Introduction
Benthische schorsing feeders spelen een essentiële rol in het functioneren van mariene ecosystemen 1. Door het filteren van grote hoeveelheden water 2,3, ze te verwijderen en scheiden deeltjes (plankton en detritus) en opgeloste verbindingen 1 (en referenties daarin) en zijn een belangrijk middel van benthische-pelagische koppeling 4,5 en voedselkringloop 6,7. Nauwkeurig meten van de deeltjes en opgeloste stoffen verwijderd en uitgescheiden door benthische schorsing feeders (zoals sponzen, ascidians, borstelwormen en tweekleppigen) is fundamenteel voor hun fysiologie, metabolisme en het voeden van de ecologie te begrijpen. Samen met pompsnelheid metingen, maar maakt het ook mogelijk een kwantificering van de nutriënten gemedieerd door deze organismen en de ecologische invloed op de kwaliteit van het water als op het ecosysteem grootschalige processen.
Het kiezen van de juiste methode voor het meten van verwijdering en productiesnelheden van deeltjes en opgeloste compond door ophanging filter feeders is van cruciaal belang voor het verkrijgen van betrouwbare gegevens over hun voedselopname 8. Zoals opgemerkt door Riisgård en anderen, ongepast methodieken vooroordelen resultaten, vervormen experimentele omstandigheden, produceren onjuiste schattingen van de inname en uitscheiding van bepaalde stoffen, en kan leiden tot foutieve kwantificering van de nutriënten verwerkt door deze organismen.
De twee meest gebruikte methoden om deeltjes en opgeloste nutriëntfluxen in filter feeders meten betrekken ofwel incubatie (indirecte technieken) of gelijktijdig verzamelen van omgevings- en uitgeademde water (directe technieken). Incubatie technieken zijn gebaseerd op het meten van de verandering in de concentratie van deeltjes en opgeloste voedingsstoffen in het water geïncubeerd, en het schatten productiesnelheden of verwijdering vergelijking aan afdoende 8. Echter, het omsluiten van een organisme in een incubatie kamer kan zijn feedin verandereng en pompen gedrag als gevolg van veranderingen in de natuurlijke stroming regime door een daling in zuurstof en / of voedselconcentratie of door accumulatie van verbindingen uitscheiding in de incubatie 7,9 water (en referenties daarin). Naast de effecten van de begrenzing en gewijzigd water, een grote voorspanning van incubatie technieken voort uit re-filtratie effecten (zie bijvoorbeeld 10). Hoewel sommige van deze methodologische problemen zijn overwonnen door de juiste omvang en vorm van het incubatievat 11 of de introductie van een recirculerend stolp systeem in situ 12, deze techniek vaak onderschat verwijdering en productiesnelheden. Kwantificeren van de stofwisseling van opgeloste stoffen zoals opgeloste organische stikstof (DON) en koolstof (DOC) of anorganische nutriënten, heeft bewezen bijzonder gevoelig voor vertekeningen veroorzaakt door incubatie technieken 13 worden.
In de late jaren '60 en vroege jaren '70, Henry Reiswig9,14,15 een pionier in de toepassing van de rechtstreekse technieken om de verwijdering deeltjes te kwantificeren door reusachtige Caribbean sponzen, door afzonderlijk bemonstering van de water ingeademd en uitgeademd door de organismen in situ. Vanwege de moeilijkheid om Reiswig techniek toegepast bij kleinere suspensie feeders en meer uitdagende onderwater omstandigheden het grootste deel van het onderzoek op dit gebied was beperkt tot het laboratorium (in vitro) waarin de meeste indirecte technieken 16 incubatie. Yahel en collega's omgebouwd Reiswig directe in situ techniek om te werken in kleinere schaal omstandigheden. Hun methode, genaamd INEX 16, is gebaseerd op de gelijktijdige onderwater bemonstering van het water ingeademd (In) en uitgeademd (Ex) van ongestoorde organismen. De verschillende concentratie van een middel (bijvoorbeeld bacteriën) tussen twee monsters (INEX) een maat voor de retentie (of productie) van die stof door het dier. De Inex techniek maakt gebruik van een open einde buizen enafhankelijk van de excurrent straal door de pompende werking van het onderzochte organisme passief vervangen vaarwater in de verzamelbuis. Terwijl Yahel en collega succesvol deze techniek toegepast bij het onderzoek van meer dan 15 verschillende suspensie feeders taxa (bijvoorbeeld 17), wordt de werkwijze beperkt door de hoge mate van oefening en ervaring nodig door de minuscule omvang van sommige excurrent openingen, en omstandigheden op zee.
Om deze obstakels te overwinnen, ontwikkelden we een alternatieve techniek gebaseerd op gecontroleerde zuiging van de bemonsterde water door minuut buizen (uitwendige diameter van <1,6 mm). Ons doel was om een eenvoudige, betrouwbare en goedkope apparaat dat schoon en gecontroleerd in situ water sampling uit een zeer specifiek punt, zou toelaten zoals de excurrent opening van bodemdieren schorsing feeders te creëren. Om effectief te zijn, heeft de werkwijze niet opdringerig zijn om te voorkomen dat de omgevingstemperatuur stromingsregiem beïnvloeden of wijzigen behavior van de bestudeerde organismen. Het apparaat hier gepresenteerd wordt genoemd VacuSIP. Het is een vereenvoudiging van het SIP is ontwikkeld door Yahel et al. (2007) 18 voor ROV-gebaseerde point sampling in de diepzee. De VacuSIP is aanzienlijk goedkoper dan de originele SIP en het is aangepast voor SCUBA-based werken. Het systeem is ontworpen volgens de principes gepresenteerd en getest door Wright en Stephens (1978) 19 en Møhlenberg en Riisgård (1978) 20 voor het laboratorium instellingen.
Hoewel het VacuSIP systeem is ontworpen voor in situ studies van het metabolisme van benthische feeders suspensie kan ook worden gebruikt voor laboratoriumonderzoek en waar een gecontroleerde en schoon puntbronnen watermonster vereist. Het systeem is vooral handig wanneer de integratie gedurende langere perioden (min-uur) of in situ filtraties vereist. De VacuSIP is met succes gebruikt bij de Yahel lab sinds 2011, en ooktewerkgesteld in twee recente studies van nutriënten gemedieerd door het Caribisch gebied en de Middellandse Zee sponssoorten 21 (Morganti et al., ingediend).
Het gebruik van specifieke samplers, de verlengde bemonstering, en het veld omstandigheden, waarin VacuSIP wordt toegepast, leiden tot een aantal afwijkingen van de standaard oceanografische protocollen voor het verzamelen, filteren, en het opslaan van monsters voor gevoelige analyten. Om het risico van besmetting te verminderen door het VacuSIP systeem of het risico van wijziging van de bemonsterde water door bacteriële activiteit na inzameling, testten we diverse in situ procedures filtratie en opslag. Verschillende filterinrichtingen, opvangbakken en opslaan procedures om de meest geschikte techniek voor het analyseren van opgeloste anorganische (PO 4 3- NO x -, NH4 +, SiO 4) bereiken onderzocht en organische (DOC + DON) verbindingen, en ultra-plankton (<1081; m) en deeltjes organische (POC + PON) sampling. Om het risico van verontreiniging verder te verminderen, vooral onder veldomstandigheden, het aantal behandelingsstappen werd teruggebracht tot een minimum. De visueel formaat waarin de werkwijze wordt aangeboden is gericht op reproduceerbaarheid vergemakkelijken en de tijd die nodig is om de techniek efficiënt gehandeld.
Systeem overzicht
Monsters in situ gepompte water suspensie voeders met exhalant openingen van slechts 2 mm, wordt de pompactiviteit van elk monster eerst gevisualiseerd door het vrijgeven gefiltreerd fluoresceïne gekleurd zeewater naast de inhalatie-opening (en) en het observeren van de stroom vanaf de excurrent opening 16 (zie ook figuur 2B 18). Het water in- en uitgeademde door de studie monster (incurrent en excurrent) worden dan gelijktijdig bemonsterd met behulp van een paar minuten buizen op maat gemaakte manipulator geïnstalleerd of twee van de "arms "van een omgekeerde flexibele draagbare driepoot (figuur 1 en aanvullende Video 1). Het water ingeademd door de studie organisme wordt verzameld door nauwkeurig positioneren van het proximale uiteinde van een buis in of nabij de inhalatie opening van het onderzoek organisme. Een identiek buis wordt dan gepositioneerd binnen het excurrent opening. voor deze functie moet goede zorg contact of verstoring van het dier, bijvoorbeeld door sediment resuspensie voorkomen. de bemonstering beginnen een duiker doorboort een septum in het verzamelvat met een injectienaald aan de distale uiteinde van elke buis, zodat de uitwendige waterdruk in de steekproef er water in het vat door de monsterbuis. de zuiging wordt geïnitieerd door het vacuüm reeds gemaakt in de flacons en het drukverschil tussen de uitwendige water en afgevoerd monsterhouder .
Om te zorgen voor een schone collectie van uitgeademde water en per ongeluk opzuigen van ambi voorkomenent water 16, het water sampling rate heeft op een aanzienlijk lager tarief (<10%) dan de excurrent debiet te worden gehouden. De afzuiging wordt geregeld door de lengte van de buis en de inwendige diameter (ID). De kleine inwendige diameter zorgt ook voor een verwaarloosbaar dood volume (<200 pi per meter buis). Bemonstering gedurende langere tijd (minuten tot uren) kan de inherente patchiness van de meeste stoffen plaats integreren. Opdat voldoende monsters worden bewaard in langdurige onderwater bemonsteringen en voor vervoer naar het laboratorium, een in situ filtratie wordt aanbevolen voor gevoelige analyten. De selectie van de bemonstering schepen, filtratie assemblage, en slangen worden gedicteerd door de studie organismen en de specifieke onderzoeksvraag. De hieronder beschreven protocol veronderstelt dat een volledige metabolisch profiel van belang (voor een overzicht zie figuur 2). Echter, het modulaire karakter van het protocol maakt fof eenvoudige modificatie eenvoudiger of zelfs heel andere bemonsteringsschema's tegemoet te komen. Voor een volledige metabole profiel, moet de sampling protocol omvatten de volgende stappen: (1) Flow visualisatie; (2) Sampling ultra-plankton voeding (plankton <10 pm); (3) Steekproef anorganische voedingsstoffen opname en excretie (met behulp van in-line filters); (4) Sampling opgeloste organische opname en excretie (met behulp van in-line filters); (5) Particulate voeden en excretie (met behulp van in-line filters); (6) Herhaal stap 2 (ultra-plankton voeden als kwaliteitscontrole); (7) Flow visualisatie.
Wanneer het logistiek mogelijk is, verdient het aanbeveling het metabolische metingen worden gecombineerd met pompsnelheid (bijvoorbeeld de kleurstof voorkant snelheid werkwijze, 16) en de ademhaling metingen. Deze metingen worden het best genomen bij het begin en einde van de sessiesteekproeven. Voor de ademhaling meten, onderwater optoden of micro-elektroden de voorkeur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. voorbereidende stappen en Cleaning Procedures
- Reinigingsproduct
- Draag beschermende kleding, een laboratoriumjas en handschoenen te allen tijde. Uitvoeren van deze voorbereidende stappen in een schone ruimte vrij van stof en rook.
- Bereid een zoutzuur 5-10% zuur (HCl) met verse, kwalitatief hoogwaardige, dubbel gedestilleerd water.
- Bereid een 5% zeer goed oplosbaar basismengsel van anionogene en niet-ionogene oppervlakteactieve oplossing (zie Materials List) met verse, hoge kwaliteit, dubbel gedestilleerd water.
- Bewaar alle oplossingen in schone, met zuur gewassen containers.
- Voorbereidende stappen en schoonmaak procedures (in het laboratorium)
LET OP: Als fosforverbindingen zijn niet van belang, kan het HCl wassen worden vervangen door een hoge kwaliteit fosforzuur (H 3 PO 4) wassen (8% H 3 PO 4 uiteindelijke concentratie).- Draag beschermende kleding, een laboratoriumjas en handschoenen te allen tijde.
- Wassende bemonsteringsapparaten (met uitzondering van de in-line roestvrijstalen Swinney filterhouder) met ruime hoeveelheid zuiver water. Laat het apparaat onderdompelen in 5-10% HCl-oplossing 's nachts. Spoel het apparaat opnieuw met ruime hoeveelheid van hoge kwaliteit dubbel gedestilleerd water.
- Was het in-line roestvrijstalen Swinney filterhouders met ruime hoeveelheid zuiver water. Laat het filter houders weken in 5% sterk oplosbare basis mix van anionische en niet-ionische oppervlakte-oplossing 's nachts. Spoel ze opnieuw met voldoende hoge kwaliteit dubbel gedestilleerd water.
- Droog alle bemonsteringsapparaten, wikkel ze in aluminiumfolie en in een schone doos te houden tot gebruik.
- Zuig rate control
- Controle van de sampling rate door aanpassing van de lengte en de inwendige diameter van de intake buis volgens de geplande werkzaamheden diepte en de temperatuur van het water. Gebruik de volgende vergelijking (afgeleid van de Hagen-Poiseuille gebruikte vergelijking voor volledig ontwikkeld laminaire pijpstroming) als leidraad:
waarin F = stroomsnelheid (cm 3 min -1), AP = drukverschil (bar), r = inlaatbuis binnenradius (cm), K = 2,417 x 10 -9 (sec -2), L = buislengte (cm ), V = water viscositeit (g cm -1 sec -1). Zie tabel 1 voor meer informatie. - Houd bemonsteringsfrequentie dan 1% van de pompsnelheid van de bestudeerde dieren.
LET OP: Het gebruik van geëvacueerd containers, soms met onbekende vacuüm stelt extra complicaties. Daarom is een veldtest zeer aan te bevelen. Op 10 meter diepte en ~ 22 ° C zeewater (40 PSU), een 50 cm inlaat slang met een inwendige diameter van 254 urn een gemiddelde schrijfsnelheid aanzuigsnelheid van ~ 26 sec -1 ui (1,56 ml min -1).
- Controle van de sampling rate door aanpassing van de lengte en de inwendige diameter van de intake buis volgens de geplande werkzaamheden diepte en de temperatuur van het water. Gebruik de volgende vergelijking (afgeleid van de Hagen-Poiseuille gebruikte vergelijking voor volledig ontwikkeld laminaire pijpstroming) als leidraad:
- sampling schepen
- Voor kleine monsters (3-20 ml, bijvoorbeeld ultra-plankton voor stroming cytmetrie) gebruik maken van pre-gestofzuigd steriele plastic buizen.
OPMERKING: Pre-gestofzuigd steriele plastic buizen worden routinematig gebruikt voor standaard bloedonderzoek bij de mens; zorg ervoor dat de steriele buizen te gebruiken zonder toevoegingen. Deze gezogen steriele plastic buizen best bemonsterd met behulp van steriele eenmalig gebruik buishouder excentrisch Luer. Hoewel dit de meest veilige en efficiënte bemonsteringsapparaten, heeft een iets grotere dode volume in vergelijking met een eenvoudige naald. - Voor grotere watermonsters zoals voedingsstoffen en opgeloste organische stoffen, gebruik maken van 40 of 60 ml glazen flesjes die voldoen aan de Environmental Protection Agency (EPA) criteria voor vluchtige organische analyses. Deze flesjes zijn voorzien van een polypropyleen dop met een PTFE-geconfronteerd met siliconen septum.
- Voor nog grotere volumes, gebruiken penicilline flessen met rubberen stop of thermosflessen.
- Gebruik high-density polyethyleen flacons (HDPE flesjes) voor silica monsters.
- Om monstervolume te verhogen en het risico van de stop losraken verminderentijdens de klim, evacueren (vacuüm) items 1.4.2-1.4.4 voor de duik met een vacuümpomp. Vacuüm handmatig met een handvacuümpomp of zelfs door zuigen de lucht met een spuit. Echter, voor het beste resultaat, een goede vacuümpomp wordt aanbevolen. Standard lyophilizers biedt hoog vacuüm.
LET OP: Let vooral bij het gebruik van grote kolven gestofzuigd om ervoor te zorgen dat de snellere initiële zuigkracht tarief niet de uitgeademde watermonsters zouden vervuilen.
- Voor kleine monsters (3-20 ml, bijvoorbeeld ultra-plankton voor stroming cytmetrie) gebruik maken van pre-gestofzuigd steriele plastic buizen.
- Vessel schoonmaak procedures
- Voor opgeloste organische stoffen en NH4 + analyse, met nieuwe pre-gereinigde EPA flesjes.
- Spoel de flacons (glas en HDPE) voor analyse van andere voedingsstoffen als volgt:
- Spoel de injectieflacons (glas en HDPE) en polypropyleen dop met een hoge kwaliteit dubbel gedestilleerd water. Installeer een nieuwe silicium septum.
- Week de flacons (glas en HDPE) in 10% HCl gedurende ten minste 3 dagen en spoel met voldoende hoge kwaliteit dubbel gedestilleerd water.
- Verbranden het glazen flesjes bij 450 ° C gedurende 4 uur en laat afkoelen in de oven. Installeer de dop, en wikkel in aluminiumfolie tot gebruik.
- filters
- Gebruik bindmiddelvrije glasvezelfilters voor filtratie van opgeloste biologische monsters (bijvoorbeeld DOC, DON) en voor het verzamelen van deeltjesvormige organische (bijv POC, PON). Pak elk glas filter in een aparte aluminiumfolie envelop. Verbranden bij 400 ° C gedurende 2 uur om organische resten en op te slaan in een schoon en droog vat vervluchtigen tot gebruik.
- Gebruik of een bindmiddelvrije glasvezelfilters hierboven of 0,2 um polycarbonaat membranen voor het bemonsteren van anorganische nutriënten (bijv PO 4 3- NO x -, NH4 +). Maak de laatste eenmaal geïnstalleerd in de filterhouder zoals hieronder beschreven (1.7.3).
- Gebruik 0,2 um polycarbonaat membranen filters voor silica bemonstering. Reinig ze eenmaal installed in de filterhouder hieronder (1.7.3) toegelicht.
- Bereiding van filtratie samenstel
- Filter de sterk oplosbare basische mengsel van anionogene en niet-ionogene oppervlakteactieve oplossing en de hoge kwaliteit dubbel gedestilleerd water door een 0,2 um filter alvorens ze naar de filtratie samenstel reinigen.
- Filtratie samenstel voor nutriënten en dan siliciumdioxide opgeloste organische stoffen:
- Plaats een verbrand bindmiddel-vrije glasvezel filters binnen de gereinigde in-line roestvrijstalen Swinney filterhouder.
- Gebruik een zuur gereinigde spuit 100 ml 5% sterk oplosbare basische mengsel van anionische en niet-ionische surfactant-oplossing en vervolgens 100 ml van hoge kwaliteit dubbel gedestilleerd water doorheen het hele samenstel.
- Filtration assemblage voor SiO 4:
- Plaats het polycarbonaat filter in het gereinigde polycarbonaat filterhouder (PC filterhouder).
- Gebruik een zuur schoongemaakt spuit run 30 ml 5% HCl en 30 ml van hoge kwaliteit dubbel gedestilleerd water door het gehele samenstel.
- System assembly
- Monteer het systeem voor onderzeese werken middels PEEK (polyetheretherketon) buis met een buitendiameter (OD) van 1,6 mm en een binnendiameter (ID) van 254 urn of 177 urn.
- Met een scherp mes of PEEK mes aan de buizen daarna tot de gewenste lengte.
- Bij het distale uiteinde (monsterhouder kant), past elke buis met een mannelijke Luer verbindingsstuk bevestigd aan een injectienaald. Zorg ervoor dat u de instructies van de fabrikant te volgen en lijn de platte kant van de blauwe flangeless ferrule met het einde van de buis voor het aandraaien van de groene noot.
- Bevestig de PEEK slang aan op het statief "armen" of custom-built manipulator met behulp van een isolerende tape.
- Bevestig een disposable injectienaald om de mannelijke Luer connector. Houd de naald met een beschermkapje om blessures te voorkomen. Het is duidelijk dat het etiket van de bemonstering vistuig en kleurcode alle ingeademd en uitgeademde componenten (bijvoorbeeld groen = In, rood = Ex).
- Op dezelfde kleurcode de sampling schepen met sets van gepaarde steekproeven schepen opeenvolgend genummerd.
waarin F = stroomsnelheid (cm 3 min -1), AP = drukverschil (bar), r = inlaatbuis binnenradius (cm), K = 2,417 x 10 -9 (sec -2), L = buislengte (cm ), V = water viscositeit (g cm -1 sec -1). Zie tabel 1 voor meer informatie. 2. Werken Onderwater
- Werk bouwrijp maken
- Vooronderzoek en de selectie van specimens
OPMERKING: Als gevolg van de complexe aard van de onderwaterwereld bemonsteringsprotocol, besteedt de nodige tijd voor de voorbereiding zal zorgen voor een efficiënte sampling duik.- De enquête van de werkplek en de nodige voorbereidingen van tevoren.
- Selecteer en markeer geschikt doelwit organismen die relatief gemakkelijk kunnen worden benaderd. Aangezien niet alle organismen per se actief kunnen zijn op het moment van de bemonstering duik, voor te bereiden meer werkstations dan je verwacht te proeven.
- Installatie van de basis ondersteuningen
- when werken aan genivelleerd substraat:
- Monteer de oorspronkelijke release clip van de flexibele statief op 1 kg duiken gewichten snel en eenvoudig te positioneren het naast het doel dier.
- Bij het werken aan verticale wanden:
- Mount base steun platen voor de VacuSIP systeem, haken voor accessoires spullen en hangers voor de opvangbak Het dragende dienblad tijdens de werkplek voorbereidingsfase (2.1.1).
- Wanneer flexibele draagbare statieven zijn gebruikt, gebruik bouten of twee-componenten epoxy hars om 10x10 cm PVC platen vast te stellen naast elke doeldier. Elke plaat moet een gat om de quick release clips van de flexibele draagbare driepoot hechten hebben.
- Wanneer de hars is uitgehard en de basisplaten zijn stevig bevestigd aan de wand, draai de snelkoppeling bevat, die als een stevige bevestiging voor de flexibele draagbare driepoot voor het VacuSIP systeem.
- when werken aan genivelleerd substraat:
- Vooronderzoek en de selectie van specimens
- Het installeren van de VaCUSIP
- Controleer of het monster pompt door het vrijgeven van gefilterde fluoresceïne kleurstof naast de inhalatie-opening en bevestigen dat de kleurstof aan het ontstaan is door de exhalent opening zoals beschreven in Yahel et al. (2005) 16.
- Installeer de VacuSIP apparaat en plaats de inhalatie (IN) bemonstering buis binnen de inhalatie-opening of gewoon ernaast (binnen ~ 5 mm). Zorg ervoor dat de inhalatie-buis is niet in de nabijheid van een ander exhalant opening.
- Zorgvuldig richt de exhalant (EX) bemonstering buis in de richting van de Osculum / exhalant sifon en steek deze heel voorzichtig in, totdat het is gepositioneerd 1-5 mm binnen de Osculum / exhalant sifon (zie figuur 1 en aanvullende Video 1). Neem grote zorg niet om contact te maken met of de bemonsterde organisme anders verstoren.
- Voor en tijdens de bemonstering double-check de locatie van beide buizen.
- Na de bemonstering controleren of het monster is nog steeds pompen als described hierboven (2.2.1).
OPMERKING: Omdat de beweging van de ene arm van het statief bij het manipuleren van de andere zou kunnen voorkomen, zorg ervoor dat je in de eerste plaats zet de inhalatie bemonsteringsleiding en in de tweede plaats de exhalant buis, die nauwkeuriger manipulatie vereist. In deze volgorde, zelfs als het manipuleren van de exhalant bemonsteringsbuis de beweging van de buis inhalatie kunnen veroorzaken, zal het geen invloed op de bemonstering.
- Modulaire onderwater bemonsteringsprocedure
Opmerking: Afhankelijk van de vraagstelling, elk van de volgende experimentele stappen worden uitgevoerd als een stand-alone experiment. De volledige metabole profiel sampling protocol hieronder beschreven is een langdurig proces, waarbij tot 8 uur per monster (voor een overzicht zie figuur 2 en tabel 2). Zoals duiken voorwaarden en regels verschillen tussen bemonstering sites, regio's en instellingen, zijn duiken plannen niet opgenomen in dit protocol. Toch besteden uiterste zorg en METIculous planning aan het duiken plan. Besteed speciale zorg aan verzadiging en yoyo duikprofielen te voorkomen. Indien mogelijk, is het raadzaam deze experimenten op geringe diepte (<10 m) voeren. Gesloten circuit rebreathers kan erg handig zijn voor een dergelijke langdurige bemonsteringsplannen zijn.- Voor het eigenlijke bemonstering begint, zorg ervoor dat er geen zichtbare sporen van fluoresceïne residu blijven en dat opgeschort sedimenten zijn voldaan of zijn weg wafted.
- Ultra-plankton, (geen filter wordt geïnstalleerd in deze stap!)
- Gebruik de naald op de IN (inhalatie) en EX (uitgeademde) gestofzuigd steriele plastic buizen septa doorboren. Controleer dat het water druipt in op de geplande koers en het verzamelen van 2-6 ml watermonsters.
- Op retrieval, houdt monsters in een koelbox op ijs. In het lab, te behouden met 1% paraformaldehyde + 0,05% EM graad glutaaraldehyde (eindconcentratie), of 0,2% EM leerjaar glutaaraldehyde. Freeze cryovials in vloeibare stikstof en bewaar bij -80 &# 176; C tot analyse.
- Silicaat bemonstering en opslag
- Installeer de voorgereinigde inline roestvrij PC filterhouder met een 0,2 micrometer polycarbonaatmembraan tussen de naald en de Luer male connector aan het distale einde van de buis.
- Doorboren het septum dop van de voorgereinigde hogedichtheidspolyethyleen flesjes (HDPE flesjes) steekproeven starten. Controleer of beide samplers druipen en het verzamelen van 15 ml water in elk flesje.
- Houd de gekoelde monsters (4 ° C) tot analyse. Indien analyse niet kan beginnen binnen twee weken, op te slaan bij -20 ° C. Voor analyse ervoor zorgen dat de monsters ontdooid bij 50 ° C gedurende ten minste 50 min silica gels lossen.
OPMERKING: Het membraan kan worden bewaard voor microscopie of DNA analyse nodig.
- Opgeloste anorganische stoffen (PO 4 3-, NO x -, NH4 +)
- Vervang tHij PC filtersamenstel met een vooraf gereinigd lijn roestvrijstalen filterhouder die een vooraf verbrand glasfilter bevat.
- Voordat de monsterneming, toe dat ten minste 20 ml zeewatermonsters door het gehele filtersysteem werden doorgegeven door EPA, HDPE flesjes of andere vacuümvat om de afzuiging te starten. Meet het volume van het verzamelde water voordat ze worden verwijderd.
- Doorboren het septum dop van de juiste EPA glazen flesjes te samplen te starten, controleer dan of beide samplers druipen, en het verzamelen van 25-30 ml voor nitraat en fosfaat analyse.
- Overschakelen naar nieuwe EPA glazen flesjes voor ammoniak analyse controleren of beide samplers druipen, en het verzamelen van 20 ml in elk flesje.
- Houd de monsters in een koude ruimte op ijs en bewaar bij -20 ° C tot de analyse.
LET OP: Als slechts het filtraat van belang is, kan wegwerpspuit filters worden gebruikt voor de stappen 2.3.3 en 2.3.4.
- Opgeloste organische stoffen (DOC + DON) bemonstering en storing
LET OP: Houd de monsters zo rechtop mogelijk gedurende het hanteren, zodat monster water niet in contact komt met het silicium septa.- Ga door met de roestvrijstalen filtersamenstel en laat 20 ml zeewatermonsters in nieuwe EPA glazen flesjes, zoals hierboven beschreven.
- Bij het ophalen, houdt de monsters in een koelbox op ijs. In het lab, gebruik maken van een pre-verbrand glas Pasteur pipet de monsters met orthofosforzuur lossen (voeg 5-6 druppels 25% trace metal graad zuur in een 20 ml monster, uiteindelijke concentratie 0,04%) of zoutzuur (2 druppels van sporen metalen graad geconcentreerd zuur in een 20 ml monster, uiteindelijke concentratie 0,1%) en koel bewaren.
- Houd de gekoelde monsters (4 ° C) tot analyse. Indien monsters niet binnen een week verzameld, geanalyseerd opslag bij -20 ° C tot de analyse.
- Particulate organisch materiaal (POC, PON, POP)
- Ga verder met behulp van de stainless stalen filter assemblage en filter ten minste 500 ml van zeewater in een geëvacueerde 250 ml thermoskan. Vervang kolven indien nodig.
- Op retrieval, maken gebruik van een met lucht gevulde injectiespuit aan alle resterende zeewater te evacueren uit de filterhouder, wikkel het in aluminiumfolie, en op te slaan in een koelbox op ijs. In het laboratorium, de filter verwijderd uit de filterhouders en bewaren bij -20 ° C tot de analyse.
- Voor het eigenlijke bemonstering begint, zorg ervoor dat er geen zichtbare sporen van fluoresceïne residu blijven en dat opgeschort sedimenten zijn voldaan of zijn weg wafted.
Figuur 1. Een voorbeeld van een correcte installatie van de VacuSIP: (A) het bemonsteren van de ascidian Polycarpa mytiligera (Golf van Aqaba, Rode Zee) met behulp van een op maat gemaakte manipulator met de kleur code die wordt gebruikt groen voor ingeademd en geel voor uitgeademde watermonsters (foto door Tom Shelizenger en Yuval Yacobi); (B) het bemonsteren van de spons Agelas oroides (NW MiddellandseSea) met een Osculum breedte van 3 mm, met de VacuSIP apparaat. De kleurcode gebruikt is geel voor inhalatie en rood voor uitgeademde watermonsters. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Overzicht van de VacuSIP techniek in de sectie protocol beschreven. Het lab werk is vertegenwoordigd in gele vakken, het veldwerk in blauwe dozen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tabel 1. De totale gemiddelde bemonsteringsfrequentie (ml min -1) verkregen met verschillende containersgebruikt voor water collecties en verschillende vacuüm niveaus: de kolven werden niet gestofzuigd (geen); EPA glazen flesjes en HDPE flesjes werden gestofzuigd de helft van hun volume (½ volume); steriele plastic buizen werden reeds gezogen door de fabrikant. Werken bij 5-8 meter diepte, watertemperatuur van 18-22 ° C, met behulp van PEEK buizen van 79 cm lengte en 25 urn inwendige diameter.
Tabel 2. Overzicht van het bemonsteringsvat, fixeermiddel, inline filterconstructie, opslag en analysemethoden voor de sectie protocol beschreven. De geanalyseerde verbindingen zijn: ultra-plankton overvloed (plankton <10 pm), silicaat (SiO 4), fosfaat (PO 4 3-), nitriet + nitraat (NO 2 - + NO 3 -), opgeloste organische stof (DOM) ammonium (NH4 +) en fijn organisch materiaal(POM). Alle sampling schepen hebben silicium septum cap en worden gestofzuigd vóór de bemonstering. De fixeermiddelen zijn: paraformaldehyde + glutaraldehyde (Glut + Parafor) orthofosforzuur (H 3 PO 4) en zoutzuur (HCl). De in-line filter samenstellingen, gebruikt zijn: polycarbonaat filterhouders en polycarbonaat membraan 0,2 urn filters (PC filterhouder + PC membraan) en roestvrij staal filterhouders en bindmiddel-vrije glasvezelfilters GFF.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Optimalisatie van zeewater collectie methoden
Selectie van de collector flesjes en reiniging
VacuSIP-compatibele opvangbakken zou een septum die het mogelijk maakt de bemonstering te worden geïnitieerd door piercing met een injectienaald te hebben. Ze moeten de verhoogde onderwater druk (2-3 bar bij typische scuba werkdieptes) te weerstaan, en moet een vacuüm te houden. Vele (maar niet alle merken) van buisjes EPA goedgekeurd voor de analyse van vluchtige organische verbindingen aan deze criteria. Pre-schoongemaakt flesjes goedgekeurd voor DOC en DON analyse zijn ook beschikbaar. Om de geschiktheid van deze flesjes voor de verzameling en analyse van voedingsstoffen en het schoonmaken procedures optimaal te testen, werd een hoge kwaliteit dubbel gedestilleerd water opgevangen in zuur schoongemaakt polypropyleen buizen (PP buizen), onlangs gekocht, in een-Cid schoongemaakt high-density polyethyleen flacons (HDPE flesjes), en in EPA glazen flesjes, allemaal uitgerust met een polytetrafluorethyleen (PTFE) septum cap. De HDPE flesjes en polypropyleen buisjes werden gereinigd zoals beschreven in paragraaf 1.5.2 hierboven, en de glazen flesjes EPA werden gereinigd door de fabrikant.
De hoeveelheid NH4 + gevonden in EPA glazen flesjes was relatief weinig (≤ 0,1 umol L -1) en is afhankelijk van de hoge kwaliteit dubbel gedestilleerd water standaardkwaliteit. Daarentegen NH4 + concentraties significant verhoogd (tot 3 en 7 maal, respectievelijk) en vertoonden een hogere variabiliteit in zuur gereinigd polypropyleen buizen en HDPE flesjes (ANOVA F (5,53) = 7,183, p < 0,001, figuur 3). Er was geen effect van hoge kwaliteit dubbel gedestilleerd water contact met het silicium septum op de ammonium-analyse.
Vergelijking van de nieuwe glazen flesjes versus schoongemaakt / glazen flesjes gerecycled
Nagaan EPA glazen flesjes voor nutriëntenanalyses kunnen worden gebruikt meer dan eens de NO x -, PO 4 3- en NH4 + concentraties in zeewater afgenomen in nieuwe EPA glazen flesjes werden vergeleken met die verzameld used EPA glazen flesjes. De nieuwe EPA glazen flesjes werden vooraf gereinigd door de fabrikant, terwijl de glazen flesjes gerecycleerde werden gereinigd zoals hierboven (1.5.2) beschreven. Gerecycleerd schalen hadden significant hogere NH4 + concentratie tot 1,5 maal de hoogte in nieuwe glazen flesjes (t-test, p <0,001, n = 5). Er werden geen significante verschillen gevonden in NO x - en PO 4 3- inhoud tussen de verzamelde in gerecycleerde flesjes monsters en de monsters verzameld in een nieuw glasflacons (Figuur 4).
Silicaat verzamelen en opslaan van procedures
Om de beste bemonsteringsvat voor de analyse van silicaat te bepalen werd hoogwaardige dubbel gedestilleerd water opgevangen in ongereinigd en zuur gereinigde polypropyleen buizen (PP buizen) in zuur gereinigd hogedichtheidspolyethyleen flesjes (HDPE flesjes), en EPA in glazen flesjes. De verwachte silicaat concentratie was dicht bij nul, zodat waarden die afweek van de verwachte concentratie werden beschouwd als besmet. Het silicaat concentratie significant tussen de gegevens die in de verschillende flesjes (ANOVA, F (3,19) = 210,047, p <0,001) monsters, die de laagste SiO 4-concentratie in het zuur gereinigd HDPE flesjes. Borosilicate glazen flesjes vervuilde de monsters, met de laatste SiO 4 concentratie stijgt met maximaal 7 umolL -1 (Figuur 5).
Selectie van filtratie-apparatuur voor het opgeloste organische stof (DOM) en nutriëntenanalyses
Om te bepalen welke filterapparaat produceert laagste leeg in de analyse van opgeloste organische (DOC en DON) en anorganische nutriënten (NO x -, NH4 +, PO 4 3-), roestvrij staal filterhouders vergeleken met polycarbonaat inline Swinney filterhouders. Bij elk type filterhouder getest we allebei van polycarbonaat membraan en pre-verbrand glasvezel filter. De combinatie van roestvrij staal filterhouder en verbrand glasvezel filter, mits de laagste blanks, terwijl de polycarbonaat Swinney filterhouder uitgerust met polycarbonaat membraan duidelijk de monsters besmet door tot 9 maal. Het verhogen van het wassen volumes deed dit probleem (figuur 6) opgelost.
Figuur 3. Ammonium concentratie (umol L -1, gemiddelde ± SD) verzameld met verschillende flesjes: (1) gereinigde HDPE flacon; (2) Schoongemaakte HDPE flacon; (3) Schoongemaakt HDPE flacon + Parafilm; (4) EPA glazen flacon; (5) EPA glazen flacon + Parafilm; (6) Schoongemaakt PP buis. De Parafilm werd geplaatst om te testen of het silicium septum de watermonsters kunnen vervuilen. Voor elke behandeling 9 monsters van hoge kwaliteit dubbel gedestilleerd water werden geanalyseerd. De monsters werden vers geanalyseerd. Significante verschillen gevonden tussen de vier steekproeven schepen (ANOVA, F (5,53) = 7,183, p <0,001, power test = 0,992). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. ammonium (NH4 +), nitriet + nitraat (NOx -) en fosfaat (PO 4 3-) concentraties (umol L -1, gemiddeld ± SD) van zeewater monsters verzameld in de nieuwe (donker) en gerecycleerd / schoongemaakt (wit) EPA glazen flesjes. Zeewater werd verzameld op de Experimental Aquaria Zone van het Institute of Marine Science en werd gefilterd met roestvrij staal filterhouder en glas filter. De monsters water werden verse geanalyseerd. Het sterretje (*) geeft aan dat het verschil significant (t-test, p <0,001, n = 5, power test = 1). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
.jpg "/>
Figuur 5. Silicaat concentratie (umol L -1, gemiddeld ± SD) in hoge kwaliteit dubbel gedestilleerd water opgevangen in verschillende flesjes: acid-gereinigde PP buizen, PP buizen, zuur-gereinigde HDPE flesjes, nieuwe EPA glazen flesjes. Significante verschillen gevonden tussen de vier sampler materialen (ANOVA, F (3,19) = 210,047, p <0,001, power test = 1). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6. Het onderzoeken van het effect van verschillende samenstellingen filtratie en wassen volumes op nitriet + nitraat (NO x - umol L -1). Monsters voor NOx - werden verkregen door het filteren van het zeewater monsters met roestvrij staal (SS fIlter houder) of polycarbonaat in-line Swinney filterhouders (PC filterhouder) uitgerust met een polycarbonaat membraan (PC filter) of een pre-verbrand glasvezel filters. Voor de PC filters werden verschillende volumes (10, 30, 60, 90 en 120 ml) van 5% HCl en hoge kwaliteit dubbel gedestilleerd water gebruikt voor het wassen van de filtersamenstelling, wordt het wasgoed volume tussen haakjes in de legenda van de figuur. De waarden worden uitgedrukt als gemiddelde ± standaardafwijking (n = 5). Zeewater werd verzameld op de Experimental Aquaria Zone van het Institute of Marine Science en de monsters werden fris na de filtratie geanalyseerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7. Voorbeeld van experimentele resultaten: ingeademd (IN, zwartcirkel) en uitgeademd (EX, rode driehoek) gepaarde watermonster concentraties (umol L -1) van verschillende stoffen verwerkt door de spons Chondrosia reniformis in de Middellandse Zee: (A) ammonium (NH4 +); (B) nitriet + nitraat (NOx -); (C) fosfaat (PO 4 3-); (D) silicaat (SiO 4); (E) opgeloste organische koolstof (DOC); (F) opgeloste organische stikstof (DON); (G) planktonische organische koolstof (LPOC); (H) planktonische organische stikstof (LPON). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 8. Een voorbeeld van een stroomdiagram cytometry analyse van gepaarde getrokken uit het water ingeademd watermonsters (A, C, E, G) en uitgeademd (B, D, F, H) door de spons Chondrosia reniformis: (A, B, C, D) fytoplankton bevolkingen; (E, F, G, H) heterotrofe bacteriën. In AB en EF was schoon en accuraat de sampling (alle plankton groepen werden efficiënt behouden). CD en GH zijn voorbeelden van uitgeademde waterverontreiniging, toont lage verwijdering van alle plankton groepen. Syn:. Synechococcus sp, pico: autotrofe picoeukariotes, nano: autotrofe nanoeukaryotes, hoog: heterotrofe bacteriën met een hoog DNA-gehalte, laag. Heterotrofe bacteriën met een laag DNA gehalte Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
aanvullende Figure 1. Cell retentie efficiëntie van verschillende planktonische prooi door de clam Chama Pacifica: Prochlorococcus sp. (Pro), Synechococcus sp. (Syn), pico-eukaryoten (Pico Euk), nano-eukaryoten (Nano Euk). Error bars = 95% CI. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende Video 1. Sampling de ascidian Polycarpa mytiligera met behulp van een custom-built manipulator met de kleur code die wordt gebruikt groen voor inhalatie en geel voor uitgeademde watermonsters. Sampling buizen (PEEK, ID 54 pm, 75 cm lang) worden zorgvuldig geplaatst in de exhalant en inhalatie sifons van de ascidian. Het water wordt dan getrokken in vacuümbuizen met een snelheid van ~ 1 ml min -1. In deze demonstratie fluoresceïne kleurstof wordt gebruikt om de exhalant jet visualiseren. Merk op dat de exhalant bemonstering buis wordt geplaatst goed widun de exhalant jet. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
voorbereidende stappen
Collector flesjes voor DOM en nutriëntenanalyses
Sinds collector schepen kunnen interageren met opgeloste micro-bestanddelen en de sampler muren kan een substraat voor de groei van bacteriën 30-34, verschillende flesjes voor DOM en voedingsstoffen collectie werden getest zijn. Borosilicate wordt niet aanbevolen voor silica kwantificering 33,35, omdat glazen flessen de aanvankelijke concentratie van silica kan verhogen met maximaal twee maal als de monsters worden niet snel bevroren 30. Onze resultaten tonen aan dat het gebruik van pre-gereinigd EPA flesjes resulteert in lage concentratie blanks voor DOC, DON, en anorganische voedingsstoffen, met name voor ammonium.
DOC filtratie en opslag
Filtratie is een noodzakelijke en, in veel gevallen, is de eerste stap in mariene analytische chemie enmicrobiologie. Hoewel het mogelijk is om de monsters te filteren na afname in het laboratorium, is deze procedure niet aangeraden voor werk in situ, waarbij monsters verwijderd van goede laboratoriumfaciliteiten water verzameld, vaak op afgelegen locaties, uren of dagen. Het gebruik van in-line, in situ filtratie minimaliseert monsterbehandeling en vermindert het risico van contaminatie. In situ filtratie verwijdert ook de meeste bacteriën en vermindert het risico dat het vloeistofmonster zal veranderen door bacteriële metabolisme tijdens de langdurige bemonstering en vervoer tijd. De filtratie-assemblage verhoogt het dode volume van de bemonstering apparaten en kan ook een bron van besmetting zijn. Een selectie van de kleinst mogelijke filterhouders (bijvoorbeeld in-line Swinney filterhouder 13 mm) en de minuten PEEK buis (bv 254 um ID) vermindert het dode volume en het risico van besmetting door ambient water.
Als het juiste filter nietgebruikt of als het niet zorgvuldig wordt gewassen, artefacten en verontreiniging van de watermonsters zijn te verwachten 32,36-39. Studies van DOC-analyse toonde aan dat filters en filterhouders gemaakt van organische verbindingen (polycarbonaat en PFA-PTFE) kan leiden tot ernstige verontreiniging DOC 32,37, vooral als het niet grondig gespoeld met een hoge kwaliteit dubbel gedestilleerd water 38. Het huidige protocol en de resultaten de volgende richtlijnen en geven ook aan dat polycarbonaat filterhouders moeten worden vermeden.
In situ werk en interoperabiliteit
Het VacuSIP systeem is een direct monsternemingstechniek dat de studie van het metabolisme van ongestoorde suspensie feeders in hun natuurlijke omgeving en de kwantificering van de ecologische rol in het systeem vergemakkelijkt. Voor ervaren en uitgerust duikers, de toepassing van de VacuSIP methode is eenvoudig en vereist slechts korte training. Inex VacuSIP experimenten zijn ontworpen voor een 'within'-design statistische analyse (dat wil zeggen, gepaarde of herhaalde maatregel analyse), dus het regelen voor de meeste analytische artefacten met inbegrip van hoge spaties. Het gebruik van gecontroleerde afzuiging zorgt voor langzame en instelbare sampling rates, waardoor accidentele verontreiniging van water te voorkomen uitgeademde met ambient water. Waar mogelijk wordt de selectie van het werk sites met lage stroom en lage troebelheid aanbevolen en zal zorgen voor schonere en nauwkeurigere resultaten. De verlengde sampling tijd (minuten tot uren) maakt de integratie van de hoge patchiness dat de bodemdieren grenslaag kenmerkt. Al deze eigenschappen zorgen ervoor dat op de juiste wijze toegepast VacuSIP methode is zeer robuust, het verstrekken van betrouwbare en reproduceerbare resultaten, zelfs bij het werken met een klein aantal herhalingen. Een voorbeeld van typische resultaten van een mediterrane spons en Indopacifische clam species is weergegeven in figuur 7 en vullendetaire Figuur 1.
Zoals met elke techniek, de VacuSIP is niet vrij van mogelijke valkuilen. Het meest voorkomende probleem is besmetting van de uitgeademde watermonster met ambient water. Redenen voor deze artefacten omvatten hoge zuigkracht tarief, buis losraken, en het gedrag van dieren. Juiste keuze van de juiste sampling rate is afhankelijk van eerdere ramingen van het excurrent debiet. Dergelijke schattingen kunnen worden verkregen met de werkwijze snelheid kleurstoffront 16. Idealiter zou de aanzuigsnelheid dan 1% van de pompsnelheid (bijvoorbeeld 1 ml min-1 voor een 6 L -1 uur pompsnelheid) gehouden. Om besmetting met ambient water te voorkomen, moet sampling rate nooit meer dan 10% van de pompsnelheid.
Bepalen van de bemonsteringssnelheid, moet de lengte en de inwendige diameter van de inlaat buis worden aangepast aan de geplande werkdiepte en watertemperatuur. De Hagen-Poiseuille vergelijking (zie hoofdstuk 1.3.1) kunnen worden gebruikt als richtlijn. Toch moet deze vergelijking als een eerste orde benadering sinds AP en sampling rate afname met sampling tijd worden beschouwd en in-line filtratie voegt onzekerheden. Het gebruik van vacuüm verpakkingen, soms met onbekende vacuümdrukken introduceert verdere complicaties. Een voorbeeld van hoe bemonsteringsfrequentie varieert als functie van verschillende geëvacueerd containers met verschillende vacuüm, wordt weergegeven in tabel 1.
Het verminderen van de sampling rate is gemakkelijk te bereiken door aanpassing van de lengte van de buis en ID, zonder technische beperkingen aan deze reductie (sampling rates van de weinige microliter per uur haalbaar zijn). Niettemin moeten onderzoekers zich bewust zijn van de langzame sampling rate gedicteerd door deze beperking voor dieren met een trage pompsnelheid en voor kleine organismen of monsters. De directe gevolgen van de langzame sampling rate is de beperkte hoeveelheid water die kan worden verzameld tijdens een enkele steekproef sessiop. Deze lage volume het aantal analyses en herhalingen die kunnen worden uitgevoerd met deze monsters te beperken, en dus ook de informatie die kan worden verkregen uit deze populaties beperken.
Tube dislodgement kan gemakkelijk worden gezien en de bemonstering kan worden afgebroken of hernieuwd, op voorwaarde dat een duiker constant in de gaten houdt. Daarentegen stopzetting van pompen tijdens de bemonstering is niet altijd gemakkelijk te ontdekken. Dit geldt niet alleen voor sponzen, maar ook voor manteldieren, tweekleppigen en polychaeten. In feite, in tegenstelling tot wat iedereen denkt, gebeurtenissen waarbij een ascidian of een tweekleppige gestopt pompen werden gedocumenteerd zonder zichtbare verandering in de sifon geometrie (Yahel, ongepubliceerde gegevens). Bovendien is in sommige gevallen kan manteldieren actieve pompen zonder mesh afscheiding (die geen filtratie plaatsvindt) behouden.
Regelen van de bemonsteringsfrequentie kritisch. In dit verband VacuSIP beter dan andere methoden, vooral wanneer de proefdieren zijn relatively klein of wanneer ze langzaam te pompen. Spuiten zijn bijzonder moeilijk te controleren 2. Bijvoorbeeld, Perea-Blazquez en collega's (2012a) 40 gebruikt een spuit om het water uitgeademde door een aantal gematigde sponssoorten proeven en verrassend had een algemeen patroon van inname / uitscheiding van bepaalde voedingsstoffen niet vinden (NO 2 -, NO 3 -, NH 4 +, PO 4 3- SiO 4). Het ontbreken van een duidelijk patroon is waarschijnlijk een gevolg van vervuiling van de uitgeademde monsters met het omringende water als gevolg van de spuit te gebruiken. Verontreiniging blijkt uit de zeer lage retentie efficiëntie van pico plankton door Perea-Blázquez en medewerkers (2012b) 41 gerapporteerd voor hun sponsen: 40 ± 14% van heterotrofe bacteriën en 54 ± 18% van Synechococcus sp. Ter vergelijking, met de VacuSIP, Mueller et al. (2014) 21 rapporteerde een verwijdering efficiëntie van heterotrofe bacteriën72 ± 15% in Siphonodictyon sp. en 87 ± 10% in cliona delitrix.
Om sample kwaliteit te controleren en ervoor te zorgen dat er geen verontreiniging van de omgevingslucht water optreedt, raden wij aan eerst analyseren van de pico en nano plankton monsters met behulp van flowcytometrie. Deze snelle, betrouwbare en goedkope analyse zal onmiddellijke informatie van het monster kwaliteit. Het is heel gebruikelijk voor sommige prooi taxa zoals Synechococcus sp. te worden verwijderd bij bijna 90% rendement 14,42 door sponzen en ascidian. Aanzienlijke afwijkingen van deze benchmark blijkt dat besmetting zou kunnen hebben voorgedaan (figuur 8).
Voor een betrouwbare en schone sampling, zorg ervoor dat het experiment ontwerp voldoet aan zeven eenvoudige regels: (1) het uitvoeren van een vooronderzoek (inclusief pompsnelheid schattingen) en de voorbereiding van de werkplek goed; (2) kennen de bestudeerde dieren; (3) nagaan of de onderzochte monster heeft een goed gedefinieerde excurrent opening eennd bereikbare locatie; (4) nagaan of de onderzochte monster voor en na elk monster collectie pompt; (5) plaatsen de buis voor het verzamelen van de uitgeademde water lichtjes in de excurrent opening (figuur 1); (6) te gebruiken sampling rate <10% van de excurrent debiet, wordt 1% sterk aanbevolen; (7) een kwaliteitscriterium en weglaten verdacht Inex paren.
Na deze eenvoudige regels, het VacuSIP systeem biedt een praktische en betrouwbare werkwijze voor het meten hoe actief suspensie feeders proces deeltjesvormige en opgeloste stoffen in natuurlijke omstandigheden, zodat nauwkeurige en vergelijkbare schattingen die kan worden gebruikt om de functionele rol van filter feeders in verschillende ecosystemen over beoordelen de wereld.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Wij danken Manel Bolivar voor zijn hulp bij het veldwerk. We zijn dankbaar voor de "Parc Natural del Montgrí, les Illes Medes i el Baix Ter" voor hun steun aan ons onderzoek en bemonstering permissies. De onderwaterwereld manipulator is ontworpen door Ayelet Dadon-Pilosof en gefabriceerd door Mr. Pilosof. Dit werk werd ondersteund door de Spaanse regering project CSI-Coral [subsidie aantal CGL2013-43106-R RC en MR] en door een FPU beurs van "Ministerio de Educación, Cultura y Deporte (MECD)" naar TM. Dit is een bijdrage van de Marine biogeochemie en Global Change onderzoeksgroep gefinancierd door de Catalaanse regering [subsidie nummer 2014SGR1029] en ISF subsidie 1280-1213 en BSF subsidie 2.012.089 G. Yahel.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GorillaPod, Original | Joby | GP000001 | flexible portable tripod |
| Flangeless Ferrule | IDEX Health & Science | P-200X | 1/16" in Blue/pk |
| Male Nut | IDEX Health & Science | P-205X | 1/16" in Green/10 pk |
| Female to Female Luer | IDEX Health & Science | P-658 | |
| Female-Male Luer | IDEX Health & Science | P-655 | |
| Peek Tubing (254 µm ID) | IDEX Health & Science | 1531 | 1/16" OD x 0.01 in ID x 5 ft length. Alternative ID can be used. |
| Two component resin epoxy | IVEGOR | 9257 | Mix well the two component resin before use |
| (TOC) EPA Vials | Cole -Parmer | 03756-20 | 40 ml glass vials. Manufactured also by Thomas Scientific (ref. number 9711F09). |
| HDPE Vials | Wheaton | 986701 (E78620) | 20 ml high-density polyethylene vials |
| Vacuette Z no additive | Greiner bio-one | 455001 | pre-vacuum by the manufacturer |
| Septum Sample Bottles | Thomas Scientific | 1755C01 | 250 ml glass bottles |
| Septum Cap 1 | Wheaton | W240844SP (E7865R) | 22-400 for HDPE vials |
| Septum Cap 2 | Wheaton | W240846 (1078-5553) | 24-400 for glass vials and bottles. Also manufactured by Thermo Scientific National (ref. 03-377-42). |
| In-line stainless steel Swinney Filter holders | Pall | 516-9067 | 13 mm of diameter |
| PTFE Seal Washer | Pall | 516-8064 | ring for stainless steel filter holders |
| TCLP Glass Filters | Pall | 516-9126 | binder-free glass fiber filters, 13 mm of diameter, pore size 0.7 µm |
| Polycarbonate Filter Holders | Cole -Parmer | 17295 | 13 mm of diameter |
| Isopore Membrane Filters | Millipore | GTTP01300 | 13 mm of diameter, pore size 0.2 µm |
| Contrad 70 Solution | Decon Labs | 1002 | highly soluble basic mix of anionic and non-ionic surfactant solution |
| Sterile Syringe Filters | VWR International Eurolab S.L. | 514-0061P | 25 mm of diameter , pore size 0.2 µm |
| Fluorescein | Sigma-Aldrich | (old ref.28802) 46955-100G | 100 g |
| Holdex, disposable,sterile | Greiner bio-one | 450263 | sterile, single-use tube holder with off-center luer for Vacuette |
| Sterile Needles | IcoGammaPlus | 5160 | 0.7 mm x 30 mm |
| Cryovials Nalgene | Nalgene | V5007(Cat. No.5000-0020) | 2 ml |
| Cryobox carton | Rubilabor | M-600 | 145x145x55 mm p/microtube 1.5 ml |
| Orthophosphoric Acid | Sigma | 79617 or Alternatively use Ultra-Pure Hydrochloric acid, final concertation 0.1% | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | 500 g |
| Glutaraldehyde | Merck | 8,206,031,000 | 25%, 1 L |
| Hand Vacuum Pump | Bürkle | 5620-2181 or Alternatively use standard laboratory vacuum pump |
References
- Gili, J. M., Coma, R. Benthic suspension feeders: their paramount role in littoral marine food webs. Trends. Ecol. Evol. 13 (8), 316-321 (1998).
- Reiswig, H. In situ pumping activities of tropical Demospongiae. Mar. Bio. 9, 38-50 (1971).
- McMurray, S., Pawlik, J., Finelli, C. Trait-mediated ecosystem impacts: how morphology and size affect pumping rates of the Caribbean giant barrel sponge. Aquat. Bio. 23 (1), 1-13 (2014).
- Pile, A. J., Young, C. M. The natural diet of a hexactinellid sponge: benthic-pelagic coupling in a deep-sea microbial food web. Deep-Sea Res. Pt. I. 53 (7), 1148-1156 (2006).
- Nielsen, T., Maar, M. Effects of a blue mussel Mytilus edulis bed on vertical distribution and composition of the pelagic food web. Mar. Ecol. Prog. Ser. 339, 185-198 (2007).
- De Goeij, J. M., et al. Surviving in a marine desert: the sponge loop retains resources within coral reefs. Science. 342, 108-110 (2013).
- Maldonado, M., Ribes, M., van Duyl, F. C. Nutrient Fluxes Through Sponges. Biology, Budgets, and Ecological Implications. Advances in Marine Biology. 62, (2012).
- Riisgård, H. U. On measurement of filtration rates in bivalves - the stony road to reliable data: review and interpretation. Mar. Ecol. Prog. Ser. 211, 275-291 (2001).
- Reiswig, H. M. Water transport, respiration and energetics of three tropical marine sponges. J. Exp. Mar. Biol. Ecol. 14, 231-249 (1974).
- Jiménez, E., Ribes, M. Sponges as a source of dissolved inorganic nitrogen: nitrification mediated by temperate sponges. Limnol. Oceanogr. 52 (3), 948-958 (2007).
- Diaz, M. C., Ward, B. Sponge-mediated nitrification in tropical benthic communities. Mar. Ecol. Prog. Ser. 156, 97-107 (1997).
- Ribes, M., Coma, R., Gili, J. Natural diet and grazing rate of the temperate sponge Dysidea avara (Demospongiae, Dendroceratida) throughout an annual cycle. Mar. Ecol. Prog. Ser. 176, 179-190 (1999).
- Jiménez, E. Nutrient fluxes in marine sponges: methodology, geographical variability and the role of associated microorganisms. , Universitat Politècnica de Catalunya. Barcelona. PhD thesis (2011).
- Reiswig, H. M. Particle feeding in natural populations of three marine demosponges. Biol. Bull. 141 (3), 568-591 (1971).
- Reiswig, H. M. In situ pumping activities of tropical Demospongiae. Mar. Biol. 9 (1), 38-50 (1971).
- Yahel, G., Marie, D., Genin, A. InEx - a direct in situ method to measure filtration rates, nutrition, and metabolism of active suspension feeders. Limnol. Oceanogr-meth. 3, 46-58 (2005).
- Genin, A., Monismith, S. S. G., Reidenbach, M. A., Yahel, G., Koseff, J. R. Intense benthic grazing of phytoplankton in a coral reef. Limnol. Oceanogr. 54 (2), 938-951 (2009).
- Yahel, G., Whitney, F., Reiswig, H. M., Leys, S. P. In situ feeding and metabolism of glass sponges (Hexactinellida , Porifera) studied in a deep temperate fjord with a remotely operated submersible. Limnol. Oceanogr. 52 (1), 428-440 (2007).
- Wright, S. H., Stephens, G. C. Removal of amino acid during a single passage of water across the gill of marine mussels. J. Exp. Zool. 205, 337-352 (1978).
- Møhlenberg, F., Riisgård, H. U. Efficiency of particle retention in 13 species of suspension feeding bivalves. Ophelia. 17 (2), 239-246 (1978).
- Mueller, B., et al. Natural diet of coral-excavating sponges consists mainly of dissolved organic carbon (DOC). PLoS ONE. 9 (2), e90152 (2014).
- Gasol, J. M., Moran, X. A. G. Effects of filtration on bacterial activity and picoplankton community structure as assessed by flow cytometry. Aquat. Microb. Ecol. 16 (3), 251-264 (1999).
- Koroleff, F. Determination of reactive silicate. New Baltic Manual, Cooperative Research Report Series A. 29, 87-90 (1972).
- Murphy, J., Riley, J. P. A. Modified single solution method for the determination of phosphate in in natural waters. Anal. Chim. Acta. 27, 31-36 (1962).
- Shin, M. B. Colorimetric method for determination of nitrite. Ind.Eng.Chem. 13 (1), 33-35 (1941).
- Wood, E. D., Armstrong, F. A. J., Richards, F. A. Determination of nitrate in sea water by cadmium-copper reduction to nitrite. J. Mar. Biol. Assoc. U. K. 47 (1), 23-31 (1967).
- Sharp, J. H., et al. A preliminary methods comparison for measurement of dissolved organic nitrogen in seawater. Mar. Chem. 78 (4), 171-184 (2002).
- Sharp, J. H. Marine dissolved organic carbon: Are the older values correct. Mar. Chem. 56 (3-4), 265-277 (1997).
- Holmes, R. M., Aminot, A., Kerouel, R., Hooker, B. A., Peterson, B. J. A simple and precise method for measuring ammonium in marine and freshwater ecosystems. Can. J. Fish. Aquat. Sci. 56 (10), 1801-1808 (1999).
- Degobbis, D. On the storage of seawater samples for ammonia determination. Limnol. Oceanogr. 18 (1), 146-150 (1973).
- Tupas, L. M., Popp, B. N., Karl, D. M. Dissolved organic carbon in oligotrophic waters: experiments on sample preservation, storage and analysis. Mar. Chem. 45, 207-216 (1994).
- Yoro, S. C., Panagiotopoulos, C., Sempéré, R. Dissolved organic carbon contamination induced by filters and storage bottles. Water Res. 33 (8), 1956-1959 (1999).
- Zhang, J. Z., Fischer, C. J., Ortner, P. B. Laboratory glassware as a contaminant in silicate analysis of natural water samples. Water Res. 33 (12), 2879-2883 (1999).
- Yoshimura, T. Appropriate bottles for storing seawater samples for dissolved organic phosphorus (DOP) analysis: a step toward the development of DOP reference materials. Limnol. Oceanogr-meth. 11 (4), 239-246 (2013).
- Strickland, J. D. H., Parsons, T. R. A practical handbook of seawater analysis. , Fisheries Research Board of Canada. Ottawa. (1968).
- Eaton, A. D., Grant, V. Freshwater sorption of ammonium by glass frits and filters: implications for analyses of brackish and freshwater. Limnol. Oceanogr. 24 (2), 397-399 (1979).
- Norrman, B. Filtration of water samples for DOC studies. Mar. Chem. 41 (1-3), 239-242 (1993).
- Carlson, C. A., Ducklow, H. W. Growth of bacterioplankton and consumption of dissolved organic carbon in the Sargasso Sea. Aquat. Microb. Ecol. 10 (1), 69-85 (1996).
- Grasshoff, K., Ehrhardt, M., Kremling, K. Methods of Seawater Analysis. Second, Revised and Extended Edition. , (1999).
- Perea-Blázquez, A., Davy, S. K., Bell, J. J. Nutrient utilisation by shallow water temperate sponges in New Zealand. Hydrobiologia. 687 (1), 237-250 (2012).
- Perea-Blázquez, A., Davy, S. K., Bell, J. J. Estimates of particulate organic carbon flowing from the pelagic environment to the benthos through sponge assemblages. PLoS ONE. 7 (1), e29569 (2012).
- Pile, A. J., Patterson, M. R., Witman, J. D. In situ grazing on plankton <10 µm by the boreal sponge Mycale lingua. Mar. Ecol. Prog. Ser. 141, 95-102 (1996).
