Introduction
Bentiske suspension foderautomater spiller væsentlige roller i driften af marine økosystemer 1. Ved at filtrere store mængder vand 2,3, de fjerner og udskille partikler (plankton og detritus) og opløste forbindelser 1 (og referencer deri) og er en vigtig agent for bentisk-pelagisk kobling 4,5 og næringsstofkredsløb 6,7. Præcist måle partikler og opløste forbindelser fjernet og udskilles af bentiske suspension foderautomater (såsom svampe, søpunge, børsteorme og muslinger) er grundlæggende for at forstå deres fysiologi, stofskifte, og fodring økologi. Sammen med at pumpe hastighedsmålinger, det også muliggør en kvantificering af de strømme næringsstoffer medieret af disse organismer og deres økologiske indflydelse på vandets kvalitet samt på økosystemet skala processer.
Valg af passende metode til måling fjernelse og produktion satser af partikler og opløst compounds ved suspension filter foderautomater er afgørende for at opnå pålidelige oplysninger om deres fodring aktivitet 8. Som påpeget af Riisgård og andre, uhensigtsmæssige metoder skævhed resultater, fordrejer eksperimentelle betingelser, give forkerte skøn over indtagelse og udskillelse af visse stoffer, og kan føre til fejlagtig kvantificering af strømme næringsstoffer behandles af disse organismer.
De to hyppigst anvendte metoder til måling af partikler og opløste flusmidler næringsstoffer i filter foderautomater involvere enten inkubation (indirekte teknikker) eller samtidig samling af ambient og udåndet vand (direkte teknikker). Inkubationsbetingelser teknikker er baseret på at måle graden af ændring i koncentrationen af partikler og opløste næringsstoffer i inkuberes vand, og estimere satser produktion eller fjernelse i forhold til tilstrækkelig kontrol 8. omslutter en organisme i en inkubation kammer kan dog ændre sit feeding og pumpning opførsel skyldes ændringer i den naturlige strøm ordning, som skyldes et fald i oxygen og / eller koncentrationen fødevarer, eller på grund af ophobning af udskillelse forbindelser i inkubationen vand 7,9 (og referencer deri). Ud over virkningerne af indespærring og modificeret vandforsyning, en større forspænding inkuberingssystemernes teknikker stammer fra re-filtrerings- virkninger (se eksempel 10). Selv om nogle af disse metodologiske problemer er blevet overvundet ved at bruge højre volumen og form inkubationsbeholderen 11 eller med indførelsen af en recirkulerende glasklokken systemet in situ 12, denne teknik ofte undervurderer fjernelse og produktionshastigheder. Kvantificering metabolismen af opløste forbindelser såsom opløst organisk nitrogen (DON) og carbon (DOC) eller uorganiske næringsstoffer, har vist sig at være særligt tilbøjelige til at bias forårsaget af inkubation teknikker 13.
I slutningen af 60'erne og begyndelsen af 70'erne, Henry Reiswig9,14,15 banebrydende anvendelsen af direkte teknikker til at kvantificere fjernelse partikel af gigantiske caribiske svampe ved separat prøveudtagning vandet inhaleres og udåndes af organismerne in situ. På grund af vanskeligheder med at anvende Reiswig teknik på mindre suspension foderautomater og i mere udfordrende undersøiske forhold, blev hovedparten af forskningen på dette område er begrænset til laboratoriet (in vitro) beskæftiger meste indirekte inkubation teknikker 16. Yahel og kolleger ombygget Reiswig direkte in situ teknik til at arbejde i mindre målestok betingelser. Deres metode, betegnet Inex 16, er baseret på samtidig undersøiske prøvetagning af vandet inhaleres (I) og udåndet (Ex) ved uberørte organismer. De forskellige koncentrationer af et stof (f.eks, bakterier) mellem et par prøver (Inex) giver et mål for opbevaring (eller produktion) af stoffet af dyret. Den Inex teknik anvender tidsubegrænsede rør ogafhængig af excurrent frembringes ved pumpning aktivitet af den undersøgte organisme til passivt erstatte det omgivende vand i indsamlingsenheden røret. Mens Yahel og kolleger med held har anvendt denne teknik i studiet af over 15 forskellige suspension fødere taxa (f.eks 17), er den metode, begrænset af den høje grad af praksis og erfaring, der kræves ved den diminutive størrelse nogle excurrent åbninger, og ved hav forhold.
For at overvinde disse forhindringer, vi udviklet en alternativ teknik baseret på kontrolleret sug af den samplede vand gennem små rør (udvendig diameter <1,6 mm). Vores mål var at skabe en enkel, pålidelig og billig enhed, der ville tillade ren og kontrolleret in situ vandprøvetagning fra en meget bestemt punkt, som den excurrent åbning af bentiske suspension foderautomater. For at være effektiv, fremgangsmåden skal være ikke-påtrængende for ikke at påvirke den omgivende flow regime eller ændre Behavior af de undersøgte organismer. Enheden præsenteres her betegnes VacuSIP. Det er en forenkling af SIP udviklet af Yahel et al. (2007) 18 for ROV-baseret punkt prøvetagning i det dybe hav. Den VacuSIP er betydeligt billigere end den oprindelige SIP og det er blevet tilpasset til SCUBA-baserede arbejde. Systemet er designet efter principper præsenteret og testet af Wright og Stephens (1978) 19 og Møhlenberg og Riisgård (1978) 20 for laboratoriet indstillinger.
Selvom VacuSIP system blev designet til in situ undersøgelser af metabolismen af bentiske Suspensionsædere, kan det også anvendes til laboratorieundersøgelser og hvor en kontrolleret og ren, punktkilde vandprøven er påkrævet. Systemet er især nyttig, når integration i længere perioder (min-timer) eller in situ-filtreringer er påkrævet. Den VacuSIP har været anvendt med succes i Yahel lab siden 2011, og har ogsåværet ansat i to nylige undersøgelser af næringsstoffluxe medieret af Caribien og Middelhavet svamp arter 21 (Morganti et al. indsendt).
Brugen af specifikke samplere, den langvarige prøvetagning varighed, og markforhold, hvor VacuSIP anvendes, medfører nogle afvigelser fra standard oceanografiske protokoller til indsamling, filtrering og lagring af prøver til følsomme analytter. For at reducere risikoen for kontaminering fra den VacuSIP system eller risikoen for modifikation af det samplede vand ved bakteriel aktivitet efter indsamling, testede vi forskellige in situ filtrerings- og opbevaring procedurer. Forskellige filtrering enheder, indsamling fartøjer og lagring procedurer blev undersøgt med henblik på at opnå den bedst egnede teknik til analyse af opløst uorganisk (PO 4 3-, NO x -, NH4 +, SiO 4) og organisk (DOC + DON) forbindelser, og ultra-plankton (<1081 m) og partikler organiske (POC + PON) prøvetagning. For yderligere at reducere risikoen for forurening, især under markforhold, blev antallet af håndteringstrin reduceret til et absolut minimum. Den visuelle format hvor fremgangsmåden præsenteres er orienteret til at lette reproducerbarhed og reducere den nødvendige tid til effektivt at anvende teknikken.
Systemoversigt
Prøve in situ pumpes vand fra Suspensionsædere med exhalant åbninger så små som 2 mm, er pumpning aktivitet af hver prøve først visualiseret ved at frigive filtreret fluorescein farvet havvand ud for den inhalant åbning (er) og observere dens strømning fra excurrent åbning 16 (se også figur 2B i 18). Vandet inhaleres og udåndes af undersøgelsen prøven (incurrent og excurrent) er derefter samtidigt samples med brugen af et par øjebliks rør installeret på specialbyggede manipulator eller på to af "arms "af en omvendt fleksible bærbare stativ (figur 1 og Supplerende Video 1). Vandet indåndes af undersøgelsen organisme opsamles ved omhyggeligt at placere den proksimale ende af et rør i eller nær den inhalant åbning af undersøgelsen organisme. Et identisk rør anbringes derpå inde i excurrent åbning. Denne operation kræver god pleje for at undgå kontakt eller forstyrrelse af dyret, fx ved sediment resuspension. til at begynde prøveudtagning en dykker gennemborer et septum i opsamlingsbeholderen med en sprøjte nål fastgjort til den distale ende af hvert rør, så det ydre vandtryk til at tvinge det samplede vand i fartøjet gennem prøverøret. sugningen initieres af vakuum tidligere oprettede i hætteglassene og af trykforskellen mellem den eksterne vand og den evakuerede prøvebeholderen .
For at sikre en ren samling af udåndet vand og undgå utilsigtet sugning af ambient vand 16, skal holdes på et betydeligt lavere sats (<10%) end den excurrent flow vandet samplingfrekvens. Suget hastighed reguleres af længden af røret og dets indre diameter (ID). Den lille indre diameter sikrer også en ubetydelig dødvolumen (<200 pi per meter slange). Udvælgelse over længere perioder (minutter til timer) gør det muligt at integrere den iboende patchiness af de fleste stoffer af interesse. At sikre, at prøverne er tilstrækkeligt bevaret i langvarige undersøiske prøveudtagningsrunder samt til transport til laboratoriet, en in situ filtrering anbefales til følsomme analytter. Udvælgelsen af stikprøver fartøjer, filtrering montage og slanger er dikteret af undersøgelsens organismer og den specifikke problemstilling. Den nedenfor beskrevne protokol antager, at en fuld metaboliske profil er af interesse (for en oversigt se figur 2). Men den modulære natur af protokollen tillader f,eller let modifikation at rumme enklere eller endda meget forskellige prøveudtagningsordninger. For en fuld metaboliske profil, skal prøvetagningsprotokol omfatte følgende trin: (1) Flow visualisering; (2) Sampling ultra-plankton fodring (plankton <10 um); (3) Stikprøver uorganiske næringsstoffer optagelse og udskillelse (ved hjælp af in-line filtre); (4) Stikprøve opløst organisk optagelse og udskillelse (ved hjælp af in-line filtre); (5) Partikler fodring og udskillelse (ved hjælp af in-line filtre); (6) Gentag trin 2 (ultra-plankton fodring som kvalitetskontrol); (7) Flow visualisering.
Når logistisk muligt, anbefales det, at de metaboliske profilmålinger kombineres med pumpehastigheden (f.eks farvefronten hastighed fremgangsmåde, i 16) samt med respiration målinger. Disse målinger bedst træffes i begyndelsen og slutningen af prøvetagningen. For respirationsmåling, undersøiske optodes eller mikroorganismer elektroder er at foretrække.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forberedende Steps og rengøringsprocedurer
- renseopløsning
- Bær beskyttelsesudstyr, en lab coat, og handsker på alle tidspunkter. Udfør disse indledende skridt i en ren rum fri for støv og røg.
- Forbered en 5-10% saltsyre (HCI) løsning med frisk, høj kvalitet, dobbelt destilleret vand.
- Der fremstilles en 5% letopløseligt grundmix af anioniske og nonioniske overfladeaktive opløsning (se Materialer List) med frisk, høj kvalitet, dobbelt destilleret vand.
- Opbevar alle løsninger i ren, syre vaskede containere.
- Forberedende skridt og rengøringsprocedurer (i laboratoriet)
BEMÆRK: Hvis fosforforbindelser er ikke af interesse, kan HCI vask blive erstattet af høj kvalitet fosforsyre (H 3 PO 4) vask (8% H 3 PO 4 slutkoncentration).- Bær beskyttelsesudstyr, en lab coat, og handsker på alle tidspunkter.
- Vaskprøvetagning apparat (eksklusive in-line rustfri stål Swinney filterholder) med rigelig mængde vand med høj renhed. Efterlad apparatet neddypning i 5-10% HCI-opløsning natten over. Skyl apparatet igen med rigelig mængde af høj kvalitet, dobbelt destilleret vand.
- in-line rustfri stål Swinney filterholdere Vask med rigelig mængde vand med høj renhed. Lad filterholderne iblødsætning i 5% letopløselige grundlæggende blanding af anioniske og nonioniske overfladeaktive løsning natten over. Skyl dem igen med rigelig høj kvalitet dobbelt destilleret vand.
- Tør alle apparatet prøveudtagning, pak dem ind i alufolie og holde i en ren boks indtil brug.
- Kontrol Suge sats
- Styr sampling rate ved at justere længden og indvendig diameter af indtaget slange i henhold til den planlagte arbejde dybde og vandtemperatur. Brug følgende ligning (afledt af Hagen-Poiseuille ligning anvendt til fuldt udvikviklet laminar pipe flow) som en guide:
hvor F = flowhastighed (cm 3 min -1), AP = differenstryk (bar), r = indløb slanger intern radius (cm), K = 2,417 x 10 -9 (sec -2), L = rørlængde (cm ), V = viskositet vand (g cm-1 sek-1). Se tabel 1 for flere detaljer. - Hold samplingfrekvens under 1% af pumpehastigheden af det undersøgte dyr.
BEMÆRK: Brug af evakuerede beholdere, undertiden med ukendt vakuum udgør yderligere komplikationer. Derfor er en felttest stærkt anbefales. Ved 10 m dybde og ~ 22 ° C havvand (40 PSU), en 50 cm indløbsrør med en indvendig diameter på 254 um leverer en gennemsnitshastighed sugning på ~ 26 pi sek-1 (1,56 ml min-1).
- Styr sampling rate ved at justere længden og indvendig diameter af indtaget slange i henhold til den planlagte arbejde dybde og vandtemperatur. Brug følgende ligning (afledt af Hagen-Poiseuille ligning anvendt til fuldt udvikviklet laminar pipe flow) som en guide:
- Sampling fartøjer
- For små mængder prøver (3-20 ml, fx, ultra-plankton for flow cytometry) bruger pre-støvsuges sterile plastrør.
BEMÆRK: Pre-støvsuges sterilt plastrør rutinemæssigt ansat til standard blodprøver hos mennesker; Sørg for at bruge de sterile rør uden tilsætningsstoffer. Disse støvsuget sterile plastrør er bedst samplet med brug af sterile, engangsbrug rør holder med off-center Luer. Mens dette er den sikreste og mest effektive apparater prøveudtagning, det har en lidt større dødvolumen sammenlignet med en simpel nål. - For større vandprøver såsom næringsstoffer og opløste organiske, bruge 40 eller 60 ml hætteglas, der opfylder Environmental Protection Agency (EPA) kriterier for flygtige organiske analyser. Disse hætteglas omfatter polypropylenlåg med en PTFE-faced silikone septum.
- For endnu større mængder, bruge penicillin flasker med gummipropper eller termoflasker.
- Brug high-density polyethylen hætteglas (HDPE hætteglas) for silica prøver.
- At øge prøvevolumen og mindske risikoen for, at proppen løsnerunder opstigningen, evakuere (vakuum) poster 1.4.2-1.4.4 før dykke med en vakuumpumpe. Vakuum manuelt ved anvendelse af en hånd vakuumpumpe eller endda ved at suge luften med en sprøjte. Men for de bedste resultater, anbefales en god vakuumpumpe. Standard lyophilizers giver højt vakuum.
BEMÆRK: Vær særlig opmærksom, når du bruger store støvsuges kolber for at sikre, at jo hurtigere indledende sug fald ikke ville forurene den udåndede vandprøver.
- For små mængder prøver (3-20 ml, fx, ultra-plankton for flow cytometry) bruger pre-støvsuges sterile plastrør.
- Procedurer Vessel rengøring
- For opløste organiske og NH4 + analyse, anvende nye pre-rengjort EPA hætteglas.
- Skyl hætteglas (glas og HDPE) til analyse af andre næringsstoffer som følger:
- Skyl hætteglas (glas og HDPE) og polypropylen hætter med høj kvalitet dobbelt destilleret vand. Installer en ny silicium septum.
- Soak hætteglassene (glas og HDPE) i 10% HCI i mindst 3 dage og skyl med rigelig høj kvalitet, dobbelt destilleret vand.
- Forbrænde de hætteglas ved 450 ° C i 4 timer og afkøles i ovnen. Monter hætten, og pak i alufolie indtil brug.
- filtre
- Brug bindemiddelfrie filtre glasfiberfiltre til filtrering af alle opløste organiske prøver (f.eks DOC, DON) og til indsamling af partikelformige organiske (f.eks POC, PON). Pak hver glasfilter i en separat aluminiumsfolie kuvert. Forbrænde ved 400 ° C i 2 timer for at fordampe organiske rester og gemmer i en ren og tør beholder indtil brug.
- Brug enten et bindemiddel-fri glasfiberfiltre som ovenfor, eller 0,2 um polycarbonat membraner til prøveudtagning uorganiske næringsstoffer (f.eks PO 4 3-, NO x -, NH4 +). Rengør sidstnævnte når de er installeret i filterholderen som forklaret nedenfor (1.7.3).
- Bruge 0,2 um polycarbonatmembraner filtre til silica prøveudtagning. Rengør dem én gang installed i filterholderen, som forklaret nedenfor (1.7.3).
- Fremstilling af filtreringskonstruktion
- Foretage letopløselige grundmix af anioniske og nonioniske overfladeaktive opløsning, og den høje kvalitet dobbelt destilleret vand gennem et 0,2 um filter før de bruges til at rense filtrering forsamling.
- Filtrering samling for næringsstoffer og andre end silica opløste organiske:
- Placer en forbrændes bindemiddel-fri filtre glasfiber inde i rengjort rustfrit stål Swinney filterholder in-line.
- Brug en syre-rengjort sprøjte til at køre 100 ml 5% letopløseligt grundmix af anioniske og nonioniske overfladeaktive opløsning og derpå 100 ml høj kvalitet dobbelt destilleret vand gennem hele aggregatet.
- Filtrering enhed til SiO 4:
- Placer polycarbonatfilter inde i renset polycarbonat filterholder (PC filterholder).
- Brug en syre-rengjort sprøjte til run 30 ml 5% HCI og 30 ml af høj kvalitet dobbelt destilleret vand gennem hele aggregatet.
- System samling
- Saml systemet til undervands arbejde ved hjælp af PEEK (polyetheretherketon) rør med en ydre diameter (OD) på 1,6 mm og en indvendig diameter (ID) på 254 um eller 177 um.
- Brug en skarp kniv eller PEEK cutter til at skære rørene i den ønskede længde.
- Ved sin distale ende (prøvebeholder side), passer hvert rør med en Luer connector fastgjort til en sprøjte nål. Sørg for at følge fabrikantens anvisninger, og tilpasse den flade side af blå kantfri ferrule med enden af røret, før stramning af grønne møtrik.
- Fastgør PEEK slangen til stativets "arme" eller specialbyggede manipulator ved hjælp af en isolerende tape.
- Vedhæft en engangssprøjte nål til den mandlige Luer stik. Hold nålen med dens beskyttende hætte for at forhindre skader. Afmærkes tydeligt sampling gear og farvekode alle inhalerede og udåndet komponenter (f.eks grøn = I, rød = Ex).
- Tilsvarende farvekode prøveudskillelsesfiltrene skibe med sæt parrede prøvetagning fartøjer fortløbende nummereret.
hvor F = flowhastighed (cm 3 min -1), AP = differenstryk (bar), r = indløb slanger intern radius (cm), K = 2,417 x 10 -9 (sec -2), L = rørlængde (cm ), V = viskositet vand (g cm-1 sek-1). Se tabel 1 for flere detaljer. 2. Working Underwater
- Forberedelse Work websted
- Indledende undersøgelse og udvælgelse af prøver
BEMÆRK: På grund af den komplekse karakter af den undersøiske prøvetagningsprotokol, afsætter den nødvendige tid til forberedelse vil sikre en effektiv sampling dykke.- Opmål arbejdspladsen og foretage de nødvendige forberedelser før tid.
- Vælg og marker egnede målorganismer, der kan tilgås relativt let. Da ikke alle organismer nødvendigvis er aktiv på tidspunktet for prøveudtagningen dykke, forberede flere arbejdsstationer, end du forventer at prøve.
- Installation af base-understøtninger
- when arbejder på nivelleret underlag:
- Monter den oprindelige frigivelse klip af den fleksible stativ på 1 kg dykning vægte hurtig og blot placere den ved siden af målet dyr.
- Når du arbejder på lodrette vægge:
- Mount basen støtteplader til VacuSIP systemet, kroge til tilbehør gear, og bøjler til opsamlingsbeholderen transporterer bakke under arbejdsstedet forberedelsesfasen (2.1.1).
- Når der anvendes fleksible bærbare stativer, bruge bolte eller to-komponent epoxy-harpiks til at fastsætte 10x10 cm PVC plader ved siden af hvert mål dyr. Hver plade skal have et hul til at fastgøre quick release klip af den fleksible bærbare stativ.
- Når harpiksen er hærdet, og bundpladerne er solidt fastgjort til væggen, skru i release klip hurtige, der tjener som et fast fastgørelsespunkt for den fleksible bærbare stativ til VacuSIP systemet.
- when arbejder på nivelleret underlag:
- Indledende undersøgelse og udvælgelse af prøver
- Installation af VaCUSIP
- Kontroller, om prøven er at pumpe ved at frigive filtreret fluorescein farvestof siden af inhalant blænde og bekræft, at farvestoffet er ved at opstå gennem exhalent åbning, som beskrevet i Yahel et al. (2005) 16.
- Installer VacuSIP enheden og placer inhalant (IN) prøverør i inhalant blænde eller lige ved siden af det (inden for ~ 5 mm). Sørg for, at inhalant rør ikke er i nærheden af en anden exhalant blænde.
- Dirigere forsigtigt exhalant (EX) prøvetagning rør mod osculum / exhalant vandlås og indsæt det meget forsigtigt i, indtil den er placeret 1-5 mm inde i osculum / exhalant vandlås (se figur 1 og Supplerende Video 1). Vær meget opmærksom på ikke at komme i kontakt med eller på anden måde forstyrre den samplede organisme.
- Før og under prøveudtagning dobbelttjekke placering begge rør.
- Efter prøvetagning kontrollere, om prøven er stadig pumpe som described ovenfor (2.2.1).
BEMÆRK: Da bevægelsen af den ene arm af stativ, når manipulere den anden kan opstå, så sørg for at det første placere inhalant prøvetagningsrøret og for det andet den exhalant rør, der kræver mere præcis manipulation. Efter denne rækkefølge, selv om manipulation af exhalant prøverør kan forårsage bevægelsen af inhalant rør, vil det ikke påvirke prøveudtagningen.
- Modular undervands prøvetagningsprocedure
BEMÆRK: Afventer på forskningsspørgsmålet, kan hver af de eksperimentelle trin nedenfor udføres som en stand-alone eksperiment. Den fulde metaboliske profil prøveudtagning nedenfor beskrevne protokol er en langvarig proces, der kræver op til 8 timer pr prøven (for en oversigt se figur 2 og tabel 2). Som dykning betingelser og regler er forskellige prøveudtagningssteder, regioner og institutioner, er dykning planer ikke omfattet af denne protokol. Ikke desto mindre, afsætte ekstrem omhu og meticulous planlægning til dykning planen. Vær særlig opmærksom på at undgå mætning og yoyo dykke profiler. Når det er muligt, er det tilrådeligt at udføre disse forsøg på overfladisk dybde (<10 m). Lukkede kredsløb rebreathers kan være meget praktisk for sådanne langvarige prøveudtagningsordninger.- Før selve prøvetagning begynder, sørg for ingen synlige spor af fluorescein rest forblive og at suspenderede sediment er afviklet, eller har wafted væk.
- Ultra-plankton, (ingen filter er installeret i dette trin!)
- Brug nål til at stikke IN (inhalerede) og EX (udåndet) støvsuget steril plastrør septa. Kontroller, at vandet drypper ind på den planlagte kurs og indsamle 2-6 ml vandprøver.
- På hentning, opbevare prøver i en kold boks på is. I laboratoriet, bevare med 1% paraformaldehyd + 0,05% EM kvalitet glutaraldehyd (slutkoncentration), eller 0,2% EM klasse glutaraldehyd. Frys kryoglas i flydende nitrogen og opbevares ved -80 &# 176; C indtil analyse.
- Silikat prøveudtagning og opbevaring
- Installer den rustfri PC filterholder forud renset in-line indeholdende et 0,2 um polycarbonatmembran mellem nålen og Luer han-stik i den distale ende af røret.
- Pierce septum cap af de forud rengøres high-density polyethylen hætteglas (HDPE hætteglas) for at starte sampling. Kontroller, at begge samplere er dryp og indsamle 15 ml vand i hvert hætteglas.
- Hold prøverne nedkølet (4 ° C) indtil analyse. Hvis analysen ikke kan begynde inden for to uger, opbevares ved -20 ° C. Til analyse, sørge for, at prøverne er optøet ved 50 ° C i mindst 50 minutter for at opløse silica geler.
BEMÆRK: Membranen kan bevares til mikroskopi eller DNA-analyse efter behov.
- Opløste uorganiske (PO 4 3-, NO x -, NH4 +)
- Udskift than PC filtersamling med en forud renset rustfrit stål filterholder in-line, som indeholder en præ-forbrændt glasfilter.
- Før prøvetagning, sikre, at mindst 20 ml havvand prøver blev ført gennem hele filtreringen system ved hjælp af EPA, HDPE hætteglas eller anden vakuumbeholder at starte sugning. Måle volumenet af det opsamlede vand, før de kasseres.
- Pierce septum cap af de relevante økonomiske partnerskabsaftaler hætteglas at starte prøveudtagning, kontrollere, at begge samplere er dryp, og indsamle 25-30 ml for nitrat og fosfat analyse.
- Skift til nye EPA hætteglas for ammoniak analyse, kontrollere, at begge samplere er dryp, og indsamle 20 ml i hvert hætteglas.
- Hold prøverne i en kold boks på is og opbevares ved -20 ° C indtil analysen.
BEMÆRK: Hvis der kun filtratet er af interesse, kan engangssprøjte filtre bruges til trin 2.3.3 og 2.3.4.
- Opløste organiske (DOC + DON) prøveudtagning og stORING
BEMÆRK: Hold prøverne så oprejst som muligt i hele håndteringen så prøve vand ikke kommer i kontakt med silicium septa.- Fortsætte med at bruge rustfrit stål filterenheden og indsamle 20 ml havvand prøver til nye EPA hætteglas, som beskrevet ovenfor.
- Ved hentning, holde prøverne i en kold boks på is. I laboratoriet, bruge en pre-forbrændt glas Pasteur-pipette til at fastsætte prøverne med orthophosphorsyre (tilsæt 5-6 dråber 25% spormetalkvalitet syre ind i en 20 ml prøve, endelig koncentration 0,04%) eller saltsyre (tilsættes 2 dråber af spormetalkvalitet koncentreret syre i et 20 ml prøve, slutkoncentration 0,1%) og opbevares i køleskab.
- Hold prøverne nedkølet (4 ° C) indtil analyse. Hvis prøverne ikke analyseres inden for en uge for indsamling, opbevares ved -20 ° C indtil analysen.
- Partikler organisk stof (POC, PON, POP)
- Fortsæt med at bruge stainless stål filterenheden og filter mindst 500 ml havvand ind i en evakueret 250 ml termoflaske. Udskift kolber om nødvendigt.
- På hentning, bruge en luft fyldt injektionssprøjte til at evakuere alle resterende havvand fra filterholderen, pak den ind i alufolie, og gemme i en kold boks på is. I laboratoriet, fjern filtrene fra filterholderne og opbevares ved -20 ° C indtil analysen.
- Før selve prøvetagning begynder, sørg for ingen synlige spor af fluorescein rest forblive og at suspenderede sediment er afviklet, eller har wafted væk.
Figur 1. Et eksempel på korrekte installationer af VacuSIP: (A) prøveudtagning søpung polycarpa mytiligera (Gulf of Aqaba, Røde Hav) med en specialbygget manipulator med farvekode anvendt grøn for inhaleret og gul for udåndet vandprøver (foto af Tom Shelizenger og Yuval Yacobi); (B) prøveudtagning svamp Agelas oroides (NW MediterraneanHav) med en osculum bredde på 3 mm, ved hjælp af VacuSIP enhed. Farven kode, der bruges, er gul for inhaleret og rød for udåndede vandprøver. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Oversigt over VacuSIP teknikken beskrevet i protokollen sektion. Laboratoriet arbejde er repræsenteret i gule kasser, feltarbejde i blå kasser. Klik her for at se en større version af dette tal.
Tabel 1. De samlede gennemsnitlige samplingfrekvenser (ml min-1) opnået med forskellige containerebruges til vand- samlinger og forskellige vakuumniveauer: kolberne blev ikke støvsuget (ingen); EPA hætteglas og HDPE hætteglas blev støvsuget halvdelen af deres volumen (½ volumen); sterile plastrør allerede støvsuget af producenten. Arbejde ved 5-8 m dybde, vandtemperatur på 18-22 ° C, ved anvendelse af PEEK rør med 79 cm længde og 25 um indvendig diameter.
Tabel 2. Oversigt over fartøjets prøveudtagning, fiksativ, in-line filterkonstruktion, opbevaring og analytiske metoder beskrevet i protokollen sektion. De analyserede forbindelser er: ultra-plankton overflod (plankton <10 um), silikat (SiO 4), fosfat (PO 4 3-), nitrit + nitrat (NO 2 - + NO 3 -), opløst organisk stof (DOM), ammonium (NH4 +) og partikler af organisk materiale(POM). Alle prøvetagning skibe har silicium septum hætte og støvsuges før prøveudtagning. De fikseringsmidler er: paraformaldehyd + glutaraldehyd (Glut + Parafor), fosforsyre (H 3 PO 4) og saltsyre (HCI). De in-line filter enheder, der bruges, er: polycarbonat filter indehavere og polycarbonat membran 0,2 um filtre (PC filter holder + PC membran) og rustfrit stål filter indehavere og bindemiddel-fri glasfiber filtre GFF.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Optimering af havvand indsamlingsmetoder
Udvælgelse af opkøber hætteglas og rengøring procedure
VacuSIP-kompatible indsamling fartøjer bør have en skillevæg, der tillader sampling at være indledt piercing med en sprøjte nål. De bør kunne modstå det forhøjede undervands tryk (2-3 bar ved typiske scuba arbejder dybder), og skal holde et vakuum. Mange (men ikke alle mærker) af hætteglas godkendt af EPA til analyse af flygtige organiske opfylder disse kriterier. Pre-renset hætteglas godkendt til DOC og DON-analyse er også tilgængelige. For at teste egnetheden af disse hætteglas til indsamling og analyse af næringsstoffer og optimere rengøringsprocedurer, var af høj kvalitet dobbelt destilleret vand opsamles i syre-renset polypropylen rør (PP rør), nyindkøbte, i enCID-rengjort high-density polyethylen hætteglas (HDPE hætteglas), og i EPA hætteglas, alle udstyret med en polytetrafluorethylen (PFTE) septum cap. De HDPE hætteglas og polypropylen rør blev renset som beskrevet i afsnit 1.5.2 ovenfor, og EPA hætteglas blev renset af producenten.
Den findes i EPA hætteglas mængde NH4 + var relativt minimal (≤ 0,1 pmol L -1) og afhænger dobbelt destilleret vand standardkvalitet høj kvalitet på. I modsætning hertil NH4 + -koncentrationer steg betydeligt (op til 3 og 7 gange, respektivt) og udviste en højere variabilitet i sure-rengjorte polypropylenrør og high-density polyethylen hætteglas (ANOVA F (5,53) = 7,183, p < 0,001, figur 3). Der var ingen virkning af høj kvalitet dobbeltdestilleret vand kontakt med silicium septum på ammonium analyse.
Sammenligning af nye hætteglas versus rensede / genanvendt hætteglas
For at teste, om EPA hætteglas kunne udnyttes til næringsstofanalyser mere end én gang, NOx -, PO 4 3-, og NH4 + koncentrationer i havvand prøver indsamlet i nye EPA hætteglas blev sammenlignet med dem, der indsamles i brugte EPA hætteglas. De nye EPA hætteglas blev forud renset af producenten, mens de genvundne hætteglas blev renset som beskrevet ovenfor (1.5.2). Genanvendt hætteglas havde signifikant højere NH4 + koncentration, op til 1,5 gange så høje som i nye hætteglas (t-test, p <0,001, n = 5). Ingen signifikante forskelle blev fundet i NO x - og PO 4 3- indhold mellem de indsamlede i genanvendte hætteglas prøver og prøver, der stammer nye glashætteglas (figur 4).
Silikat indsamling og lagring procedurer
At bestemme den bedste prøveudtagning fartøj til analyse af silicat, var høj kvalitet dobbelt destilleret vand opsamlet i ikke-rengjorte og i sure-renset polypropylenrør (PP rør), i sure renset high-density polyethylen hætteglas (HDPE hætteglas), og i EPA hætteglas. Den forventede silicat-koncentrationen var tæt på nul, så værdier, der afveg fra den forventede koncentration blev anset kontamineret. Koncentrationen af silikat betydeligt afveg mellem prøver indsamlet i de forskellige hætteglas (ANOVA, F (3,19) = 210,047, p <0,001), der viser den laveste SiO 4 koncentration i syre-renset HDPE hætteglas. Borosilikatglas hætteglas forurenet prøverne, med den endelige SiO 4-koncentration stiger med op til 7 pmolL -1 (figur 5).
Udvælgelse af filtrering apparatur til opløst organisk stof (DOM) og næringsstofanalyser
For at bestemme hvilket filter apparat producerer den laveste blank i analysen af opløst organisk (DOC og DON) og uorganiske næringsstoffer (NO x -, NH4 +, PO 4 3-), rustfrit stål filterholdere blev sammenlignet med polycarbonat in-line Swinney filterholdere. Med hver filterholder typetestet vi begge polycarbonat membran og pre-forbrændt glasfiberfilter. Kombinationen af rustfrit stål filter holder og forbrændes glasfiberfilter forudsat de laveste blanke, mens polycarbonat Swinney filterholder udstyret med polycarbonat membran tydeligt forurenede prøver med op til 9 gange. Forøgelse vask mængder gjorde ikke kan løse problemet (figur 6).
Figur 3. ammoniumkoncentrationen (pmol L -1, gennemsnitlig ± SD) opsamlet med forskellige hætteglas: (1) Urensede HDPE hætteglas; (2) Renset HDPE hætteglas; (3) Renset HDPE hætteglas + Parafilm; (4) EPA hætteglas; (5) EPA hætteglas + Parafilm; (6) rengøres PP rør. Den Parafilm blev placeret til at teste, om silicium septum kan forurene vandprøverne. For hver behandling blev analyseret 9 prøver af høj kvalitet, dobbelt destilleret vand. Prøverne blev analyseret frisk. Signifikante forskelle blev fundet mellem de fire stikprøver fartøjer (ANOVA, F (5,53) = 7,183, p <0,001, power test = 0,992). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Ammonium (NH4 +), nitrit + nitrat (NOx -), og fosfat (PO 4 3-) koncentrationer (pmol L -1, gennemsnitlig ± SD) af havvand prøver indsamlet i nye (mørk) og genbrugte / renses (hvid) EPA hætteglas. Havvand blev indsamlet i Eksperimentel Aquaria Zone af Institute of Marine Science og blev filtreret med rustfrit stål filter holder og glas filter. Vandprøverne blev analyseret frisk. Stjernen (*) angiver, at forskellen er signifikant (t-test, p <0,001, n = 5, power test = 1). Klik her for at se en større version af dette tal.
.jpg "/>
Figur 5. Silikat fusion (pmol L -1, gennemsnitlig ± SD) i høj kvalitet dobbelt destilleret vand opsamles i forskellige hætteglas: syre-rensede PP-rør, PP rør, syre-rensede HDPE hætteglas, nye EPA hætteglas. Signifikante forskelle blev fundet mellem de fire sampler materialer (ANOVA, F (3,19) = 210,047, p <0,001, power test = 1). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6. Undersøgelse af virkningen af forskellige filtrerings- enheder og vask volumener på nitrit + nitrat (NO x - pmol L -1). Prøver til NO x - blev opnået ved at filtrere havvand prøver med rustfrit stål (SS filter indehaver) eller polycarbonat in-line Swinney filterholdere (PC filterholderens) udstyret med enten en polycarbonat membran (PC-filter) eller en pre-forbrændt glasfiberfiltre. Til PC filtre blev forskellige volumener (10, 30, 60, 90 og 120 ml) af 5% HCI og høj kvalitet dobbelt destilleret vand, der anvendes til vask af filteraggregatet er vask volumen angivet i parentes i figuren legende. Værdier er udtrykt som middelværdi ± standardafvigelse (n = 5). Havvand blev indsamlet i Eksperimentel Aquaria Zone af Institute of Marine Science og prøverne blev analyseret frisk efter filtreringen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7. Eksempel på eksperimentelle resultater: inhaleret (IN, sortcirkel) og udåndet (EX, rød trekant) parret vand prøve koncentrationer (pmol L -1) af forskellige stoffer, der behandles af svampen Chondrosia reniformis i Middelhavet: (A) ammonium (NH4 +); (B) nitrit + nitrat (NOx -); (C) phosphat (PO 4 3-); (D) Silikat (SiO 4); (E) opløst organisk kulstof (DOC); (F) opløst organisk kvælstof (DON); (G) plankton organisk kulstof (LPOC); (H) plankton organisk kvælstof (LPON). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8. Et eksempel på et flow cytomEtry analyse af parrede vand- prøver udtaget af vandet inhaleres (A, C, E, G) og udåndet (B, D, F, H) af svampen Chondrosia reniformis: (A, B, C, D) planteplankton populationer; (E, F, G, H) heterotrofe bakterier. I AB og EF var ren og nøjagtig prøvetagning (alle planktoniske grupper blev effektivt bevaret). CD og GH er eksempler på forurening udåndede vand, viser lav fjernelse af alle planktoniske grupper. Syn:. Synechococcus sp, pico: autotrofe picoeukariotes, nano: autotrofe nanoeukaryotes, høj: heterotrofe bakterier med høj DNA-indhold, lav:. Heterotrofe bakterier med lav DNA-indhold Klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende Figure 1. Cell fastholdelse effektiviteten af forskellige plankton bytte ved clam Chama pacifica: Prochlorococcus sp. (Pro), Synechococcus sp. (Syn), pico-eukaryoter (Pico Euk), nano-eukaryoter (Nano Euk). Fejl barer = 95% CI. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende Video 1. Prøveudtagning den søpung polycarpa mytiligera ved hjælp af en specialbygget manipulator med farvekode anvendt grøn for inhaleret og gul for udåndede vandprøver. Sampling rør (PEEK, ID 54 um, 75 cm lang) er omhyggeligt placeret i exhalant og inhalant vandlås i søpung. Vand end trukket ind evakuerede rør ved en hastighed på ~ 1 ml min-1. I denne demonstration fluorescein farvestof anvendes til at visualisere exhalant jet. Bemærk, at den exhalant prøvetagning røret er placeret godt witynde exhalant jet. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Forberedende skridt
Samler hætteglas for DOM og næringsstofanalyser
Da collector fartøjer kan interagere med opløste mikro-vælgere og sampler vægge kan være et substrat for bakterievækst 30-34, forskellige hætteglas for DOM og næringsstoffer samling blev testet. Borsilicat anbefales ikke til silica kvantificering 33,35, idet glasflasker kan øge den initiale koncentration af silica med op til to gange, hvis prøverne ikke fryses hurtigt 30. Vores resultater viser, at brug af pre-rengjort EPA hætteglas resulterer i lav koncentration emner til DOC, DON, og uorganiske næringsstoffer, især for ammonium.
DOC filtrering og opbevaring
Filtrering er en nødvendig, og i mange tilfælde, er det første analytiske skridt i marine kemi ogmikrobiologi. Selv om det er muligt at filtrere prøverne efter opsamling i laboratoriet, er denne procedure anbefales ikke til in situ arbejde, hvor prøverne er indsamlet under vandet, ofte i fjerntliggende steder, timer eller dage væk fra ordentlige laboratoriefaciliteter. Anvendelsen af in-line, in situ filtrering minimerer prøvehåndtering og reducerer således risikoen for forurening. In situ filtrering fjerner også de fleste af de bakterier og reducerer risikoen for, at prøven sammensætning vil blive ændret ved bakteriel metabolisme under den lange prøveudtagning og transport tid. Filtreringen samling forøger dødvolumen af apparatet prøveudtagning og kan også være en kilde til forurening. Et udvalg af de mindste mulige filterholdere (fx in-line Swinney filterholder 13 mm) og minutter PEEK slanger (f.eks 254 um ID) reducerer den døde volumen og risikoen for forurening med omgivende vand.
Hvis det korrekte filter er ikkebrugt, eller hvis det ikke vaskes grundigt, artefakter og forurening af vandprøverne er sandsynlig 32,36-39. Undersøgelser af DOC-analyse viste, at filtre og filterholdere lavet af organiske forbindelser (polycarbonat og PFA-PTFE) kan resultere i alvorlig DOC forurening 32,37, især når der ikke skylles grundigt med høj kvalitet dobbelt destilleret vand 38. Den nuværende protokol og resultater følger disse retningslinjer, og viser også, at polycarbonat filterholdere bør undgås.
In situ arbejde og samarbejdet mellem
Det VacuSIP-systemet er en direkte sampling teknik, der letter undersøgelse af stofskiftet i uforstyrrede suspension foderautomater i deres naturlige miljø og kvantificering af deres økologiske rolle i systemet. For erfarne og udstyret dykkere, anvendelsen af VacuSIP metode er enkel og kræver kun korte training. Inex VacuSIP eksperimenter er designet til en "within'-design statistisk analyse (dvs. parret eller gentagen foranstaltning analyse), derfor styre for de fleste analytiske artefakter herunder højt emner. Brugen af kontrollerede suge sikrer langsom og justerbare samplingfrekvenser, hvilket forhindrer utilsigtet forurening af udåndet vand med omgivende vand. Hvor det er muligt, er udvælgelsen af arbejdspladser med lav strøm og lav turbiditet anbefales og vil sikre renere og mere præcise resultater. Den forlængede sampletid (minutter til timer) giver mulighed for integration af den høje patchiness der kendetegner det bentiske grænselag. Alle disse funktioner sikrer, at når de anvendes korrekt den VacuSIP metoden er yderst robust, giver pålidelige og reproducerbare resultater, selv når der arbejdes med et lille antal gentagelser. Et eksempel på typiske resultater opnået fra en Middelhavsområdet svamp og Indo-Pacific clam arter er vist i figur 7 og Supplemenplerende figur 1.
Som med enhver teknik, den VacuSIP er ikke fri for potentielle faldgruber. Det mest almindelige problem er forurening af den udåndede vandprøve med omgivelsernes vand. Årsager til disse artefakter omfatter høj suge sats, rør dislodgments og dyrs adfærd. Korrekt valg af den korrekte samplingfrekvens er afhængig af tidligere estimater af excurrent strømningshastighed. Sådanne skøn kan opnås ved hjælp af farvestoffet forreste hastighed metode 16. Ideelt set bør sugeraten holdes under 1% af pumpehastigheden (f.eks 1 ml min-1 for en 6 L time -1 pumpehastighed). For at undgå kontaminering med omgivende vand, bør samplinghastighed aldrig være større end 10% af pumpehastigheden.
For at kontrollere for samplingfrekvens, skal længden og indvendig diameter af indtaget slangen justeres i henhold til det planlagte arbejde dybde og vandtemperatur. Den Hagen-Poiseuille ligningen (se afsnit 1.3.1 ovenfor) kan anvendes som en vejledning. denne ligning skal dog betragtes som et første ordre tilnærmelse siden AP og samplingfrekvens fald med sampling tid og in-line filtrering tilføjer usikkerheder. Anvendelsen af evakuerede beholdere, undertiden med ukendte vakuumtryk, introducerer yderligere komplikationer. Et eksempel på hvordan samplingfrekvenser varierer som en funktion af forskellige evakuerede beholdere med forskellig vakuum, er vist i tabel 1.
Reduktion samplingfrekvens opnås let ved at justere røret længde og ID, med ingen tekniske begrænsninger for denne reduktion (samplingfrekvens på få mikroliter timen er mulige). Ikke desto mindre bør eksperimentatorer være opmærksom på den langsomme samplefrekvens dikteret af denne begrænsning for dyr med langsom pumpehastighed og for små organismer eller prøver. Den umiddelbare konsekvens af langsom samplingfrekvens er den begrænsede mængde vand, der kan indsamles i løbet af en enkelt sampling sessipå. Denne lave volumen vil begrænse antallet af analyser og gentagelser, som kan køres med disse prøver, og vil dermed også begrænse de oplysninger, der kan opnås fra disse populationer.
Tube løsrivelse kan let plettede og prøveudtagning kan afbrydes eller genstartes, forudsat at en dykker holder konstant vagt. I modsætning hertil ophør af pumpning under prøveudtagning er ikke altid let at opdage. Dette gælder ikke kun for svampe, men også for sækdyr, muslinger og polychæter. I modsætning til fælles tro, begivenheder, hvor en søpung eller et toskallede stoppet pumpning blev dokumenteret med nogen synlig ændring i vandlåsen geometri (Yahel, upublicerede data). I visse tilfælde kan sækdyr opretholde aktiv pumpning uden mesh sekretion (det er, er der ingen filtrering finder sted).
Styring samplingfrekvens er kritisk. I denne henseende er VacuSIP bedre end andre metoder, især når undersøgelsens dyr er relatively små eller når de pumpe langsomt. Sprøjter er særligt vanskelige at styre 2. For eksempel Perea-Blazquez og kolleger (2012a) 40 brugte en sprøjte til at prøve vandet udåndet af flere tempereret svamp arter og overraskende fandt ikke et generelt mønster for indtagelse / udskillelse af bestemte næringsstoffer (NO 2 -, NO 3 -, NH 4 +, PO 4 3-, SiO 4). Manglen på et klart mønster er sandsynligt et resultat af forurening af den udåndede prøver med omgivende vand på grund af sprøjte brug. Kontaminering fremgår af ekstremt lave tilbageholdelse effektivitet pico plankton rapporteret af Perea-Blázquez og kolleger (2012b) 41 for deres svampe: 40 ± 14% af heterotrofe bakterier og 54 ± 18% af Synechococcus sp. Til sammenligning, ved hjælp af VacuSIP, Mueller et al. (2014) 21 rapporterede en fjernelse effektivitet heterotrofe bakterier72 ± 15% i Siphonodictyon sp. og 87 ± 10% i Cliona delitrix.
For at verificere prøve kvaliteten og sikre, at ingen forurening af det omgivende vand sker, anbefaler vi kraftigt først at analysere de pico og nano plankton prøver ved anvendelse af flowcytometri. Denne hurtige, pålidelige, og billige analyse vil give øjeblikkelig information om prøven kvalitet. Det er meget almindeligt for nogle byttedyr systematiske enheder såsom Synechococcus sp. skal fjernes på næsten 90% virkningsgrad 14,42 af svampe og søpung. Væsentlige afvigelser fra dette benchmark tyder på, at forureningen kan have fundet sted (figur 8).
For pålidelig og ren sampling, sørg eksperimentet design opfylder syv enkle regler: (1) udføre en indledende undersøgelse (herunder pumpning sats skøn) og forberede arbejdspladsen godt; (2) ved de undersøgte dyr; (3) kontrollere, at de undersøgte prøve har en veldefineret excurrent blænde ennd tilgængeligt sted; (4) kontrollere, at de undersøgte prøven pumper før og efter hver prøvetagning; (5) placere røret til opsamling af den udåndede vand lidt inde i excurrent blænde (figur 1); (6) anvendelse samplingfrekvens <10% af den excurrent strømningshastighed, er 1% stærkt anbefales; (7) definerer kvalitetskriterium og udelade mistænkes Inex par.
Efter disse enkle regler, det VacuSIP system tilbyder en praktisk og pålidelig metode til at måle, hvor aktiv affjedring foderautomater proces partikler og opløste forbindelser i naturlige forhold, hvilket giver præcise og sammenlignelige skøn, der kan bruges til at vurdere den funktionelle rolle filter foderautomater i forskellige økosystemer rundt verdenen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi takker Manel Bolivar for hans assistance i feltarbejde. Vi er taknemmelige for den "Parc Natural del Montgri, les Illes Medes i el Baix Ter" for deres støtte til vores forsknings- og prøveudtagning tilladelser. Den undersøiske manipulator er designet af Ayelet Dadon-Pilosof og fabrikeret af Mr. Pilosof. Dette arbejde blev støttet af den spanske regering projektet CSI-Coral [tilskud nummer CGL2013-43106-R til RC og MR] og ved en FPU fellowship fra "Ministerio de Educación, Cultura y Deporte (MECD)" til TM. Dette er et bidrag fra Marine Biogeokemi og Global Change forskergruppe finansieret af den catalanske regering [tilskud nummer 2014SGR1029] og ISF tilskud 1280-1213 og BSF tilskud 2.012.089 til G. Yahel.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GorillaPod, Original | Joby | GP000001 | flexible portable tripod |
| Flangeless Ferrule | IDEX Health & Science | P-200X | 1/16" in Blue/pk |
| Male Nut | IDEX Health & Science | P-205X | 1/16" in Green/10 pk |
| Female to Female Luer | IDEX Health & Science | P-658 | |
| Female-Male Luer | IDEX Health & Science | P-655 | |
| Peek Tubing (254 µm ID) | IDEX Health & Science | 1531 | 1/16" OD x 0.01 in ID x 5 ft length. Alternative ID can be used. |
| Two component resin epoxy | IVEGOR | 9257 | Mix well the two component resin before use |
| (TOC) EPA Vials | Cole -Parmer | 03756-20 | 40 ml glass vials. Manufactured also by Thomas Scientific (ref. number 9711F09). |
| HDPE Vials | Wheaton | 986701 (E78620) | 20 ml high-density polyethylene vials |
| Vacuette Z no additive | Greiner bio-one | 455001 | pre-vacuum by the manufacturer |
| Septum Sample Bottles | Thomas Scientific | 1755C01 | 250 ml glass bottles |
| Septum Cap 1 | Wheaton | W240844SP (E7865R) | 22-400 for HDPE vials |
| Septum Cap 2 | Wheaton | W240846 (1078-5553) | 24-400 for glass vials and bottles. Also manufactured by Thermo Scientific National (ref. 03-377-42). |
| In-line stainless steel Swinney Filter holders | Pall | 516-9067 | 13 mm of diameter |
| PTFE Seal Washer | Pall | 516-8064 | ring for stainless steel filter holders |
| TCLP Glass Filters | Pall | 516-9126 | binder-free glass fiber filters, 13 mm of diameter, pore size 0.7 µm |
| Polycarbonate Filter Holders | Cole -Parmer | 17295 | 13 mm of diameter |
| Isopore Membrane Filters | Millipore | GTTP01300 | 13 mm of diameter, pore size 0.2 µm |
| Contrad 70 Solution | Decon Labs | 1002 | highly soluble basic mix of anionic and non-ionic surfactant solution |
| Sterile Syringe Filters | VWR International Eurolab S.L. | 514-0061P | 25 mm of diameter , pore size 0.2 µm |
| Fluorescein | Sigma-Aldrich | (old ref.28802) 46955-100G | 100 g |
| Holdex, disposable,sterile | Greiner bio-one | 450263 | sterile, single-use tube holder with off-center luer for Vacuette |
| Sterile Needles | IcoGammaPlus | 5160 | 0.7 mm x 30 mm |
| Cryovials Nalgene | Nalgene | V5007(Cat. No.5000-0020) | 2 ml |
| Cryobox carton | Rubilabor | M-600 | 145x145x55 mm p/microtube 1.5 ml |
| Orthophosphoric Acid | Sigma | 79617 or Alternatively use Ultra-Pure Hydrochloric acid, final concertation 0.1% | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | 500 g |
| Glutaraldehyde | Merck | 8,206,031,000 | 25%, 1 L |
| Hand Vacuum Pump | Bürkle | 5620-2181 or Alternatively use standard laboratory vacuum pump |
References
- Gili, J. M., Coma, R. Benthic suspension feeders: their paramount role in littoral marine food webs. Trends. Ecol. Evol. 13 (8), 316-321 (1998).
- Reiswig, H. In situ pumping activities of tropical Demospongiae. Mar. Bio. 9, 38-50 (1971).
- McMurray, S., Pawlik, J., Finelli, C. Trait-mediated ecosystem impacts: how morphology and size affect pumping rates of the Caribbean giant barrel sponge. Aquat. Bio. 23 (1), 1-13 (2014).
- Pile, A. J., Young, C. M. The natural diet of a hexactinellid sponge: benthic-pelagic coupling in a deep-sea microbial food web. Deep-Sea Res. Pt. I. 53 (7), 1148-1156 (2006).
- Nielsen, T., Maar, M. Effects of a blue mussel Mytilus edulis bed on vertical distribution and composition of the pelagic food web. Mar. Ecol. Prog. Ser. 339, 185-198 (2007).
- De Goeij, J. M., et al. Surviving in a marine desert: the sponge loop retains resources within coral reefs. Science. 342, 108-110 (2013).
- Maldonado, M., Ribes, M., van Duyl, F. C. Nutrient Fluxes Through Sponges. Biology, Budgets, and Ecological Implications. Advances in Marine Biology. 62, (2012).
- Riisgård, H. U. On measurement of filtration rates in bivalves - the stony road to reliable data: review and interpretation. Mar. Ecol. Prog. Ser. 211, 275-291 (2001).
- Reiswig, H. M. Water transport, respiration and energetics of three tropical marine sponges. J. Exp. Mar. Biol. Ecol. 14, 231-249 (1974).
- Jiménez, E., Ribes, M. Sponges as a source of dissolved inorganic nitrogen: nitrification mediated by temperate sponges. Limnol. Oceanogr. 52 (3), 948-958 (2007).
- Diaz, M. C., Ward, B. Sponge-mediated nitrification in tropical benthic communities. Mar. Ecol. Prog. Ser. 156, 97-107 (1997).
- Ribes, M., Coma, R., Gili, J. Natural diet and grazing rate of the temperate sponge Dysidea avara (Demospongiae, Dendroceratida) throughout an annual cycle. Mar. Ecol. Prog. Ser. 176, 179-190 (1999).
- Jiménez, E. Nutrient fluxes in marine sponges: methodology, geographical variability and the role of associated microorganisms. , Universitat Politècnica de Catalunya. Barcelona. PhD thesis (2011).
- Reiswig, H. M. Particle feeding in natural populations of three marine demosponges. Biol. Bull. 141 (3), 568-591 (1971).
- Reiswig, H. M. In situ pumping activities of tropical Demospongiae. Mar. Biol. 9 (1), 38-50 (1971).
- Yahel, G., Marie, D., Genin, A. InEx - a direct in situ method to measure filtration rates, nutrition, and metabolism of active suspension feeders. Limnol. Oceanogr-meth. 3, 46-58 (2005).
- Genin, A., Monismith, S. S. G., Reidenbach, M. A., Yahel, G., Koseff, J. R. Intense benthic grazing of phytoplankton in a coral reef. Limnol. Oceanogr. 54 (2), 938-951 (2009).
- Yahel, G., Whitney, F., Reiswig, H. M., Leys, S. P. In situ feeding and metabolism of glass sponges (Hexactinellida , Porifera) studied in a deep temperate fjord with a remotely operated submersible. Limnol. Oceanogr. 52 (1), 428-440 (2007).
- Wright, S. H., Stephens, G. C. Removal of amino acid during a single passage of water across the gill of marine mussels. J. Exp. Zool. 205, 337-352 (1978).
- Møhlenberg, F., Riisgård, H. U. Efficiency of particle retention in 13 species of suspension feeding bivalves. Ophelia. 17 (2), 239-246 (1978).
- Mueller, B., et al. Natural diet of coral-excavating sponges consists mainly of dissolved organic carbon (DOC). PLoS ONE. 9 (2), e90152 (2014).
- Gasol, J. M., Moran, X. A. G. Effects of filtration on bacterial activity and picoplankton community structure as assessed by flow cytometry. Aquat. Microb. Ecol. 16 (3), 251-264 (1999).
- Koroleff, F. Determination of reactive silicate. New Baltic Manual, Cooperative Research Report Series A. 29, 87-90 (1972).
- Murphy, J., Riley, J. P. A. Modified single solution method for the determination of phosphate in in natural waters. Anal. Chim. Acta. 27, 31-36 (1962).
- Shin, M. B. Colorimetric method for determination of nitrite. Ind.Eng.Chem. 13 (1), 33-35 (1941).
- Wood, E. D., Armstrong, F. A. J., Richards, F. A. Determination of nitrate in sea water by cadmium-copper reduction to nitrite. J. Mar. Biol. Assoc. U. K. 47 (1), 23-31 (1967).
- Sharp, J. H., et al. A preliminary methods comparison for measurement of dissolved organic nitrogen in seawater. Mar. Chem. 78 (4), 171-184 (2002).
- Sharp, J. H. Marine dissolved organic carbon: Are the older values correct. Mar. Chem. 56 (3-4), 265-277 (1997).
- Holmes, R. M., Aminot, A., Kerouel, R., Hooker, B. A., Peterson, B. J. A simple and precise method for measuring ammonium in marine and freshwater ecosystems. Can. J. Fish. Aquat. Sci. 56 (10), 1801-1808 (1999).
- Degobbis, D. On the storage of seawater samples for ammonia determination. Limnol. Oceanogr. 18 (1), 146-150 (1973).
- Tupas, L. M., Popp, B. N., Karl, D. M. Dissolved organic carbon in oligotrophic waters: experiments on sample preservation, storage and analysis. Mar. Chem. 45, 207-216 (1994).
- Yoro, S. C., Panagiotopoulos, C., Sempéré, R. Dissolved organic carbon contamination induced by filters and storage bottles. Water Res. 33 (8), 1956-1959 (1999).
- Zhang, J. Z., Fischer, C. J., Ortner, P. B. Laboratory glassware as a contaminant in silicate analysis of natural water samples. Water Res. 33 (12), 2879-2883 (1999).
- Yoshimura, T. Appropriate bottles for storing seawater samples for dissolved organic phosphorus (DOP) analysis: a step toward the development of DOP reference materials. Limnol. Oceanogr-meth. 11 (4), 239-246 (2013).
- Strickland, J. D. H., Parsons, T. R. A practical handbook of seawater analysis. , Fisheries Research Board of Canada. Ottawa. (1968).
- Eaton, A. D., Grant, V. Freshwater sorption of ammonium by glass frits and filters: implications for analyses of brackish and freshwater. Limnol. Oceanogr. 24 (2), 397-399 (1979).
- Norrman, B. Filtration of water samples for DOC studies. Mar. Chem. 41 (1-3), 239-242 (1993).
- Carlson, C. A., Ducklow, H. W. Growth of bacterioplankton and consumption of dissolved organic carbon in the Sargasso Sea. Aquat. Microb. Ecol. 10 (1), 69-85 (1996).
- Grasshoff, K., Ehrhardt, M., Kremling, K. Methods of Seawater Analysis. Second, Revised and Extended Edition. , (1999).
- Perea-Blázquez, A., Davy, S. K., Bell, J. J. Nutrient utilisation by shallow water temperate sponges in New Zealand. Hydrobiologia. 687 (1), 237-250 (2012).
- Perea-Blázquez, A., Davy, S. K., Bell, J. J. Estimates of particulate organic carbon flowing from the pelagic environment to the benthos through sponge assemblages. PLoS ONE. 7 (1), e29569 (2012).
- Pile, A. J., Patterson, M. R., Witman, J. D. In situ grazing on plankton <10 µm by the boreal sponge Mycale lingua. Mar. Ecol. Prog. Ser. 141, 95-102 (1996).
