This manuscript presents a unique in vitro model of immunopurified human villous cytotrophoblast cells cultured under hypoxia/reoxygenation. This model is suitable to study the protective effects of promising treatments, such as melatonin, on pregnancy complications associated with increased oxidative stress and altered placental function.
This protocol describes how villous cytotrophoblast cells are isolated from placentas at term by successive enzymatic digestions, followed by density centrifugation, media gradient isolation and immunomagnetic purification. As observed in vivo, mononucleated villous cytotrophoblast cells in primary culture differentiate into multinucleated syncytiotrophoblast cells after 72 hr. Compared to normoxia (8% O2), villous cytotrophoblast cells that undergo hypoxia/reoxygenation (0.5% / 8% O2) undergo increased oxidative stress and intrinsic apoptosis, similar to that observed in vivo in pregnancy complications such as preeclampsia, preterm birth, and intrauterine growth restriction. In this context, primary villous trophoblasts cultured under hypoxia/reoxygenation conditions represent a unique experimental system to better understand the mechanisms and signalling pathways that are altered in human placenta and facilitate the search for effective drugs that protect against certain pregnancy disorders. Human villous trophoblasts produce melatonin and express its synthesizing enzymes and receptors. Melatonin has been suggested as a treatment for preeclampsia and intrauterine growth restriction because of its protective antioxidant effects. In the primary villous cytotrophoblast cell model described in this paper, melatonin has no effect on trophoblast cells in normoxic state but restores the redox balance of syncytiotrophoblast cells disrupted by hypoxia/reoxygenation. Thus, human villous trophoblast cells in primary culture are an excellent approach to study the mechanisms behind the protective effects of melatonin on placental function during hypoxia/reoxygenation.
במהלך הריון אדם, תאי cytotrophoblast השליה, אשר הם תאי גזע mononucleated, להתרבות במהירות להתמיין לתאי cytotrophoblast או villous או extravillous. cytotrophoblasts Extravillous לפלוש לשפץ העורקים ספירלה של דופן הרחם. Cytotrophoblasts Villous, מצד שני, ממשיכים להתרבות, להבדיל הפתיל כדי ליצור syncytiotrophoblast multinucleated (להלן syncytium) 1. התחזוקה של הומאוסטזיס trophoblast villous חיונית לרווחתה עוברית הריון בריא. למעשה, trophoblasts villous לאפשר חילופי האם והעובר של חמצן וחומרים מזינים, וכן ליצירת הורמונים חיוניים עבור ההריון. יתר על כן, syncytiotrophoblast הוא תא מהסוג רק במגע ישיר עם מחזור הדם האימהי ומספק מחסום פיזי אימונולוגיים חיוני. לכן, syncytiotrophoblast חייב לעבור אפופטוזיס והחלפת לתחזוקה ההומיאוסטטית וכדי AVOid השליה פתולוגיות 2-5.
הטכניקה פותחה על ידי Kliman et al. 6 בשנת 1986 לבודד cytotrophoblasts villous ראשית ממנהל שליות אדם גרמה מהפכה במחקר שליה בכך שהוא מאפשר בחקר המנגנונים המולקולריים המעורבים בידול trophoblast villous. טכניקה קלסית זו, המבוססת על digestions האנזימטית רציף עם טריפסין ו DNase, ואחריו בידוד במדיה צנטריפוגה הצפיפות (חלקיקי סיליקה colloidal מצופים ידי polyvinylpyrrolidone, או Percoll) מוכר כיום את תקן הזהב עבור לבודד תאי cytotrophoblast villous. הטכניקה יכולה להיות מותאמת על ידי מגנטי immunopurification, הליך שמפריד cytotrophoblasts villous מתאי הלא trophoblastic מבוססים על ביטוי ההפרש של אנטיגנים ספציפיים על פני השטח של תאים אלה. בחרנו ABC אנטיגן לויקוציטים אנושיים (HLA-ABC) בשל העדר הביטוי שלה על membran תא trophoblasticדואר 7,8.
השליה היא איבר שעובר וריאציות דרמטיות ברמות החמצן במהלך הריון. בטרימסטר הראשון, יחס החמצון הוא פיסיולוגי נמוך מאוד (2% O 2) אך עליות לרמות קלות של חמצון (8% O 2) בטרימסטר השני ושלישי. Tuuli et al. 9 תיאר כי רבייה במבחנה של הסביבה trophoblast בתוך villi השליה היא אתגר לשינויים ברמות חמצון עשוי אפילו להוביל לשינויים phenotypical. זהו, אם כן, הציע לאמץ חמצן 8% כפי normoxia לחקות את המתח חמצן נמצא villi השליה במהלך השליש השלישי של ההריון 8,9. חן et al. 10 בהרחבה למדו מספר משתנים הקשורים במתח חמצן תרבית תאי trophoblast והדגימו את החשיבות של קביעת רמות חמצן בסביבת pericellular. רמות חמצן villi נוטות להגדילבשל vasculogenesis. זרימת הדם בעליות villi שלית זמן ורמת החמצן (זן חמצן תגובתי בשפע) היא איתות חשובה שולט vasculogenesis 11,12. בשנת סיבוכי הריון, חוסר vasculogenesis מייצר היפוקסיה, ויותר מכך, וריאציות לסירוגין של חמצון (שנקרא היפוקסיה / reoxygenation). תנאים אלה להוביל לעלייה חריגה סטרס חמצוני, אשר פוגעת השליה 13,14 הכדאיות עוברית. השינויים שתאים trophoblast לעבור in vivo במהלך אירועי היפוקסיה / reoxygenation ניתן חיקה במבחנה כדלקמן: cytotrophoblasts villous נשמרים בתנאי normoxic (8% O 2) עד שהם להתמיין syncytiotrophoblast. לאחר מכן הם חשופים לתנאי חוסר חמצן (0.5% O 2) עבור 4 שעות, ואחריו hr 18 נוסף של normoxia (reoxygenation). באמצעות גישה זו היפוקסיה / reoxygenation, trophoblasts לשעברhibit deregulated מצב חיזור רמות גבוהות של אפופטוזיס המהותי 8, כמו נצפה סיבוכי הריון מסוימים. לפיכך, מדובר שימושי במודל חוץ גופית על מנת להעריך גישות למנוע ולרפא אותן חדשה למאבק סיבוכי הריון הקשורות השליה היפוקסיה / reoxygenation.
תאי שליה לייצר מלטונין, אשר יש פונקציות חשובות, כגון היכולת לייתר סטרס חמצוני ופגיעה בתפקוד השליה 15. כאן, אנו מציגים מודלי הגישה ותא הניסוי נעשו שימוש כדי להמחיש את ההשפעות המגנות של מלטונין בתאי trophoblast שליה ברמה המולקולרית, תאית ופונקציונלית 8.
ביונקים, התפתחות עוברת תלויה ישירות על תפקוד השליה נאות. מקורותיה ההתפתחותי של הפרעות בריאות מבוססים על ההשערה כי הגורם למחלות לידי ביטוי בשלב מאוחר יותר בחיים יכול להיות נעוצה בהתפתחות מוקדמת וכי השליה יש תפקיד מכניסטית בתכנות עוברי 30-32. השליה היא מתווך המפתח…
The authors have nothing to disclose.
Supported by grants from the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) (no. 262011-2009) to CV and March of Dimes Social and Behavioral Sciences Research grant (#12-FY12-179) to CV and JTS; by studentships to LSF from the Ministère de l’éducation, de l’Enseignement supérieurs et de la recherche (MEESR)-Fonds de recherche du Québec (FRQ)-Nature et technologies (NT) and the Fondation Universitaire Armand-Frappier INRS, to HC from the Réseau Québécois en Reproduction-NSERC-CREATE, to AAHT from the Canadian Institutes of Health Research (CIHR) and FRQ-Santé, and to JBP from NSERC; by a fellowship to EMAS from the Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientìfico e Tecnològico (CNPq) and the Programme de bourses d’excellence pour étudiants étrangers MEESR-FRQNT.
Curved Metzenbaum Scissors | Shandon | 9212 | surgical equipment (cell isolation) (2 units) |
Splinter Forceps Fine 41/2in | Fisherbrand | 13-812-42 | surgical equipment (cell isolation) (2 units) |
Scissors 4.5 Str Dissection | Fisherbrand | 08-940 | surgical equipment (cell isolation) (2 units) |
Gauze Sponge 10cm X 10cm | Cardinal Health | 361020733 | |
Oblong Glass Baking Dish | Pyrex | 1105397 | Glassware (2.8L) |
Funnel Buchner | Coorstek Inc | 10-356E | Glassware (114MM DIAMeter) |
Watch Glass | pyrex | 9985100EMD | Glassware |
Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128-4L | histological tissue fixative solution |
Trypsinizing Flasks | Wheaton | 355395 | Glassware (1 unit) |
Disposable Culture Tubes | Kimble | 73750-13100 | Glassware |
Borosilicate Glass Pasteur Pipet (22.8 Cm) | Fisherbrand | K63B1367820C | Glassware |
250 Ml Glass Beakers | Fisherbrand | KFS14005250 | Glassware |
Glass Media Bottles With Cap | Fisherbrand | KFS14395250 | Glassware (8 units) |
50 Ml Corex Tube | Corning | 8422-A | (1 unit) |
15 Ml Polystyrene Centrifuge Tube | Corning | 430791 | |
50 Ml Polystyrene Centrifuge Tube | Corning | 430829 | |
10ml Serological Pipet | Corning | 11415038 | |
Cell Strainer 100μm Nylon | Corning | 431752 | |
Absorbant Liner | Scienceware | 1199918 | |
500 Ml Bottles Top Filter | Corning | Pore: 0,22 µm / medium and HBSS preparation | |
2 Ml Criogenic Vials | Corning | 430488 | |
Freezing Container, Nalgene Mr. Frosty | Sigma-Aldrich | C1562-1EA | |
Peristaltic Pump | Pharmacia Fine Chemicals | P3 model | |
Shaking Water Bath | Fisher | Model 127 | |
Vacuum Pump | ABM | 4EKFS6CX-4 | |
Sodium Chloride | Fisherbrand | EC231-598-3 | Saline solution 0.9% |
Hank’s Buffered Salt Solution (Hbss) | Sigma-Aldrich | H2387 | Quantity: 9.25 (one vial) for 1L of digestion solution |
Hydroxypiperazineethansulphonic Acid (Hepes) | Life Technologies | 15630-080 | 25mL (1M) for 1L of digestion solution |
Trypsin Type I | Sigma-Aldrich | T8003 | 9,888U |
Deoxyribonuclease Type Iv | Roche | 10-104-159-001 | 402,000U |
Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C4901 | 100mM |
Magnesium Sulfate | Baker | 2500-01 | 800mM |
Dulbecco’s Modified Eagle Medium High Glucose (Dmem) | Life Technologies | 10564-045 | |
Penicillin/Streptomycin Sulphate | Hyclone | SV30010 | |
Fetal Bovine Serum | Corning | 35-010-CV | |
Percoll | Sigma-Aldrich | P1644 | Density centrifugation media gradient. Volume: 36mL |
Isopropanol | Acros | 42383-0010 | 50mL |
Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | 472301 | |
Automacs Magnetic Separator | Miltenyi Biotec | Model 003 | |
Automacs Columns | Miltenyi Biotec | 130-021-101 | |
Automacs Running Buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | http://www.miltenyibiotec.com/~/media/Images/Products/Import/0001100/IM0001131.ashx?force=1 |
Automacs Rinsing Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | http://www.miltenyibiotec.com/en/products-and-services/macs-cell-separation/cell-separation-buffers/automacs-rinsing-solution.aspx |
Anti-Human Hla Abc Purified Clone W6/32 | Affymetrix eBioscience | 14-9983-82 | anti-mouse antibody |
Anti Mouse Igg Microbeads | Miltenyi Biotec | 130048401 | |
Multiple Well Plate - 6 Well With Lid | Corning | 3335 | Cell Bind surface |
Multiple Well Plate - 24 Well With Lid | Corning | 3337 | Cell Bind surface |
Multiple Well Plate - 96 Well With Lid | Corning | 3300 | Cell Bind surface |
Modular Incubator Chamber | Billups-Rothenberg | MIC-101 | A set of two is necessary for simultaneous to generate normoxia and hypoxia/reoxygenation conditions |
Single Flow Meter | Billups-Rothenberg | SFM3001 | |
50 Mm In-Line Filter | Whatman | 6721-5010 | PTFE, pore: 1.0 µm |
Gas Regulator | Pro Star | PRS301233 | A set of two is necessary for simultaneous to generate normoxia and hypoxia/reoxygenation conditions |
Gas Hose Class Vi Clear 5/16 | Parker | 100-05070102 | 3 pieces with ~ 0.5 m |
17 Mm Adjustable Gas Hose Clamp | Tiewraps | THCSS-16 | |
Normoxia Gas Cylinder | Praxair | NI CDOXR1U-K | Size K (3rd trimester‘s composition: 5% CO2, 8% O2, Bal. N2) |
Normoxia Gas Cylinder | Praxair | NI CDOXR1U-K | Size K (3rd trimester‘s composition: 5% CO2, 0.5% O2, Bal. N2) |
Oxygen Microelectrode Mi-730 | Microelectrodes INC | 84477 | |
Oxygen Adapter | Microelectrodes INC | 3572 | |
ROS Detection Reagent: CM-H2DCFDA | Invitrogen | C-400 | |
β-hCG ELISA kit | DRG internatinal | EIA-4115 | |
Anti-Vimentin ourified antibody | eBioscience | 14-9897 | Host: mouse |
Anti-Cytokeratin 7 (FITC) antibody | Abcam | ab119697 | Host: mouse |
Alexa Fluor 488 Goat Anti-mousse IgG H&L antibody | Life Technologies | A-11029 |