lesões renais decorrentes de nefrotoxinas, que incluem drogas que variam de antibióticos para quimioterápicos, pode resultar em doenças complexas, cuja patogênese permanece incompletamente compreendida. Este protocolo demonstra como peixe-zebra pode ser utilizado para modelar doenças destas condições, que podem ser aplicados para a identificação de medidas renoprotetor.
Os rins são suscetíveis a danos causados por exposição a produtos químicos que filtram da corrente sanguínea. Isso pode levar a lesões de órgãos associada a um rápido declínio da função e desenvolvimento da síndrome clínica conhecida como lesão renal aguda (LRA) renal. Os agentes farmacológicos usados para tratar condições médicas que variam de infecção bacteriana para cancro, quando administrados individualmente ou em combinação com outras drogas, pode iniciar LRA. Os peixes-zebra são um modelo animal útil para o estudo dos efeitos químicos sobre a função renal, in vivo, uma vez que formam um rim embrionário composta de unidades de nefrónios funcionais que são conservados com vertebrados superiores, incluindo seres humanos. Além disso, o peixe-zebra pode ser utilizado para realizar telas genéticos e químicas, que fornecem oportunidades para elucidar as facetas celulares e moleculares de AKI e desenvolver estratégias terapêuticas tais como identificação de moléculas nefroprotector. Aqui, demonstramos como microinjeção noembrião do peixe-zebra pode ser utilizado como um paradigma para estudos nefrotoxina.
LRA é uma perda abrupta da função renal que pode conduzir a consequências devastadoras saúde 1. AKI é uma questão importante de saúde em todo o mundo devido à sua alta incidência de aproximadamente 20% entre os pacientes hospitalizados, com taxas ainda maiores de 30-50% em casos de cuidados críticos e os idosos, e as taxas de mortalidade de 50-70% 1-3. Infelizmente, a prevalência de AKI tem vindo a aumentar e está projetado para aumentar ainda mais durante a próxima década, em parte devido à diversidade de fatores que podem induzir AKI, que incluem stress pós-operatório, isquemia e exposição a nefrotoxinas como antibióticos e 4 fármacos quimioterapêuticos.
LRA envolve dano celular súbita dentro do rim, que ocorre comumente na nefrónios, que são as unidades funcionais essenciais, e são constituídos por um filtro de sangue e um túbulo segmentada que drena a urina em condutas de recolha central 1. Quando um número significativo de néfrons sãodanificada durante LRA, os efeitos imediatos incluem uma interrupção na depuração de resíduos a partir da circulação, e reduzida ou abolida através de fluxo de fluido nefrónios devido à obstrução de células mortas e moribundas 1. Ao longo do tempo, a obstrução tubular pode levar à degeneração de nefrónios inteiras, o que reduz de forma permanente da função renal 1. Alterações fisiológicas no rim seguintes AKI também envolvem eventos inflamatórios que podem levar a cicatrizes crônica 1.
Apesar destes resultados, néfrons têm alguma capacidade de se submeter a regeneração após AKI que reconstitui a 5,6 epitélio tubular. Embora tenha havido uma compreensão molecular crescente de regeneração néfron, os mecanismos são ainda imperceptíveis em muitos aspectos e necessitam continuou investigação 7. O grau em que LRA resulta em dano renal permanente também permanece desconhecida. A investigação actual sugere o potencial de regeneração para o rim é omaior seguinte casos menos graves de AKI, enquanto episódios mais pronunciados ou repetidas levar à doença renal crônica (DRC) e culminam com doença renal terminal (DRT) que requer transplante ou diálise 8,9 salva-vidas. Além disso, os indivíduos que já sofrem de doença renal crônica têm um risco ainda maior de contrair um episódio grave de AKI 8,9. Tomados em conjunto, é claro que continuou pesquisa básica e clínica é vital para compreender, tratar e prevenir a AKI.
A pesquisa com modelos animais tem sido fundamental para apreciar a progressão de alterações locais e ambientais que ocorrem durante AKI 10. Para expandir este entendimento, bem como desenvolver novas terapias, o modelo animal peixe-zebra foi empregada em uma variedade de formas 11,12. Os nefrónios do rim do peixe-zebra, tanto no embrião e do adulto, apresentam um elevado grau de conservação com mamíferos 13-16. Além disso, lesão epitelial nephron em zebrafish se assemelha ao processo em vertebrados superiores, em que a destruição local de células tubulares é seguida pela proliferação intratubular e restabelecimento da arquitectura nefrónios 17-19. No embrião, no entanto, grandes danos túbulo das nefrotoxinas como cisplatina está associado com letalidade 20,21. Em comparação, os adultos de peixe-zebra sobreviver AKI e exibem capacidades regenerativas substantivas no rim. Por exemplo, após a exposição ao antibiótico aminoglicósido gentamicina, peixe-zebra regenerar dano epitelial dos túbulos e crescer novas unidades de nefrónios bem como 22-24. Embora esses estudos LRA induzida por gentamicina ter fornecido informações valiosas, entendendo dano renal de diversas nefrotoxinas permanece crítica para apreciar os efeitos e resposta a diferentes tipos de danos 25.
O embrião de peixe-zebra, devido ao seu tamanho, transparência e rastreabilidade genética, tem muitos benefícios para estudos nefrotoxina <sup> 25, em que o método de microinjecção 20,21 é utilizado para administrar a molécula (s) para a investigação. Néfrons são formados por 24 horas após a fertilização (hpf) e começar a filtrar o sangue por cerca de 48 hpf 26,27. Assim, a rápida formação e a função do rim embrionário facilita a análise experimental. No entanto, o processo de microinjeção tem desafios técnicos e não pode haver uma curva de aprendizagem para dominar a técnica. Neste artigo de vídeo, que descrevem como realizar e proporcionar microinjections dicas de resolução de problemas, a fim de aumentar a taxa de sucesso de injecções.
Um número diverso de agentes terapêuticos têm sido associados com LRA 29. Tem havido avanços significativos na compreensão de investigação do dano induzido por muitos compostos individuais, tais como a gentamicina aminoglicósido 30 e a cisplatina quimioterapêutico largamente utilizado 31,32. Algumas alterações patológicas envolvidos nestas condições, no entanto, continuar a ser objecto de estudo em curso. Um desafio emergente continua a compreensão de como múltiplas droga…
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi financiado em parte pelo DP2OD008470 concessão NIH. Além disso, RAM foi apoiado em parte por fundos fornecidos pela Universidade de Notre Dame Graduate School. Agradecemos aos funcionários do Departamento de Ciências Biológicas, o Centro de Zebrafish Research, e do Centro de Células Estaminais e Medicina Regenerativa na Universidade de Notre Dame. Agradecemos especialmente os membros do laboratório para envolver discussões sobre a biologia rim e seu feedback útil sobre este trabalho.
Sodium Chloride | American Bioanalytical | AB01915 | |
Potassium Chloride | American Bioanalytical | AB01652 | |
Calcium Chloride | American Bioanalytical | AB00366 | |
N-Phenylthiourea (PTU) | Aldrich Chemistry | P7629 | |
Ethyl 3-aminobenzoate (Tricaine) | Fluka Analytical | A5040 | |
Borosilicate glass | Sutter Instruments Co. | BF100-50-10 | |
Flaming/Brown Micropipette puller | Sutter Instruments Co. | Mo. P097 | |
UltraPure Agarose | Invitrogen | 15510-027 | |
Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | |
Methylene Blue | Sigma-Aldrich | M9140 | |
Falcon Diposable Petri Dishes, Sterile, Corning: | |||
60mm x 15mm | VWR | 25373-085 | |
100mm x 15mm | VWR | 25373-100 | |
(microinjection tray) 150mm x 15mm | VWR | 25373-187 | |
Low Temperature Incubator | Fischer Scientific | 11 690 516DQ | |
Micro Dissecting Tweezer | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5010 | |
Micrometer | Ted Pella, Inc. | 2280-24 |