Introduction
Benthic Filtrierer spielen eine entscheidende Rolle in der Funktionsweise der marinen Ökosysteme 1. Durch das Filtern von großen Mengen Wasser 2,3, sie zu entfernen und Partikel (Plankton und Geröll) und gelösten Verbindungen 1 (und Referenzen darin) und sind ein wichtiger Agent der Benthos-pelagische Kopplung 4,5 und Nährstoffkreislauf 6,7 ausscheiden. Genau das Partikelmess und gelösten Verbindungen entfernt und durch benthische Filtrierer (wie Schwämme, Seescheiden, Polychaeten und bivalves) ausgeschieden ist von grundlegender Bedeutung, ihre Physiologie, Stoffwechsel zu verstehen und Nahrungsökologie. Zusammen mit Geschwindigkeitsmessungen Pumpen, sondern ermöglicht auch eine Quantifizierung der Nährstoffflüsse durch diese Organismen und ihre ökologischen Auswirkungen auf die Wasserqualität sowie auf Ökosystemebene Prozesse vermittelt.
Die Wahl der geeigneten Methode zur Messung der Entfernung und Produktionsraten von partikulären und gelösten comPfund durch Suspension Filtrierer ist entscheidend für die zuverlässige Daten zu erhalten , die ihre Fraßaktivität 8. Wie durch Riisgård und andere unangemessene Methoden Bias-Ergebnisse darauf hingewiesen, verzerren experimentellen Bedingungen zu falschen Einschätzungen der Einnahme und Ausscheidung bestimmter Stoffe, und von diesen Organismen verarbeitet, um fehlerhafte Quantifizierung der Nährstoffflüsse führen kann.
Die beiden am häufigsten verwendeten Methoden partikulären und gelösten Nährstoffflüsse in Filtrierer beinhalten messen entweder Inkubation (indirekte Techniken) oder simultane Erfassung von Umgebungs- und atmete aus Wasser (direkte Techniken). Die Inkubation Techniken basieren in der Konzentration von partikulären und gelösten Nährstoffen im Wasser inkubiert, die Änderungsrate auf Messen und 8 Produktionsraten oder Entfernung im Vergleich zu angemessenen Kontrollen abzuschätzen. Jedoch kann ein Organismus in einer Inkubationskabine umschließt seine feedin änderng und Pumpverhalten aufgrund von Änderungen in der natürlichen Strömungsbereich aufgrund einer Abnahme der Sauerstoff und / oder in der Nahrungsmittelkonzentration oder aufgrund der Ansammlung von Ausscheidungsverbindungen in der Inkubation 7,9 Wasser (und Referenzen darin). Zusätzlich zu den Auswirkungen der Confinement und modifizierte Wasserversorgung stammt ein großer Vorspannung der Inkubation Techniken aus re Filtrationswirkungen (siehe beispielsweise 10). Obwohl einige dieser methodischen Probleme haben mit der rechten Form und Volumen des Inkubationsgefäßes 11 oder mit der Einführung einer Umlaufglasglocke System in situ 12, diese Technik oft unterschätzt Entfernung und Produktionsraten überwunden. Quantifizieren des Metabolismus von gelösten Verbindungen, wie gelösten organischen Stickstoff (DON) und Kohlenstoff (DOC) oder anorganische Nährstoffe, hat sich als besonders zu sein , anfällig für Verzerrungen verursacht durch Inkubation Techniken 13.
In den späten 60er und frühen 70er Jahre, Henry Reiswig9,14,15 Vorreiter bei der Anwendung der direkten Techniken zur Partikelentfernung von riesigen Karibik Schwämme durch getrenntes Abtasten des Wasser ein- und ausgeatmeten durch die Organismen in situ, zu quantifizieren. Aufgrund der Schwierigkeit Reiswig der Technik , die auf kleinere Filtrierer und in anspruchsvoller Unterwasserbedingungen, der Großteil der Forschung auf diesem Gebiet an das Labor wurde anzuwenden beschränkt (in vitro) 16 meist indirekte Inkubationstechniken einsetzt. Yahel und Kollegen wieder montiert Reiswig direkte in situ - Technik in kleinerem Maßstab Bedingungen zu arbeiten. Ihre Methode, genannt 16 INEX, basiert auf der gleichzeitigen Unterwasserprobenentnahme des Wassers inhaliert (In) und abgeatmet (Ex) durch ungestörte Organismen. Die unterschiedliche Konzentration einer Substanz (zB Bakterien) zwischen einem Paar von Proben (inex) liefert ein Maß für die Retention (oder Produktion) dieses Stoffes durch das Tier. Die INEX Technik verwendet offene Röhren undberuht auf der excurrent Strahl durch die Pumpaktivität des untersuchten Organismus produziert, um das umgebende Wasser in das Sammelrohr passiv ersetzen. Während Yahel und Kollegen diese Technik erfolgreich bei der Untersuchung von mehr als 15 verschiedenen Aussetzung beantragt haben Beschicker Taxa (zB 17), wobei das Verfahren durch das hohe Maß an Übung und Erfahrung erforderlich, von der winzigen Größe einiger excurrent Öffnungen beschränkt ist, und durch Seegang.
Um diese Hindernisse zu überwinden, entwickelten wir eine alternative Technik basiert auf kontrollierten Absaugung des abgetasteten Wasser durch winzige Röhrchen (Außendurchmesser <1,6 mm). Unser Ziel war es, eine einfache, zuverlässige und kostengünstige Vorrichtung zu schaffen , die in situ Wasserentnahme aus einem ganz bestimmten Punkt, wie die excurrent Öffnung benthischer Filtrierer sauber und kontrolliert erlauben würde. Um wirksam zu sein, hat das Verfahren nicht aufdringlich sein, um nicht die Umgebungsströmungsregime zu beeinflussen oder die b ändernehavior der untersuchten Organismen. Das Gerät präsentiert hier wird VACUSIP bezeichnet. Es ist eine Vereinfachung des SIP - System entwickelt von Yahel et al. (2007) 18 für ROV-basierte Punktabtastung in der Tiefsee. Die VACUSIP ist wesentlich billiger als die ursprüngliche SIP und es hat für SCUBA-basierte Arbeit angepasst. Das System wurde nach den Prinzipien entworfen präsentiert und getestet von Wright und Stephens (1978) 19 und Møhlenberg und Riisgård (1978) 20 für Labor - Einstellungen.
Obwohl das VACUSIP System für in - situ - Untersuchungen des Stoffwechsels von benthic Filtrierer entwickelt wurde, kann es auch für Laborstudien verwendet werden , und überall dort , wo eine kontrollierte und saubere, Point-Source - Wasser - Probe erforderlich ist. Das System ist besonders nützlich , wenn die Integration über längere Zeit (min-Stunden) oder in situ Filtrationen erforderlich sind. Die VACUSIP ist seit 2011 erfolgreich am Yahel Labor verwendet, und hat auchwurde in zwei aktuellen Studien von Nährstoffflüsse vermittelt durch Karibik und Mittelmeer Schwammarten 21 (Morganti et al. eingereicht) eingesetzt.
Die Verwendung spezieller Sampler, der verlängerten Abtastdauer, und den Feldbedingungen, in denen VACUSIP angelegt wird, ziehen einige Abweichungen von Standardprotokollen ozeanographischer zum Sammeln, Filtern und Proben für empfindliche Analyte zu speichern. Um das Risiko einer Kontamination durch das VACUSIP System oder das Risiko einer Modifikation des beprobten Wasser durch bakterielle Aktivität nach der Entnahme zu verringern, haben wir getestet , verschiedene in situ Filtration und Lagerungsverfahren. Verschiedene Filtervorrichtungen, Sammelgefäße und Speichern Verfahren wurden untersucht , um die am besten geeignete Technik für die Analyse von gelösten anorganischen (PO 4 3-, NO x -, NH 4 +, SiO 4) zu erreichen , und organische (DOC + DON) Verbindungen und ultra Plankton (<1081; m) und partikulärer organischer (POC + PON) Probenahme. Um weiter das Risiko einer Kontamination zu reduzieren, vor allem unter Freilandbedingungen wurde die Anzahl der Handhabungsschritte auf ein Minimum reduziert. Die visuelle Format, in dem das Verfahren dargestellt ist, ausgerichtet Reproduzierbarkeit zu erleichtern und um die Zeit zu reduzieren, die erforderlich, um effizient die Technik anzuwenden.
Systemübersicht
Zur in situ gepumpte Wasser aus der Suspension Abzweige mit exhalant Öffnungen so klein wie 2 mm, die Pumpaktivität jeder Probe Die Probe wird zuerst durch Lösen gefiltert Fluorescein gefärbt Meerwasser neben der inhalant Öffnung (en) sichtbar gemacht und das Beobachten seiner Strömung von der excurrent Öffnung 16 (siehe auch 2B Abbildung in 18). Das Wasser ein- und ausgeatmeten durch die Studie Probe (angefallenen und excurrent) werden dann mit der Verwendung eines Paares von kleinen Röhren installiert maßgeschneiderte Manipulator oder auf zwei der "ar gleichzeitig abgetastetms "eines upside-down flexible tragbare Stativ (Abbildung 1 und Ergänzungs Video 1). Das Wasser in der Studie Organismus inhaliert wird durch sorgfältiges Positionieren des proximalen Endes eines Rohres innerhalb oder in der Nähe der inhalant Apertur der Studie Organismus gesammelt. Eine identische Rohr dann innerhalb des excurrent Öffnung positioniert ist. Diese Operation gute Pflege erfordert Kontakt oder Störung des Tieres zu vermeiden, beispielsweise durch Sediment Resuspension. das Abtasten zu beginnen, durchsticht ein Taucher ein Septum in den Auffangbehälter mit einer Injektionsnadel auf die anhänge distale Ende jedes Rohrs, so dass der Außenwasserdruck das abgetastete Wasser in den Behälter durch das Entnahmerohr zu zwingen. das Ansaugen durch die Vakuum zuvor in den Fläschchen und durch die Druckdifferenz zwischen dem externen Wasser und dem evakuierten Probenbehälter geschaffen eingeleitet wird .
Um eine saubere Sammlung von ausgeatmeten Wasser gewährleisten und ein versehentliches Absaugen von Ambi zu vermeidenent Wasser 16, muss die Wasser Abtastrate bei einer signifikant niedrigeren Rate (<10%) als die excurrent Flussrate gehalten werden. Die Saugleistung wird durch die Länge des Rohres und dessen Innendurchmesser (ID) gesteuert. Der kleine Innendurchmesser sorgt auch für eine vernachlässigbare Totvolumen (<200 & mgr; l pro Meter Leitung). Probenahme über längere Zeiträume (Minuten bis Stunden) ermöglicht es, die inhärente Lückenhaftigkeit der meisten Substanzen von Interesse zu integrieren. Um sicherzustellen , dass die Proben werden in längeren Unterwasserprobenahme Sitzungen sowie für den Transport zum Labor ausreichend konserviert, eine in situ Filtration wird für empfindliche Analyte empfohlen. Die Auswahl der Stichprobenbehälter, Filtersystem und Schläuche werden durch die Studie Organismen und der spezifischen Fragestellung bestimmt. Das Protokoll weiter unten beschrieben wird davon ausgegangen , dass eine vollständige metabolische Profil von Interesse ist (für eine Übersicht siehe Abbildung 2). Jedoch erlaubt die modulare Natur des Protokolls foder einfache Änderung aufzunehmen einfacher oder sogar sehr unterschiedliche Stichprobenpläne. Für eine vollständige metabolische Profil sollte die Probenahmeprotokoll die folgenden Schritte umfassen: (1) Strömungsvisualisierung; (2) Die Probenahme ultra Plankton Fütterung (Plankton <10 & mgr; m); (3) Die Probenahme anorganische Nährstoffe Aufnahme und Ausscheidung (in-line Filter verwendet wird); (4) Die Probenahme gelösten organischen Aufnahme und Ausscheidung (unter Verwendung von in-line-Filter); (5) Particulate Fütterung und Ausscheidung (unter Verwendung von in-line-Filter); (6) Wiederholen Sie Schritt 2 (Ultra-Plankton Fütterung als Qualitätskontrolle); (7) Visualisierung fließen.
Wenn logistisch machbar, wird empfohlen , dass die metabolische Profilmessungen mit Pumprate kombiniert werden (zB Verfahren der Farbstofffront Geschwindigkeit, in 16) sowie mit der Atmung Messungen. Diese Messungen werden am besten am Anfang und am Ende der Stichprobensitzung genommen. Für die Atmung Messung sind unter Wasser Optodenbasis oder Mikroelektroden bevorzugt.
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Protocol
1. Vorbereitende Schritte und Reinigungsverfahren
- Reinigungslösung
- Schutzausrüstung tragen, einen Laborkittel und Handschuhe zu allen Zeiten. Führen Sie diese vorbereitenden Schritte in einem sauberen Raum frei von Staub und Rauch.
- Bereiten Sie eine 5-10% ige Salzsäure (HCl) -Lösung mit frischen, hochwertigen, doppelt destilliertes Wasser.
- Bereiten Sie eine 5% hochlösliche basische Mischung aus anionische und nichtionische Tensid-Lösung (siehe Materialliste) mit frischen, qualitativ hochwertige, doppelt destilliertes Wasser.
- Speichern Sie alle Lösungen in einem sauberen, mit Säure gewaschen Behälter.
- Vorbereitende Schritte und Reinigungsverfahren (im Labor)
HINWEIS: Wenn Phosphorverbindungen nicht von Interesse sind, kann die HCl Wasch durch hohe Qualität Phosphorsäure (H 3 PO 4) Wäsche (8% H 3 PO 4 Endkonzentration) ersetzt werden.- Schutzausrüstung tragen, einen Laborkittel und Handschuhe zu allen Zeiten.
- Waschendie Entnahmevorrichtung (mit Ausnahme des Edelstahl Swinney Filterhalter in-line) mit reichliche Menge an hochreinem Wasser. Lassen Sie das Gerät in 5-10% HCl-Lösung Einweichen über Nacht. Spülen Sie das Gerät wieder mit reichliche Menge an qualitativ hochwertigen doppelt destilliertem Wasser.
- Waschen Sie die in-line Edelstahl Swinney Filterhalter mit reichliche Menge an hochreinem Wasser. Lassen Sie die Filterhalter in 5% Einweichen hochlösliche basische Mischung aus anionische und nichtionische Tenside Lösung über Nacht. Spülen Sie sie wieder mit ausreichend hoher Qualität doppelt destilliertem Wasser.
- Trocknen Sie alle Probenentnahmegerät, wickeln sie in Alufolie und halten in einem sauberen Kasten bis zur Verwendung.
- Saugvermögen Steuer
- Kontrollieren Sie die Abtastrate durch die Länge und den Innendurchmesser des Einlassrohr Anpassung entsprechend der geplanten Arbeitstiefe und Wassertemperatur. Verwenden Sie die folgende Gleichung (abgeleitet von der Hagen-Poiseuille-Gleichung für voll Entwick verwendetwickelten Strömung laminar Rohr) als Leitfaden:
wobei F = Durchflussrate (cm 3 min -1), AP = Differenzdruck (bar), r = Einlass Innenradius Schlauch (cm), K = 2,417 x 10 -9 (sec -2), L = Rohrlänge (cm ), V = Wasserviskosität (g cm -1 s -1). Siehe Tabelle 1 für weitere Details. - Halten Abtastrate von unter 1% der Pumprate des untersuchten Tieres.
HINWEIS: Die Verwendung evakuierten Behälter, manchmal mit unbekannten Vakuum stellt zusätzliche Komplikationen. Daher wird ein Feldtest sehr zu empfehlen. Bei 10 m Tiefe und ~ 22 ° C Meerwasser (40 PSU), ein 50 cm Einlassrohr mit einem Innendurchmesser von 254 & mgr; m liefert eine durchschnittliche Sauggeschwindigkeit von ~ 26 & mgr; l s -1 (1,56 ml min -1).
- Kontrollieren Sie die Abtastrate durch die Länge und den Innendurchmesser des Einlassrohr Anpassung entsprechend der geplanten Arbeitstiefe und Wassertemperatur. Verwenden Sie die folgende Gleichung (abgeleitet von der Hagen-Poiseuille-Gleichung für voll Entwick verwendetwickelten Strömung laminar Rohr) als Leitfaden:
- Probenahmegefäße
- Für kleine Probenvolumina (20.3 ml, zum Beispiel ultra Plankton für die Strömung cyttrie) verwenden pre-vakuumiert sterilen Plastikröhrchen.
HINWEIS: Pre-vakuumiert sterile Kunststoffröhrchen sind für Standard-Bluttests beim Menschen routinemäßig eingesetzt wird; stellen Sie sicher, die sterilen Röhrchen ohne Zusätze zu verwenden. Diese vakuumiert sterilen Plastikrohre werden am besten mit der Verwendung von sterilen Einwegrohrhalter mit außermittig Luer abgetastet. Während dies die sicherste und effizienteste Entnahmevorrichtung ist, weist sie einen etwas größeren Totvolumen im Vergleich zu einer einfachen Nadel. - Für größere Wasserproben wie Nährstoffe und gelösten organischen Substanzen, verwenden Sie 40 oder 60 ml Glasfläschchen, die die Environmental Protection Agency (EPA) Kriterien für flüchtige organische Analysen treffen. Diese Fläschchen umfassen eine Polypropylenkappe mit einem PTFE-faced Silikonseptum.
- Für eine noch größere Mengen verwenden Penicillin Flaschen mit Gummistopfen oder Vakuumflaschen.
- Verwenden Polyethylen hoher Dichte Vials (HDPE Vials) für Kieselsäureproben.
- Zur Erhöhung der Probenvolumen und das Risiko des Anschlags Verdrängen reduzierenwährend des Aufstiegs, evakuieren (Vakuum) Artikel 1.4.2-1.4.4 vor dem Tauchgang mit einer Vakuumpumpe. Vakuum manuell durch eine Handvakuumpumpe oder sogar durch die Luft mit einer Spritze zu saugen. Doch für die besten Ergebnisse wird eine gute Vakuumpumpe empfohlen. Standard-lyophilizers bietet Hochvakuum.
HINWEIS: Achten Sie besonders auf, wenn große vakuumiert Flaschen mit würde, um sicherzustellen, dass die schnellere anfängliche Saugleistung der ausgeatmeten Wasserproben nicht verunreinigen.
- Für kleine Probenvolumina (20.3 ml, zum Beispiel ultra Plankton für die Strömung cyttrie) verwenden pre-vakuumiert sterilen Plastikröhrchen.
- Vessel Reinigungsverfahren
- Für gelöste organische und NH 4 + Analyse verwenden , um neue vorgereinigte EPA Fläschchen.
- Spülen Sie die Fläschchen (Glas und HDPE) für die Analyse von anderen Nährstoffen wie folgt:
- Spülen Sie die Fläschchen (Glas und HDPE) und die Polypropylen-Kappen mit hoher Qualität doppelt destilliertem Wasser. Installieren Sie einen neuen Silizium-Septum.
- Weichen Sie die Fläschchen (Glas und HDPE) in 10% HCl für mindestens 3 Tage und spülen Sie mit reichlich hoher Qualität doppelt destilliertem Wasser.
- Combust die Glasfläschchen bei 450 ° C für 4 Stunden und erlauben in dem Ofen abkühlen. Die Kappe, und in Alufolie wickeln bis zur Verwendung.
- Filter
- Verwenden bindemittelfreien Glasfaserfilter zur Filtration aller gelösten organischen Proben (zB DOC, DON) und für die Sammlung von partikulären organischen Stoffe ( zum Beispiel POC, PON). Verpacken jedes Glasfilter in einem separaten Aluminiumfolie Umschlag. in einem sauberen und trockenen Behälter bis zur Verwendung combust für 2 Stunden bei 400 ° C organische Rückstände und speichern zu verflüchtigen.
- Verwenden Sie entweder eine bindemittelfreien Glasfaserfilter , wie oben, oder 0,2 um Polycarbonatmembranen für die Probenahme anorganische Nährstoffe (zB PO 4 3-, NO x -, NH 4 +). Reinigen Sie die letztere einmal in den Filterhalter eingebaut, wie unten erläutert (1.7.3).
- Verwenden Sie 0,2 um Polycarbonatmembranen Filter für Kieselsäure Probenahme. Reinigen Sie sie einmal installed in den Filterhalter wie unten erläutert (1.7.3).
- Herstellung von Filtrationsanordnung
- Filtern Sie das hochlösliche basische Mischung aus anionischen und nicht-ionischen Tensid-Lösung und die hohe Qualität bidestilliertem Wasser durch ein 0,2 um Filter vor der Verwendung ihnen die Filtrationsanordnung zu reinigen.
- Filtrationsanordnung nach Nährstoffen und gelösten organischen Stoffe außer Siliciumdioxid:
- Legen Sie ein Bindemittel verbrannt freien Glasfaserfilter im Inneren des gereinigten in-line Edelstahl Swinney Filterhalter.
- Verwenden einer Säure gereinigt Spritze 100 ml 5% hochlösliche basische Mischung aus anionischen und nicht-ionischen Tensid-Lösung und dann 100 ml von hoher Qualität bidestilliertem Wasser durch die gesamte Anordnung auszuführen.
- Filtrationsanordnung für SiO 4:
- Legen Sie das Polycarbonat-Filter im Inneren des gereinigten Polycarbonat Filterhalter (PC Filterhalter).
- Verwenden Sie eine Säure gereinigt Spritze run 30 ml 5% HCl und 30 ml von hoher Qualität bidestilliertem Wasser durch die gesamte Anordnung.
- Systemmontage
- Montieren Sie das System für die Unterwasserarbeiten mit PEEK (Polyetheretherketon) Rohr mit einem Außendurchmesser (OD) von 1,6 mm und einem Innendurchmesser (ID) von 254 & mgr; m oder 177 & mgr; m.
- Mit einem scharfen Messer oder PEEK Schneider die Rohre auf die gewünschte Länge zu schneiden.
- An seinem distalen Ende (Probenbehälterseite), passt jedes Rohr mit einem männlichen Luer-Anschluss an eine Spritzennadel befestigt ist. Stellen Sie sicher, dass Sie den Anweisungen des Herstellers folgen und die flache Seite des blauen flangeless Zwinge mit dem Ende des Rohrs ausrichten, bevor die grüne Mutter anziehen.
- Bringen Sie die PEEK Schlauch an den Stativ "Arme" oder speziell angefertigten Manipulator durch eine isolierende Klebeband.
- Bringen Sie eine Einweg-Spritzennadel mit dem männlichen Luer-Anschluss. Halten Sie die Nadel mit ihrer Schutzkappe Verletzungen zu vermeiden. Offensichtlich beschriften Sie die Probenahmegeräte und Farbcode alle ein- und ausgeatmeten Komponenten (zB grün = In, rot = Ex).
- In ähnlicher Farbcode die Probenahmegefäße mit Sätzen von gepaarte Stichprobengefäße fortlaufend nummeriert.
wobei F = Durchflussrate (cm 3 min -1), AP = Differenzdruck (bar), r = Einlass Innenradius Schlauch (cm), K = 2,417 x 10 -9 (sec -2), L = Rohrlänge (cm ), V = Wasserviskosität (g cm -1 s -1). Siehe Tabelle 1 für weitere Details. 2. Arbeitsunterwasser
- Einsatzort Vorbereitung
- Voruntersuchung und Auswahl von Proben
HINWEIS: Aufgrund der komplexen Natur des Unterwasserprobenahmeprotokoll, die notwendige Zeit für die Vorbereitung widmen wird eine effiziente Probenahme Tauchgang gewährleisten.- Erhebung über die Baustelle und die notwendigen Vorbereitungen vor der Zeit.
- Auswählen und geeignete Zielorganismen markieren, die relativ leicht zugegriffen werden kann. Da nicht unbedingt alle Organismen zum Zeitpunkt der Probenahme Tauchgang aktiv sein kann, mehr Arbeitsplätze vorbereiten, als Sie zu probieren erwarten.
- Die Montage der Grundträger
- When arbeiten an nivelliert Substrat:
- Montieren Sie die Original-Schnellspanner Clip des flexiblen Stativ an 1 kg Tauchgewichte und einfach positionieren es neben dem Zieltier.
- Bei Arbeiten an senkrechten Wänden:
- Berg Basisträgerplatten für die VACUSIP System, Haken für Zubehörausrüstung und Aufhänger für den Auffangbehälter Fach während der Baustelle Vorbereitungsphase Durchführung (2.1.1).
- Wenn flexible tragbare Stative verwendet werden, verwenden Sie Schrauben oder Zweikomponenten-Epoxidharz zu 10x10 cm PVC-Platten neben jedem Zieltier zu beheben. Jede Platte muss ein Loch haben, um die Schnellspanner Clips des flexiblen tragbaren Stativ zu befestigen.
- Sobald das Harz ausgehärtet ist und die Grundplatten sind fest an der Wand befestigt, drehen Sie die Schnellspannklammern, als feste Befestigungspunkt für den flexiblen tragbaren Stativ für die VACUSIP Systems zu ermöglichen.
- When arbeiten an nivelliert Substrat:
- Voruntersuchung und Auswahl von Proben
- Installieren des VaCUSIP
- Prüfen , ob die Probe durch Pumpen filtriert Lösen Fluorescein - Farbstoff neben dem inhalant Öffnung und bestätigen , dass der Farbstoff durch die Ausatmungsluft Öffnung entsteht , wie in Yahel et al. (2005) 16.
- Installieren Sie die VACUSIP Gerät und legen Sie das Inhalat (IN) Probenrohr in der Inhalations-Öffnung oder direkt daneben (innerhalb von ~ 5 mm). Stellen Sie sicher, dass das Inhalations-Rohr nicht in der Nähe eines anderen exhalant Öffnung ist.
- Richten Sie vorsichtig die exhalant (EX) Probenrohr in Richtung der osculum / exhalant Siphon und sehr sanft legen Sie sie in, bis sie 1-5 mm innerhalb des osculum / exhalant Siphon positioniert ist (siehe Abbildung 1 und Ergänzungs Video 1). Nehmen Sie nicht große Sorgfalt in Kontakt zu treten mit oder auf andere Weise das abgetastete Organismus stören.
- Vor und während der Probenahme doppelt überprüfen Sie die Lage der beiden Rohre.
- Nach der Probenahme zu überprüfen, ob die Probe gepumpt wird immer noch als described oben (2.2.1).
Hinweis: Da die Bewegung eines Armes des Stativs, wenn die andere manipulieren können auftreten, stellen Sie sicher, dass das Inhalations-Probenahmeröhrchen, zunächst platzieren und zum anderen die exhalant Röhre, die eine genauere Manipulation erfordert. Im Anschluss an diese Ordnung, auch wenn die Manipulation des exhalant Probenrohr könnte die Bewegung des Inhalations-Röhre verursachen, wird es nicht die Probenahme beeinflussen.
- Modulare Unterwasserprobenahmeverfahren
HINWEIS: Bis auf die Forschungsfrage, jeder der experimentellen Schritte unten kann als Stand-alone-Experiment durchgeführt werden. Der vollständige metabolische Profil Probenahmeprotokoll unten beschrieben ist ein langwieriger Prozess, der bis zu 8 Stunden pro Probe (eine Übersicht siehe Abbildung 2 und Tabelle 2). Als Tauchbedingungen und Regelungen zwischen Probenahmestellen unterscheiden, Regionen und Institutionen, werden Tauchpläne in diesem Protokoll nicht enthalten. Dennoch widmen äußerste Sorgfalt und meticulous Planung zum Tauchplan. Beachten Sie insbesondere die Sättigung und Jojo Tauchprofile zu vermeiden. Wenn möglich, ist es ratsam, diese Experimente in geringer Tiefe zu führen (<10 m). Closed Circuit Rebreather kann für solche längeren Probenahmeverfahren sehr nützlich sein.- Bevor die eigentliche Probenahme beginnt, stellen Sie sicher, dass keine sichtbaren Spuren von Fluorescein Rückstand verbleiben und dass die Schwebstoffe geregelt wurden oder entfernt haben geweht.
- Ultra-Plankton, (kein Filter wird in diesem Schritt installiert!)
- Verwenden Sie die Nadel in die IN (inhalativen) und EX (atmeten) vakuumiert sterilen Plastikröhrchen Septen zu durchbohren. Stellen Sie sicher, dass das Wasser tropft auf die geplante Rate in und 2-6 ml Wasserproben zu sammeln.
- Auf Abruf halten Proben in einem Cold-Box auf dem Eis. Im Labor erhalten mit 1% Paraformaldehyd + 0,05% EM Klasse Glutaraldehyd (Endkonzentration) oder 0,2% EM Grad Glutaraldehyd. Frieren Kryovials in flüssigem Stickstoff und bei -80 &# 176; C bis zur Analyse.
- Silicate Abtasten und Speichern
- Installieren der vorgereinigten in-line rostfreiem PC Filterhalter eine 0,2 um Polycarbonatmembran zwischen der Nadel und dem Luer-Stecker an dem distalen Ende des Rohres enthält.
- Pierce die Septumdeckel der vorgereinigten Polyethylen hoher Dichte Fläschchen (HDPE Fläschchen) Probenahme zu beginnen. Stellen Sie sicher, dass beide Sampler tropft und sammeln 15 ml Wasser in jedem Fläschchen.
- Halten Sie die Proben gekühlt (4 ° C) bis zur Analyse. Wenn die Analyse nicht innerhalb von zwei Wochen, bei -20 ° C beginnen. Für die Analyse, stellen Sie sicher, dass die Proben bei 50 ° C aufgetaut werden mindestens 50 min für Kieselgele aufzulösen.
HINWEIS: Die Membran kann für die Mikroskopie oder DNA-Analyse erhalten werden, je nach Bedarf.
- Gelöster Inorganics (PO 4 3-, NO x -, NH 4 +)
- Ersetzen ter PC-Filteranordnung mit einem vorgereinigten in-line Edelstahlfilterhalter, der eine vorgebrannte Glasfilter enthält.
- Vor der Probenahme, sicherzustellen, daß mindestens 20 ml Meerwasser Proben durch das gesamte Filtersystem geleitet wurden von EPA Verwendung HDPE Phiolen oder anderen Vakuumbehälter die Saugwirkung zu starten. Messen, das Volumen des gesammelten Wassers, bevor sie verworfen werden.
- Pierce die Septumdeckel der entsprechenden Glasfläschchen EPA Sampling zu starten, stellen Sie sicher, dass beide Samplern triefen, und sammeln 25-30 ml für Nitrat und Phosphat-Analyse.
- Wechseln Sie zu neuen EPA-Glasfläschchen für Ammoniak-Analyse, stellen Sie sicher, dass beide Samplern triefen, und sammeln Sie 20 ml in jedem Fläschchen.
- Halten Sie die Proben in einem Cold-Box auf Eis und bei -20 ° C bis zur Analyse.
HINWEIS: Wenn nur das Filtrat von Interesse ist, können Einwegspritzenfilter für die Schritte 2.3.3 und 2.3.4 verwendet werden.
- Gelöste organische Stoffe (DOC + DON) Probenahme und storing
HINWEIS: Bewahren Sie die Proben so aufrecht wie möglich über Handhabung, so dass Probenwasser kommt nicht mit dem Silizium-Septen in Kontakt.- Weiterhin die Edelstahlfilteranordnung verwenden und sammeln 20 ml Meerwasser Proben in neue EPA Glasfläschchen, wie oben beschrieben.
- Nach dem Abrufen halten die Proben in einem Cold-Box auf dem Eis. Im Labor verwenden, um eine vorge verbrannt Glas Pasteur Pipette die Proben mit Orthophosphorsäure (fügen Sie 5-6 Tropfen von 25% Spurenmetallmittelsäure in einen 20-ml-Probe, Endkonzentration 0,04%) oder Salzsäure (2 Tropfen zu beheben Grad konzentrierte Säure in einen 20-ml-Probe, Endkonzentration 0,1%) von Spurenmetallen und im Kühlschrank aufbewahren.
- Halten Sie die Proben gekühlt (4 ° C) bis zur Analyse. Werden die Proben nicht innerhalb einer Woche nach der Sammlung, Lagerung bei -20 ° C bis zur Analyse analysiert.
- Partikulärer organischer Materie (POC, PON, POP)
- Weiter die M anschlagenainless Stahlfilteranordnung und Filter mindestens 500 ml Meerwasser in einem evakuierten 250 ml Vakuumflasche. Ersetzen Kolben, wenn nötig.
- Auf Abruf, verwenden Sie einen mit Luft gefüllten Spritze alle verbleibenden Meerwasser aus dem Filterhalter zu evakuieren, wickeln Sie es in Alufolie, und speichern Sie in einer Kühlbox auf dem Eis. Im Labor, entfernen Sie die Filter aus dem Filterhalter und bei -20 ° C bis zur Analyse.
- Bevor die eigentliche Probenahme beginnt, stellen Sie sicher, dass keine sichtbaren Spuren von Fluorescein Rückstand verbleiben und dass die Schwebstoffe geregelt wurden oder entfernt haben geweht.
Abbildung 1. Ein Beispiel für korrekte Installationen des VACUSIP: (A) Abtasten des ascidian Polycarpa mytiligera (Golf von Aqaba, Rotes Meer) , um eine maßgeschneiderte Manipulator mit dem Farbcode verwendet , grün für inhaliert und Gelb für atmeten Wasserproben (Foto mit von Tom Shelizenger und Yuval Yacobi); (B) Abtasten der Schwamm Agelas oroides (NW MittelmeerMeer) mit einer osculum Breite von 3 mm, die VACUSIP Gerät. Der Farbcode verwendet wird , ist gelb für inhalative und rot für atmeten Wasserproben. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Überblick über die VACUSIP Technik im Protokoll Abschnitt beschrieben. Die Arbeit im Labor in gelben Kästen dargestellt wird, wird die Feldarbeit in blauen Kästchen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Tabelle 1. Die gesamte durchschnittliche Abtastraten (ml min -1) mit verschiedenen Behältern erhaltenfür Wasseransammlungen und unterschiedlichen Vakuumniveaus verwendet: die Kolben nicht gesaugt wurden (keine); EPA-Glasfläschchen und HDPE Fläschchen wurden die Hälfte ihres Volumens unter Vakuum (½ Volumen); sterilen Plastikröhrchen wurden bereits vom Hersteller vakuumiert. Arbeiten bei 5-8 m Tiefe, Wassertemperatur von 18-22 ° C, PEEK Rohre von 79 cm Länge mit und von 25 & mgr; m Innendurchmesser.
Tabelle 2 Übersicht der Probenbehälter, Fixiermittel, in-line - Filteranordnung, die Lagerung und Analyseverfahren in dem Protokoll beschrieben. Die untersuchten Verbindungen sind: ultra-Planktonfluss (Plankton <10 um), Silicat (SiO 4), Phosphat (PO 4 3-), Nitrit + Nitrat (NO 2 - + NO 3 -), gelöste organische Materie (DOM), Ammonium (NH 4 +) und partikulären organischen Substanz(POM). Alle Stichprobengefäße haben Kappe Silizium Septum und sind vor der Probenahme vakuumiert. Die Fixiermittel sind: Paraformaldehyd + Glutaraldehyd (Glut + Parafor), Orthophosphorsäure (H 3 PO 4) und Salzsäure (HCl). Die In-line-Filteranordnungen verwendet werden: Polycarbonat-Filterhalter und Polycarbonatmembran 0,2 um Filter (PC Filterhalter + PC-Membran) und Edelstahl-Filterhalter und bindemittelfreien Glasfaserfilter GFF.
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Representative Results
Optimierung von Meerwasser Erhebungsmethoden
Die Auswahl der Sammler Fläschchen und Reinigungsverfahren
VACUSIP-kompatible Auffanggefäße sollte ein Septum, die Probenahme eingeleitet werden können, indem sie mit einer Spritzennadel Piercing. Sie sollten die erhöhten Unterwasserdruck (2-3 bar bei typischen Taucharbeitstiefen) standhalten, und sollte ein Vakuum zu halten. Viele (aber nicht alle Marken) von Fläschchen von der EPA für die Analyse von flüchtigen organischen Stoffen diese Kriterien erfüllen, genehmigt. Vorgereinigte Vials für DOC und DON-Analyse zugelassen sind ebenfalls erhältlich. Um die Eignung dieser Fläschchen für die Sammlung und Analyse von Nährstoffen testen und Reinigungsverfahren, hohe Qualität doppelt destilliertem Wasser optimieren in Säure gereinigt Polypropylen-Röhrchen (PP Röhrchen) gesammelt wurde, neu erworben haben, in eincid reinigten Polyethylen hoher Dichte Fläschchen (HDPE Fläschchen) und in der EPA-Glasfläschchen, die alle mit einem Polytetrafluorethylen (PTFE) Septumdeckel ausgestattet. Die HDPE-Vials und Polypropylenröhrchen wurden wie in Abschnitt 1.5.2 oben beschrieben gereinigt, und die EPA-Glasfläschchen wurden vom Hersteller gereinigt.
Die Menge an NH 4 + in EPA Glasfläschchen gefunden war relativ gering (≤ 0,1 & mgr; mol L -1) und hängt von der hohen Qualität doppelt destilliertem Wasser Standardqualität. Im Gegensatz dazu, NH 4 + Konzentrationen (bis zu 3 und 7 - fache, beziehungsweise) signifikant erhöht und zeigte eine höhere Variabilität in Säure gereinigt Polypropylenröhrchen und in Polyethylen hoher Dichte Vials (ANOVA F (5,53) = 7,183, p < 0,001, Abbildung 3). Es gab keine Wirkung von hoher Qualität doppelt destilliertem Wasser Kontakt mit dem Silizium-Septum auf der Ammonium-Analyse.
Vergleich von neuen Glasfläschchen im Vergleich zu reinigen / recycelten Glasfläschchen
Um zu testen , ob EPA Glasphiolen für die Nährstoffanalyse mehr als einmal verwendet werden könnte, die NO x -, PO 4 3-, und NH 4 + Konzentrationen im Meerwasser - Proben in neuen EPA - Glasfläschchen gesammelt wurden im Vergleich zu denen in gebrauchten EPA Glasfläschchen gesammelt. Die neuen EPA-Glasfläschchen wurden vom Hersteller vorgereinigt, und das recycelte Glasfläschchen gereinigt wurden wie oben (1.5.2) beschrieben. Recycelte Fläschchen hatten signifikant höhere NH 4 + Konzentration, bis zu 1,5 das Niveau in neue Glasfläschchen (t - Test, p <0,001, n = 5) gefunden falten. Wurden keine signifikanten Unterschiede in der NO x gefunden - und PO 4 3- Inhalt zwischen den in recycelten Fläschchen gesammelten Proben und die in neuen Glas gesammelten ProbenFläschchen (Abbildung 4).
Silicate Sammlung und Speicherung von Prozeduren
Um die beste Probenbehälter für die Analyse von Silicat, Qualität bidestilliertem Wasser bestimmen, wurde nicht gereinigt und in Säure gereinigt Polypropylenröhrchen (PP Röhrchen), in Säurereinigten Polyethylen hoher Dichte Vials (HDPE Vials) gesammelt und in EPA Glasfläschchen. Die erwartete Konzentration an Silicat war nahe Null, so Werte, die sich aus der erwarteten Konzentration abgelenkt wurden kontaminiert betrachtet. Die Silikatkonzentration zwischen den Proben gesammelt in den verschiedenen Fläschchen (ANOVA, F (3,19) = 210,047, p <0,001), welche die niedrigsten SiO 4 - Konzentration in den säure gereinigt HDPE Fläschchen deutlich unterschied. Borosilikat - Glasfläschchen , die Proben kontaminiert ist , mit der endgültige SiO 4 zunehmender Konzentration von bis zu 7 & mgr; molL -1 (Abbildung 5).
Die Auswahl der Filtervorrichtung für gelösten organischen Stoffen (DOM) und Nährstoffanalysen
Um herauszufinden , welches Filtergerät die niedrigste Leer in der Analyse des gelösten organischen (DOC und DON) und anorganische Nährstoffe produziert (NO x -, NH 4 +, PO 4 3-), Edelstahl - Filterhalter wurden im Vergleich zu Polycarbonat in-line Swinney Filterhalter. Mit jedem Filterhalter Typ testeten wir sowohl Polycarbonatmembran und vorge verbrannt Glasfaserfilter. Die Kombination aus Edelstahl Filterhalter und verbrannt Glasfaserfilter vorgesehen, um die niedrigsten Rohlinge, während das Polycarbonat Swinney Filterhalter mit Polycarbonatmembran ausgestattet klar die Proben kontaminiert um bis zu 9-fach. die Waschvolumina Erhöhung tat nicht lösen dieses Problem (Abbildung 6).
Abbildung 3. Ammonium - Konzentration (& mgr; mol L -1, durchschnittliche SD ±) gesammelt mit verschiedenen Fläschchen: (1) Unger HDPE Fläschchen; (2) Gereinigt HDPE Fläschchen; (3) Gereinigt HDPE Fläschchen + Parafilm; (4) EPA-Glasgefäß; (5) EPA Glasfläschchen + Parafilm; (6) Gereinigt PP-Leitung. Der Parafilm wurde gelegt zu testen, ob das Silizium Septum die Wasserproben kontaminieren können. Für jede Behandlung 9 Proben von hoher Qualität doppelt destilliertem Wasser wurden analysiert. Die Proben wurden frisch analysiert. Signifikante Unterschiede wurden zwischen den vier Probenahmegefäße (ANOVA, F (5,53) = 7,183, p <0,001, Power - Test = 0,992). Gefunden Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. Ammonium (NH 4 +), Nitrit Nitrat + (NOx -) und Phosphat (PO 4 3-) Konzentrationen (& mgr; mol L -1, Durchschnitt ± SD) von Meerwasser Proben in neuen (dunkel) gesammelt und recycelt / gereinigt (weiß) EPA Glasfläschchen. Meerwasser wurde an der Experimental Aquaria Zone des Instituts für Meereswissenschaften gesammelt und mit Edelstahl-Filterhalter und Glasfilter gefiltert. Die Wasserproben wurden frisch analysiert. Der Stern (*) zeigt an, dass der Unterschied signifikant (t - Test, p <0,001, n = 5, Power - Test = 1). Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Abbildung 5. Silicat - Konzentration (& mgr; mol L -1, Mittelwert ± SD) in hoher Qualität doppelt destilliertem Wasser in verschiedenen Fläschchen gesammelt: säure gereinigt PP Röhrchen, PP Rohre, säure gereinigt HDPE Fläschchen, neue EPA-Glasfläschchen. Signifikante Unterschiede wurden zwischen den vier Sampler Materialien gefunden (ANOVA, F (3,19) = 210,047, p <0,001, Power - Test = 1). Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 6. die Wirkung verschiedener Filteranordnungen untersuchen und Waschvolumina auf Nitrit + Nitrat (NO x - & mgr; mol L -1). Die Proben für die NO x - wurden durch Filtern der Meerwasser Proben mit Edelstahl (SS f erhaltenilter Halter) oder Polycarbonat in-line Swinney Filterhalter (PC Filterhalter), ausgestattet mit entweder einer Polycarbonatmembran (PC-Filter) oder eine vorge verbrannt Glasfaserfilter. Für die PC-Filter, verschiedene Volumina (10, 30, 60, 90 und 120 ml) 5% HCl und hohe Qualität bidestilliertem Wasser wurden zum Waschen des Filteranordnung verwendet wird, wird das Waschvolumen in Klammern in der Figurenlegende angegeben. Die Werte sind als Mittelwert ± Standardabweichung ausgedrückt (n = 5). Meerwasser wurde an der Experimental Aquaria Zone des Instituts für Meereswissenschaften gesammelt und die Proben wurden frisch nach der Filtration analysiert. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 7. Beispiel von experimentellen Ergebnissen: inhaliert (IN, schwarzKreis) und abgeatmet (EX, rotes Dreieck) gepaart Wasserprobe Konzentrationen (& mgr; mol L -1) verschiedener Substanzen durch den Schwamm verarbeitet Chondrosia reniformis im Mittelmeer: (A) Ammonium (NH 4 +); (B) Nitrit + Nitrat (NOx -); (C) Phosphat (PO 4 3-); (D) Silikat (SiO 4); (E) gelöstem organischen Kohlenstoff (DOC); (F) gelösten organischen Stickstoff (DON); (G) planktonischen organischen Kohlenstoff (LPOC); (H) planktonischen organischen Stickstoff (LPON). Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 8. Ein Beispiel eines Strömungs cytometry Analyse der gekoppelten Wasserproben aus dem inhalierten Wasser gezogen (A, C, E, G) und abgeatmet (B, D, F, H) durch den Schwamm Chondrosia reniformis: (A, B, C, D) Phytoplanktonpopulationen; (E, F, G, H) heterotrophen Bakterien. In AB und EF war die Probenahme sauber und präzise (alle planktonischen Gruppen wurden effizient zurückgehalten). CD und GH sind Beispiele für ausgeatmeten Wasserverschmutzung, geringe Entfernung aller planktonischen Gruppen zeigt. Syn. Synechococcus sp, pico: autotrophen picoeukariotes, nano: autotrophen nanoeukaryotes, hoch: heterotrophen Bakterien mit hohem DNA - Gehalt niedrig. Heterotrophen Bakterien mit niedrigen DNA - Gehalt Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Ergänzende Figure 1. Zellrückhalteeffizienz verschiedener Plankton Beute durch die Muschel Chama Pacifica: Prochlorococcus sp. (Pro), sp Synechococcus. (Syn), pico-Eukaryoten (Pico Eukanuba), Nano-Eukaryoten (Nano Eukanuba). Die Fehlerbalken = 95% CI. Bitte klicken Sie hier , um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Video 1. Die Probenahme der ascidian Polycarpa mytiligera ein custom-built - Manipulator mit dem Farbcode mit grün für atmeten Wasserproben zur inhalativen und Gelb verwendet. Probenahmeröhrchen (PEEK, ID 54 & mgr; m, 75 cm lang) in den exhalant und Inhalations-Siphons des ascidian sorgfältig platziert. Wasser wird als in evakuierten Röhrchen gezogen mit einer Rate von ~ 1 ml min -1. In dieser Demonstration wird Fluoreszeinfarbstoff verwendet, um die exhalant Strahl sichtbar zu machen. Beachten Sie, dass die exhalant Probenahmeröhrchen gut wi platziertdünn die exhalant Strahl. Bitte hier klicken , um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Vorbereitende Schritte
Collector Fläschchen für DOM und Nährstoffanalysen
Da Kollektor Gefäße können mit gelösten Mikrokomponenten interagieren und die Sampler Wände 30-34, verschiedene Fläschchen für DOM und Nährstoff Sammlung wurden getestet kann ein Substrat für das Wachstum von Bakterien. Borosilikat ist nicht für die Kieselsäure Quantifizierung empfohlen 33,35, da Glasflaschen die anfängliche Konzentration an Kieselsäure erhöhen um bis zu zweifach , wenn die Proben nicht schnell 30 eingefroren. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Verwendung von vorgereinigten EPA Fläschchen führt in geringer Konzentration Rohlinge für DOC, DON und anorganische Nährstoffe, vor allem für Ammonium.
DOC Filtration und Lagerung
Filtration ist ein erforderliches und in vielen Fällen ist die erste Analyseschritt in Meereschemie undMikrobiologie. Während es möglich ist , die Proben nach der Entnahme im Labor zu filtern, ist dieses Verfahren nicht für in - situ - Arbeit zu empfehlen, in denen Proben unter Wasser gesammelt werden, oft in abgelegenen Orten, Stunden oder Tage weg von richtigen Laboreinrichtungen. Die Verwendung von in-line, in situ Filtration minimiert Handhabungs Probe und verringert somit das Risiko einer Kontamination. In situ Filtration entfernt auch die meisten Bakterien und reduziert das Risiko , dass die Probenzusammensetzung wird durch Bakterienstoffwechsel während der verlängerten Probenahme- und Transport verändert werden Zeit. Die Filtrationsanordnung erhöht das Totvolumen der Entnahmevorrichtung und auch eine Kontaminationsquelle sein kann. Eine Auswahl der kleinsten möglichen Filterhalter (zB in-line Swinney Filterhalter 13 mm) und Minute PEEK - Schlauch (zB 254 um ID) reduziert das Totvolumen und das Risiko einer Kontamination durch Umgebungswasser.
Wenn der richtige Filter nichtverwendet , oder wenn es nicht sorgfältig gewaschen, Artefakte und eine Verunreinigung der Wasserproben sind wahrscheinlich 32,36-39 auftreten. Studium der DOC - Analyse zeigte , dass die Filter und Filterhalter aus organischen Verbindungen (Polycarbonat und PFA-PTFE) in schweren DOC Kontamination 32,37 führen kann, vor allem , wenn sie nicht gründlich mit hoher Qualität doppelt destilliertem Wasser 38 gespült. Das vorliegende Protokoll und Ergebnisse folgen Sie diesen Richtlinien und zeigen auch, dass Polycarbonat-Filterhalter sollte vermieden werden.
In - situ - Arbeit und das Zusammenspiel
Das VACUSIP System ist eine direkte Sampling-Technik, die die Untersuchung des Stoffwechsels von ungestörten Filtrierer in ihrer natürlichen Umgebung und die Quantifizierung ihrer ökologischen Rolle im System erleichtert. Für erfahrene Taucher und ausgestattet, ist die Anwendung des VACUSIP Methode ist einfach und erfordert nur kurze training. Inex VACUSIP Experimente sind für eine "within'-Design statistischen Analyse (dh gepaart oder wiederholte Maßnahme Analyse) ausgelegt, also für die meisten analytischen Artefakte einschließlich High - Rohlinge zu steuern. Die Verwendung der kontrollierten Absaugung sorgt für langsame und einstellbare Abtastraten, damit zufällige Verunreinigung des ausgeatmeten Wasser mit Umgebungswasser zu verhindern. Wo es möglich ist, die Auswahl an Arbeitsstellen mit geringer Strom und niedrige Trübung wird empfohlen und wird sauberer und genaue Ergebnisse zu gewährleisten. Die verlängerte Abtastzeit (Minuten bis Stunden) ermöglicht die Integration des hohen Lückenhaftigkeit, die die Bodengrenzschicht charakterisiert. All diese Eigenschaften gewährleisten, dass bei vorschriftsmäßiger VACUSIP Methode angewendet sehr robust ist, zuverlässige und reproduzierbare Ergebnisse selbst bei einer geringen Anzahl von Wiederholungen zu arbeiten. Ein Beispiel für eine typische Ergebnisse aus einem mediterranen Schwamm erhalten und Indo-Pazifik Muschelarten ist in Abbildung 7 und Supplemen gezeigtTary 1.
Wie bei jeder Technik ist die VACUSIP von möglichen Gefahren nicht frei. Das häufigste Problem ist die Verunreinigung der ausgeatmeten Wasserprobe mit Umgebungswasser. Gründe für diese Artefakte sind die hohe Saugleistung, Rohr Dislokationen, und das Verhalten der Tiere. Die richtige Auswahl der richtigen Abtastrate ist abhängig von früheren Schätzungen des excurrent Flussrate. Solche Schätzungen können unter Verwendung der Farbstofffront Geschwindigkeit Verfahren 16 erhalten werden. Idealerweise sollte die Ansaugrate unter 1% der Pumpgeschwindigkeit gehalten werden (beispielsweise 1 ml min -1 für einen 6 L h -1 Pumprate). Um eine Kontamination mit Umgebungswasser zu vermeiden, sollte Abtastrate nie größer sein als 10% der Pumprate.
Zur Steuerung der Abtastrate, sollte die Länge und der Innendurchmesser des Einlaßrohrleitung eingestellt werden entsprechend der geplanten Arbeitstiefe und Wassertemperatur. Die Hagen-Poiseuille-Gleichung (siehe Abschnitt 1.3.1) kann als Leitfaden verwendet werden. Allerdings sollte diese Gleichung als erster Näherung, da & Delta; P und Abtastrate Abnahme mit Abtastzeit und in-line in Betracht gezogen werden Filtration fügt Unsicherheiten. Die Verwendung von evakuierten Behälter, manchmal mit unbekannten Vakuumdruck führt zu weiteren Komplikationen. Ein Beispiel, wie Abtastraten variiert in Abhängigkeit von verschiedenen evakuierten Behälter mit unterschiedlichen Vakuum wird in Tabelle 1 gezeigt.
Die Reduzierung der Sampling-Rate wird leicht erreicht, indem die Rohrlänge und ID-Einstellung ohne technische Einschränkungen dieser Reduktion (Abtastraten von wenigen Mikrolitern pro Stunde sind möglich). Trotzdem sollte Experimentatoren der langsamen Abtastrate von dieser Einschränkung nicht für Tiere, die mit langsamen Pumpgeschwindigkeit und für kleine Organismen oder Proben diktiert bewusst sein. Die unmittelbare Auswirkung der langsamen Abtastrate ist die begrenzte Wassermenge, die während einer einzigen Abtastung sessi gesammelt werden könnenauf. Diese geringe Volumen wird die Anzahl der Analysen und Replikate begrenzen, die mit diesen Proben durchgeführt werden kann, und somit auch die Informationen zu begrenzen, die von diesen Populationen erhalten werden kann.
Rohr dislodgement werden kann leicht zu erkennen und kann die Abtastung abgebrochen oder neu gestartet werden, vorausgesetzt, dass ein Taucher ständige Beobachtung hält. Im Gegensatz dazu Beendigung des Pumpens während der Probenahme ist nicht immer leicht zu erkennen. Das gilt nicht nur für Schwämme, sondern auch für Tunikata, Muscheln und Polychaeten. In der Tat, im Gegensatz zum allgemeinen Glauben, Ereignisse, bei denen ein ascidian oder ein zweischaliger Pumpen gestoppt wurden, ohne sichtbare Veränderung der Siphon Geometrie (Yahel, nicht veröffentlichte Daten) dokumentiert. Ferner wird in einigen Fällen kann Tunikata ohne Mesh-Sekretion aktives Pumpen halten (das heißt, ist keine Filtration stattfindet).
die Abtastrate zu steuern ist kritisch. In dieser Hinsicht ist die VACUSIP besser als andere Verfahren, insbesondere wenn die Versuchstiere sind Relatively klein oder wenn sie die Pumpe langsam. Spritzen sind besonders schwierig zu 2 steuern. Zum Beispiel Perea-Blázquez und Kollegen (2012a) 40 verwendet , um eine Spritze , um das Wasser von mehreren gemäßigten Schwammarten ausgeatmeten Probe und überraschend keine allgemeine Muster der Einnahme / Ausscheidung von bestimmten Nährstoffen (NO 2 gefunden haben -, NO 3 -, NH 4 +, PO 4 3-, SiO 4). Das Fehlen einer klaren Muster ist wahrscheinlich eine Folge der Verunreinigung der ausgeatmeten Proben mit Umgebungswasser aufgrund Spritze Verwendung. Eine Verunreinigung ergibt sich aus der extrem niedrigen Rückhalteeffizienz von pico Plankton berichtet von Perea-Blázquez und Kollegen (2012b) 41 für ihre Schwämme: 40 ± 14% der heterotrophen Bakterien und 54 ± 18% der Synechococcus sp. Zum Vergleich mit der VACUSIP, Mueller et al. (2014) 21 berichtete über eine Reinigungsleistung von heterotrophen Bakterien72 ± 15% in Siphonodictyon sp. und 87 ± 10% in Cliona delitrix.
unter Verwendung der Durchflusszytometrie, um Probenqualität zu überprüfen und sicherzustellen, dass keine Kontamination des umgebenden Wassers auftritt, wird dringend empfohlen, zunächst die pico und Nanoplanktonproben analysieren. Dieser schnelle, zuverlässige und billige Analyse sofortige Information der Probenqualität. Es ist für einige Beute Taxa wie Synechococcus sp sehr verbreitet. werden in der Nähe von 90% Wirkungsgrad 14,42 durch Schwämme und ascidian entfernt. Wesentliche Abweichungen von der Benchmark deuten darauf hin , dass die Kontamination aufgetreten sind (Abbildung 8).
Für eine sichere und saubere Probenahme, stellen Sie sicher, dass die Versuchsplanung erfüllt sieben einfachen Regeln: (1) eine Voruntersuchung durchzuführen (einschließlich Ratenschätzungen Pumpen) und die Einschlags gut vorbereiten; (2) kennen die untersuchten Tiere; (3) überprüfen, ob die untersuchten Probe hat eine gut definierte excurrent Öffnung einnd zugänglichen Ort; (4) überprüfen, ob die untersuchten Probe vor und nach jeder Probenentnahme pumpt; (5) wird das Reagenzglas für die Sammlung des ausgeatmeten Wasser leicht in der excurrent Öffnung (Abbildung 1); (6) verwenden Abtastrate <10% der excurrent Flussrate von 1% ist sehr zu empfehlen; (7) ein Qualitätskriterium zu definieren und im Verdacht auslassen Inex-Paare.
Im Anschluss an diese einfachen Regeln bietet das VACUSIP System eine praktische und zuverlässige Methode zur Messung, wie aktive Filtrierer Prozess partikulären und gelösten Verbindungen in die natürlichen Gegebenheiten, so dass eine genaue und vergleichbare Schätzungen, die die funktionelle Rolle der Filtrierer verwendet werden kann in verschiedenen Ökosystemen zu bewerten um die Welt.
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Acknowledgments
Wir danken Manel Bolivar für seine Unterstützung bei der Feldarbeit. Wir sind dankbar, dass der "Parc Natural del Montgrí, les Illes Medes i el Baix Ter" für ihre Unterstützung unserer Forschungs- und Sampling-Berechtigungen. Die Unterwasser-Manipulator wurde von Ayelet Dadon-Pilosof entworfen und hergestellt von Herrn Pilosof. Diese Arbeit wurde von der spanischen Regierung Projekt CSI-Coral [Gewährungsnummer CGL2013-43106-R RC und MR] und durch eine FPU Stipendium "Ministerio de Educación, Cultura y Deporte (MECD)" auf TM unterstützt. Dies ist ein Beitrag aus dem Marine Biogeochemie und Global Change Forschungsgruppe von der katalanischen Regierung [Grant-Nummer 2014SGR1029] und ISF Zuschuss 1280/13 und BSF Zuschuss 2.012.089 G. Yahel finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GorillaPod, Original | Joby | GP000001 | flexible portable tripod |
| Flangeless Ferrule | IDEX Health & Science | P-200X | 1/16" in Blue/pk |
| Male Nut | IDEX Health & Science | P-205X | 1/16" in Green/10 pk |
| Female to Female Luer | IDEX Health & Science | P-658 | |
| Female-Male Luer | IDEX Health & Science | P-655 | |
| Peek Tubing (254 µm ID) | IDEX Health & Science | 1531 | 1/16" OD x 0.01 in ID x 5 ft length. Alternative ID can be used. |
| Two component resin epoxy | IVEGOR | 9257 | Mix well the two component resin before use |
| (TOC) EPA Vials | Cole -Parmer | 03756-20 | 40 ml glass vials. Manufactured also by Thomas Scientific (ref. number 9711F09). |
| HDPE Vials | Wheaton | 986701 (E78620) | 20 ml high-density polyethylene vials |
| Vacuette Z no additive | Greiner bio-one | 455001 | pre-vacuum by the manufacturer |
| Septum Sample Bottles | Thomas Scientific | 1755C01 | 250 ml glass bottles |
| Septum Cap 1 | Wheaton | W240844SP (E7865R) | 22-400 for HDPE vials |
| Septum Cap 2 | Wheaton | W240846 (1078-5553) | 24-400 for glass vials and bottles. Also manufactured by Thermo Scientific National (ref. 03-377-42). |
| In-line stainless steel Swinney Filter holders | Pall | 516-9067 | 13 mm of diameter |
| PTFE Seal Washer | Pall | 516-8064 | ring for stainless steel filter holders |
| TCLP Glass Filters | Pall | 516-9126 | binder-free glass fiber filters, 13 mm of diameter, pore size 0.7 µm |
| Polycarbonate Filter Holders | Cole -Parmer | 17295 | 13 mm of diameter |
| Isopore Membrane Filters | Millipore | GTTP01300 | 13 mm of diameter, pore size 0.2 µm |
| Contrad 70 Solution | Decon Labs | 1002 | highly soluble basic mix of anionic and non-ionic surfactant solution |
| Sterile Syringe Filters | VWR International Eurolab S.L. | 514-0061P | 25 mm of diameter , pore size 0.2 µm |
| Fluorescein | Sigma-Aldrich | (old ref.28802) 46955-100G | 100 g |
| Holdex, disposable,sterile | Greiner bio-one | 450263 | sterile, single-use tube holder with off-center luer for Vacuette |
| Sterile Needles | IcoGammaPlus | 5160 | 0.7 mm x 30 mm |
| Cryovials Nalgene | Nalgene | V5007(Cat. No.5000-0020) | 2 ml |
| Cryobox carton | Rubilabor | M-600 | 145x145x55 mm p/microtube 1.5 ml |
| Orthophosphoric Acid | Sigma | 79617 or Alternatively use Ultra-Pure Hydrochloric acid, final concertation 0.1% | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | 500 g |
| Glutaraldehyde | Merck | 8,206,031,000 | 25%, 1 L |
| Hand Vacuum Pump | Bürkle | 5620-2181 or Alternatively use standard laboratory vacuum pump |
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