This manuscript presents a unique in vitro model of immunopurified human villous cytotrophoblast cells cultured under hypoxia/reoxygenation. This model is suitable to study the protective effects of promising treatments, such as melatonin, on pregnancy complications associated with increased oxidative stress and altered placental function.
This protocol describes how villous cytotrophoblast cells are isolated from placentas at term by successive enzymatic digestions, followed by density centrifugation, media gradient isolation and immunomagnetic purification. As observed in vivo, mononucleated villous cytotrophoblast cells in primary culture differentiate into multinucleated syncytiotrophoblast cells after 72 hr. Compared to normoxia (8% O2), villous cytotrophoblast cells that undergo hypoxia/reoxygenation (0.5% / 8% O2) undergo increased oxidative stress and intrinsic apoptosis, similar to that observed in vivo in pregnancy complications such as preeclampsia, preterm birth, and intrauterine growth restriction. In this context, primary villous trophoblasts cultured under hypoxia/reoxygenation conditions represent a unique experimental system to better understand the mechanisms and signalling pathways that are altered in human placenta and facilitate the search for effective drugs that protect against certain pregnancy disorders. Human villous trophoblasts produce melatonin and express its synthesizing enzymes and receptors. Melatonin has been suggested as a treatment for preeclampsia and intrauterine growth restriction because of its protective antioxidant effects. In the primary villous cytotrophoblast cell model described in this paper, melatonin has no effect on trophoblast cells in normoxic state but restores the redox balance of syncytiotrophoblast cells disrupted by hypoxia/reoxygenation. Thus, human villous trophoblast cells in primary culture are an excellent approach to study the mechanisms behind the protective effects of melatonin on placental function during hypoxia/reoxygenation.
طوال فترة الحمل البشري، وخلايا الأرومة الغاذية الخلوية المشيمة، وهي الخلايا الجذعية mononucleated، تتكاثر بسرعة وتفرق في أي خلايا الأرومة الغاذية الخلوية زغبي أو extravillous. أرومة غاذية خلوية Extravillous تغزو واعادة تشكيلها الشرايين دوامة من جدار الرحم. أرومة غاذية خلوية زغبي، من ناحية أخرى، لا تزال تتكاثر، والتفريق والصمامات لتشكيل الأرومة الغاذية المخلوية متعددة النوى (ومخلى) 1. الحفاظ على التوازن الأرومة الغاذية زغابي أمر ضروري لعافية الجنين والحمل الصحي. في الواقع، أرومة مغذية زغبي تسمح الصرف الأم الجنين من الأكسجين والمواد المغذية، وتنتج الهرمونات الضرورية للحمل. وعلاوة على ذلك، والأرومة الغاذية المخلوية هو الوحيد من نوع الخلية على اتصال مباشر مع الدورة الدموية للأم وتوفر حاجزا البدني والمناعية الأساسية. ولذلك، يجب على الأرومة الغاذية المخلوية الخضوع لموت الخلايا المبرمج واستبدال لصيانة التماثل الساكن وآفومعرف المشيمة الأمراض 2-5.
تسببت هذه التقنية التي وضعتها كليمان وآخرون. 6 في عام 1986 إلى عزل أرومة غاذية خلوية زغبي الأولية من مشيمة الآدمي ثورة في مجال البحوث المشيمة من خلال السماح للدراسة الآليات الجزيئية المعنية في التفريق الأرومة الغاذية الزغابي. هذه التقنية الكلاسيكية، على أساس الهضم الأنزيمية متتابعة مع التربسين والدناز، تليها العزلة في وسائل الإعلام الكثافة الطرد المركزي (جسيمات السيليكا الغروية المغلفة التي كتبها بوفيدون، أو Percoll) ومن المسلم به الآن باعتباره المعيار الذهبي لعزل خلايا الأرومة الغاذية الخلوية زغبي. هذه التقنية يمكن أن يكون الأمثل من قبل immunopurification المغناطيسي، وهو الإجراء الذي يفصل أرومة غاذية خلوية زغبي من الخلايا غير الأرومة الغاذية على أساس التعبير التفاضلية للمستضدات معينة على أسطح هذه الخلايا. اخترنا الكريات البيض البشرية مستضد ABC (HLA-ABC) بسبب غياب التعبير عنها على MEMBRAN خلية الأرومة الغاذيةه 7،8.
المشيمة هي الجهاز الذي يخضع لتغيرات كبيرة في مستويات الأكسجين أثناء الحمل. في الثلث الأول من الحمل، ونسبة الأوكسجين هو من الناحية الفسيولوجية منخفضة جدا (2٪ O 2) ولكن الزيادات إلى مستويات معتدلة من الأوكسجين (8٪ O 2) في الثلث الثاني والثالث. وصف تيولي وآخرون. 9 أن الاستنساخ في المختبر البيئة الأرومة الغاذية داخل الزغابات المشيمية هو التحدي والاختلافات في مستويات الأوكسجين قد يؤدي حتى إلى تغييرات phenotypical. ولذلك، اقترح اعتماد 8٪ من الأكسجين كما normoxia لتقليد توتر الأوكسجين الموجودة في الزغابات المشيمية خلال الربع الثالث من الحمل 8،9. تشن وآخرون. 10 درس على نطاق واسع العديد من المتغيرات المتعلقة توتر الأوكسجين في زراعة الخلايا الأرومة الغاذية وأوضح أهمية تحديد مستويات الأكسجين في بيئة المحيطة بالخلايا. مستويات الأوكسجين في الزغابات تميل إلى زيادةنظرا لتكون الأوعية. تدفق الدم في الزيادات الزغابات المشيمية باستمرار ومستوى بيروكسيد الهيدروجين (وهي وفيرة أنواع الاكسجين التفاعلية) هو إشارة مهمة التي تسيطر تكون الأوعية 11،12. في مضاعفات الحمل، وعدم تكون الأوعية يولد نقص الأكسجين، والأهم من ذلك، والاختلافات متقطعة من الأوكسجين (وتسمى نقص الأكسجة / عودة التأكسج). هذه الظروف تؤدي إلى زيادة غير طبيعية في الاكسدة، الذي يعرض للخطر المشيمة والجنين 13،14 جدوى. التعديلات التي تخضع لخلايا الأرومة الغاذية في الجسم الحي خلال حلقة من نقص الأكسجة / عودة التأكسج يمكن تحاكي في المختبر على النحو التالي: يتم الاحتفاظ أرومة غاذية خلوية زغبي في ظل ظروف normoxic (8٪ O 2) حتى تتمايز إلى الأرومة الغاذية المخلوية. ثم يتعرضون لظروف نقص الأوكسجين (0.5٪ O 2) لمدة 4 ساعة، تليها 18 ساعة إضافية من normoxia (عودة التأكسج). باستخدام هذا النهج نقص الأكسجة / عودة التأكسج، أرومة مغذية السابقحررت hibit حالة الأكسدة والاختزال وزيادة مستويات الخلايا الجوهرية 8، كما لوحظ في بعض مضاعفات الحمل. وبالتالي، هذا هو مفيد في نموذج المختبر لتقييم نهج وقائية وعلاجية جديدة لمكافحة مضاعفات الحمل يرتبط مع المشيمة نقص الأكسجة / عودة التأكسج.
خلايا المشيمة تنتج الميلاتونين، الذي لديه عدة وظائف مهمة، مثل القدرة على تفادي الإجهاد التأكسدي وضعف المشيمة 15. هنا، نقدم نماذج النهج وخلية تجريبية تستخدم للتدليل على آثار وقائية من الميلاتونين في خلايا الأرومة الغاذية المشيمة على مستوى الجزيئات والخلايا وظيفية 8.
في الثدييات، تعتمد اعتمادا مباشرا على وظيفة المشيمة كافية نمو الجنين. وتستند أصول التنموية من الاضطرابات الصحية على فرضية أن سبب الأمراض يتجلى في وقت لاحق في الحياة يمكن ان ترجع الى التنمية في وقت مبكر وأن المشيمة دورا الآلية في البرمجة الجنينية 30-32. المشيمة هي…
The authors have nothing to disclose.
Supported by grants from the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) (no. 262011-2009) to CV and March of Dimes Social and Behavioral Sciences Research grant (#12-FY12-179) to CV and JTS; by studentships to LSF from the Ministère de l’éducation, de l’Enseignement supérieurs et de la recherche (MEESR)-Fonds de recherche du Québec (FRQ)-Nature et technologies (NT) and the Fondation Universitaire Armand-Frappier INRS, to HC from the Réseau Québécois en Reproduction-NSERC-CREATE, to AAHT from the Canadian Institutes of Health Research (CIHR) and FRQ-Santé, and to JBP from NSERC; by a fellowship to EMAS from the Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientìfico e Tecnològico (CNPq) and the Programme de bourses d’excellence pour étudiants étrangers MEESR-FRQNT.
Curved Metzenbaum Scissors | Shandon | 9212 | surgical equipment (cell isolation) (2 units) |
Splinter Forceps Fine 41/2in | Fisherbrand | 13-812-42 | surgical equipment (cell isolation) (2 units) |
Scissors 4.5 Str Dissection | Fisherbrand | 08-940 | surgical equipment (cell isolation) (2 units) |
Gauze Sponge 10cm X 10cm | Cardinal Health | 361020733 | |
Oblong Glass Baking Dish | Pyrex | 1105397 | Glassware (2.8L) |
Funnel Buchner | Coorstek Inc | 10-356E | Glassware (114MM DIAMeter) |
Watch Glass | pyrex | 9985100EMD | Glassware |
Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128-4L | histological tissue fixative solution |
Trypsinizing Flasks | Wheaton | 355395 | Glassware (1 unit) |
Disposable Culture Tubes | Kimble | 73750-13100 | Glassware |
Borosilicate Glass Pasteur Pipet (22.8 Cm) | Fisherbrand | K63B1367820C | Glassware |
250 Ml Glass Beakers | Fisherbrand | KFS14005250 | Glassware |
Glass Media Bottles With Cap | Fisherbrand | KFS14395250 | Glassware (8 units) |
50 Ml Corex Tube | Corning | 8422-A | (1 unit) |
15 Ml Polystyrene Centrifuge Tube | Corning | 430791 | |
50 Ml Polystyrene Centrifuge Tube | Corning | 430829 | |
10ml Serological Pipet | Corning | 11415038 | |
Cell Strainer 100μm Nylon | Corning | 431752 | |
Absorbant Liner | Scienceware | 1199918 | |
500 Ml Bottles Top Filter | Corning | Pore: 0,22 µm / medium and HBSS preparation | |
2 Ml Criogenic Vials | Corning | 430488 | |
Freezing Container, Nalgene Mr. Frosty | Sigma-Aldrich | C1562-1EA | |
Peristaltic Pump | Pharmacia Fine Chemicals | P3 model | |
Shaking Water Bath | Fisher | Model 127 | |
Vacuum Pump | ABM | 4EKFS6CX-4 | |
Sodium Chloride | Fisherbrand | EC231-598-3 | Saline solution 0.9% |
Hank’s Buffered Salt Solution (Hbss) | Sigma-Aldrich | H2387 | Quantity: 9.25 (one vial) for 1L of digestion solution |
Hydroxypiperazineethansulphonic Acid (Hepes) | Life Technologies | 15630-080 | 25mL (1M) for 1L of digestion solution |
Trypsin Type I | Sigma-Aldrich | T8003 | 9,888U |
Deoxyribonuclease Type Iv | Roche | 10-104-159-001 | 402,000U |
Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C4901 | 100mM |
Magnesium Sulfate | Baker | 2500-01 | 800mM |
Dulbecco’s Modified Eagle Medium High Glucose (Dmem) | Life Technologies | 10564-045 | |
Penicillin/Streptomycin Sulphate | Hyclone | SV30010 | |
Fetal Bovine Serum | Corning | 35-010-CV | |
Percoll | Sigma-Aldrich | P1644 | Density centrifugation media gradient. Volume: 36mL |
Isopropanol | Acros | 42383-0010 | 50mL |
Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | 472301 | |
Automacs Magnetic Separator | Miltenyi Biotec | Model 003 | |
Automacs Columns | Miltenyi Biotec | 130-021-101 | |
Automacs Running Buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | http://www.miltenyibiotec.com/~/media/Images/Products/Import/0001100/IM0001131.ashx?force=1 |
Automacs Rinsing Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | http://www.miltenyibiotec.com/en/products-and-services/macs-cell-separation/cell-separation-buffers/automacs-rinsing-solution.aspx |
Anti-Human Hla Abc Purified Clone W6/32 | Affymetrix eBioscience | 14-9983-82 | anti-mouse antibody |
Anti Mouse Igg Microbeads | Miltenyi Biotec | 130048401 | |
Multiple Well Plate - 6 Well With Lid | Corning | 3335 | Cell Bind surface |
Multiple Well Plate - 24 Well With Lid | Corning | 3337 | Cell Bind surface |
Multiple Well Plate - 96 Well With Lid | Corning | 3300 | Cell Bind surface |
Modular Incubator Chamber | Billups-Rothenberg | MIC-101 | A set of two is necessary for simultaneous to generate normoxia and hypoxia/reoxygenation conditions |
Single Flow Meter | Billups-Rothenberg | SFM3001 | |
50 Mm In-Line Filter | Whatman | 6721-5010 | PTFE, pore: 1.0 µm |
Gas Regulator | Pro Star | PRS301233 | A set of two is necessary for simultaneous to generate normoxia and hypoxia/reoxygenation conditions |
Gas Hose Class Vi Clear 5/16 | Parker | 100-05070102 | 3 pieces with ~ 0.5 m |
17 Mm Adjustable Gas Hose Clamp | Tiewraps | THCSS-16 | |
Normoxia Gas Cylinder | Praxair | NI CDOXR1U-K | Size K (3rd trimester‘s composition: 5% CO2, 8% O2, Bal. N2) |
Normoxia Gas Cylinder | Praxair | NI CDOXR1U-K | Size K (3rd trimester‘s composition: 5% CO2, 0.5% O2, Bal. N2) |
Oxygen Microelectrode Mi-730 | Microelectrodes INC | 84477 | |
Oxygen Adapter | Microelectrodes INC | 3572 | |
ROS Detection Reagent: CM-H2DCFDA | Invitrogen | C-400 | |
β-hCG ELISA kit | DRG internatinal | EIA-4115 | |
Anti-Vimentin ourified antibody | eBioscience | 14-9897 | Host: mouse |
Anti-Cytokeratin 7 (FITC) antibody | Abcam | ab119697 | Host: mouse |
Alexa Fluor 488 Goat Anti-mousse IgG H&L antibody | Life Technologies | A-11029 |