Introduction
Bentiska suspensionsätare spelar viktiga roller i funktion marina ekosystem 1. Genom att filtrera stora mängder vatten 2,3, de tar bort och utsöndrar partiklar (plankton och smuts) och lösta föreningarna 1 (och referenser däri) och är en viktig agent för bentiska-pelagiska koppling 4,5 och närings cykling 6,7. Noggrant mäta partikel och lösta föreningar avlägsnas och utsöndras av botten suspensionsätare (t.ex. svampar, sjöpungar, havsborstmaskar och musslor) är grundläggande för att förstå deras fysiologi, metabolism och utfodring ekologi. Tillsammans med pump mätningar ränta gör det också en kvantifiering av näringsflödena förmedlade av dessa organismer och deras ekologiska påverkan på vattenkvaliteten samt ekosystem skala processer.
Att välja en lämplig metod för att mäta borttagning och produktionstakten av partiklar och upplösta compounds per upphängnings filtrerare är avgörande för att erhålla tillförlitliga uppgifter om sin näring 8. Som påpekats av Riisgård och andra olämpliga metoder partiskhet resultat, snedvrider experimentella betingelser, ge felaktiga uppskattningar av intag och utsöndring av vissa ämnen, och kan leda till felaktig kvantifiering av näringsflödena behandlas av dessa organismer.
De två vanligaste använda metoderna för att mäta partiklar och lösta näringsämnen flöden i filtrerare involverar antingen inkubation (indirekta tekniker) eller samtidig insamling av omgivande och utandad vatten (direkta tekniker). Inkubationstider tekniker bygger på mätning av graden av förändring i koncentrationen av partiklar och lösta näringsämnen i det inkuberade vatten, och uppskatta produktionshastigheter eller avlägsnande jämfört med adekvata kontroller 8. Däremot kan innesluter en organism i en inkubation kammare ändra sitt inmatningszong och pumpa beteende på grund av förändringar i det naturliga systemet flödet, på grund av en nedgång i syre och / eller i livsmedel koncentration, eller på grund av ansamling av utsöndring föreningar i inkubation vatten 7,9 (och referenser däri). Förutom effekterna av instängdhet och ändrat vattenförsörjning, en större förspänning inkubation teknik härrör från re-filtreringseffekter (se t ex 10). Även om vissa av dessa metodologiska problem har övervunnits genom att använda rätt volym och form av inkubationskärlet 11 eller med införandet av en återcirkulerande klock behållarsystemet in situ 12, underskattar denna teknik ofta borttagning och produktionshastigheter. Kvantifiering av metabolismen av upplösta föreningar såsom löst organiskt kväve (DON) och kol (DOC) eller oorganiska näringsämnen, har visat sig vara särskilt benägna att skevheter orsakade av inkubationstider tekniker 13.
I slutet av 60-talet och början av 70-talet, Henry Reiswig9,14,15 banat väg för tillämpning av direkta metoder för att kvantifiera partikelavlägsnande av gigantiska karibiska svampar, genom separat sampling vattnet inandas och utandas av organismerna på plats. På grund av svårigheten att tillämpa Reiswig teknik på mindre suspensionsätare och mer utmanande vattens förhållanden, var den största delen av forskningen på detta område begränsas till laboratoriet (in vitro) sysselsätter mestadels indirekt inkubation tekniker 16. Yahel och kollegor byggs Reiswig direkta in situ teknik för att arbeta i mindre skala förhållanden. Deras metod, benämnd inex 16, är baserad på samtidig vattens provtagning av vattnet inhaleras (In) och utandad (Ex) genom ostörda organismer. De olika koncentration av ett ämne (t.ex. bakterier) mellan ett par av prover (Inex) ger ett mått på retention (eller produktion) av ämnet av djuret. Inex teknik använder öppna ändar rör ochförlitar sig på excurrent stråle som åstadkoms av pump aktiviteten hos den studerade organismen att passivt ersätta det omgivande vattnet i uppsamlingsröret. Medan Yahel och kollegor har framgångsrikt tillämpat denna teknik i studien med över 15 olika suspensionsätare taxa (t.ex. 17), är den metod som begränsas av den höga nivån av praxis och erfarenhet som krävs, genom minimala storleken på vissa excurrent öppningar, och sjöförhållanden.
För att övervinna dessa hinder, vi utvecklat en alternativ teknik baserad på kontrollerad sugning av den samplade vatten genom minut rör (ytterdiameter <1,6 mm). Vårt mål var att skapa en enkel, tillförlitlig och billig anordning som skulle tillåta ren och kontrollerad in situ vattenprovtagning från en mycket specifik punkt, t.ex. excurrent öppning av botten suspensionsätare. För att vara effektiv, har metoden att vara icke störande att inte påverka regimen omgivande flödet eller modifiera behavior av de studerade organismer. Anordningen som presenteras här kallas VacuSIP. Det är en förenkling av SIP-systemet som utvecklats av Yahel et al. (2007) 18 för ROV-baserad punkt provtagning i det djupa havet. Den VacuSIP är betydligt billigare än den ursprungliga SIP och det har anpassats för SCUBA baserat arbete. Systemet har utformats i enlighet med principer som presenteras och testas av Wright och Stephens (1978) 19 och Møhlenberg och Riisgård (1978) 20 för laboratoriemiljö.
Även om VacuSIP systemet utformades för in situ studier av metabolismen av botten suspensionsätare kan det också användas för laboratoriestudier och varhelst det krävs en kontrollerad och ren, punktkälla vattenprov. Systemet är särskilt användbart när integrationen över långa perioder (min-timmar) eller in situ filtreringar krävs. Den VacuSIP har använts framgångsrikt vid Yahel labbet sedan 2011, och har ävenanvänts i två nya studier av näringsflöden förmedlade av Karibien och Medelhavet svamp arter 21 (Morganti et al. submitted).
Användningen av specifika provtagare, den förlängda provtagningstiden, och fältförhållanden, där VacuSIP tillämpas, medföra vissa avvikelser från standardoceanografiska protokoll för att samla in, filtrera och lagra prover för känsliga analyter. För att minska risken för kontamination av VacuSIP systemet eller risk för modifiering av den samplade vatten genom bakteriell aktivitet efter insamling, testade vi olika in situ filtrering och lagringsförfaranden. Olika filteranordningar, uppsamlingskärl och lagring förfaranden undersöktes i syfte att uppnå den mest lämpliga tekniken för analys av löst oorganiskt (PO 4 3-, NOx -, NH 4 +, SiO 4) och den organiska (DOC + DON) föreningar, och ultra-plankton (<1081; m) och partikulärt organiskt (POC + PON) provtagning. För att ytterligare minska risken för kontaminering, särskilt under fältmässiga förhållanden, har antalet hanteringssteg reduceras till ett minimum. Den visuellt format, i vilket förfarandet presenteras är orienterad för att underlätta reproducerbarheten och minska den tid som krävs för att effektivt tillämpa den tekniken.
System översikt
Att sampla in situ pumpas vatten från suspensionsätare med exhalant öppningar så små som 2 mm, är pump aktiviteten hos varje prov först visualiseras genom att släppa filtrerat fluorescein färgade havsvatten bredvid inhalant öppning (s) och observera dess flöde från excurrent öppningen 16 (se även figur 2B i 18). Vattnet inandas och utandas av studieprov (incurrent och excurrent) är sedan samtidigt samplas med användning av ett par av minimala rören installerade på specialbyggd manipulator eller på två av de "arms "av en upp-och-ned flexibel bärbar stativ (Figur 1 och tilläggs Video 1). Vattnet inandas av försöksorganismen samlas genom att försiktigt placera den proximala änden av ett rör inuti eller i närheten av inhalant öppning av studien organismen. En identisk röret placeras sedan inuti excurrent öppningen. Denna åtgärd kräver god omsorg för att undvika kontakt eller störning av djur, till exempel genom att sediment resuspension. för att börja provtagning genomborrar en dykare en skiljevägg i uppsamlingskärlet med en sprutnål fäst vid distala änden av varje rör, vilket gör att den externa vattentrycket att tvinga den samplade vatten in i kärlet genom provtagningsröret. suget initieras av vakuumet som skapats tidigare i ampullerna och av tryckskillnaden mellan den externa vatten och den evakuerade provbehållaren .
För att säkerställa en ren samling av utandad vatten och för att undvika oavsiktlig uppsugning av ambient vatten 16, behöver vatten samplingshastigheten hållas på en betydligt lägre hastighet (<10%) än excurrent flödet. Suganhastigheten regleras genom längden av röret och dess innerdiameter (ID). Den lilla innerdiameter ger också en försumbar död volym (<200 ^ per meter slang). Provtagning under långa perioder (minuter till timmar) gör det möjligt att integrera den inneboende flammighet de flesta ämnen av intresse. För att säkerställa att proven är tillräckligt bevaras i långa undervattens provtagningarna samt för transport till laboratoriet, en in situ filtrering rekommenderas för känsliga analyter. Valet av provtagningskärl, filtreringsanordningen, och slangar dikteras av studie organismer och den specifika frågeställningen. Protokollet som beskrivs nedan förutsätter att en fullständig metabolisk profil är av intresse (för en översikt se figur 2). Emellertid tillåter f modul karaktär av protokolleteller lätt modifiering för att rymma enklare eller till och med mycket olika system för provtagning. För en fullständig metabolisk profil, bör provtagningsprotokoll omfatta följande steg: (1) Flödes visualisering; (2) Provtagning ultra plankton utfodring (plankton <10 um); (3) Provtagning oorganiska näringsämnen upptag och utsöndring (med in-line filter); (4) Provtagning löst organiskt upptag och utsöndring (med in-line filter); (5) Partikel utfodring och utsöndring (med in-line filter); (6) Upprepa steg 2 (ultra-plankton utfodring som kvalitetskontroll); (7) Flödes visualisering.
När logistiskt möjligt, rekommenderas att de metaboliska profilmätningar kombineras med pumphastighet (t.ex. färgfronten hastighetsmetoden, 16) samt med respirationsmätningar. Dessa mätningar är bäst tas i början och slutet av provtagning. För andning mätning vattens optodes eller mikroelektroder är att föredra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. förberedande åtgärder och rengöringsmetoder
- tvättlösning
- Bär skyddsutrustning, en labbrock och handskar vid alla tidpunkter. Utföra dessa förberedande steg i en ren plats fri från damm och rök.
- Bered en 5-10% -ig saltsyra (HCl) -lösning med färsk, hög kvalitet, dubbeldestillerat vatten.
- Bered en 5% mycket löslig basisk blandning av anjoniska och icke-joniska lösningen ytaktivt medel (se Material List) med färskt, hög kvalitet, dubbeldestillerat vatten.
- Lagra alla lösningar i ren, tvättas syrabehållare.
- Förberedande steg och rengöringsmetoder (i labbet)
OBS: Om fosforföreningar inte är av intresse, kan HCl tvätt ersättas med hög kvalitet fosforsyra (H 3 PO 4) tvätt (8% H 3 PO 4 slutlig koncentration).- Bär skyddsutrustning, en labbrock och handskar vid alla tidpunkter.
- Tvättaprovtagningsanordningen (exklusive in-line rostfritt stål Swinney filterhållaren) med riklig mängd vatten med hög renhet. Lämna anordningen blötläggning i 5-10% HCl-lösning över natten. Skölj anordningen igen med riklig mängd högkvalitativt dubbeldestillerat vatten.
- Tvätta i linje rostfria Swinney filterhållare med riklig mängd vatten med hög renhet. Låt filterhållare blötläggning i 5% starkt basisk blandning av anjoniska och nonjoniska tensider lösning över natten. Skölj dem igen med gott om hög kvalitet dubbel destillerat vatten.
- Torka alla provtagningsanordningen, slå in dem i aluminiumfolie och hålla i en ren låda fram till användning.
- Sugstaktstyrnings
- Styra samplingshastigheten genom att justera längden och innerdiameter av inloppsslangen i enlighet med den planerade arbetsdjup och vattentemperatur. Använd följande ekvation (härledd från Hagen-Poiseuilles lag används för fullt develvecklat laminärt rörströmning) som en guide:
där F = flödeshastighet (cm 3 min -1), AP = differenstryck (bar), r = inloppsslang inre radien (cm), K = 2,417 x 10 -9 (sek -2), L = rörlängd (cm ), V = vatten viskositet (g cm -1 s -1). Se tabell 1 för mer information. - Hålla samplingsfrekvens under 1% av pumphastigheten hos den studerade djur.
OBS: Med hjälp av evakuerade behållare, ibland med okända vakuum innebär ytterligare komplikationer. Därför är ett fälttest rekommenderas. Vid 10 m djup och ~ 22 ° C havsvatten (40 PSU), en 50 cm inloppsslang med en inre diameter av 254 ^ m ger en genomsnittlig insugningshastighet av ~ 26 | il sek -1 (1,56 ml min -1).
- Styra samplingshastigheten genom att justera längden och innerdiameter av inloppsslangen i enlighet med den planerade arbetsdjup och vattentemperatur. Använd följande ekvation (härledd från Hagen-Poiseuilles lag används för fullt develvecklat laminärt rörströmning) som en guide:
- provtagningskärl
- För små volymer prover (3-20 ml, till exempel, ultra-plankton för flödes cytometry) använd pre-vacuumed sterila plaströr.
OBS: Pre-sugits sterila plaströr rutinmässigt används för standardblodprover i människor; se till att använda sterila rör utan tillsatser. Dessa sugits sterila plaströr bäst samplas med användning av sterila, engångs rörhållaren med excentrisk Luer. Även om detta är det säkraste och mest effektiva provtagningsanordningen, den har en något större dödvolym jämfört med en enkel nål. - För större vattenprover som näringsämnen och lösta organiska, använd 40 eller 60 ml glasflaskor som uppfyller Environmental Protection Agency (EPA) kriterierna för flyktiga organiska analyser. Dessa flaskor inkluderar polypropenlock med en PTFE-faced silikon septum.
- För ännu större volymer, använder penicillin flaskor med gummiproppar eller termosflaskor.
- Använd hög densitet polyeten flaskor (HDPE flaskor) för kiselprov.
- För att öka provvolym och för att minska risken av proppen lossnarunder uppstigningen, evakuera (vakuum) objekt 1.4.2-1.4.4 innan dyket med en vakuumpump. Vakuum manuellt genom användning av en handvakuumpump eller till och med genom att suga luften med en spruta. Men för bästa resultat är en god vakuumpump rekommenderas. Standard lyophilizers ger högt vakuum.
OBS: Var särskilt uppmärksam när man använder stora sugits flaskor för att säkerställa att snabbare inledande Sughastighet inte skulle förorena utandnings vattenprov.
- För små volymer prover (3-20 ml, till exempel, ultra-plankton för flödes cytometry) använd pre-vacuumed sterila plaströr.
- Fartygsrengöringsrutiner
- För lösta organiska ämnen och NH 4 + analys, använda nya pre-cleaned EPA flaskor.
- Skölj flaskorna (glas och HDPE) för analys av andra näringsämnen enligt följande:
- Skölj flaskorna (glas och HDPE) och de polypropylen lock med hög kvalitet dubbeldestillerat vatten. Installera en ny kisel septum.
- Blötlägg flaskorna (glas och HDPE) i 10% HCl under minst 3 dagar och skölj med riklig hög kvalitet dubbel destillerat vatten.
- Förbränna de glasflaskor vid 450 ° C under 4 h och låt svalna i ugnen. Montera locket, och linda in i aluminiumfolie fram till användning.
- filter
- Använd bindemedelsfria glasfiberfilter för filtrering av alla lösta organiska prover (t.ex. DOC, DON) och för insamling av partikel organiska (t.ex. POC, PON). Packa varje glasfilter i en separat aluminiumfolie kuvert. Förbränna vid 400 ° C under 2 h för att förflyktiga organiska rester och förvara i en ren och torr fartyg fram till användning.
- Använd antingen ett bindemedel fria glasfiberfilter som ovan, eller 0,2 pm polykarbonatmembran för provtagning oorganiska näringsämnen (t.ex. PO 4 3-, NOx -, NH 4 +). Rengöra den senare en gång installerat i filterhållaren, såsom förklaras nedan (1.7.3).
- Använd 0,2 pm polykarbonatmembran filter för kisel provtagning. Rengör dem en gång installed i filterhållaren, såsom förklaras nedan (1.7.3).
- Framställning av filtreringsanordningen
- Filtrera den mycket lösliga grund blandning av anjoniska och icke-joniska lösningen ytaktivt medel och den höga kvaliteten dubbeldestillerat vatten genom ett 0,2 pm filter innan de används för att rengöra filtreringsanordningen.
- Filtreringsanordningen för näringsämnen och andra än kisel lösta organiska:
- Placera en förbrända bindemedelsfria glasfiberfilter inuti rengjorda in-line rostfritt stål Swinney filterhållaren.
- Använder en syra-rengjord spruta för att köra 100 ml av 5% mycket löslig basisk blandning av anjoniska och icke-joniska lösningen tensid och därefter 100 ml av hög kvalitet dubbeldestillerat vatten genom hela enheten.
- Filtreringsanordningen för SiO 4:
- Placera polykarbonatfilter inuti rengjorda polykarbonatfilterhållaren (PC filterhållaren).
- Använd en syra rengjord spruta till run 30 ml 5% HCl och 30 ml av hög kvalitet dubbeldestillerat vatten genom hela aggregatet.
- Systemanordning
- Montera systemet för undervattensarbete med användning av PEEK (polyetereterketon) rör med en yttre diameter (OD) av 1,6 mm och en inre diameter (ID) av 254 um eller 177 um.
- Använd en vass kniv eller PEEK kniven för att klippa rören till önskad längd.
- Vid sin distala ände (prov förpackningssida), passa varje rör med en han-Luer-kontaktdon fäst på en sprutnål. Se till att du följer tillverkarens anvisningar och rikta in den platta sidan av blå flänslös hylsa med änden av röret innan du drar åt den gröna mutter.
- Fäst PEEK slangen på stativet "armar" eller specialbyggd manipulator med en isolerande tejp.
- Fäst en engångsspruta nålen på Luer-kontakten. Håll nålen med sin skyddande lock för att förhindra skador. Märk provtagnings redskap och färgkod alla inandad och utandad komponenter (t.ex. grönt = In, röd = Ex).
- Likaså färgkod provtagningskärl med uppsättningar av parade provtagningskärl sekventiellt numrerade.
där F = flödeshastighet (cm 3 min -1), AP = differenstryck (bar), r = inloppsslang inre radien (cm), K = 2,417 x 10 -9 (sek -2), L = rörlängd (cm ), V = vatten viskositet (g cm -1 s -1). Se tabell 1 för mer information. 2. Arbets Underwater
- Arbete markberedning
- Preliminär undersökning och urval av prover
OBS: På grund av den komplexa naturen hos undervattensprovtagningsprotokoll, ägna den tid som behövs för förberedelser kommer att säkerställa en effektiv provtagning dyk.- Undersökning arbetsplatsen och göra nödvändiga förberedelser i förväg.
- Välj och markera lämpliga målorganismer som kan nås relativt lätt. Eftersom inte alla organismer nödvändigtvis vara aktiv vid tidpunkten för provtagning dyk, förbereda flera arbetsstationer än du räknar med att prova.
- Installation av grundstöd
- when arbetar på planat substrat:
- Montera den ursprungliga quick release klipp av den flexibla stativ på 1 kg dykning vikter och helt enkelt placera den bredvid måldjuret.
- När man arbetar med lodräta väggar:
- Montera bas stödplattor för VacuSIP systemet, krokar för tillbehör redskap, och hängare för uppsamlingskärlet bärande bricka under arbetsplatsen och planeringsstadiet (2.1.1).
- När flexibla bärbara stativ används, använda bultar eller tvåkomponents epoxiharts att fixa 10x10 cm PVC plattor bredvid varje djurart. Varje platta måste ha ett hål för att fästa de snabbt frigjorda klipp av den flexibla bärbara stativ.
- När plasten har härdat och bottenplattorna är fast fäst på väggen, skruva in quick release klipp, fungerar som en fast fästpunkt för den flexibla bärbara stativ för VacuSIP systemet.
- when arbetar på planat substrat:
- Preliminär undersökning och urval av prover
- Installera VaCUSIP
- Kontrollera om provet pumpar genom att släppa filtrerad fluoresceinfärgämnet bredvid inhalant öppningen och kontrollera att färgämnet fram genom utandningsluft öppningen som beskrivs i Yahel et al. (2005) 16.
- Installera VacuSIP enheten och placera inhalant (IN) provrör i inhalant öppning eller precis bredvid den (inom ~ 5 mm). Se till att inhalant röret är inte i närheten av en annan exhalant öppning.
- Rikta noga exhalant (EX) provrör mot osculum / exhalant sifon och mycket försiktigt in den i, tills den är placerad 1-5 mm innanför osculum / exhalant sifon (se figur 1 och tilläggs Video 1). Var mycket noga med att inte komma i kontakt med eller på annat sätt störa den samplade organismen.
- Före och under provtagning dubbelkolla placeringen av båda rören.
- Efter stickprov om provet fortfarande pumpar som desfaktorer beskrivs ovan (2.2.1).
OBS: På grund av att rörelsen hos en arm av stativet när manipulera andra kan uppstå, se till att först placera inhalant provtagningsröret och det andra exhalant röret, vilket kräver mer exakt manipulation. Efter denna ordning, även om manipulering av exhalant provtagningsröret kan orsaka förflyttning av inhalant röret, kommer det inte att påverka provtagning.
- Modular vattensprovtagningsförfarandet
OBS: I väntan på den frågeställningen, kan var och en av de experimentella stegen nedan utföras som ett fristående experiment. Den fullständiga metabola profil provtagningsprotokoll som beskrivs nedan är en lång process som kräver upp till 8 timmar per prov (för en översikt se figur 2 och tabell 2). Som dykförhållanden och regler skiljer sig mellan provtagningsplatser, regioner och institutioner, är dykning planer ingår inte i detta protokoll. Ändå ägna mycket försiktig och METIculous planerar att dykning planen. Ägna särskild försiktighet för att undvika mättnad och yoyo dykprofiler. När det är möjligt, är det lämpligt att genomföra dessa experiment på grunt (<10 m). Sluten krets rebreathers kan vara mycket praktiskt för sådana långa stickprovs.- Innan själva provtagningen börjar, se till att inga synliga spår av fluorescein rester kvar och att suspenderade sediment har reglerats eller har wafted bort.
- Ultra-plankton, (inget filter har installerats i det här steget!)
- Använd nålen att tränga igenom IN (inhalerade) och EX (utandad) sugits steril plaströr septa. Kontrollera att vattnet droppande i vid den planerade hastigheten och samla 2-6 ml vattenprov.
- På hämtning hålla prover i en kall låda på is. I labbet, bevara med 1% paraformaldehyd + 0,05% EM grade glutaraldehyd (slutlig koncentration), eller 0,2% EM grade glutaraldehyd. Frysa cryovials i flytande kväve och förvaras vid -80 &# 176; C tills analys.
- Silikat provtagning och lagring
- Montera förren in-line rostfritt PC filterhållare som innehåller en 0,2 pm polykarbonatmembran mellan nålen och Luer hankontakt vid den bortre änden av röret.
- Pierce septum locket på pre-cleaned polyetenflaskor med hög densitet (HDPE flaskor) för att starta provtagning. Kontrollera att båda provtagare droppande och samla 15 ml vatten i varje flaska.
- Hålla proverna kylda (4 ° C) fram till analys. Om analysen inte kan påbörjas inom två veckor, lagra vid -20 ° C. För analys, se till att proverna tinas vid 50 ° C under minst 50 minuter för att lösa silikageler.
OBS: Membranet kan bevaras för mikroskopi eller DNA-analys efter behov.
- Lösta oorganiska (PO 4 3-, NOx -, NH 4 +)
- ersätta than PC filteranordning med en i förväg rengjord in-line rostfritt stål filterhållare som innehåller en i förväg förbränns glasfilter.
- Före provtagning, se till att åtminstone 20 ml havsvatten prover bringades att passera genom hela filtreringssystemet genom att använda EPA, HDPE flaskor eller andra vakuumkärlet för att starta sugning. Mäta volymen av det uppsamlade vattnet innan de slängs.
- Pierce septum locket på lämpliga EPA glasflaskor för att starta provtagning, kontrollera att båda provtagare droppande, och samla 25-30 ml för nitrat och fosfat analys.
- Växla till nya EPA glasflaskor för ammoniak analys, kontrollera att båda provtagare droppande, och samla in 20 ml i varje flaska.
- Hålla proverna i en kall låda på is och förvara vid -20 ° C fram till analysen.
OBS: Om bara filtratet är av intresse, kan engångssprutfilter användas för steg 2.3.3 och 2.3.4.
- Lösta organiska (DOC + DON) provtagning och storing
OBS: Håll proverna så upprätt som möjligt under hantering så att vattenprovet inte kommer i kontakt med kisel septa.- Fortsätta att använda rostfritt stål filteraggregatet och samla 20 ml havsvatten prover i nya EPA glasflaskor, såsom beskrivits ovan.
- Vid hämtning, hålla proverna i en kall låda på is. I labbet använder en pre-förbrända glas pasteurpipett att fixera prover med ortofosforsyra (lägg 5-6 droppar 25% spårmetallkvalitet syra i ett 20 ml prov, slutlig koncentration 0,04%) eller saltsyra (tillsätt 2 droppar av spårmetall grad koncentrerad syra i ett 20 ml prov, slutkoncentration 0,1%) och hålla i kylskåp.
- Hålla proverna kylda (4 ° C) fram till analys. Om proverna inte analyseras inom en vecka efter samling, förvara vid -20 ° C tills analys.
- Partikelformigt organiskt material (POC, PON, POP)
- Fortsätta att använda stainless stål filterenheten och filter minst 500 ml havsvatten i en evakuerad 250 ml vakuumkolv. Byt kolvar om nödvändigt.
- På hämtning, använder en luftfylld spruta för att evakuera alla återstående havsvattnet från filterhållaren, slå in den i aluminiumfolie och förvara i en kall låda på is. I labbet, ta bort filtren från filterhållarna och förvara vid -20 ° C tills analys.
- Innan själva provtagningen börjar, se till att inga synliga spår av fluorescein rester kvar och att suspenderade sediment har reglerats eller har wafted bort.
Figur 1. Ett exempel på korrekta installationer av VacuSIP: (A) sampla ascidian polycarpa mytiligera (Aqabaviken, Röda havet) med hjälp av en specialbyggd manipulator med färgkod används grönt för inandning och gult för utandnings vattenprover (foto Tom Shelizenger och Yuval Yacobi); (B) sampling av svamp agelas oroides (NW MedelhavetSea) med en osculum bredd av 3 mm, med hjälp av VacuSIP enheten. Koden färgen som används är gul för inhalerad och röd för utandnings vattenprover. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Översikt över VacuSIP tekniken beskrivs i protokollet sektion. Laborationen är representerad i gula rutor, fältarbetet i blå rutor. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tabell 1. De totala genomsnittliga samplingsfrekvenser (ml min -1) som erhållits med olika behållareanvänds för vattensamlingar och olika vakuumnivåer: kolvarna inte sugits (ingen); EPA glasflaskor och HDPE Flaskorna sugits hälften av sin volym (½ volym); sterila plaströr redan sugits av tillverkaren. Att arbeta på 5-8 meters djup, vattentemperatur på 18-22 ° C, med hjälp av PEEK rör med 79 cm långt och med 25 nm innerdiameter.
Tabell 2. Översikt av provtagningskärlet, fixativ, in-line filterenheten, lagring och analytiska metoder som beskrivs i protokollet sektion. De analyserade föreningarna är: ultra plankton överflöd (plankton <10 um), silikat (SiO 4), fosfat (PO 4 3-), nitrit + nitrat (NO 2 - + NO 3 -), löst organiskt material (DOM), ammonium (NH4 +) och partikulärt organiskt material(POM). Samtliga provtagningskärl har kisel septum cap och sugs före provtagning. De fixativen är: paraformaldehyd + glutaraldehyd (Glut + Parafor), ortofosforsyra (H 3 PO 4) och saltsyra (HCl). De in-line filteranordningar som används är: polykarbonat filterhållare och polykarbonatmembran 0,2 um filter (PC filterhållare + PC membran) och rostfria filterhållare och bindemedel fria glasfiberfilter GFF.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Optimering av havsvatteninsamlingsmetoder
Val av samlar flaskor och rengöring
VacuSIP-kompatibla uppsamlingskärl bör ha en skiljevägg som tillåter provtagning ska inledas genom att sticka hål med en sprutnål. De bör motstå förhöjda vattens tryck (2-3 bar vid typiska scuba arbetsdjup), och bör hålla ett vakuum. Många (men inte alla varumärken) av flaskor som godkänts av EPA för analys av flyktiga organiska uppfyller dessa kriterier. Pre-rengjorda flaskor godkända för DOC och DON analys finns också. För att testa lämpligheten av dessa flaskor för insamling och analys av näringsämnen och för att optimera rengöringsrutiner, var hög kvalitet dubbeldestillerat vatten samlas i syra rengjorda polypropylenrör (PP rör), nyinköpta, i enCID rengjord hög densitet polyeten flaskor (HDPE flaskor), och i EPA glasflaskor, alla utrustade med en polytetrafluoretylen (PFTE) septum cap. HDPE-flaskor och polypropenrör rengjordes såsom beskrivits i avsnitt 1.5.2 ovan, och EPA-glasflaskor rengjordes av tillverkaren.
Mängden NH4 + finns i EPA glasflaskor var relativt minimal (≤ 0,1 fimol L -1) och beror på den höga kvaliteten dubbeldestillerat vatten standardkvalitet. Däremot NH 4 + koncentrationer ökat avsevärt (upp till 3 och 7 gånger, respektive) och uppvisade en högre variabilitet i syra rengjorda polypropylenrör och i flaskor med hög densitet polyeten (ANOVA F (5,53) = 7,183, p < 0,001, Figur 3). Det fanns ingen effekt av hög kvalitet dubbeldestillerat vatten kontakt med kisel septum på ammonium-analys.
Jämförelse av nya glasflaskor kontra rengjorda / återvunna glasflaskor
För att testa om EPA glasflaskor skulle kunna utnyttjas för näringsämnesanalyser mer än en gång, NOx -, PO 4 3- och NH 4 + koncentrationer i havsvatten prover som tagits i nya EPA glasflaskor jämfördes med de som samlats in i begagnade EPA glasflaskor. De nya EPA glasflaskor var pre-cleaned av tillverkaren, medan de återvunna glasflaskor rengjordes såsom beskrivits ovan (1.5.2). Återvunna flaskorna hade signifikant högre NH 4 + koncentration, upp till 1,5 gånger nivån som finns i nya glasflaskor (t-test, p <0,001, n = 5). Inga signifikanta skillnader påträffades i NOx - och PO 4 3- innehåll mellan de insamlade i återvunna flaskor prover och prover som tagits i nya glasflaskor (Figur 4).
Silikat insamling och lagring av förfarandena
För att bestämma den bästa provtagningskärlet för analys av silikat, var hög kvalitet dubbeldestillerat vatten uppsamlas i icke-rengjorda och i sura rengjorda polypropylenrör (PP rör), i injektionsflaskor syra rengöras med hög densitet polyeten (HDPE flaskor), och i EPA-glasflaskor. Den förväntade silikat koncentrationen var nära noll, så värden som avvikit från den förväntade koncentrationen ansågs förorenad. Silikathalten avsevärt skilde mellan de prover som tagits i de olika flaskorna (ANOVA, F (3,19) = 210,047, p <0,001), som visar lägsta SiO 4-koncentrationen i syra rengjorda HDPE flaskor. Borosilicate glasflaskor förorenade proverna, med den slutliga SiO 4 koncentration ökar med upp till 7 fimolL -1 (Figur 5).
Val av filtreringsapparat för löst organiskt material (DOM) och näringsämnesanalyser
För att bestämma vilket filter apparat ger det lägsta vita i analysen av löst organiskt (DOC och DON) och oorganiska näringsämnen (NOx -, NH 4 +, PO 4 3-), rostfritt stål filterhållare jämfördes med polykarbonat in-line Swinney filterhållare. Med varje filterhållare typ testade vi både polykarbonatmembran och pre-förbrända glasfiberfilter. Kombinationen av rostfritt stål filterhållaren och förbränns glasfiberfilter under förutsättning att lägsta ämnena, medan polykarbonat Swinney filterhållaren försedd med polykarbonatmembran klart förorenade proverna med upp till nio gånger. Att öka tvättvolymer gjorde inte lösa detta problem (figur 6).
Figur 3. Ammonium koncentration (imol L -1, i genomsnitt ± SD) samlas med olika flaskor: (1) rengjorda HDPE flaska; (2) Rensad HDPE flaska; (3) Rensad HDPE flaska + Parafilm; (4) flaska EPA glas; (5) EPA glasflaska + Parafilm; (6) Rengjord PP-röret. Parafilm placerades för att testa om kisel septum kan förorena vattenproven. För varje behandling 9 prover av hög kvalitet dubbeldestillerat vatten analyserades. Proverna analyserades färska. Signifikanta skillnader konstaterades mellan de fyra provtagningskärl (ANOVA, F (5,53) = 7,183, p <0,001, makt test = 0,992). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Ammoniumnitrat (NH 4 +), nitrit + nitrat (NOx -), och fosfat (PO 4 3-) koncentrationer (imol L -1, i genomsnitt ± SD) av havsvattenprover som samlats in i nya (mörk) och återvunna / rengöras (vit) EPA glasflaskor. Havsvatten samlades vid den experimentella Aquaria zon Institute of Marine Science och filtrerades med rostfritt stål filterhållaren och glasfilter. Vattenproven analyserades färska. Asterisken (*) indikerar att skillnaden är signifikant (t-test, p <0,001, n = 5, makt test = 1). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
.jpg "/>
Figur 5. Silikathalten (imol L -1, i genomsnitt ± SD) i hög kvalitet dubbeldestillerat vatten samlas i olika flaskor: syra rengöras PP rör, PP rör, syra rengjorda HDPE flaskor, nya EPA glasflaskor. Signifikanta skillnader konstaterades mellan de fyra sampler material (ANOVA, F (3,19) = 210,047, p <0,001, makt test = 1). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6. Undersöka effekten av olika filtreringsaggregat och tvätta volymer på nitrit + nitrat (NO x - imol L -1). Prover för NOx - erhölls genom filtrering av havsvattenproverna med rostfritt stål (SS fIlter hållare) eller polykarbonat in-line Swinney filterhållare (PC filterhållaren) är utrustade med antingen en polykarbonatmembran (PC filter) eller en pre-förbrända glasfiberfilter. För PC-filter, användes olika volymer (10, 30, 60, 90 och 120 ml) av 5% HCl och hög kvalitet dubbeldestillerat vatten som används för tvättning av filteranordningen, är tvättvolymen ges inom parentes i figuren legend. Värden uttrycks som medelvärde ± standardavvikelse (n = 5). Havsvatten samlades vid den experimentella Aquaria zon Institute of Marine Science och proverna analyserades fräsch efter filtreringen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7. Exempel på experimentella resultat: inandning (IN, svartcirkel) och utandade (EX, röd triangel) parade vattenprovkoncentrationer (xmol L -1) av olika ämnen som behandlas av den svamp Chondrosia reniformis i Medelhavet: (A) ammonium (NH4 +); (B) nitrit + nitrat (NOx -); (C) fosfat (PO 4 3-); (D) silikat (SiO 4); (E) upplöst organiskt kol (DOC); (F) löst organiskt kväve (DON); (G) plankton organiskt kol (LPOC); (H) plankton organiskt kväve (LPON). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8. Ett exempel på en flödes cytomgeometri analys av parade vattenprover som dras från vattnet inhaleras (A, C, E, G) och utandad (B, D, F, H) av den svamp Chondrosia reniformis: (A, B, C, D) fytoplankton populationer; (E, F, G, H) heterotrofa bakterier. I AB och EF provtagning var ren och korrekt (alla plankton grupper effektivt bibehålls). CD och GH är exempel på utandad vattenförorening, som visar låg avlägsnande av alla plankton grupper. Syn:. Synechococcus sp, pico: autotrofa picoeukariotes, nano: autotrofa nanoeukaryotes, hög: heterotrofa bakterier med hög DNA-innehåll, låg. Heterotrofa bakterier med låg DNA-innehåll klicka god här för att se en större version av denna siffra.
kompletterande Figure 1. Cell behålla effektiviteten i olika plankton byte av clam Chama pacifica: Prochlorococcus sp. (Pro), Synechococcus sp. (SYN), pico-eukaryoter (Pico EUK), nano eukaryoter (Nano EUK). Felstaplar = 95% CI. Klicka här för att ladda ner filen.
Kompletterande Video 1. Provtagningen av ascidian polycarpa mytiligera med hjälp av en specialbyggd manipulator med färgkod används grönt för inhalerade och gult för utandnings vattenprover. Provtagningsrör (PEEK, ID 54 pm, 75 cm lång) är noggrant placerade i exhalant och inhalerade sifoner i ascidian. Vatten än dras in evakuerade rör med en hastighet av ~ 1 ml min -1. I denna demonstration fluoresceinfärgämnet används för att visualisera den exhalant stråle. Observera att exhalant provtagningsröret placeras väl witunna exhalant jet. Klicka här för att ladda ner filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
förberedande steg
Samlare flaskor för DOM och näringsämnesanalyser
Eftersom samlare fartyg kan interagera med lösta mikrokomponenter och provtagaren väggarna kan vara ett substrat för bakterietillväxt 30-34 olika flaskor för DOM och närings samling testades. Borsilikat rekommenderas inte för kiseldioxid kvantifiering 33,35, eftersom glasflaskor kan öka den initiala koncentrationen av kiseldioxid med upp till tvåfaldigt om proverna inte snabbt fryses 30. Våra resultat visar att användning av pre-cleaned EPA flaskor resulterar i låga ämnen koncentrations för DOC, DON, och oorganiska näringsämnen, framför allt för ammonium.
DOC filtrering och lagring
Filtrering är en krävs och, i många fall, är den första analytiska steget i marin kemi ochmikrobiologi. Även om det är möjligt att filtrera proverna efter samlingen i labbet, är detta förfarande rekommenderas inte för in situ arbete, där prover samlas under vattnet, ofta i avlägsna platser, timmar eller dagar från lämpliga laboratorier. Användningen av in-line, in situ filtrering minimerar provhantering och därmed minskar risken för kontaminering. In situ filtrering avlägsnar också de flesta av bakterierna och minskar risken för att provkompositionen kommer att ändras genom bakteriell metabolism under den förlängda provtagning och transport tid. Filtreringsanordningen ökar dödvolymen hos provtagningsapparaten och kan också vara en källa till kontaminering. Ett urval av de minsta möjliga filterhållare (t.ex. in-line Swinney filterhållaren 13 mm) och minuters PEEK slang (t.ex., 254 | j, m ID) minskar dödvolymen och risken för kontaminering av omgivande vatten.
Om den rätta filtret är inteanvänds eller om det inte tvättas noggrant, artefakter och förorening av vattenproven kan förekomma 32,36-39. Studier av DOC-analys visade att filter och filterhållare av organiska föreningar (polykarbonat och PFA-PTFE) kan resultera i allvarlig förorening DOC 32,37, särskilt när de inte noggrant spolas med hög kvalitet dubbel destillerat vatten 38. Det nuvarande protokollet och resultat följer dessa riktlinjer och även ange att polykarbonatfilterhållare bör undvikas.
In situ arbete och samverkan
Den VacuSIP systemet är en direkt provtagningsteknik som underlättar studier av metabolismen av ostörda suspensionsätare i sin naturliga miljö och kvantifiering av deras ekologiska roll i systemet. För erfarna och utrustade dykare, är tillämpningen av VacuSIP metoden enkel och kräver endast kort training. Inex VacuSIP experiment är avsedda för en "within' design statistisk analys (dvs parade eller upprepad åtgärd analys), därför styrning för de flesta analytiska artefakter inklusive höga blanksteg. Användningen av kontrollerad sug säkerställer långsam och justerbara samplingsfrekvenser, vilket förhindrar oavsiktlig förorening av utandad vatten med omgivande vatten. Där det är möjligt, är valet av arbetsplatser med låg ström och låg grumlighet rekommenderas och kommer att se renare och mer korrekta resultat. Den förlängda samplingstiden (minuter till timmar) möjliggör integrering av den höga flammighet som kännetecknar den bentiska gränsskiktet. Alla dessa funktioner säkerställa att när de är korrekt tillämpat VacuSIP metoden är mycket robust och ger tillförlitliga och reproducerbara resultat även när man arbetar med ett litet antal replikat. Ett exempel på typiska resultat som erhållits från en medelhavs svamp och Indo-Pacific mussla arter visas i figur 7 och Supplementary Figur 1.
Som med vilken teknik som helst, är den VacuSIP inte fritt från potentiella fallgropar. Det vanligaste problemet är kontaminering av den utandade vattenprovet med omgivnings vatten. Orsakerna till dessa artefakter är hög Sughastighet, rör dislodgments och djurens beteende. Korrekt val av den korrekta samplingshastigheten är beroende av tidigare uppskattningar av excurrent flödeshastigheten. Sådana beräkningar kan erhållas genom att använda färgfronten hastighetsmetoden 16. Helst ska Sughastighet hållas under 1% av pumphastigheten (t.ex., 1 ml min -1 för en 6 L timme -1 pumphastighet). För att undvika kontaminering med omgivande vatten, bör samplingsfrekvensen aldrig vara större än 10% av pumphastigheten.
För att kontrollera för samplingshastigheten, bör längden och innerdiametern av inloppsslangen justeras i enlighet med den planerade arbetsdjup och vattentemperatur. Hagen-Poiseuille ekvation (se avsnitt 1.3,1 ovan) kan användas som en guide. Emellertid bör denna ekvation betraktas som en första ordningens approximation sedan AP och samplingshastigheten minskar med provtagningstiden och in-line filtrering lägger osäkerheter. Användningen av evakuerade behållare, ibland med okända vakuumtryck, introducerar ytterligare komplikationer. Ett exempel på hur samplingsfrekvenser varierar som en funktion av olika evakuerade behållare med olika vakuum, visas i tabell 1.
Reducera samplingshastigheten är lätt uppnås genom att justera rörlängden och ID, med inga tekniska begränsningar för denna minskning (samplingsfrekvenser på några mikroliter per timme är möjliga). Icke desto mindre bör praktiker vara medvetna om den långsamma samplingstakten dikteras av denna begränsning för djur med långsam pumpningshastighet och för små organismer eller prover. Den omedelbara konsekvensen av långsam samplingshastighet är den begränsade mängd vatten som kan samlas under en enda provtagning Sessipå. Detta låg volym kommer att begränsa antalet analyser och replikat som kan köras med dessa prover, och därmed också begränsa den information som kan erhållas från dessa populationer.
Tube rubbas lätt kan upptäckas och provtagning kan avbrytas eller startas, under förutsättning att en dykare håller ständig uppsikt. Däremot är upphörande av pumpning under provtagningen inte alltid lätt att upptäcka. Detta gäller inte bara för svampar, men även för manteldjur, musslor och havsborstmaskar. I själva verket, i motsats till den allmänna uppfattningen var händelser där en ascidian eller en mussla slutat pumpa dokumenteras med någon synlig förändring i sifon geometri (Yahel, opublicerade data). Dessutom, i vissa fall, kan manteldjur upprätthålla aktiv pumpning utan masksekre (det vill säga ingen filtrering äger rum).
Styrning av samplingshastigheten är kritisk. I detta avseende är VacuSIP är bättre än andra metoder, speciellt när försöksdjuren är relatively liten eller när de pumpar långsamt. Sprutor är särskilt svåra att styra två. Till exempel, Perea-Blazquez och kollegor (2012a) 40 använde en spruta för att ta prov på vattnet utandad av flera tempererade svamp arter och överraskande inte hitta ett allmänt mönster av förtäring / utsöndring av vissa näringsämnen (NO 2 -, NO 3 -, NH 4 +, PO 4 3-, SiO 4). Avsaknaden av ett tydligt mönster är sannolikt ett resultat av förorening i utandningsprover med omgivande vatten på grund av sprut användning. Kontaminering är uppenbart från den extremt låg kvarhållning effektivitet pico plankton rapporterats av Perea-Blázquez och medarbetare (2012b) 41 för att de svampar: 40 ± 14% av heterotrofa bakterier och 54 ± 18% av Synechococcus sp. För jämförelse, med användning av VacuSIP, Mueller et al. (2014) 21 rapporterade en reningsgrad av heterotrofa bakterier72 ± 15% i Siphonodictyon sp. och 87 ± 10% i cliona delitrix.
För att verifiera prov kvalitet och säkerställa att ingen förorening av det omgivande vattnet inträffar rekommenderar vi att först analysera pico och nano plankton prover med hjälp av flödescytometri. Denna snabba, pålitliga och billiga analys kommer att ge omedelbar information om prov kvalitet. Det är mycket vanligt att en del byten taxa som Synechococcus sp. tas bort till nära 90% effektivitet 14,42 av svampar och ascidian. Väsentliga avvikelser från detta riktmärke tyder på att föroreningar kan ha förekommit (Figur 8).
För tillförlitlig och ren provtagning se till att experimentets utformning uppfyller sju enkla regler: (1) utföra en preliminär undersökning (inklusive pumphastigheten uppskattningar) och förbereda arbetsplatsen väl; (2) känner de studerade djuren; (3) kontrollera att de studerade provet har en väldefinierad excurrent öppning ennd tillgänglig plats; (4) kontrollera att de studerade provet pumpa före och efter varje provsamling; (5) placera röret för uppsamling av den utandade vatten något inuti excurrent öppningen (figur 1); (6) använd samplingsfrekvens <10% av flödeshastigheten excurrent, är 1% rekommenderas starkt; (7) definierar ett kvalitetskriterium och utelämna misstänkta Inex par.
Efter dessa enkla regler, erbjuder VacuSIP systemet en praktisk och tillförlitlig metod för att mäta hur aktiv suspensionsätare process partiklar och lösta föreningar i naturliga förhållanden, så att korrekta och jämförbara uppskattningar som kan användas för att bedöma den funktionella rollen av filtrerare i olika ekosystem runt världen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi tackar Manel Bolivar för hans hjälp i fältarbetet. Vi är tacksamma för "Parc Natural del Montgri, les Illes Medes i el Baix Ter" för deras stöd till vår forskning och provtagnings behörigheter. Undervattens manipulator designades av Ayelet Dadon-Pilosof och tillverkas av Mr. Pilosof. Detta arbete stöddes av den spanska regeringen projektet CSI-Coral [licensnummer CGL2013-43106-R RC och MR] och en FPU stipendium från "Ministerio de Educación, Cultura y Deporte (MECD)" till TM. Detta är ett bidrag från den marina biogeokemi och global förändring forskargrupp som finansieras av den katalanska regeringen [licensnummer 2014SGR1029] och ISF bidrag 1280-1213 och BSF bidrag 2.012.089 till G. Yahel.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GorillaPod, Original | Joby | GP000001 | flexible portable tripod |
| Flangeless Ferrule | IDEX Health & Science | P-200X | 1/16" in Blue/pk |
| Male Nut | IDEX Health & Science | P-205X | 1/16" in Green/10 pk |
| Female to Female Luer | IDEX Health & Science | P-658 | |
| Female-Male Luer | IDEX Health & Science | P-655 | |
| Peek Tubing (254 µm ID) | IDEX Health & Science | 1531 | 1/16" OD x 0.01 in ID x 5 ft length. Alternative ID can be used. |
| Two component resin epoxy | IVEGOR | 9257 | Mix well the two component resin before use |
| (TOC) EPA Vials | Cole -Parmer | 03756-20 | 40 ml glass vials. Manufactured also by Thomas Scientific (ref. number 9711F09). |
| HDPE Vials | Wheaton | 986701 (E78620) | 20 ml high-density polyethylene vials |
| Vacuette Z no additive | Greiner bio-one | 455001 | pre-vacuum by the manufacturer |
| Septum Sample Bottles | Thomas Scientific | 1755C01 | 250 ml glass bottles |
| Septum Cap 1 | Wheaton | W240844SP (E7865R) | 22-400 for HDPE vials |
| Septum Cap 2 | Wheaton | W240846 (1078-5553) | 24-400 for glass vials and bottles. Also manufactured by Thermo Scientific National (ref. 03-377-42). |
| In-line stainless steel Swinney Filter holders | Pall | 516-9067 | 13 mm of diameter |
| PTFE Seal Washer | Pall | 516-8064 | ring for stainless steel filter holders |
| TCLP Glass Filters | Pall | 516-9126 | binder-free glass fiber filters, 13 mm of diameter, pore size 0.7 µm |
| Polycarbonate Filter Holders | Cole -Parmer | 17295 | 13 mm of diameter |
| Isopore Membrane Filters | Millipore | GTTP01300 | 13 mm of diameter, pore size 0.2 µm |
| Contrad 70 Solution | Decon Labs | 1002 | highly soluble basic mix of anionic and non-ionic surfactant solution |
| Sterile Syringe Filters | VWR International Eurolab S.L. | 514-0061P | 25 mm of diameter , pore size 0.2 µm |
| Fluorescein | Sigma-Aldrich | (old ref.28802) 46955-100G | 100 g |
| Holdex, disposable,sterile | Greiner bio-one | 450263 | sterile, single-use tube holder with off-center luer for Vacuette |
| Sterile Needles | IcoGammaPlus | 5160 | 0.7 mm x 30 mm |
| Cryovials Nalgene | Nalgene | V5007(Cat. No.5000-0020) | 2 ml |
| Cryobox carton | Rubilabor | M-600 | 145x145x55 mm p/microtube 1.5 ml |
| Orthophosphoric Acid | Sigma | 79617 or Alternatively use Ultra-Pure Hydrochloric acid, final concertation 0.1% | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | 500 g |
| Glutaraldehyde | Merck | 8,206,031,000 | 25%, 1 L |
| Hand Vacuum Pump | Bürkle | 5620-2181 or Alternatively use standard laboratory vacuum pump |
References
- Gili, J. M., Coma, R. Benthic suspension feeders: their paramount role in littoral marine food webs. Trends. Ecol. Evol. 13 (8), 316-321 (1998).
- Reiswig, H. In situ pumping activities of tropical Demospongiae. Mar. Bio. 9, 38-50 (1971).
- McMurray, S., Pawlik, J., Finelli, C. Trait-mediated ecosystem impacts: how morphology and size affect pumping rates of the Caribbean giant barrel sponge. Aquat. Bio. 23 (1), 1-13 (2014).
- Pile, A. J., Young, C. M. The natural diet of a hexactinellid sponge: benthic-pelagic coupling in a deep-sea microbial food web. Deep-Sea Res. Pt. I. 53 (7), 1148-1156 (2006).
- Nielsen, T., Maar, M. Effects of a blue mussel Mytilus edulis bed on vertical distribution and composition of the pelagic food web. Mar. Ecol. Prog. Ser. 339, 185-198 (2007).
- De Goeij, J. M., et al. Surviving in a marine desert: the sponge loop retains resources within coral reefs. Science. 342, 108-110 (2013).
- Maldonado, M., Ribes, M., van Duyl, F. C. Nutrient Fluxes Through Sponges. Biology, Budgets, and Ecological Implications. Advances in Marine Biology. 62, (2012).
- Riisgård, H. U. On measurement of filtration rates in bivalves - the stony road to reliable data: review and interpretation. Mar. Ecol. Prog. Ser. 211, 275-291 (2001).
- Reiswig, H. M. Water transport, respiration and energetics of three tropical marine sponges. J. Exp. Mar. Biol. Ecol. 14, 231-249 (1974).
- Jiménez, E., Ribes, M. Sponges as a source of dissolved inorganic nitrogen: nitrification mediated by temperate sponges. Limnol. Oceanogr. 52 (3), 948-958 (2007).
- Diaz, M. C., Ward, B. Sponge-mediated nitrification in tropical benthic communities. Mar. Ecol. Prog. Ser. 156, 97-107 (1997).
- Ribes, M., Coma, R., Gili, J. Natural diet and grazing rate of the temperate sponge Dysidea avara (Demospongiae, Dendroceratida) throughout an annual cycle. Mar. Ecol. Prog. Ser. 176, 179-190 (1999).
- Jiménez, E. Nutrient fluxes in marine sponges: methodology, geographical variability and the role of associated microorganisms. , Universitat Politècnica de Catalunya. Barcelona. PhD thesis (2011).
- Reiswig, H. M. Particle feeding in natural populations of three marine demosponges. Biol. Bull. 141 (3), 568-591 (1971).
- Reiswig, H. M. In situ pumping activities of tropical Demospongiae. Mar. Biol. 9 (1), 38-50 (1971).
- Yahel, G., Marie, D., Genin, A. InEx - a direct in situ method to measure filtration rates, nutrition, and metabolism of active suspension feeders. Limnol. Oceanogr-meth. 3, 46-58 (2005).
- Genin, A., Monismith, S. S. G., Reidenbach, M. A., Yahel, G., Koseff, J. R. Intense benthic grazing of phytoplankton in a coral reef. Limnol. Oceanogr. 54 (2), 938-951 (2009).
- Yahel, G., Whitney, F., Reiswig, H. M., Leys, S. P. In situ feeding and metabolism of glass sponges (Hexactinellida , Porifera) studied in a deep temperate fjord with a remotely operated submersible. Limnol. Oceanogr. 52 (1), 428-440 (2007).
- Wright, S. H., Stephens, G. C. Removal of amino acid during a single passage of water across the gill of marine mussels. J. Exp. Zool. 205, 337-352 (1978).
- Møhlenberg, F., Riisgård, H. U. Efficiency of particle retention in 13 species of suspension feeding bivalves. Ophelia. 17 (2), 239-246 (1978).
- Mueller, B., et al. Natural diet of coral-excavating sponges consists mainly of dissolved organic carbon (DOC). PLoS ONE. 9 (2), e90152 (2014).
- Gasol, J. M., Moran, X. A. G. Effects of filtration on bacterial activity and picoplankton community structure as assessed by flow cytometry. Aquat. Microb. Ecol. 16 (3), 251-264 (1999).
- Koroleff, F. Determination of reactive silicate. New Baltic Manual, Cooperative Research Report Series A. 29, 87-90 (1972).
- Murphy, J., Riley, J. P. A. Modified single solution method for the determination of phosphate in in natural waters. Anal. Chim. Acta. 27, 31-36 (1962).
- Shin, M. B. Colorimetric method for determination of nitrite. Ind.Eng.Chem. 13 (1), 33-35 (1941).
- Wood, E. D., Armstrong, F. A. J., Richards, F. A. Determination of nitrate in sea water by cadmium-copper reduction to nitrite. J. Mar. Biol. Assoc. U. K. 47 (1), 23-31 (1967).
- Sharp, J. H., et al. A preliminary methods comparison for measurement of dissolved organic nitrogen in seawater. Mar. Chem. 78 (4), 171-184 (2002).
- Sharp, J. H. Marine dissolved organic carbon: Are the older values correct. Mar. Chem. 56 (3-4), 265-277 (1997).
- Holmes, R. M., Aminot, A., Kerouel, R., Hooker, B. A., Peterson, B. J. A simple and precise method for measuring ammonium in marine and freshwater ecosystems. Can. J. Fish. Aquat. Sci. 56 (10), 1801-1808 (1999).
- Degobbis, D. On the storage of seawater samples for ammonia determination. Limnol. Oceanogr. 18 (1), 146-150 (1973).
- Tupas, L. M., Popp, B. N., Karl, D. M. Dissolved organic carbon in oligotrophic waters: experiments on sample preservation, storage and analysis. Mar. Chem. 45, 207-216 (1994).
- Yoro, S. C., Panagiotopoulos, C., Sempéré, R. Dissolved organic carbon contamination induced by filters and storage bottles. Water Res. 33 (8), 1956-1959 (1999).
- Zhang, J. Z., Fischer, C. J., Ortner, P. B. Laboratory glassware as a contaminant in silicate analysis of natural water samples. Water Res. 33 (12), 2879-2883 (1999).
- Yoshimura, T. Appropriate bottles for storing seawater samples for dissolved organic phosphorus (DOP) analysis: a step toward the development of DOP reference materials. Limnol. Oceanogr-meth. 11 (4), 239-246 (2013).
- Strickland, J. D. H., Parsons, T. R. A practical handbook of seawater analysis. , Fisheries Research Board of Canada. Ottawa. (1968).
- Eaton, A. D., Grant, V. Freshwater sorption of ammonium by glass frits and filters: implications for analyses of brackish and freshwater. Limnol. Oceanogr. 24 (2), 397-399 (1979).
- Norrman, B. Filtration of water samples for DOC studies. Mar. Chem. 41 (1-3), 239-242 (1993).
- Carlson, C. A., Ducklow, H. W. Growth of bacterioplankton and consumption of dissolved organic carbon in the Sargasso Sea. Aquat. Microb. Ecol. 10 (1), 69-85 (1996).
- Grasshoff, K., Ehrhardt, M., Kremling, K. Methods of Seawater Analysis. Second, Revised and Extended Edition. , (1999).
- Perea-Blázquez, A., Davy, S. K., Bell, J. J. Nutrient utilisation by shallow water temperate sponges in New Zealand. Hydrobiologia. 687 (1), 237-250 (2012).
- Perea-Blázquez, A., Davy, S. K., Bell, J. J. Estimates of particulate organic carbon flowing from the pelagic environment to the benthos through sponge assemblages. PLoS ONE. 7 (1), e29569 (2012).
- Pile, A. J., Patterson, M. R., Witman, J. D. In situ grazing on plankton <10 µm by the boreal sponge Mycale lingua. Mar. Ecol. Prog. Ser. 141, 95-102 (1996).
