This manuscript presents a unique in vitro model of immunopurified human villous cytotrophoblast cells cultured under hypoxia/reoxygenation. This model is suitable to study the protective effects of promising treatments, such as melatonin, on pregnancy complications associated with increased oxidative stress and altered placental function.
This protocol describes how villous cytotrophoblast cells are isolated from placentas at term by successive enzymatic digestions, followed by density centrifugation, media gradient isolation and immunomagnetic purification. As observed in vivo, mononucleated villous cytotrophoblast cells in primary culture differentiate into multinucleated syncytiotrophoblast cells after 72 hr. Compared to normoxia (8% O2), villous cytotrophoblast cells that undergo hypoxia/reoxygenation (0.5% / 8% O2) undergo increased oxidative stress and intrinsic apoptosis, similar to that observed in vivo in pregnancy complications such as preeclampsia, preterm birth, and intrauterine growth restriction. In this context, primary villous trophoblasts cultured under hypoxia/reoxygenation conditions represent a unique experimental system to better understand the mechanisms and signalling pathways that are altered in human placenta and facilitate the search for effective drugs that protect against certain pregnancy disorders. Human villous trophoblasts produce melatonin and express its synthesizing enzymes and receptors. Melatonin has been suggested as a treatment for preeclampsia and intrauterine growth restriction because of its protective antioxidant effects. In the primary villous cytotrophoblast cell model described in this paper, melatonin has no effect on trophoblast cells in normoxic state but restores the redox balance of syncytiotrophoblast cells disrupted by hypoxia/reoxygenation. Thus, human villous trophoblast cells in primary culture are an excellent approach to study the mechanisms behind the protective effects of melatonin on placental function during hypoxia/reoxygenation.
मानव गर्भावस्था के दौरान, अपरा कोशिकापोषकप्रसू कोशिकाओं है, जो स्टेम कोशिकाओं mononucleated कर रहे हैं, तेजी से पैदा और या तो विलस या extravillous कोशिकापोषकप्रसू कोशिकाओं में अंतर। Extravillous cytotrophoblasts आक्रमण और गर्भाशय की दीवार की सर्पिल धमनियों फिर से तैयार करना। विलस cytotrophoblasts, दूसरे हाथ पर, पैदा अंतर और फ्यूज multinucleated syncytiotrophoblast (संकोश) 1 के रूप में करने के लिए जारी है। विलस trophoblast homeostasis के रखरखाव के लिए भ्रूण भलाई और स्वस्थ गर्भावस्था के लिए आवश्यक है। वास्तव में, विलस trophoblasts ऑक्सीजन और पोषक तत्वों की मातृ-भ्रूण विनिमय की अनुमति, और गर्भावस्था के लिए आवश्यक हार्मोन का उत्पादन। इसके अलावा, syncytiotrophoblast मातृ रक्त परिसंचरण के साथ सीधे संपर्क में केवल सेल प्रकार है और एक आवश्यक शारीरिक और प्रतिरक्षा बाधा प्रदान करता है। इसलिए, syncytiotrophoblast होमियोस्टैटिक रखरखाव के लिए apoptosis और प्रतिस्थापन से गुजरना होगा और avo करने के लिएआईडी अपरा 2-5 विकृतियों।
तकनीक 1986 में Kliman एट अल। 6 द्वारा विकसित मानव गर्भनालों से प्राथमिक विलस cytotrophoblasts को अलग-थलग करने के लिए आणविक विलस trophoblast भेदभाव में शामिल तंत्र के अध्ययन की अनुमति से अपरा अनुसंधान के क्षेत्र में एक क्रांति का कारण बना। यह शास्त्रीय तकनीक, trypsin और DNase के साथ अनुक्रमिक एंजाइमी digestions के आधार पर, घनत्व centrifugation मीडिया में अलगाव के बाद (कोलाइडयन सिलिका के कण polyvinylpyrrolidone से लेपित, या Percoll) अब विलस कोशिकापोषकप्रसू कोशिकाओं को अलग करने के लिए स्वर्ण मानक के रूप में मान्यता प्राप्त है। तकनीक चुंबकीय immunopurification, एक प्रक्रिया है कि इन कोशिकाओं की सतह पर विशिष्ट एंटीजन का अंतर अभिव्यक्ति के आधार पर गैर-trophoblastic कोशिकाओं से विलस cytotrophoblasts को अलग से अनुकूलित किया जा सकता। हम trophoblastic सेल membran पर अपनी अभिव्यक्ति के अभाव के कारण मानव ल्युकोसैट प्रतिजन एबीसी (एचएलए-एबीसी) चुनाई 7.8।
अपरा एक अंग है कि गर्भावस्था के दौरान ऑक्सीजन के स्तर में नाटकीय बदलाव कर आए। पहली तिमाही में, ऑक्सीजन अनुपात physiologically बहुत कम (2% ओ 2), लेकिन दूसरी और तीसरी तिमाही में ऑक्सीजन के हल्के स्तर (8% 2 हे) के लिए बढ़ जाती है। टुली एट अल। 9 में वर्णित है कि अपरा विल्ली अंदर trophoblast पर्यावरण की इन विट्रो प्रजनन एक चुनौती है और ऑक्सीजन के स्तर में बदलाव के भी phenotypical परिवर्तन करने के लिए नेतृत्व कर सकते है। यह इसलिए, normoxia के रूप में ऑक्सीजन तनाव हमल 8,9 की तीसरी तिमाही के दौरान अपरा विल्ली में पाया नकल करने के लिए 8% ऑक्सीजन को अपनाने का सुझाव दिया है। चेन एट अल। 10 बड़े पैमाने पर trophoblast सेल संस्कृति में ऑक्सीजन तनाव से संबंधित कई चर का अध्ययन किया और एक pericellular वातावरण में ऑक्सीजन के स्तर को निर्धारित करने के महत्व का प्रदर्शन किया। विल्ली में ऑक्सीजन के स्तर को बढ़ाने के लिए करते हैंvasculogenesis की वजह से। अपरा विल्ली बढ़ जाती लगातार रक्त प्रवाह और हाइड्रोजन पेरोक्साइड के स्तर (एक प्रचुर मात्रा में प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों) एक महत्वपूर्ण संकेत है कि vasculogenesis 11,12 को नियंत्रित करता है। गर्भावस्था की जटिलताओं में, vasculogenesis की कमी हाइपोक्सिया, और अधिक महत्वपूर्ण बात, ऑक्सीजन की रुक-रुक कर रूपों (बुलाया हाइपोक्सिया / reoxygenation) उत्पन्न करता है। इन शर्तों ऑक्सीडेटिव तनाव में एक असामान्य वृद्धि है, जो अपरा और भ्रूण व्यवहार्यता 13,14 समझौता करने के लिए नेतृत्व। परिवर्तन है कि trophoblast कोशिकाओं हाइपोक्सिया / reoxygenation के प्रकरणों के दौरान vivo में इन विट्रो में से गुजरना मजाक उड़ाया जा सकता है इस प्रकार है: विलस cytotrophoblasts normoxic शर्तों (8% ओ 2) जब तक वे syncytiotrophoblast में अंतर के तहत रखा जाता है। वे तो 4 घंटे के लिए कमी वाली स्थिति (0.5% ओ 2) के अधीन हैं, normoxia (reoxygenation) के एक अतिरिक्त 18 घंटा के द्वारा पीछा किया। इस हाइपोक्सिया / reoxygenation दृष्टिकोण का प्रयोग, पूर्व trophoblastshibit, redox स्थिति और आंतरिक apoptosis 8 के स्तर में वृद्धि के रूप में कुछ नियंत्रण मुक्त गर्भावस्था जटिलताओं में देखा गया है। इसलिए, इस गर्भावस्था अपरा हाइपोक्सिया / reoxygenation से संबंधित जटिलताओं से निपटने के लिए नई निवारक और उपचारात्मक दृष्टिकोण का मूल्यांकन करने के लिए इन विट्रो मॉडल में एक उपयोगी है।
अपरा कोशिकाओं मेलाटोनिन, जो इस तरह के ऑक्सीडेटिव तनाव और अपरा शिथिलता 15 का निराकरण करने की क्षमता के रूप में कई महत्वपूर्ण कार्य किया है उत्पादन। यहाँ, हम आणविक, सेलुलर और कार्यात्मक स्तर 8 बजे अपरा trophoblast कोशिकाओं में मेलाटोनिन की सुरक्षात्मक प्रभाव को प्रदर्शित करने के लिए इस्तेमाल प्रयोगात्मक दृष्टिकोण और सेल मॉडल प्रस्तुत करते हैं।
स्तनधारियों में, भ्रूण के विकास सीधे पर्याप्त अपरा समारोह पर निर्भर है। स्वास्थ्य विकार के विकास के मूल परिकल्पना है कि बाद के जीवन में प्रकट रोगों के कारण प्रारंभिक विकास के लिए और नाल भ्रूण प्रोग्र?…
The authors have nothing to disclose.
Supported by grants from the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) (no. 262011-2009) to CV and March of Dimes Social and Behavioral Sciences Research grant (#12-FY12-179) to CV and JTS; by studentships to LSF from the Ministère de l’éducation, de l’Enseignement supérieurs et de la recherche (MEESR)-Fonds de recherche du Québec (FRQ)-Nature et technologies (NT) and the Fondation Universitaire Armand-Frappier INRS, to HC from the Réseau Québécois en Reproduction-NSERC-CREATE, to AAHT from the Canadian Institutes of Health Research (CIHR) and FRQ-Santé, and to JBP from NSERC; by a fellowship to EMAS from the Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientìfico e Tecnològico (CNPq) and the Programme de bourses d’excellence pour étudiants étrangers MEESR-FRQNT.
Curved Metzenbaum Scissors | Shandon | 9212 | surgical equipment (cell isolation) (2 units) |
Splinter Forceps Fine 41/2in | Fisherbrand | 13-812-42 | surgical equipment (cell isolation) (2 units) |
Scissors 4.5 Str Dissection | Fisherbrand | 08-940 | surgical equipment (cell isolation) (2 units) |
Gauze Sponge 10cm X 10cm | Cardinal Health | 361020733 | |
Oblong Glass Baking Dish | Pyrex | 1105397 | Glassware (2.8L) |
Funnel Buchner | Coorstek Inc | 10-356E | Glassware (114MM DIAMeter) |
Watch Glass | pyrex | 9985100EMD | Glassware |
Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128-4L | histological tissue fixative solution |
Trypsinizing Flasks | Wheaton | 355395 | Glassware (1 unit) |
Disposable Culture Tubes | Kimble | 73750-13100 | Glassware |
Borosilicate Glass Pasteur Pipet (22.8 Cm) | Fisherbrand | K63B1367820C | Glassware |
250 Ml Glass Beakers | Fisherbrand | KFS14005250 | Glassware |
Glass Media Bottles With Cap | Fisherbrand | KFS14395250 | Glassware (8 units) |
50 Ml Corex Tube | Corning | 8422-A | (1 unit) |
15 Ml Polystyrene Centrifuge Tube | Corning | 430791 | |
50 Ml Polystyrene Centrifuge Tube | Corning | 430829 | |
10ml Serological Pipet | Corning | 11415038 | |
Cell Strainer 100μm Nylon | Corning | 431752 | |
Absorbant Liner | Scienceware | 1199918 | |
500 Ml Bottles Top Filter | Corning | Pore: 0,22 µm / medium and HBSS preparation | |
2 Ml Criogenic Vials | Corning | 430488 | |
Freezing Container, Nalgene Mr. Frosty | Sigma-Aldrich | C1562-1EA | |
Peristaltic Pump | Pharmacia Fine Chemicals | P3 model | |
Shaking Water Bath | Fisher | Model 127 | |
Vacuum Pump | ABM | 4EKFS6CX-4 | |
Sodium Chloride | Fisherbrand | EC231-598-3 | Saline solution 0.9% |
Hank’s Buffered Salt Solution (Hbss) | Sigma-Aldrich | H2387 | Quantity: 9.25 (one vial) for 1L of digestion solution |
Hydroxypiperazineethansulphonic Acid (Hepes) | Life Technologies | 15630-080 | 25mL (1M) for 1L of digestion solution |
Trypsin Type I | Sigma-Aldrich | T8003 | 9,888U |
Deoxyribonuclease Type Iv | Roche | 10-104-159-001 | 402,000U |
Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C4901 | 100mM |
Magnesium Sulfate | Baker | 2500-01 | 800mM |
Dulbecco’s Modified Eagle Medium High Glucose (Dmem) | Life Technologies | 10564-045 | |
Penicillin/Streptomycin Sulphate | Hyclone | SV30010 | |
Fetal Bovine Serum | Corning | 35-010-CV | |
Percoll | Sigma-Aldrich | P1644 | Density centrifugation media gradient. Volume: 36mL |
Isopropanol | Acros | 42383-0010 | 50mL |
Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | 472301 | |
Automacs Magnetic Separator | Miltenyi Biotec | Model 003 | |
Automacs Columns | Miltenyi Biotec | 130-021-101 | |
Automacs Running Buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | http://www.miltenyibiotec.com/~/media/Images/Products/Import/0001100/IM0001131.ashx?force=1 |
Automacs Rinsing Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | http://www.miltenyibiotec.com/en/products-and-services/macs-cell-separation/cell-separation-buffers/automacs-rinsing-solution.aspx |
Anti-Human Hla Abc Purified Clone W6/32 | Affymetrix eBioscience | 14-9983-82 | anti-mouse antibody |
Anti Mouse Igg Microbeads | Miltenyi Biotec | 130048401 | |
Multiple Well Plate - 6 Well With Lid | Corning | 3335 | Cell Bind surface |
Multiple Well Plate - 24 Well With Lid | Corning | 3337 | Cell Bind surface |
Multiple Well Plate - 96 Well With Lid | Corning | 3300 | Cell Bind surface |
Modular Incubator Chamber | Billups-Rothenberg | MIC-101 | A set of two is necessary for simultaneous to generate normoxia and hypoxia/reoxygenation conditions |
Single Flow Meter | Billups-Rothenberg | SFM3001 | |
50 Mm In-Line Filter | Whatman | 6721-5010 | PTFE, pore: 1.0 µm |
Gas Regulator | Pro Star | PRS301233 | A set of two is necessary for simultaneous to generate normoxia and hypoxia/reoxygenation conditions |
Gas Hose Class Vi Clear 5/16 | Parker | 100-05070102 | 3 pieces with ~ 0.5 m |
17 Mm Adjustable Gas Hose Clamp | Tiewraps | THCSS-16 | |
Normoxia Gas Cylinder | Praxair | NI CDOXR1U-K | Size K (3rd trimester‘s composition: 5% CO2, 8% O2, Bal. N2) |
Normoxia Gas Cylinder | Praxair | NI CDOXR1U-K | Size K (3rd trimester‘s composition: 5% CO2, 0.5% O2, Bal. N2) |
Oxygen Microelectrode Mi-730 | Microelectrodes INC | 84477 | |
Oxygen Adapter | Microelectrodes INC | 3572 | |
ROS Detection Reagent: CM-H2DCFDA | Invitrogen | C-400 | |
β-hCG ELISA kit | DRG internatinal | EIA-4115 | |
Anti-Vimentin ourified antibody | eBioscience | 14-9897 | Host: mouse |
Anti-Cytokeratin 7 (FITC) antibody | Abcam | ab119697 | Host: mouse |
Alexa Fluor 488 Goat Anti-mousse IgG H&L antibody | Life Technologies | A-11029 |