Protocol
Leukaferese blev udført under et menneske forskning protokol godkendt af en National Institutes of Health institutionelle Review Board.
1. Isolering og Kryopræservering af monocytter
- Opnå mononukleære celler ved leukaferese af humane donorer, og berige monocytter ved kontinuerlig modstrøms centrifugering slæmning af mononukleære celler som beskrevet i referencerne 7,8. Opnå ca. 100 x 10 6 elutrieret celler (ca. 80 - 90% monocytter) i elutriation buffer angivet af fabrikanten. Tæl celler under anvendelse af et hæmocytometer.
- Centrifuge monocytter i et 15 ml polypropylenrør ved 300 xg i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Fjern supernatanten og forsigtigt resuspender cellerne i FBS efterfulgt af dimethylsulfoxid til opnåelse af en slutkoncentration på 90% FBS / 10% dimethylsulfoxid og 50 x 10 6 celler / ml.
- Tilføj hver ml cellesuspension to en individuel cryovial.
- Placer kryoglas i en celle frysning beholder og overføres til en -80 ° C fryser i 24 timer før overførsel til en flydende nitrogen kryohætteglas lagertank til langtidsopbevaring.
2. Differentiering af monocytter til makrofager
- Tø et kryoglas af celler ved hurtigt at overføre til et 37 ° C vandbad og derefter straks fjernes når cellesuspensionen er tøet omkring 70%.
- Straks efter fuldstændig optøning ved stuetemperatur, overføre 1 ml kryoglas indhold i 50 ml 37 ° C opvarmet Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium med 2 mM L-glutamin, 50 ng / ml M-CSF, 25 ng / ml interleukin-10 (IL-10), og 10% FBS (komplet medium).
- Transfer 25 ml monocyt suspension i hver af to 75 cm2 plastik celledyrkningskolber.
- Inkuber kulturer i et 37 ° C cellekultur inkubator med 5% CO2 / 95% luft i 48 timer.
- Skyl cultures 3 gange med 10 ml RPMI 1640 medium (pre-opvarmet til 37 ° C), forsigtigt fjerne dyrkningsmediet ikke forskubbes eventuelle løst bundne celler.
- Efter skylning, tilsæt frisk komplet medium, ændre medium hver 2. dag indtil monocytter differentiere og formere tilstrækkeligt til at blive sammenflydende. Dette kræver ca. en uges kultur.
3. Høst makrofager Igangsætte Eksperimenter
- Skyl differentierede makrofager i kolbe 3 gange med 10 ml forvarmet 37 ° C Dulbeccos phosphatbufret saltvand uden Ca2 + og Mg2 + før tilsætning af 10 ml forvarmet 37 ° C 0,25% trypsin-ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) opløsning.
- Sted kolbe i cellekultur inkubator i 10 - 15 minutter, på hvilket tidspunkt ca. 90% af makrofagerne bør have afrundede og fritliggende. Kontroller dette ved mikroskopisk undersøgelse af kolben.
- Der tilsættes 10 ml RMPI 1640-medium indeholdende 10% FBS til stop trypsinisering.
- Overfør makrofag cellesuspension fra kolben til et 50 ml polypropylen rør, centrifuge 300 xg i 5 min, og kassér supernatanten.
- resuspender forsigtigt makrofagerne i 1 ml komplet medium.
- Bland 10 pi makrofag cellesuspension med 10 pi trypanblåt-opløsning og bestemme makrofag celleantal og levedygtighed (typisk> 95%) under anvendelse af et hæmocytometer.
- Baseret på celletælling (sædvanligvis ca. 15 - 18 x 10 5 makrofager), tilføje yderligere komplet medium til opnåelse af den ønskede seeding celledensitet. Bemærk: 1 x 10 5 makrofager i 1,5 ml medium per brønd af en 12-brønds plade vil producere en nær-sammenflydende kultur.
- Efter podning inkuberes makrofager natten over i en 37 ° C cellekultur inkubator med 5% CO2 / 95% luft for at tillade cellevedhæftning. Derefter begynder ønskede eksperimenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Levedygtighed friske eller cryokonserverede monocytter var større end 95% som bestemt med Trypan Blue-farvning 9. Figur 1 og figur 2 sammenlignes ved lavere og højere forstørrelser henholdsvis forløbet af friske og kryopræserveret (dvs. frosne) monocyt differentiering til makrofager. Bemærk, at den friske sammenlignet med kryopræserverede monocytter viser en delpopulation differentiere monocytter, der ikke spredes, men forbliver afrundet. Fase-Lucent vakuoler forekomme i monocytafledte makrofager i begge betingelser. Disse vakuoler repræsenterer macropinosomes karakteristisk for M-CSF typen makrofager som tidligere beskrevet 10,11.
Cryopræserverende makrofager efter deres høst fra kolberne, hvor de blev differentieret fra monocytter producerede ikke vellykkede makrofagkulturer ( Ovenstående protokol til fremstilling af M-CSF typen makrofager gør det uden tilstedeværelse af kontaminerende GM-CSF typen makrofager, der kan forekomme, når kulturer etableres direkte fra monocytter uden deres kryopræservering og differentiering til M-CSF typen makrofager i kolber. Imidlertid kryopræserverede monocytter differentieret med FBS + GM-CSF producere fremragende GM-CSF Type Cultures (figur 4). 
Figur 1: Sammenligning af frisk versus kryopræserverede monocytter bruges til at producere makrofager (lav forstørrelse) Fase kontrast mikroskopiske billeder af kryopræserverede (frosne) og friske monocytter under deres M-CSF induceret differentiering i. NTO makrofager. Vist er monocytter under kultur i kolber på 3 og 7 dage, og på dag 8, en dag efter deres høst og -genudpladning i 12-brønds dyrkningsplader. Bar = 100 um og gælder for alle. Klik her for at se en større version af dette tal. 
Figur 2:. Sammenligning af frisk versus kryopræserverede monocytter anvendes til fremstilling af makrofager (høj forstørrelse) Monocytter blev dyrket som beskrevet i figur 1 legende og vist her ved højere forstørrelse. Fase-Lucent vakuoler er macropinosomes (hvide pile). Bar = 50 um og gælder for alle. Klik her for at se en større version af dette tal. 
Figur 3: kryopræserveret makrofager ikke producerer tilstrækkelige kulturer Friske monocytter blev podet i en kolbe og differentierede 7 dage med M-CSF, som vist i figur 1 og 2 ovenfor.. Derefter blev de differentierede makrofager høstet fra kolber og kryopræserveret. Dernæst blev kryopræserverede makrofager podet i plader med 12 brønde som beskrevet i protokollen for ikke-kryopræserverede makrofager og dyrkes 1 dag (dag 8). Fase kontrast mikroskopisk billede af 1-dags kultur, viser, at meget få af de makrofager vedhæfte efter deres kryopræservering (sammenlign til dag 8 resultater for ikke-kryopræserverede makrofager i figur 1 ovenfor). Bar = 100 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4:. Kryopræserverede monocytter var også egnet til at producere GM-CSF typen monocytafledte makrofager Kryopræserverede monocytter (25 x 10 6) blev podet i en kolbe og differentierede 8 dage med 10% FBS indeholdende 50 ng / ml GM-CSF. Fase-kontrast billede viser den typiske "spejlæg" morfologi GM-CSF typen makrofager. Bar = 100 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Generering definerede makrofag typer kan afklare nogle af de modstridende resultater, som efterforskerne, når man studerer makrofag biologi. Brugen af forskellige dyrkningsbetingelser og differentieringsfaktorer at generere primære humane makrofager kan føre til meget forskellige makrofag typer, en kendsgerning, der ikke kan forstås af forskeren. For eksempel makrofager undertiden genereres fra humane monocytter uden anvendelse af serum, humant serum alene, humant serum suppleret med M-CSF, FBS alene, eller FBS indeholdende M-CSF eller GM-CSF. Som rapporteret tidligere, og som vi også har observeret, monocytter dyrket i en uge uden serum eller med FBS uden tilsatte differentieringsfaktorer ikke forblive levedygtig 3. Som nævnt ovenfor, monocytter dyrket med human serum alene eller suppleret med M-CSF generere makrofager, der viser "spejlæg" morfologi karakteristisk for monocytter differentierede med FBS plus GM-CSF. Således, i nærvær af humant serum M-CSF typen makrofag viser en mere langstrakt morfologi ikke opnås selvom monocytter er blevet differentieret med M-CSF.
Interessant nok har vi observeret, at differentieringen af monocytter med FBS indeholdende både M-CSF og GM-CSF, genererer både M-CSF langstrakt og GM-CSF "spejlæg" morfologiske fænotyper i den samme kultur. Dette antyder, at distinkte monocyt subpopulationer giver anledning til disse to makrofag typer. Tidligere undersøgelser har vist, at M-CSF og GM-CSF differentieringsfaktorer påvirker ikke kun morfologi makrofagen, men også påvirke genekspression og cellefunktion, der er væsentligt forskelligt for de to makrofag typer 2-6. Immunfarvning for makrofag CD68 sammen med CD14, som udtrykkes af M-CSF typen makrofager og 25F9, der er udtrykt af GM-CSF makrofager kan anvendes til at bekræfte makrofag type som tidligere 2 vist. Disse to makrofag typer may være særligt relevante for undersøgelsen af åreforkalkning, hvor forskellige makrofag typer forekommer i aterosklerotiske plaques og kan vise forskelle i kolesterol metabolisme og udtryk for betændelse mæglere 2,12,13. For eksempel M-CSF typen makrofager er unikke ved, at disse makrofager deponering cholesterol i den ekstracellulære matrix, når makrofagerne er beriget med cholesterol 12,14,15.
I den protokol præsenteret, under dyrkning med M-CSF, har IL-10 blevet rutinemæssigt tilføjet som tidligere 16 beskrevet. Dette cytokin fremmer væksten og differentiering af makrofagerne og danner en mere homogen langstrakt morfologi af makrofager. Desuden IL-10 inhiberer GM-CSF-afhængig monocyt overlevelse ved at hæmme de signaleringshændelser induceret af GM-CSF 17. Dog bør undersøgere, at IL-10 kan påvirke andre celleresponser under undersøgelse, og derfor kan ønske at udelade IL-10. Føranvendelse af den nuværende protokol anvender proliferation og differentiering af monocytter i en kolbe blev der makrofagkulturer initieret ved direkte udpladning elutrieret monocytter til kulturbrønde og differentiere dem i 7 dage inden påbegyndelse eksperimenter. Men selv med tilsætning af IL-10, nogle af disse makrofag kulturer viste, små tal (sædvanligvis mindre end 10%) af "spejlæg" GM-CSF typen makrofager kontaminerende de langstrakte M-CSF typen makrofager. Med den nuværende protokol, er GM-CSF typen makrofag forurening ikke forekomme af grunde, der ikke er klar. Imidlertid er det ikke fordi GM-CSF makrofag typen precursor monocytter går tabt under frysning, som dyrkning af de kryopræserverede monocytter med FBS + GM-CSF producerer fremragende GM-CSF Type Cultures (se figur 4).
Den beskrevne protokol udnytter kryokonservering af monocytter før deres differentiering til makrofager. Monocyt kryopræservering har været previously vist ikke at påvirke monocyt funktion og er almindeligt anvendt 18-21. I denne forbindelse har vi konstateret, at makrofager frembragt af forskrift ovenfor deponering cholesterol ind i det ekstracellulære rum svarer til, hvad vi tidligere har beskrevet med ikke-kryopræserverede monocytter, der blev dyrket direkte i makrofager 12. Med monocyt nedfrysning, monocytter er altid til rådighed til at iværksætte eksperimenter, uafhængigt af hvor monocytter kan fås fra en donor. Selv om det ikke er afgørende at kryopræservere monocytterne før du fortsætter med protokollen, kryopræservering gjorde producere mere homogene makrofagkulturer i at alle makrofager blev mere spredt snarere end at være både afrundede og spredes som det var tilfældet, da friske monocytter blev brugt til at initiere kulturer. Vi har med succes skabt makrofagkulturer fra monocytter, der blev holdt nedfrosset indtil 6 måneder, (længst testet). På den anden side, såning af kryopræserveret macrophages i kultur brønde til eksperimenter gav ikke tilstrækkelige makrofagkulturer.
Kritiske trin i protokollen indeholde umiddelbart placere monocytter i fryseren efter tilsætning af dimethylsulfoxid, og straks overføre optøede monocytter til dyrkningsmediet. Selv om det er almindeligt at fjerne DMSO ved centrifugering frosne celler, før de podes i kultur, fandt vi ikke dette var et nødvendigt skridt i en vellykket kultur af monocytter. Dog kan efterforskerne nødt til at gøre dette, hvis koncentrationen af resterende DMSO (2 pl / ml) er højere end det, der blev anvendt i den ovennævnte protokol. Det er vigtigt ikke at skylle monocytter indtil 48 timer efter deres såning i dyrkningskolber. Ellers kan nogle monocytter tabt afhængigt af deres grad af adhæsion til kulturen overflade. På den anden side, når monocytterne differentiere til makrofager, forøget adhæsion af makrofagerne kan kræve længere trypsinbehandling for at fjerne dem,eller en celle løfteren kan anvendes til at lette frigivelse efter den indledende trypsinbehandling. Hvis monocytter ikke proliferere og differentiere, kunne dette skyldes, at nogle usædvanlige egenskab ved monocyt donor, tab af aktivitet af M-CSF, eller på grund af masse FBS anvendes. Også af mulige bekymring, når kulturerne ikke udvikler er kontaminering af reagenser med endotoksin, et middel, der inhiberer makrofag proliferation 22.
Differentiering de kryopræserverede monocytter i kolber med M-CSF giver deres bulk-differentiering i makrofager. Derefter kan makrofagerne høstes og podet i dyrkningsbrønde på nødvendige celletætheder til udførelse af eksperimenter. Anvendelsen af definerede antal makrofager i stedet for definerede antal monocytter at initiere makrofagkulturer til eksperimenter, giver makrofag kulturer, hvor den ønskede celledensitet kan mere konsekvent opnået.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cellbind 12-well culture plate | Corning | 3336 | |
| CELLSTAR, T-75 flask, tissue culture treated | Greiner Bio-One North America | 658157 | |
| RPMI 1640 culture medium | Cellgro Mediatech | 15-040-CM | warmed to 37 °C |
| L-Glutamine | Cellgro Mediatech | 25-005-CI | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000-036 | |
| M-CSF | PeproTech | 300-25 | |
| GM-CSF | PeproTech | 300-03 | |
| IL-10 | PeproTech | 200-10 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Cryovial | Thermo Scientific | 375418 | |
| DPBS without Ca2+ and Mg2+ | Corning cellgro | 21-031-CV | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| 50 ml polypropylene conical tube | Falcon | 352070 | |
| Trypan Blue | Lonza | 17-942E | |
| Neubauer-improved bright light hemocytometer | Paul Marienfeld GmbH & Co. KG | 610031 | http://www.marienfeld-superior.com/index.php/counting-chambers/articles/counting-chambers.html |
| CoolCell LX cell freezing container | BioCision | BCS-405 | other freezing containers also should be adequate for this step |
| Liquid Nitrogen Storage System, CryoPlus 1 | Thermo Scientific | 7400 | any liquid nitrogen tank should be adequate |
References
- Dey, A., Allen, J., Hankey-Giblin, P. A. Ontogeny and polarization of macrophages in inflammation: blood monocytes versus tissue macrophages. Front. Immunol. 5, 683 (2014).
- Waldo, S. W., et al. Heterogeneity of human macrophages in culture and in atherosclerotic plaques. Am. J. Pathol. 172, 1112-1126 (2008).
- Akagawa, K. S. Functional heterogeneity of colony-stimulating factor-induced human monocyte-derived macrophages. Int. J. Hematol. 76, 27-34 (2002).
- Akagawa, K. S., et al. Functional heterogeneity of colony-stimulating factor-induced human monocyte-derived macrophages. Respirology. 11 Suppl, S32-S36 (2006).
- Fleetwood, A. J., Lawrence, T., Hamilton, J. A., Cook, A. D. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (CSF) and macrophage CSF-dependent macrophage phenotypes display differences in cytokine profiles and transcription factor activities: implications for CSF blockade in inflammation. J. Immunol. 178, 5245-5252 (2007).
- Lacey, D. C., et al. Defining GM-CSF- and macrophage-CSF-dependent macrophage responses by in vitro models. J. Immunol. 188, 5752-5765 (2012).
- Strasser, E. F., Eckstein, R. Optimization of leukocyte collection and monocyte isolation for dendritic cell culture. Transfus. Med. Rev. 24, 130-139 (2010).
- Kim, S., et al. Monocyte enrichment from leukapheresis products by using the Elutra cell separator. Transfusion (Paris). 47, 2290-2296 (2007).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr. Protoc. Immunol. Appendix 3 (Appendix 3B), (2001).
- Anzinger, J. J., et al. Native low-density lipoprotein uptake by macrophage colony-stimulating factor-differentiated human macrophages is mediated by macropinocytosis and micropinocytosis. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 30, 2022-2031 (2010).
- Zhao, B., et al. Constitutive receptor-independent low density lipoprotein uptake and cholesterol accumulation by macrophages differentiated from human monocytes with macrophage-colony-stimulating factor (M-CSF). J. Biol. Chem. 281, 15757-15762 (2006).
- Freeman, S. R., et al. ABCG1-mediated generation of extracellular cholesterol microdomains. J. Lipid Res. 55, 115-127 (2014).
- Kruth, H. S. Receptor-independent fluid-phase pinocytosis mechanisms for induction of foam cell formation with native low-density lipoprotein particles. Curr. Opin. Lipidol. 22, 386-393 (2011).
- Jin, X., et al. ABCA1 contributes to macrophage deposition of extracellular cholesterol. J. Lipid Res. 56, 1720-1726 (2015).
- Ong, D. S., et al. Extracellular cholesterol-rich microdomains generated by human macrophages and their potential function in reverse cholesterol transport. J. Lipid Res. 51, 2303-2313 (2010).
- Hashimoto, S., Yamada, M., Motoyoshi, K., Akagawa, K. S. Enhancement of macrophage colony-stimulating factor-induced growth and differentiation of human monocytes by interleukin-10. Blood. 89, 315-321 (1997).
- Hashimoto, S. I., Komuro, I., Yamada, M., Akagawa, K. S. IL-10 inhibits granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-dependent human monocyte survival at the early stage of the culture and inhibits the generation of macrophages. J. Immunol. 167, 3619-3625 (2001).
- Lund, P. K., Joo, G. B., Westvik, A. B., Ovstebo, R., Kierulf, P. Isolation of monocytes from whole blood by density gradient centrifugation and counter-current elutriation followed by cryopreservation: six years' experience. Scand. J. Clin. Lab. Invest. 60, 357-365 (2000).
- Weiner, R. S., Normann, S. J. Functional integrity of cryopreserved human monocytes. J. Natl. Cancer Inst. 66, 255-260 (1981).
- Hansen, J. B., et al. Retention of phagocytic functions in cryopreserved human monocytes. J. Leukoc. Biol. 57, 235-241 (1995).
- Seager Danciger, J., et al. Method for large scale isolation, culture and cryopreservation of human monocytes suitable for chemotaxis, cellular adhesion assays, macrophage and dendritic cell differentiation. J. Immunol. Methods. 288, 123-134 (2004).
- Jin, X., Xu, Q., Champion, K., Kruth, H. S. Endotoxin contamination of apolipoprotein A-I: effect on macrophage proliferation--a cautionary tale. Atherosclerosis. 240, 121-124 (2015).
