Introduction
Донные сестонофагов играют существенную роль в функционировании морских экосистем 1. Путем фильтрации больших объемов воды 2,3, они удаляют и выделяют в виде частиц (планктон и детрит) и растворенные соединения 1 (и ссылки в них) и являются важным агентом бентического-пелагическая связи 4,5 и круговорот питательных веществ 6,7. Точного измерения частиц и растворенных веществ удаляются и выводятся из организма бентосными сестонофагов (например, губок, асцидий, полихет и двустворчатых) имеет фундаментальное значение для понимания их физиологии, обмена веществ и экологии питания. Вместе с накачкой измерения скорости, он также позволяет количественно оценить питательных потоков, опосредованных этими организмами и их экологического влияния на качество воды, а также на экосистемы масштабных процессов.
Выбор подходящего метода измерения скорости удаления и производства частиц и растворенный комфунтов по фильтраторов подвески имеет решающее значение для получения достоверных данных относительно их кормления деятельности 8. Как отметил Riisgård и других, несоответствующих результатов методики смещения, искажают условия эксперимента, некорректными оценки приема и выделения определенных веществ, и может привести к ошибочному квантификации питательных потоков, обрабатываемых этими организмами.
Два наиболее часто используемые методы измерения частиц и растворенных потоков питательных веществ в фильтраторов включают либо инкубация (косвенные методы) или одновременный сбор окружающего воздуха и выдыхаемый воды (прямые методы). Методы инкубации основаны на измерении скорости изменения концентрации частиц и растворенных веществ в воде инкубированных и оценки темпов производства или удаления по сравнению с 8 надлежащих мер контроля. Тем не менее, приложив организм в инкубационной камере может изменить ее Feedinг и насосное поведение в связи с изменением режима естественного потока, из - за снижения кислорода и / или в концентрации пищи, или из - за накопления экскреции соединений в инкубационном воды 7,9 (и ссылки в них). В дополнение к эффектам удержания и модифицированном водоснабжения, главным уклон методов инкубации происходит от повторной фильтрации эффектов (см, например , 10). Хотя некоторые из этих методологических проблем были преодолены с помощью правильного объема и формы инкубационной емкости 11 или с введением системы вакуумном колоколе , рециркулирующей в месте 12, этот метод часто занижает скорость удаления и производства. Количественная метаболизм растворенных соединений , таких как растворенного органического азота (ДОН) и углерода (DOC) или неорганических питательных веществ, оказалась особенно склонны к пристрастий , вызванных методами инкубации 13.
В конце 60-х и в начале 70-х годов, Генри Reiswig9,14,15 пионером применения прямых методов количественной оценки удаления частиц гигантскими карибских губок, путем раздельного отбора проб воды , вдыхаемого и выдыхаемого организмов на месте. Из - за трудностей , чтобы применить технику Reiswig на меньших сестонофагов и в более сложных подводных условиях, большая часть исследований в этой области было ограничено лаборатории (in vitro) с использованием в основном косвенные методы 16 инкубации. Яэль и его коллеги переоборудованы Reiswig Прямые техники на месте , чтобы работать в менее масштабных условиях. Их метод, названный InEx 16, основан на одновременном подводного отбора проб воды вдыхаемого (В) и выдыхаемого (Ex) от ненарушенных организмов. Различная концентрация вещества (например, бактерии) между парой образцов (INEX) дает меру удержания (или производства) этого вещества животным. Методика InEx использует открытые трубы иопирается на выводной струи одной насосной активности исследуемого организма пассивно заменить окружающую воду в сборном трубке. В то время как Яэль и его коллеги успешно применили эту технику при изучении более чем 15 различных сестонофагов таксонов (например, 17), метод сдерживается высоким уровнем практики и опыта , необходимых, по крохотной размер некоторых выводящий отверстий, и морские условия.
Чтобы преодолеть эти препятствия, мы разработали альтернативный метод, основанный на контролируемом отсоса отобранного воды через минуту трубок (наружным диаметром <1,6 мм). Наша цель состояла в том, чтобы создать простую, надежную и недорогое устройство , которое позволило бы чистой и контролируемой на месте отбора проб воды в с очень конкретной точки, такие как вытекающий отверстие донными сестонофагов. Чтобы быть эффективным, этот метод должен быть ненавязчивым, чтобы не повлиять на режим окружающего потока или изменить бehavior изученных организмов. Устройство, представленное здесь, называется VacuSIP. Это упрощение системы SIP , разработанного Yahel и др. (2007) 18 для точки отбора проб ROV основе в глубоком море. VacuSIP значительно дешевле, чем оригинальный SIP и он был адаптирован для SCUBA на основе работы. Система была разработана в соответствии с принципами , изложенными и испытываются Райтом и Stephens (1978) 19 и Møhlenberg и Riisgård (1978) 20 для лабораторных установок.
Хотя система VacuSIP была разработана для исследований натурных метаболизма донными сестонофагов в, он также может быть использован для лабораторных исследований и там , где требуется контролировать и чистый, отбираемой воды из точечных источников. Эта система особенно полезна , когда требуется интеграция в течение продолжительного периода (мин-часов) или в фильтраций на места. VacuSIP был успешно использован в лаборатории Yahel с 2011 года, а также имеетбыли использованы в двух недавних исследованиях питательных потоков , опосредованных карибских и средиземноморских видов губок 21 (Morganti и др. представили).
Использование конкретных пробников, продолжительность отбора проб длительной и полевых условиях, в которых применяется VacuSIP, влекут за собой некоторые отклонения от стандартных океанографических протоколов для сбора, фильтрации и хранения образцов для чувствительных аналитов. Для того, чтобы снизить риск заражения системы VacuSIP или риск модификации отобранного воды за счет бактериальной активности после сбора, мы тестировали различные в точке процедур фильтрации и хранения. Различные фильтрующие устройства, сбор судов, а также процедуры хранения были рассмотрены с целью достижения наиболее подходящей методики для анализа растворенного неорганического (PO 4 3-, NO х -, NH 4 +, SiO 4) и органических (DOC + DON) соединения и ультра-планктон (<1081; м) и твердых органических (ПСУ + выборки PON). Для дальнейшего снижения риска загрязнения, особенно в полевых условиях, число шагов обработки было сведено к минимуму. Визуальный формат, в котором представлен способ ориентирован, чтобы облегчить воспроизводимости и сократить время, необходимое для эффективного применения метода.
Системный Обзор
Для образца на месте закачивают воду из сестонофагов с exhalant отверстиями размером до 2 мм в насосную активность каждого образца вначале визуализируются, освободив фильтруется флуоресцеина окрашенные морской воды рядом с летучими отверстием (ами) и наблюдая за его потока из выводной апертуры 16 (см также рис 2B в 18). Вода вдохнул и выдыхаемым исследование образца (incurrent и вытекающий) затем одновременно оцифровываются с использованием пары минутных трубок, установленных на заказного манипулятором или на двух из "армс "перевернутого вниз гибкий переносной штатив (рисунок 1 и дополнительного видео 1). Вода вдыхается исследуемого организма собирают путем тщательного позиционирования проксимальный конец одной трубы внутри или вблизи летучими апертуры исследуемого организма. Идентичный затем труба расположена внутри выводной отверстия. Эта операция требует хорошего ухода , чтобы избежать контакта или помех животного, например, осадком взмучивания. чтобы начать отбор проб, водолаз прокалывает перегородку в накопительную емкость с иглой шприца , прикрепленной к дистальный конец каждой трубки, что позволяет внешнему давлению воды, чтобы заставить отобранной воды в емкость через пробоотборную трубку. всасывающий инициируется с помощью вакуума предварительно созданного в ампулах и по разности давлений между внешней водой и эвакуированной контейнер для образца ,
Для того, чтобы обеспечить чистую коллекцию выдыхаемого воды и во избежание случайного всасывания AMBIлор воды 16, частота дискретизации вода должна храниться при значительно более низкой скорости (<10%) , чем скорость потока выводной. Скорость всасывания регулируется по длине трубы и ее внутренним диаметром (ID). Небольшой внутренний диаметр также обеспечивает незначительный мертвый объем (<200 мкл на метр трубы). Отбор проб в течение длительных периодов (от минут до часов) позволяет интегрировать присущую мозаичности большинства веществ, представляющих интерес. Для того, чтобы гарантировать , что образцы должным образом сохраняется при длительных подводных сеансов отбора проб, а также для транспортировки в лабораторию, фильтрации на месте в рекомендуется для чувствительных аналитов. Выбор сосудов для отбора проб, сборка фильтрации и трубы продиктованы исследования организмов и конкретного вопроса исследования. Протокол , описанный ниже , предполагает , что полный метаболическим профилем представляет интерес (для получения дополнительной информации смотрите Рисунок 2). Тем не менее, модульный характер протокола позволяет пили простой модификации, чтобы приспособить более простые или даже очень разные схемы отбора проб. Для полного метаболического профиля, протокол выборки должен включать в себя следующие шаги: (1) Визуализация потока; (2) подачи проб ультра-планктона (планктон <10 мкм); (3) Отбор проб неорганический поглощение питательных веществ и выведению (с использованием проходных фильтров); (4) Отбор проб растворенного органического поглощения и выведения (с использованием проходных фильтров); (5) Твердые частицы кормления и экскреции (с использованием проходных фильтров); (6) Повторите шаг 2 (ультра-планктона кормление как проверка качества); (7) потока визуализации.
Когда это возможно материально - технического обеспечения, то рекомендуется , что метаболические измерения профилей в сочетании с накачкой скорость (например, метод спереди красителя скорость, в 16), а также с результатами измерений дыхания. Эти измерения лучше всего принимать в начале и в конце сеанса выборки. Для измерения дыхания, подводные optodes или микро-электроды являются предпочтительными.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовительные шаги и очистительные процедуры
- очищающий раствор
- Носите защитную одежду, пальто лаборатории и перчатки во все времена. Выполните эти подготовительные шаги в чистом пространстве, свободной от пыли и дыма.
- Приготовьте раствор 5-10% соляной кислоты (HCl) со свежей, высокое качество, дважды дистиллированной воды.
- Готовят 5% -ный легкорастворимой основную смесь анионного и неионогенного поверхностно-активного раствора (см список материалов) со свежим, высокое качество, дважды дистиллированной воды.
- Храните все решения в чистой, промытых кислотой контейнеры.
- Подготовительные шаги и процедуры очистки (в лаборатории)
Примечание: Если соединения фосфора , не представляют интереса, промывочная HCl можно заменить высокого качества фосфорной кислоты (H 3 PO 4) мойка (8% H 3 PO 4 конечная концентрация).- Носите защитную одежду, пальто лаборатории и перчатки во все времена.
- мытьустройство для отбора образцов (за исключением нержавеющей стали Суинни держатель фильтра в линию) с достаточным количеством воды высокой степени чистоты. Оставьте аппарат замачивания в 5-10% растворе соляной кислоты в течение ночи. Промыть аппарат снова с достаточным количеством высококачественного дважды дистиллированной воды.
- Вымойте нержавеющей стали держатели Суинни фильтра в линию с достаточным количеством воды высокой степени чистоты. Оставьте фильтродержателями замачивания в 5% легкорастворимой основную смесь анионных и неионогенных поверхностно-активных веществ раствора в течение ночи. Ополосните их снова с достаточным количеством высококачественной дистиллированной воды.
- Сушат все устройство для отбора образцов, завернуть их в алюминиевую фольгу и держать в чистом поле до использования.
- Управление скоростью всасывания
- Контроль частоты дискретизации путем регулировки длины и внутреннего диаметра впускного трубопровода в соответствии с намеченным глубины работы и температуры воды. Используйте следующее уравнение (полученный из течение пуазёйля используется для полностью развиOped потока трубы ламинарного) в качестве руководства:
где F = скорость потока (см 3 мин -1), P = дифференциальное давление (бар), г = впускной трубки внутренний радиус (см), K = 2,417 · 10 -9 (-2 сек), L = длина трубки (см ), V = вязкость воды (г см -1 с -1). Таблицу 1 для более подробной информации. - Держите частоту дискретизации ниже 1% от скорости откачки исследуемого животного.
Примечание: Использование эвакуированные контейнеров, иногда с неизвестным вакуумом создает дополнительные осложнения. Поэтому полевое испытание настоятельно рекомендуется. В 10 м глубиной и ~ 22 ° C морской воды (40 PSU), 50 см на входе трубки с внутренним диаметром 254 мкм обеспечивает среднюю скорость всасывания ~ 26 мкл с -1 (1,56 мл мин -1).
- Контроль частоты дискретизации путем регулировки длины и внутреннего диаметра впускного трубопровода в соответствии с намеченным глубины работы и температуры воды. Используйте следующее уравнение (полученный из течение пуазёйля используется для полностью развиOped потока трубы ламинарного) в качестве руководства:
- Отбор проб судов
- Для образцов небольшого объема (3-20 мл, например, ультра-планктона для цитохрома потокавыбранной геометрии) используют предварительно пылесосить стерильные пластиковые пробирки.
Примечание: Предварительно пылесосить стерильные пластиковые трубки обычно используются для стандартных анализов крови в организме человека; убедитесь, что использовать стерильные пробирки без каких-либо добавок. Эти пылесосить стерильные пластиковые пробирки лучше пробы с использованием стерильной, держатель трубки одноразового использования с смещенной от центра Luer. Хотя это является самым безопасным и наиболее эффективным устройство для отбора образцов, он имеет немного больший мертвый объем по сравнению с простой иглой. - Для больших проб воды, таких как питательные вещества и растворенных органических веществ, использовать 40 или 60 мл стеклянные флаконы, которые отвечают критериям Агентства по охране окружающей среды (EPA) для летучих органических анализов. Эти флаконы включают полипропиленовый колпачок с тефлоновым лицом силиконовой мембраной.
- Для еще больших объемах, использовать пенициллин бутылки с резиновыми пробками или термосы.
- Использование полиэтиленовых флаконов высокой плотности (ПЭВП ампула) для образцов кремнезема.
- Для увеличения объема пробы и для снижения риска стопора выбиванииво время подъема, эвакуации (вакуум) пункты 1.4.2-1.4.4 перед погружением с вакуумным насосом. Вакуумная вручную с помощью ручной вакуумный насос или даже путем всасывания воздуха с помощью шприца. Тем не менее, для достижения наилучших результатов, рекомендуется хороший вакуумный насос. Стандартные лиофилизаторы обеспечивает высокий вакуум.
Примечание: Обратите особое внимание при использовании больших пылесосить колб для того, чтобы быстрее начальная скорость всасывания не будет загрязнять выдыхаемом пробы воды.
- Для образцов небольшого объема (3-20 мл, например, ультра-планктона для цитохрома потокавыбранной геометрии) используют предварительно пылесосить стерильные пластиковые пробирки.
- Процедуры очистки судов
- Для растворенных органических веществ и NH 4 + анализа используют новые предварительно очищенную флаконы EPA.
- Промыть флаконы (стеклянные и HDPE) для анализа других питательных веществ следующим образом:
- Промыть флаконы (стеклянные и HDPE) и полипропилена крышки с высоким качеством дважды дистиллированной водой. Установить новую силиконовую перегородку.
- Выдержите флаконы (стеклянные и HDPE) в 10% HCl в течение не менее 3-х дней и промыть с достаточным количеством высококачественной дистиллированной воды.
- Воспламеняться стеклянные флаконы при 450 ° С в течение 4 часов и дают остыть в печи. Установите крышку, и оберните алюминиевой фольгой до использования.
- фильтры
- Используйте фильтры без связующего из стекловолокна для фильтрации всех растворенных органических образцов (например, DOC, ДОН) и для сбора органических частиц (например, ЛОК, PON). Упаковать каждый стеклянный фильтр в отдельный конверт из алюминиевой фольги. Воспламеняться при температуре 400 ° С в течение 2 ч, чтобы улетучиться органические остатки и хранить в сухом и чистом сосуде до использования.
- Не использовать или без связующего фильтры из стекловолокна как указано выше, или 0,2 мкм поликарбонатные мембраны для отбора проб неорганических питательных веществ (например, PO 4 3-, NO х -, NH 4 +). Почистите последний раз установлен в держателе фильтра, как описано ниже (1.7.3).
- Используйте 0,2 мкм поликарбонатные мембраны фильтров для отбора проб двуокиси кремния. Очищайте их раз installed в держателе фильтра, как описано ниже (1.7.3).
- Подготовка узла фильтрации
- Фильтруют легкорастворимой основную смесь анионных и раствора неионогенного поверхностно-активного вещества и высокое качество дистиллированной воды через фильтр с размером пор 0,2 мкм, прежде чем использовать их для очистки узла фильтрации.
- Узел фильтрации для питательных веществ и растворенных кроме кремнезема органики:
- Поместите сжигаются без связующего фильтры из стекловолокна внутри очищенную в линии из нержавеющей стали Суинни держатель фильтра.
- Используйте промыты кислотой шприц пробежать 100 мл 5% быстрорастворимых основной смеси анионных и раствора неионогенного поверхностно-активного вещества, а затем 100 мл высокого качества бидистиллированной воды через всю сборку.
- Узел фильтрации для SiO 4:
- Поместите фильтр из поликарбоната внутри очищенную держателя поликарбоната фильтра (PC держатель фильтра).
- Используйте промыты кислотой шприц гООН 30 мл 5% -ной HCl и 30 мл высокого качества бидистиллированной воды через всю сборку.
- система сборки
- Собрать систему для подводных работ с использованием PEEK (полиэфирэфиркетона) трубки с наружным диаметром (OD) 1,6 мм и внутренний диаметр (ID) 254 мкм или 177 мкм.
- Используйте острый нож или PEEK резак, чтобы разрезать трубы до необходимой длины.
- На своем дистальном конце (образец контейнер сторона), соответствовать каждой трубки с штыревым разъемом Люэра, присоединенного к игле шприца. Убедитесь, что вы будете следовать инструкциям производителя и выровнять плоскую сторону синего безбортовым наконечника с концом трубы перед затягиванием зеленую гайку.
- Прикрепите PEEK трубку к штативу "руками" или заказного манипулятором с помощью изоленты.
- Приложить одноразовый шприц иглой к штыревым разъемом Luer. Держите иглу с защитным колпачком для предотвращения травм. Очевидно , маркировать выборки шестеренки и цветовой код все ингаляционные и выдыхаемого компоненты (например, зеленый = В, красный = Ex).
- Точно так же цветовой код сосуды для отбора проб с наборами парных сосудов выборки последовательно пронумерованы.
где F = скорость потока (см 3 мин -1), P = дифференциальное давление (бар), г = впускной трубки внутренний радиус (см), K = 2,417 · 10 -9 (-2 сек), L = длина трубки (см ), V = вязкость воды (г см -1 с -1). Таблицу 1 для более подробной информации. 2. Рабочая Подводный
- Подготовка к работе сайта
- Предварительное обследование и отбор образцов
Примечание: Из-за сложного характера подводного протокола отбора проб, посвятив необходимое время для подготовки обеспечит эффективное погружение выборки.- Рассмотрите работу сайта и сделать необходимые приготовления раньше времени.
- Выберите и отметьте подходящие целевые организмы, которые могут быть доступны относительно легко. Так как не все организмы обязательно могут быть активны во время погружения выборки, подготовить больше рабочих мест, чем вы ожидаете попробовать.
- Установка базовых опор
- Wheп работает на выровненной подложке:
- Установите оригинальный зажим для быстрого высвобождения гибкого штатива на 1 кг веса для дайвинга и просто расположить его рядом с целевым животным.
- При работе на вертикальных стенках:
- Основание для крепления опорных пластин для системы VacuSIP, крючки для аксессуаров и снаряжения, плечики для сборного судна, перевозящего лоток на этапе подготовки работы на площадке (2.1.1).
- Когда гибкие переносные штативы используются, используйте болты или двухкомпонентной эпоксидной смолы для фиксации пластин 10х10 см ПВХ рядом с каждой целевой животного. Каждая пластина должна иметь отверстие, чтобы прикрепить быстросъемное зажимы гибкого портативного штатива.
- После того, как смола затвердеет, и опорные пластины прочно прикреплены к стене, ввернуть в клипах быстроразъемных, выступающей в качестве твердой точки крепления для гибкой портативной штатив для системы VacuSIP.
- Wheп работает на выровненной подложке:
- Предварительное обследование и отбор образцов
- Установка VaCUSIP
- Проверьте , правильно ли образец накачки, выпустив фильтрованную флуоресцеина красителя рядом с ингаляционным отверстием и подтвердить , что краситель появляется через exhalent отверстие , как описано в Yahel и др. (2005) 16.
- Установите устройство VacuSIP и поместите трубку ингаляционное (IN) отбора проб в пределах ингаляционного отверстия или просто рядом с ним (в пределах ~ 5 мм). Убедитесь, что ингаляционное трубка не находится в непосредственной близости от другого exhalant отверстия.
- Тщательно направлять пробоотборную трубку exhalant (EX) к Osculum / exhalant сифона и очень аккуратно вставьте его, пока он не установится 1-5 мм внутри Osculum / exhalant сифона (см рисунок 1 и Дополнительный Video 1). Будьте очень осторожны, чтобы не вступать в контакт с или иным образом нарушить отобранной организм.
- До и во время отбора проб перепроверить расположение обеих трубок.
- После проверки правильности отбора проб ли образец до сих пор, как насосное дезсываются выше (2.2.1).
Примечание: Поскольку движение одной рукой штатива при манипулировании другой может произойти, убедитесь, что во-первых, поместите летучими трубку отбора проб и во-вторых exhalant трубку, которая требует более точной манипуляции. После этого заказа, даже если манипуляция exhalant пробоотборной трубки может вызвать перемещение ингаляционной трубки, это не повлияет на выборку.
- Модульная процедура подводного отбора проб
Примечание: В ожидании на вопрос исследования, каждый из экспериментальных этапов ниже, могут быть выполнены в виде автономного эксперимента. Полный протокол выборки метаболического профиля , описанный ниже , длительный процесс, требующий до 8 часов в образце (для обзора см рисунок 2 и таблицу 2). Поскольку условия для дайвинга и правила различаются между участками отбора проб, регионов и учреждений, водолазные планы не включены в этот протокол. Тем не менее, уделять особое внимание следует уделить и METIculous планирования к плану погружения. Обратите особое внимание во избежание насыщения и YOYO профилей погружения. Когда это возможно, целесообразно проводить эти эксперименты на малых глубинах (<10 м). Закрытые ребризеры схема может быть очень удобно для таких длительных схем отбора проб.- Перед началом фактической выборки, убедитесь в отсутствии видимых следов флуоресцеина остатка остаются и что взвешенные наносы были урегулированы или повеяло прочь.
- Ультра-планктон, (фильтр не установлен на этом шаге!)
- Используйте иглу, чтобы проколоть IN (ингаляционный) и EX (выдыхаемого) стерильные пластиковые пылесосом трубки перегородками. Убедитесь в том, что вода капает в на запланированном скорости и собирают 2-6 образцы мл воды.
- На извлечения, сохранить образцы в холодной коробке на льду. В лаборатории, сохраняют с 1% параформальдегидом + 0,05% EM класса глутаральдегида (конечная концентрация), или 0,2% глутаральдегида EM класса. Замораживание криопробирки в жидком азоте и хранят при -80 &# 176; C до анализа.
- Силикатный выборки и хранения
- Вмонтируйте держатель предварительно очищенное в линию ПК фильтра, содержащего 0,2 мкм поликарбонатную мембрану между иглой и штыревым разъемом Люэра на дистальном конце трубки.
- Пирс перегородку колпачок предварительно очищенную полиэтиленовых флаконов высокой плотности (HDPE флаконы), чтобы начать отбор проб. Убедитесь в том, что оба пробников капают и собирают 15 мл воды в каждом флаконе.
- Хранить образцы в холодильнике (4 ° С) до анализа. Если анализ не может начаться в течение двух недель, хранить при температуре -20 ° C. Для анализа, убедитесь, что образцы оттаивают при 50 ° С в течение не менее 50 мин, чтобы растворить силикагели.
Примечание: мембрана может быть сохранена для микроскопии и анализа ДНК по мере необходимости.
- Растворенные неорганические вещества (PO 4 3-, NO х -, NH 4 +)
- Заменить тон ПК фильтр в сборе с предварительно очищенное в линии из нержавеющей стали, держатель фильтра, который содержит предварительно сгорает стеклянного фильтра.
- Перед отбором проб, убедитесь, что по крайней мере 20 мл проб морской воды пропускали через всю систему фильтрации с использованием EPA, HDPE флаконах или другой вакуумный сосуд, чтобы начать отсасывание. Измерьте объем собранной воды, прежде чем они будут отброшены.
- Пирс септа колпачок из соответствующих стеклянных флаконах EPA начать отбор проб, убедитесь, что оба пробников капают, и собирают 25-30 мл для нитрата и фосфата анализа.
- Переход к новым EPA стеклянные флаконы для анализа аммиака, убедитесь, что оба пробников капают, и собирают 20 мл в каждом флаконе.
- Храните образцы в холодной коробке на льду и хранить при температуре -20 ° С до анализа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если только фильтрат представляет интерес, одноразовые шприцевые фильтры могут быть использованы для шагов 2.3.3 и 2.3.4.
- Растворенной органики отбор проб и й (DOC + DON)ORing
Примечание: Храните образцы вертикально, насколько это возможно на протяжении обработки таким образом, чтобы проба воды не входит в контакт с силиконовой прокладкой.- Продолжить с использованием нержавеющей стали в сборе фильтра и собрать 20 мл проб морской воды в новые стеклянные флаконы EPA, как описано выше.
- После извлечения, сохранить образцы в холодной коробке на льду. В лаборатории использовать предварительно сжигается стекло пипетки Пастера, чтобы исправить образцы с ортофосфорной кислотой (добавьте 5-6 капель 25% следов металла класса кислоты в 20 мл образца, конечная концентрация 0,04%) или соляной кислоты (добавьте 2 капли следовых металла класса концентрированной кислоты в образце 20 мл, конечная концентрация 0,1%) и хранить в холодильнике.
- Хранить образцы в холодильнике (4 ° С) до анализа. Если образцы не анализировали в течение недели хранить при температуре от -20 ° С до анализа.
- Твердые частицы органического вещества (ПСУ, PON, POP)
- Продолжить использование улainless стальной фильтр в сборе и фильтр по меньшей мере, 500 мл морской воды в вакуумную 250 мл термос. При необходимости замените колб.
- На извлечения, используйте шприц, заполненные воздухом, чтобы эвакуировать всех оставшихся морскую воду из держателя фильтра, завернуть в алюминиевую фольгу и хранить в холодном поле на льду. В лаборатории, снимите фильтры из фильтродержателями и хранить при -20 ° С до анализа.
- Перед началом фактической выборки, убедитесь в отсутствии видимых следов флуоресцеина остатка остаются и что взвешенные наносы были урегулированы или повеяло прочь.
Рисунок 1. Пример правильных установок VacuSIP: (A) Отбор проб асцидии Polycarpa mytiligera (залив Акаба, Красное море) , используя пользовательский встроенный манипулятор с цветовым кодом используется зеленый цвет для вдыхаемого и выдыхаемого желтого для проб воды (фото Том Shelizenger и Юваль Якоби); (B) выборки oroides губки Agelas (NW СредиземноморьеМоре) с шириной Osculum 3 мм, с использованием устройства VacuSIP. Цветовой код используется желтый для вдыхаемого и выдыхаемого красного для проб воды. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Общий обзор метода VacuSIP , описанного в разделе протокола. Лабораторная работа представлена в желтых коробках, полевые работы в синих коробках. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Таблица 1. Общие средние частоты дискретизации (мл мин -1) , полученный с различными контейнерамииспользуется для коллекций воды и различных уровнях вакуума: склянки не пылесосить (нет); EPA стеклянные флаконы и флаконы из ПЭВП пылесосить половину их объема (½ объема); стерильные пластиковые пробирки уже пылесосить производителем. Работа на 5-8 м глубины, температура воды 18-22 ° С, используя PEEK трубки длиной 79 см и внутренним диаметром 25 мкм.
Таблица 2. Обзор выборки судна, узла фильтра закрепителя, рядный, хранения и аналитические методы , описанные в разделе протокола. Изученные соединения являются: ультра-планктон изобилие (планктон <10 мкм), силикат (SiO 4), фосфат (PO 4 3-), нитрит + нитрат (NO 2 - + NO 3 -), растворенного органического вещества (DOM), аммония (NH + 4) и в виде частиц органического вещества ,(ПОМ). Все сосуды для отбора проб имеют кремниевую перегородку колпачок и вакуумируют до взятия пробы. В фиксаторами являются: параформальдегид + глутаровый альдегид (Перенасыщение + Parafor), ортофосфорной кислоты (Н 3 РО 4) и соляной кислоты (HCl). Фильтр сборки в линии используются: держатели из поликарбоната фильтр и поликарбонатные мембраны 0,2 мкм фильтры (PC держатель фильтра + мембранные PC) и держатели фильтров из нержавеющей стали и без связующего фильтры из стекловолокна GFF.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Оптимизация методов сбора морской воды
Выбор коллектора флаконов и процедуры очистки
VacuSIP-совместимые коллекторные емкости должны иметь перегородку, которая позволяет выборочный быть начато, прокалывая иглой шприца. Они должны выдерживать повышенное давление под водой (2-3 бара при типичных акваланга рабочих глубин), и должен держать вакуум. Многие (но не все бренды) флаконов, утвержденных по охране окружающей среды для анализа летучих органических веществ отвечают этим критериям. Предварительно очищенные флаконы, утвержденные для DOC и анализа DON также доступны. Для проверки пригодности этих флаконов для сбора и анализа питательных веществ и оптимизации процедур очистки, высокое качество двойной дистиллированную воду собирали в промыты кислотой полипропиленовых труб (ПП трубы), недавно приобрела, вРТВ-очищено полиэтиленовые флаконы высокой плотности (HDPE флаконы), а также в стеклянных флаконах EPA, все оборудованы перегородкой крышкой из политетрафторэтилена (ПТФЭ). ПЭВП ампул и полипропиленовые трубы были очищены, как описано в разделе 1.5.2 выше, и стеклянные флаконы EPA были очищены от производителя.
Количество NH + 4 найдены в EPA стеклянных флаконах было относительно минимальным (≤ 0,1 мкмоль · л -1) и зависит от высокого качества бидистиллированной стандарта качества воды. В отличие от этого , NH 4 + концентрации значительно возросло (до 3 и 7 раз соответственно) и показал более высокую изменчивость в промыты кислотой полипропиленовые пробирки и в полиэтиленовых флаконах с высокой плотностью (ANOVA F (5,53) = 7.183, p < 0,001, рис 3). Там не было никакого влияния высокого качества двойного контакта дистиллированная вода с кремниевой мембраной на анализе аммония.
Сравнение новых стеклянных флаконов по сравнению с очищаемых / переработанная стеклянные флаконы
Для того, чтобы проверить , можно ли использовать EPA стеклянные флаконы для анализа питательных веществ больше , чем один раз, NO х -, PO 4 3-, и NH 4 + концентрации в пробах морской воды , собранных в новых стеклянных флаконах EPA сравнивали с данными , собранными в использованных стеклянных флаконах EPA. Новые стеклянные флаконы EPA были предварительно очищены от производителя, в то время как переработанные стеклянные пробирки были очищены, как описано выше (1.5.2). Переработанные Флаконы имели значительно более высокую концентрацию NH 4 +, до 1,5 раза уровень найденный в новых стеклянных флаконах (т тест, р <0,001, п = 5). Никаких существенных различий не было обнаружено в NO х - и PO 4 3- содержание между собранным в перерабатываемых флаконах образцов и образцов , собранных в новом стеклеФлаконы (рис 4).
Силикатный сбор и процедуры хранения
Для того, чтобы определить наилучший сосуд отбора проб для анализа силиката, высокое качество бидистиллированной воды собирали в неочищенных и в промыты кислотой полипропиленовые пробирки (PP трубки), в полиэтиленовых ампулах промыты кислотой высокой плотности (ПЭВП ампул), и в EPA стеклянные флаконы. Ожидаемая концентрация силиката была близка к нулю, так что значения, отклоняющиеся от ожидаемой концентрации считались загрязненными. Концентрация силиката существенно отличались между образцами , собранными в разных флаконах (ANOVA, F (3,19) = 210,047, р <0,001), показывая самую низкую концентрацию SiO 4 в промыты кислотой HDPE флаконы. Боросиликатного стекла флаконы загрязненные образцы, причем конечная концентрация SiO 4 увеличивается вплоть до 7 мкмольL - 1 (рисунок 5).
Выбор устройства для фильтрации растворенного органического вещества (DOM) и биогенного анализа
Для того, чтобы определить , какой фильтр устройство производит самый низкий пробел в анализе растворенного органического (DOC и DON) и неорганических веществ (NO х -, NH 4 +, PO 4 3-), сравнивали с поликарбонатом фильтродержатели из нержавеющей стали в линии Суинни фильтродержатели. С каждого типа держателя фильтра мы тестировали как поликарбонатную мембрану, предварительно сгорает фильтр из стекловолокна. Комбинация из нержавеющей стали держатель фильтра и сжигаемого фильтр из стекловолокна при условии, что низкие заготовки, в то время как поликарбонат Суинни держатель фильтра оснащен поликарбонатной мембраной четко загрязнены образцы вплоть до 9 раз. Увеличение объемов промывки сделал не решить эту проблему (рисунок 6).
Рисунок 3. Концентрация аммоний (мкмоль · л -1, среднее значение ± стандартное отклонение) , собранных с разных флаконах: (1) Неочищенные флакон ПЭВП; (2) Cleaned флакон HDPE; (3) Убирали HDPE флакон + парафильмом; (4) EPA стеклянный флакон; (5) EPA стеклянный пузырек + парафильмом; (6) Убирали PP трубку. Парафильмом был помещен, чтобы проверить, может ли кремния перегородку загрязнить образцы воды. Для каждой обработки были проанализированы 9 образцов высокого качества бидистиллированной воды. Образцы анализировали в свежем виде. Значительные различия были обнаружены между четырьмя судами выборки (ANOVA, F (5,53) = 7.183, р <0,001, тест мощность = 0,992). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4. аммоний (NH + 4), нитрит + нитрат (NO x -), и фосфат (PO 4 3-) концентрации (мкмоль · л -1, среднее значение ± стандартное отклонение) проб морской воды , собранных в новой (темный) и переработанные / очищено (белый) EPA стеклянные флаконы. Морская вода была собрана на экспериментальной Aquaria зоне Института морских наук и фильтровали с нержавеющей стали держателем фильтра и стеклянный фильтр. Пробы воды были проанализированы в свежем виде. Звездочка (*) указывает на то, что разница существенна (т тест, р <0,001, п = 5, тест мощности = 1). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
.jpg "/>
Рисунок 5. Силикат концентрация (мкмоль · л -1, среднее ± стандартное отклонение) в высоком качестве двойной дистиллированной воды, собранной в разных флаконах: промыты кислотой ПП трубы, полипропиленовые трубы, промыты кислотой HDPE флаконы, новые стеклянные флаконы EPA. Значительные различия были обнаружены между четырьмя сэмплера материалов (ANOVA, F (3,19) = 210,047, р <0,001, тест мощности = 1). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 6. Изучение влияния различных сборок фильтрации и мыть объемы на нитрита + нитрата (NO х - мкмоль L -1). Образцы для NO х - были получены путем фильтрации проб морской воды из нержавеющей стали (SS FМСДЭНИ держатель) или поликарбоната в линию держатели Суинни фильтр (PC держатель фильтра), оснащенные либо поликарбонатную мембрану (PC фильтр) или предварительно сжигается фильтры из стекловолокна. Для фильтров ПК, разные объемы (10, 30, 60, 90 и 120 мл), 5% -ной HCl и высокого качества бидистиллированной воды использовали для промывания фильтр в сборе, объем стирки приводится в круглых скобках в подписи к фигуре. Величины выражены как среднее ± стандартное отклонение (n = 5). Морская вода была собрана на экспериментальной Aquaria зоне Института морских наук и образцы анализировали свежие после фильтрации. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 7. Пример экспериментальных результатов: вдыхается (IN, черныйкруг) и выдыхаемого (EX, красный треугольник) парные концентрации пробы воды (мкмоль · л -1) различных веществ , обработанных губкой Chondrosia reniformis в Средиземном море: (A) аммония (NH 4 +); (В) нитрат нитрит + (NO x -); (С) фосфат (PO 4 3-); (D) , силикатные (SiO 4); (Е) , растворенного органического углерода (DOC); (F) , растворенный органический азот (ДОН); (G) планктонные органический углерод (LPOC); (H) планктонные органический азот (LPON). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 8. Пример cytom потокаметрия анализ спаренных образцов воды , извлекаемой из воды вдыхаемого (А, С, Е, G) и выдыхаемого (В, D, F, Н) с помощью губки Chondrosia reniformis: (А, В, С, D) популяций фитопланктона; (E, F, G, H) гетеротрофные бактерии. В AB и EF выборка была чистой и точной (все планктонные группы были эффективно сохранены). CD и GH являются примерами загрязнения выдыхаемом воды, показывая низкий удаление всех планктонных групп. Syn:. Synechococcus зр, пико: автотрофные picoeukariotes, нано: автотрофные nanoeukaryotes, высокая: гетеротрофные бактерии с высоким содержанием ДНК, низким:. Гетеротрофные бактерии с низким содержанием ДНК Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Дополнительный Figurе 1. Cell эффективность удержания различных планктонных добычи по моллюска Chama расШса: Prochlorococcus зр. (Pro), Synechococcus зр. (Син), Pico-эукариоты (Pico EUK), нано-эукариоты (Nano EUK). Усы = 95% CI. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы загрузить этот файл.
Дополнительное видео 1. Отбор проб асцидии Polycarpa mytiligera с помощью пользовательского встроенный манипулятор с кодом цвета используется зеленый цвет для ингаляционного и желтый для выдыхаемом проб воды. Пробирки (PEEK, ID 54 мкм, длиной 75 см) тщательно помещены в exhalant и летучими сифонов из асцидии. Вода чем втягивается в вакуумированных трубок со скоростью ~ 1 мл мин -1. В этой демонстрации флуоресцеина краситель используется для визуализации exhalant струи. Обратите внимание, что exhalant пробоотборной трубки помещается также Wiтонкие струи exhalant. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Подготовительные шаги
Коллектор Флаконы для DOM и анализа питательных веществ
Поскольку коллектор суда могут взаимодействовать с растворенными в микро-составляющих и сэмплера стенки могут быть субстратом для бактерий роста 30-34 были испытаны различные Флаконы для DOM и питательных веществ коллекции. Боросиликатного не рекомендуется для кремнезема количественной оценки 33,35, так как стеклянные бутылки может увеличить начальную концентрацию двуокиси кремния до двух раз , если образцы не быстро замораживают 30. Наши результаты показывают, что использование предварительно очищенных флаконов EPA приводит к низкой концентрации заготовок для DOC, ДОН и неорганических питательных веществ, в первую очередь для аммония.
Фильтрация и хранение DOC
Фильтрация является обязательным и, во многих случаях, является первым шагом в аналитической химии и морскоймикробиология. В то время как можно фильтровать образцы после сбора в лаборатории, эта процедура не рекомендуется для работы на месте, где образцы собраны под водой, часто в отдаленных местах, часов или дней от надлежащих лабораторных помещений. Использование в линии, фильтрация на месте в минимизирует обработку образца и , таким образом , снижает риск загрязнения. В фильтрации на месте также удаляет большинство бактерий и снижает риск того, что состав образца будет изменяться бактериального метаболизма в течение длительного отбора проб и транспортировки время. Узел фильтрации увеличивает мертвый объем аппарата для отбора проб, а также может быть источником загрязнения. Подборка самых маленьких держателей возможно фильтров (например, в линию Свинни держатель фильтра 13 мм) и минут PEEK трубки (например, 254 мкм ID) уменьшает мертвый объем , и риск загрязнения окружающей воды.
Если соответствующий фильтр неиспользуется или если он тщательно не моют, артефакты и загрязнения проб воды , которые могут произойти 32,36-39. Исследования анализа DOC показали , что фильтры и держатели фильтров из органических соединений (поликарбонат и PFA-PTFE) может привести к серьезному загрязнению DOC 32,37, особенно если не тщательно промыть с высоким качеством дважды дистиллированной воды 38. Настоящий Протокол и результаты следуют этим рекомендациям, а также указать, что держатели из поликарбоната фильтр следует избегать.
В работе на месте и интероперабельности
Система VacuSIP является прямой метод отбора проб, что облегчает изучение метаболизма ненарушенных сестонофагов в их естественной среде и количественной оценки их экологической роли в системе. Для опытных и оснащенных водолазов, применение метода VacuSIP прост и требует лишь короткий трAining. Эксперименты InEx VacuSIP предназначены для «within'-дизайн статистического анализа (то есть, в паре или повторный анализ мера), поэтому контроль для большинства аналитических артефактов в том числе высоких заготовок. Использование регулируемого всасывания обеспечивает медленное и возможность регулирования частоты дискретизации, тем самым предотвращая случайное загрязнение выдыхаемого воды с окружающей водой. Там, где это возможно, выбор рабочих мест с низким током и низкой мутностью рекомендуется и обеспечит более чистые и более точные результаты. Длительное время выборки (минут до нескольких часов) позволяет интегрировать высокой мозаичности, характеризующей бентическое пограничный слой. Все эти функции обеспечивают, что при правильном применении метода VacuSIP является высокой надежностью, обеспечивая надежные и воспроизводимые результаты даже при работе с небольшим числом повторов. Пример типичных результатов , полученных из средиземноморской губки и Индопацифики видов моллюсков показан на рисунке 7 и линии Дополнительного Рисунок 1.
Как и с любой техникой, то VacuSIP не свободна от потенциальных опасностей. Самой распространенной проблемой является загрязнение выдыхаемом пробы воды с окружающей водой. Причины этих артефактов включают высокую скорость всасывания, dislodgments трубки и поведение животных. Правильный выбор правильной частоты дискретизации зависит от предыдущих оценок скорости выводящий потока. Такие оценки могут быть получены с помощью метода скорости переднего красителе 16. В идеале, скорость всасывания должна быть ниже 1% от скорости откачки (например, 1 мл мин -1 в течение 6 ч -1 л скорости откачки). Для того, чтобы избежать загрязнения окружающей среды с водой, частота дискретизации не должна превышать 10% от скорости накачки.
Для контроля частоты дискретизации, длина и внутренний диаметр всасывающей трубки должен быть отрегулирован в соответствии с намеченным глубины работы и температуры воды. Течение пуазёйля (смотри раздел 1.3.1 выше) могут быть использованы в качестве руководства. Тем не менее, это уравнение следует рассматривать в качестве приближения первого порядка, так как ΔP и уменьшение частоты дискретизации с временем выборки и в линии фильтрации добавляет неопределенности. Использование вакуумированных контейнеров, иногда с неизвестными вакуумные давления, вносит дополнительные осложнения. Пример того , как частота дискретизации варьируется в зависимости от различных вакуумированных контейнеров с различным вакуумом, показано в таблице 1.
Уменьшение частоты дискретизации легко достигается путем регулировки длины трубки и идентификационный номер, без каких-либо технических ограничений для этого сокращения (частоту дискретизации нескольких микролитров в час возможны). Тем не менее, экспериментаторы должны быть осведомлены о медленной частотой дискретизации, диктуемого этим ограничением для животных с медленной скоростью накачки и для мелких организмов или образцов. Непосредственным последствием медленной частоты дискретизации является ограниченный объем воды, который может быть собран в течение одного Сесси выборкина. Такой низкий объем будет ограничить количество анализов и повторов, которые могут быть запущены с этими образцами, и, таким образом, также ограничить информацию, которую можно получить из этих популяций.
Труба может быть смещение легко обнаружить и отбор проб может быть прервана или перезапущен, при условии, что прыгун держит постоянные часы. В отличие от этого, прекращение откачки во время отбора проб, не всегда легко обнаружить. Это справедливо не только для губок, но и для оболочников, двустворчатых и полихет. На самом деле, вопреки распространенному мнению, события, в которых асцидии или двустворчатый остановленные перекачку были зарегистрированы без видимых изменений в геометрии сифона (Yahel, неопубликованные данные). Кроме того, в некоторых случаях, оболочники могут поддерживать активную накачку без каких-либо секрета сетки (то есть, не фильтрация происходит).
Управление частотой дискретизации имеет решающее значение. В этом отношении VacuSIP лучше, чем другие методы, особенно, когда исследование животные relativEly мал или когда они насос медленно. Шприцы особенно трудно контролировать 2. Например, Переа-Blazquez и его коллеги (2012a) 40 использовали шприц для образца воды , выдыхаемый несколько видов умеренной губки и на удивление не нашли общий образец проглатывания / экскреции определенных питательных веществ (NO 2 -, NO 3 -, NH 4 +, PO 4 3-, SiO 4). Отсутствие четкой картины, вероятно, является результатом загрязнения выдыхаемом образцов с окружающей водой за счет использования шприца. Заражение видно из - за крайне низкой эффективности удержания пико планктона , сообщенные Переа-Blazquez и его коллеги (2012b) 41 для своих губок: 40 ± 14% от гетеротрофных бактерий и 54 ± 18% от Synechococcus зр. Для сравнения, с использованием VacuSIP, Мюллера и др. (2014) 21 сообщили , эффективность удаления гетеротрофных бактерий72 ± 15% в Siphonodictyon зр. и 87 ± 10% в Cliona delitrix.
Для проверки качества образцов и убедитесь, что нет загрязнения окружающей воды не происходит, мы настоятельно рекомендуем сначала проанализировать пико и нано планктонных проб с помощью проточной цитометрии. Это быстрый, надежный и дешевый анализ обеспечит немедленную информацию о качестве образца. Очень часто для некоторой добычи таксонов , таких как Synechococcus зр. должны быть удалены, близкой к эффективности 14,42 90% губками и асцидии. Значительные отклонения от этого теста показывают , что загрязнение могло произойти (рисунок 8).
Для надежного и чистого отбора проб, убедитесь, что эксперимент дизайн удовлетворяет семь простых правил: (1) выполнить предварительное обследование (включая насосные оценки скорости) и подготовить рабочее место хорошо; (2) знать, изученные животных; (3) проверить, что исследуемые образец имеет четко определенный выводной апертуройй доступном месте; (4) проверить, что исследуемые образцы прокачивает до и после каждого взятия пробы; (5) Поместите пробирку для сбора выдыхаемого воды немного внутри выводной апертуры (рисунок 1); (6) использовать частоту дискретизации <10% от скорости потока вытекающий, 1% настоятельно рекомендуется; (7) определить критерий качества и опустить подозреваемых пар INEX.
Следуя этим простым правилам, система VacuSIP предлагает практичный и надежный метод измерения, как активный частиц сестонофагов процесса и растворенные соединения в естественных условиях, что позволяет точно и сопоставимых оценок, которые могут быть использованы для оценки функциональной роли фильтраторов в различных экосистемах вокруг мир.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Мы благодарим Manel Боливара за помощь в полевых работах. Мы благодарны "Parc Natural дель Montgri, ле Медес я эль Бахо Тер" за поддержку наших исследований и отбора образцов разрешений. Подводный манипулятор был разработан Айелет Dadon-Pilosof и производство готовых г-ном Pilosof. Эта работа была поддержана испанским проектом правительства CSI-Корал [номер гранта CGL2013-43106-R с дистанционным управлением и MR] и с помощью FPU общения с "Ministerio де educación, Cultura у Deporte (МЭиЧС)" к ТМ. Это вклад от морской биогеохимии и глобальное изменение климата исследовательская группа финансируется каталонского правительства [грант номер 2014SGR1029] и ISF грант 1280/13 и BSF грант 2012089 до G. Yahel.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GorillaPod, Original | Joby | GP000001 | flexible portable tripod |
| Flangeless Ferrule | IDEX Health & Science | P-200X | 1/16" in Blue/pk |
| Male Nut | IDEX Health & Science | P-205X | 1/16" in Green/10 pk |
| Female to Female Luer | IDEX Health & Science | P-658 | |
| Female-Male Luer | IDEX Health & Science | P-655 | |
| Peek Tubing (254 µm ID) | IDEX Health & Science | 1531 | 1/16" OD x 0.01 in ID x 5 ft length. Alternative ID can be used. |
| Two component resin epoxy | IVEGOR | 9257 | Mix well the two component resin before use |
| (TOC) EPA Vials | Cole -Parmer | 03756-20 | 40 ml glass vials. Manufactured also by Thomas Scientific (ref. number 9711F09). |
| HDPE Vials | Wheaton | 986701 (E78620) | 20 ml high-density polyethylene vials |
| Vacuette Z no additive | Greiner bio-one | 455001 | pre-vacuum by the manufacturer |
| Septum Sample Bottles | Thomas Scientific | 1755C01 | 250 ml glass bottles |
| Septum Cap 1 | Wheaton | W240844SP (E7865R) | 22-400 for HDPE vials |
| Septum Cap 2 | Wheaton | W240846 (1078-5553) | 24-400 for glass vials and bottles. Also manufactured by Thermo Scientific National (ref. 03-377-42). |
| In-line stainless steel Swinney Filter holders | Pall | 516-9067 | 13 mm of diameter |
| PTFE Seal Washer | Pall | 516-8064 | ring for stainless steel filter holders |
| TCLP Glass Filters | Pall | 516-9126 | binder-free glass fiber filters, 13 mm of diameter, pore size 0.7 µm |
| Polycarbonate Filter Holders | Cole -Parmer | 17295 | 13 mm of diameter |
| Isopore Membrane Filters | Millipore | GTTP01300 | 13 mm of diameter, pore size 0.2 µm |
| Contrad 70 Solution | Decon Labs | 1002 | highly soluble basic mix of anionic and non-ionic surfactant solution |
| Sterile Syringe Filters | VWR International Eurolab S.L. | 514-0061P | 25 mm of diameter , pore size 0.2 µm |
| Fluorescein | Sigma-Aldrich | (old ref.28802) 46955-100G | 100 g |
| Holdex, disposable,sterile | Greiner bio-one | 450263 | sterile, single-use tube holder with off-center luer for Vacuette |
| Sterile Needles | IcoGammaPlus | 5160 | 0.7 mm x 30 mm |
| Cryovials Nalgene | Nalgene | V5007(Cat. No.5000-0020) | 2 ml |
| Cryobox carton | Rubilabor | M-600 | 145x145x55 mm p/microtube 1.5 ml |
| Orthophosphoric Acid | Sigma | 79617 or Alternatively use Ultra-Pure Hydrochloric acid, final concertation 0.1% | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | 500 g |
| Glutaraldehyde | Merck | 8,206,031,000 | 25%, 1 L |
| Hand Vacuum Pump | Bürkle | 5620-2181 or Alternatively use standard laboratory vacuum pump |
References
- Gili, J. M., Coma, R. Benthic suspension feeders: their paramount role in littoral marine food webs. Trends. Ecol. Evol. 13 (8), 316-321 (1998).
- Reiswig, H. In situ pumping activities of tropical Demospongiae. Mar. Bio. 9, 38-50 (1971).
- McMurray, S., Pawlik, J., Finelli, C. Trait-mediated ecosystem impacts: how morphology and size affect pumping rates of the Caribbean giant barrel sponge. Aquat. Bio. 23 (1), 1-13 (2014).
- Pile, A. J., Young, C. M. The natural diet of a hexactinellid sponge: benthic-pelagic coupling in a deep-sea microbial food web. Deep-Sea Res. Pt. I. 53 (7), 1148-1156 (2006).
- Nielsen, T., Maar, M. Effects of a blue mussel Mytilus edulis bed on vertical distribution and composition of the pelagic food web. Mar. Ecol. Prog. Ser. 339, 185-198 (2007).
- De Goeij, J. M., et al. Surviving in a marine desert: the sponge loop retains resources within coral reefs. Science. 342, 108-110 (2013).
- Maldonado, M., Ribes, M., van Duyl, F. C. Nutrient Fluxes Through Sponges. Biology, Budgets, and Ecological Implications. Advances in Marine Biology. 62, (2012).
- Riisgård, H. U. On measurement of filtration rates in bivalves - the stony road to reliable data: review and interpretation. Mar. Ecol. Prog. Ser. 211, 275-291 (2001).
- Reiswig, H. M. Water transport, respiration and energetics of three tropical marine sponges. J. Exp. Mar. Biol. Ecol. 14, 231-249 (1974).
- Jiménez, E., Ribes, M. Sponges as a source of dissolved inorganic nitrogen: nitrification mediated by temperate sponges. Limnol. Oceanogr. 52 (3), 948-958 (2007).
- Diaz, M. C., Ward, B. Sponge-mediated nitrification in tropical benthic communities. Mar. Ecol. Prog. Ser. 156, 97-107 (1997).
- Ribes, M., Coma, R., Gili, J. Natural diet and grazing rate of the temperate sponge Dysidea avara (Demospongiae, Dendroceratida) throughout an annual cycle. Mar. Ecol. Prog. Ser. 176, 179-190 (1999).
- Jiménez, E. Nutrient fluxes in marine sponges: methodology, geographical variability and the role of associated microorganisms. , Universitat Politècnica de Catalunya. Barcelona. PhD thesis (2011).
- Reiswig, H. M. Particle feeding in natural populations of three marine demosponges. Biol. Bull. 141 (3), 568-591 (1971).
- Reiswig, H. M. In situ pumping activities of tropical Demospongiae. Mar. Biol. 9 (1), 38-50 (1971).
- Yahel, G., Marie, D., Genin, A. InEx - a direct in situ method to measure filtration rates, nutrition, and metabolism of active suspension feeders. Limnol. Oceanogr-meth. 3, 46-58 (2005).
- Genin, A., Monismith, S. S. G., Reidenbach, M. A., Yahel, G., Koseff, J. R. Intense benthic grazing of phytoplankton in a coral reef. Limnol. Oceanogr. 54 (2), 938-951 (2009).
- Yahel, G., Whitney, F., Reiswig, H. M., Leys, S. P. In situ feeding and metabolism of glass sponges (Hexactinellida , Porifera) studied in a deep temperate fjord with a remotely operated submersible. Limnol. Oceanogr. 52 (1), 428-440 (2007).
- Wright, S. H., Stephens, G. C. Removal of amino acid during a single passage of water across the gill of marine mussels. J. Exp. Zool. 205, 337-352 (1978).
- Møhlenberg, F., Riisgård, H. U. Efficiency of particle retention in 13 species of suspension feeding bivalves. Ophelia. 17 (2), 239-246 (1978).
- Mueller, B., et al. Natural diet of coral-excavating sponges consists mainly of dissolved organic carbon (DOC). PLoS ONE. 9 (2), e90152 (2014).
- Gasol, J. M., Moran, X. A. G. Effects of filtration on bacterial activity and picoplankton community structure as assessed by flow cytometry. Aquat. Microb. Ecol. 16 (3), 251-264 (1999).
- Koroleff, F. Determination of reactive silicate. New Baltic Manual, Cooperative Research Report Series A. 29, 87-90 (1972).
- Murphy, J., Riley, J. P. A. Modified single solution method for the determination of phosphate in in natural waters. Anal. Chim. Acta. 27, 31-36 (1962).
- Shin, M. B. Colorimetric method for determination of nitrite. Ind.Eng.Chem. 13 (1), 33-35 (1941).
- Wood, E. D., Armstrong, F. A. J., Richards, F. A. Determination of nitrate in sea water by cadmium-copper reduction to nitrite. J. Mar. Biol. Assoc. U. K. 47 (1), 23-31 (1967).
- Sharp, J. H., et al. A preliminary methods comparison for measurement of dissolved organic nitrogen in seawater. Mar. Chem. 78 (4), 171-184 (2002).
- Sharp, J. H. Marine dissolved organic carbon: Are the older values correct. Mar. Chem. 56 (3-4), 265-277 (1997).
- Holmes, R. M., Aminot, A., Kerouel, R., Hooker, B. A., Peterson, B. J. A simple and precise method for measuring ammonium in marine and freshwater ecosystems. Can. J. Fish. Aquat. Sci. 56 (10), 1801-1808 (1999).
- Degobbis, D. On the storage of seawater samples for ammonia determination. Limnol. Oceanogr. 18 (1), 146-150 (1973).
- Tupas, L. M., Popp, B. N., Karl, D. M. Dissolved organic carbon in oligotrophic waters: experiments on sample preservation, storage and analysis. Mar. Chem. 45, 207-216 (1994).
- Yoro, S. C., Panagiotopoulos, C., Sempéré, R. Dissolved organic carbon contamination induced by filters and storage bottles. Water Res. 33 (8), 1956-1959 (1999).
- Zhang, J. Z., Fischer, C. J., Ortner, P. B. Laboratory glassware as a contaminant in silicate analysis of natural water samples. Water Res. 33 (12), 2879-2883 (1999).
- Yoshimura, T. Appropriate bottles for storing seawater samples for dissolved organic phosphorus (DOP) analysis: a step toward the development of DOP reference materials. Limnol. Oceanogr-meth. 11 (4), 239-246 (2013).
- Strickland, J. D. H., Parsons, T. R. A practical handbook of seawater analysis. , Fisheries Research Board of Canada. Ottawa. (1968).
- Eaton, A. D., Grant, V. Freshwater sorption of ammonium by glass frits and filters: implications for analyses of brackish and freshwater. Limnol. Oceanogr. 24 (2), 397-399 (1979).
- Norrman, B. Filtration of water samples for DOC studies. Mar. Chem. 41 (1-3), 239-242 (1993).
- Carlson, C. A., Ducklow, H. W. Growth of bacterioplankton and consumption of dissolved organic carbon in the Sargasso Sea. Aquat. Microb. Ecol. 10 (1), 69-85 (1996).
- Grasshoff, K., Ehrhardt, M., Kremling, K. Methods of Seawater Analysis. Second, Revised and Extended Edition. , (1999).
- Perea-Blázquez, A., Davy, S. K., Bell, J. J. Nutrient utilisation by shallow water temperate sponges in New Zealand. Hydrobiologia. 687 (1), 237-250 (2012).
- Perea-Blázquez, A., Davy, S. K., Bell, J. J. Estimates of particulate organic carbon flowing from the pelagic environment to the benthos through sponge assemblages. PLoS ONE. 7 (1), e29569 (2012).
- Pile, A. J., Patterson, M. R., Witman, J. D. In situ grazing on plankton <10 µm by the boreal sponge Mycale lingua. Mar. Ecol. Prog. Ser. 141, 95-102 (1996).
