahel, G., Koseff, J. R. Intense benthic grazing of phytoplankton in a coral reef. Limnol. Oceanogr. 54 (2), 938-951 (2009).
- Yahel, G., Whitney, F., Reiswig, H. M., Leys, S. P. In situ feeding and metabolism of glass sponges (Hexactinellida , Porifera) studied in a deep temperate fjord with a remotely operated submersible. Limnol. Oceanogr. 52 (1), 428-440 (2007).
- Wright, S. H., Stephens, G. C. Removal of amino acid during a single passage of water across the gill of marine mussels. J. Exp. Zool. 205, 337-352 (1978).
- Møhlenberg, F., Riisgård, H. U. Efficiency of particle retention in 13 species of suspension feeding bivalves. Ophelia. 17 (2), 239-246 (1978).
- Mueller, B., et al. Natural diet of coral-excavating sponges consists mainly of dissolved organic carbon (DOC). PLoS ONE. 9 (2), e90152 (2014).
- Gasol, J. M., Moran, X. A. G. Effects of filtration on bacterial activity and picoplankton community structure as assessed by flow cytometry. Aquat. Microb. Ecol. 16 (3), 251-264 (1999).
- Koroleff, F. Determination of reactive silicate. New Baltic Manual, Cooperative Research Report Series A. 29, 87-90 (1972).
- Murphy, J., Riley, J. P. A. Modified single solution method for the determination of phosphate in in natural waters. Anal. Chim. Acta. 27, 31-36 (1962).
- Shin, M. B. Colorimetric method for determination of nitrite. Ind.Eng.Chem. 13 (1), 33-35 (1941).
- Wood, E. D., Armstrong, F. A. J., Richards, F. A. Determination of nitrate in sea water by cadmium-copper reduction to nitrite. J. Mar. Biol. Assoc. U. K. 47 (1), 23-31 (1967).
- Sharp, J. H., et al. A preliminary methods comparison for measurement of dissolved organic nitrogen in seawater. Mar. Chem. 78 (4), 171-184 (2002).
- Sharp, J. H. Marine dissolved organic carbon: Are the older values correct. Mar. Chem. 56 (3-4), 265-277 (1997).
- Holmes, R. M., Aminot, A., Kerouel, R., Hooker, B. A., Peterson, B. J. A simple and precise method for measuring ammonium in marine and freshwater ecosystems. Can. J. Fish. Aquat. Sci. 56 (10), 1801-1808 (1999).
- Degobbis, D. On the storage of seawater samples for ammonia determination. Limnol. Oceanogr. 18 (1), 146-150 (1973).
- Tupas, L. M., Popp, B. N., Karl, D. M. Dissolved organic carbon in oligotrophic waters: experiments on sample preservation, storage and analysis. Mar. Chem. 45, 207-216 (1994).
- Yoro, S. C., Panagiotopoulos, C., Sempéré, R. Dissolved organic carbon contamination induced by filters and storage bottles. Water Res. 33 (8), 1956-1959 (1999).
- Zhang, J. Z., Fischer, C. J., Ortner, P. B. Laboratory glassware as a contaminant in silicate analysis of natural water samples. Water Res. 33 (12), 2879-2883 (1999).
- Yoshimura, T. Appropriate bottles for storing seawater samples for dissolved organic phosphorus (DOP) analysis: a step toward the development of DOP reference materials. Limnol. Oceanogr-meth. 11 (4), 239-246 (2013).
- Strickland, J. D. H., Parsons, T. R. A practical handbook of seawater analysis. , Fisheries Research Board of Canada. Ottawa. (1968).
- Eaton, A. D., Grant, V. Freshwater sorption of ammonium by glass frits and filters: implications for analyses of brackish and freshwater. Limnol. Oceanogr. 24 (2), 397-399 (1979).
- Norrman, B. Filtration of water samples for DOC studies. Mar. Chem. 41 (1-3), 239-242 (1993).
- Carlson, C. A., Ducklow, H. W. Growth of bacterioplankton and consumption of dissolved organic carbon in the Sargasso Sea. Aquat. Microb. Ecol. 10 (1), 69-85 (1996).
- Grasshoff, K., Ehrhardt, M., Kremling, K. Methods of Seawater Analysis. Second, Revised and Extended Edition. , (1999).
- Perea-Blázquez, A., Davy, S. K., Bell, J. J. Nutrient utilisation by shallow water temperate sponges in New Zealand. Hydrobiologia. 687 (1), 237-250 (2012).
- Perea-Blázquez, A., Davy, S. K., Bell, J. J. Estimates of particulate organic carbon flowing from the pelagic environment to the benthos through sponge assemblages. PLoS ONE. 7 (1), e29569 (2012).
- Pile, A. J., Patterson, M. R., Witman, J. D. In situ grazing on plankton <10 µm by the boreal sponge Mycale lingua. Mar. Ecol. Prog. Ser. 141, 95-102 (1996).
