Protocol
Leukaferese werd uitgevoerd onder een menselijk onderwerp onderzoeksprotocol door een National Institutes of Health Institutional Review Board goedgekeurd uitgevoerd.
1. Isolatie en cryopreservatie van monocyten
- Verkrijgen mononucleaire cellen door leukaferese van humane donoren en verrijken monocyten door continue tegenstroom centrifugatie elutie van mononucleaire cellen zoals beschreven in de referenties 7,8. Verkrijgen ongeveer 100 x 10 6 cellen elutriated (ongeveer 80 - 90% monocyten) in elutratie buffer die door de fabrikant. Aantal cellen met een hemocytometer.
- Centrifuge monocyten in een 15 ml polypropyleen buis bij 300 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen voorzichtig in FBS vervolgens dimethylsulfoxide tot een uiteindelijke concentratie van 90% FBS / 10% dimethylsulfoxide en 50 x 10 6 cellen / ml bereiken.
- Voeg elke ml celsuspensie to een individuele cryovial.
- Plaats de cryovials in een cel bevriezen houder en overbrengen naar een -80 ° C vriezer gedurende 24 uur alvorens naar een vloeibare stikstof cryovial opslagtank voor langdurige opslag.
2. Differentiatie van monocyten tot macrofagen
- Dooi een cryovial van de cellen door het snel overbrengen naar een 37 ° C waterbad en dan onmiddellijk te verwijderen wanneer de cel suspensie ongeveer 70% is ontdooid.
- Onmiddellijk na volledig ontdooien bij kamertemperatuur, breng de 1 ml cryovial inhoud in 50 ml 37 ° C opgewarmd Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium met 2 mM L-glutamine, 50 ng / ml M-CSF, 25 ng / ml interleukine-10 (IL-10) en 10% FBS (volledig medium).
- Overdracht 25 ml van monocyten suspensie in elk van twee 75 cm 2 plastic celkweek kolven.
- Incubeer kweken in een 37 ° C celkweek incubator met 5% CO2 / 95% lucht gedurende 48 uur.
- Spoel de cultures 3 maal met 10 ml RPMI 1640 medium (voorverwarmd tot 37 ° C) voorzichtig verwijderen van het kweekmedium te voorkomen loskomen elke losjes verbonden cellen.
- Na spoelen, voeg vers compleet medium, het veranderen medium elke 2 dagen tot monocyten differentiëren en vermenigvuldigen voldoende om confluent worden. Dit vergt ongeveer een week van de cultuur.
3. Oogsten Macrofagen experimenten starten
- Spoel gedifferentieerde macrofagen in kolf 3 maal met 10 ml voorverwarmd 37 ° C Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing zonder Ca2 + en Mg2 + voordat 10 ml voorverwarmd 37 ° C 0,25% trypsine-ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) oplossing.
- Cuvette in celkweek incubator gedurende 10 - 15 min waarna ongeveer 90% van de macrofagen moeten rond en losgemaakt. Verifieer dit door microscopisch onderzoek van de kolf.
- Voeg 10 ml RMPI 1640 medium dat 10% FBS tot stop trypsine.
- Breng de macrofaag celsuspensie uit de kolf in een 50 ml polypropyleen buis, centrifuge 300 xg gedurende 5 min en gooi het supernatant.
- Voorzichtig resuspendeer de macrofagen in 1 ml compleet medium.
- Meng 10 pl macrofaag celsuspensie met 10 pi trypan blauwe oplossing en bepaal macrofaag celaantal en levensvatbaarheid (gewoonlijk> 95%) met een hemocytometer.
- Op basis van het aantal cellen (gewoonlijk ongeveer 15-18 x 10 5 macrofagen), voeg extra compleet medium om de gewenste zaaien celdichtheid bereiken. Opmerking: 1 x 10 5 macrofagen in 1,5 ml medium per putje van een 12-wells plaat zal een bijna-confluente cultuur te produceren.
- Na enten macrofagen incubeer overnacht in een 37 ° C celkweek incubator met 5% CO2 / 95% lucht celhechting mogelijk. Vervolgens beginnen gewenste experimenten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De levensvatbaarheid van vers of gecryopreserveerde monocyten was hoger dan 95%, bepaald met Trypan Blue kleuring 9. Figuur 1 en Figuur 2 vergelijkt bij lagere en hogere vergrotingen, respectievelijk, de voortgang van verse en gecryopreserveerd (dwz bevroren) monocytdifferentiatie tot macrofagen. Merk op dat de verse opzichte van gecryopreserveerde monocyten tonen een subpopulatie differentiëren monocyten die niet verspreiden maar blijft afgerond. Phase-Lucent vacuoles optreden in de van monocyten afgeleide macrofagen in beide condities. Deze vacuolen vertegenwoordigen macropinosomes kenmerk van M-CSF het type macrofagen zoals eerder beschreven 10,11.
Cryopreserving macrofagen na het oogsten van de kolven waarin zij zijn gedifferentieerd uit monocyten veroorzaakte geen succesvol macrofaagkweken ( De bovenstaande protocol voor het produceren van M-CSF Type macrofagen doet dit zonder de aanwezigheid van verontreinigende GM-CSF soort macrofagen die soms optreedt bij het kweken van monocyten rechtstreeks zonder hun cryopreservatie en differentiatie M-CSF soort macrofagen in kolven worden vastgesteld. Echter, gecryopreserveerde monocyten gedifferentieerd FBS + GM-CSF produceert uitmuntend type GM-CSF kweken (figuur 4). 
Figuur 1: Vergelijking van verse versus gecryopreserveerde monocyten gebruikt om macrofagen (lage vergroting) produceren Phase-contrast microscopische beelden van gecryopreserveerd (bevroren) en verse monocyten tijdens hun M-CSF geïnduceerde differentiatie i. nto macrofagen. Getoond worden monocyten tijdens de cultuur in kolven op 3 en 7 dagen, en op dag 8, een dag na hun oogst en replating in 12-putjes. Bar = 100 urn en geldt voor iedereen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. 
Figuur 2. Vergelijking van verse versus gecryopreserveerde monocyten gebruikt macrofagen (hoge vergroting) Monocyten werden gekweekt zoals beschreven in figuur 1 legenda en hier bij een grotere vergroting. Phase-Lucent vacuolen zijn macropinosomes (witte pijlen). Bar = 50 pm en geldt voor iedereen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. 
Figuur 3: gecryopreserveerde macrofagen geen adequate cultures produceren verse monocyten werden geënt in een kolf en gedifferentieerde 7 dagen met M-CSF volgens de figuren 1 en 2 hierboven.. Vervolgens werden de gedifferentieerde macrofagen geoogst kolven en gecryopreserveerd. Vervolgens werden de gecryopreserveerde macrofagen gezaaid in 12-well platen zoals beschreven in het protocol voor niet-gecryopreserveerd macrofagen en gekweekt 1 dag (dag 8). Fase-contrast microscopische beeld van de 1-daagse cultuur toont aan dat zeer weinig van de macrofagen hechten na hun cryopreservatie (te vergelijken met de dag 8 resultaten voor niet-gecryopreserveerd macrofagen in figuur 1 hierboven). Bar = 100 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4:. Gecryopreserveerde monocyten ook geschikt type GM-CSF-monocyten afgeleide macrofagen gecryopreserveerde monocyten (25 x 10 6) werden geënt in een kolf en 8 dagen gedifferentieerd met 10% FBS bevattende 50 ng / ml GM-CSF. image fase-contrast toont de typische "gebakken ei" morfologie van GM-CSF soort macrofagen. Bar = 100 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het genereren van gedefinieerde typen macrofaag kan een deel van de tegenstrijdige resultaten verkregen door de onderzoekers bij het bestuderen van macrofaag biologie te verduidelijken. Het gebruik van verschillende kweekomstandigheden en differentiatiefactoren genereren primaire humane macrofagen kan leiden tot zeer verschillende typen macrofaag, een feit dat niet kan worden gewaardeerd door de onderzoeker. Bijvoorbeeld, macrofagen soms gegenereerd uit humane monocyten gebruiken, wordt geen serum, humaan serum alleen, humaan serum aangevuld met M-CSF, alleen FBS of FBS bevattende M-CSF of GM-CSF. Zoals eerder vermeld en zoals we ook hebben opgemerkt, monocyten gekweekt gedurende een week zonder serum of FBS zonder toevoeging differentiatiefactoren niet levensvatbaar 3 blijven. Zoals hierboven vermeld, monocyten gekweekt met humaan serum alleen of gesupplementeerd met M-CSF macrofagen genereren dat de "gebakken ei" morfologie kenmerkend monocyten gedifferentieerd FBS plus GM-CSF zien. Zo is in de aanwezigheid van humaan serum de M-CSF soort macrofaag toont een langwerpige morfologie niet wordt verkregen, ook al monocyten worden onderscheiden met M-CSF.
Interessant genoeg hebben we vastgesteld dat differentiatie van monocyten met FBS met zowel M-CSF en GM-CSF, genereert zowel M-CSF langwerpig en GM-CSF "gebakken ei" morfologische fenotypen in dezelfde cultuur. Dit suggereert dat monocyten verschillende subpopulaties leiden deze twee typen macrofaag. Eerdere studies hebben aangetoond dat M-CSF en GM-CSF differentiatiefactoren die niet alleen de morfologie van de macrofaag, maar ook genexpressie beïnvloeden en celfunctie, die wezenlijk verschilt van deze twee typen macrofaag 2-6. Immunokleuring voor macrofaag marker CD68 tezamen met CD14 dat tot expressie gebracht door M-CSF soort macrofagen en 25F9 dat wordt uitgedrukt door GM-CSF macrofagen kan worden gebruikt om de macrofaag soort bevestiging zoals eerder 2 getoond. Deze twee typen macrofaag may is vooral relevant voor de studie van atherosclerose waarbij verschillende macrofaag voorkomen in atherosclerotische plaques en kunnen verschillen van cholesterol metabolisme en expressie van ontstekingsmediatoren 2,12,13 tonen. Typ bijvoorbeeld M-CSF macrofagen zijn uniek omdat deze macrofagen storting cholesterol in de extracellulaire matrix bij de macrofagen zijn verrijkt met cholesterol 12,14,15.
In het protocol gepresenteerd, tijdens de kweek met M-CSF, is IL-10 routinematig toegevoegd zoals eerder 16 beschreven. Dit cytokine bevordert de groei en differentiatie van macrofagen en vormt een homogene langwerpige morfologie van de macrofagen. Bovendien, IL-10 remt GM-CSF-afhankelijke monocyt overleving door remming van de signaleringsgebeurtenissen geïnduceerd door GM-CSF 17. Wel moet onderzoekers menen dat IL-10 kunnen beïnvloeden andere celreacties bestudeerd, en daarom kan wilt overbruggen IL-10. Voormet het huidige protocol gebruik proliferatie en differentiatie van de monocyten in een kolf werden macrofaag kweken geïnitieerd door direct uitplaten elutriated monocyten in kweekcellen en differentiëren ze gedurende 7 dagen voordat wordt begonnen experimenten. Echter, zelfs met de toevoeging van IL-10, sommige macrofaag kweken vertoonden kleine hoeveelheden (gewoonlijk minder dan 10%) van "gebakken ei" GM-CSF macrofagen soort verontreiniging van het langwerpige M-CSF soort macrofagen. Met het huidige protocol, heeft GM-CSF soort macrofaag besmetting zich niet om redenen die niet duidelijk zijn. Het is echter niet omdat GM-CSF macrofaag Type precursor monocyten verloren tijdens het vriezen, zoals het kweken van de gecryopreserveerde monocyten met FBS + GM-CSF produceert uitmuntend type GM-CSF cultures (zie figuur 4).
De beschreven protocol gebruikt cryopreservatie van monocyten voor de differentiatie in macrofagen. Monocyten cryopreservatie is prev geweestiously getoond monocyten functie niet te beïnvloeden en wordt gewoonlijk gebruikt 18-21. In dit verband hebben wij gevonden dat macrofagen die door de bovenstaande protocol storting cholesterol in de extracellulaire ruimte vergelijkbaar met wat we eerder beschreven niet-gecryopreserveerde monocyten die direct in macrofagen 12 werden gekweekt. Met monocyt cryopreservatie, monocyten altijd beschikbaar experimenten, onafhankelijk van wanneer de monocyten kunnen worden verkregen van een donor te leiden. Hoewel het niet essentieel voor de monocyten cryopreserve alvorens de protocol cryopreservatie deed produceren homogener macrofaagkweken dat de macrofagen werden eerder meer verspreid dan die zowel rond en gespreid het geval was Wanneer monocyten werden gebruikt om kweken te initiëren. We hebben met succes gegenereerd macrofaag kweken van monocyten die waren bevroren gehouden tot 6 maanden (de langste tijd getest). Anderzijds, het zaaien van gecryopreserveerde macrophages in de cultuur putten voor experimenten leverden geen adequate macrofagen culturen.
Kritische stappen in het protocol omvatten direct plaatsen van monocyten in de vriezer na toevoeging van dimethylsulfoxide en direct overdragen ontdooide monocyten kweekmedium. Hoewel het gebruikelijk om DMSO te verwijderen door centrifugeren bevroren cellen voordat ze worden gezaaid in de cultuur, hebben we niet vinden dit was een noodzakelijke stap in de succesvolle cultuur van de monocyten. Evenwel moeten onderzoekers dit doen als de concentratie resterend DMSO (2 pl / ml) hoger dan wat werd gebruikt in de bovenstaande protocol. Het is belangrijk om niet te monocyten tot 48 uur te spoelen na hun zaaien in de cultuur kolven. Anders kunnen sommige monocyten verloren gaan, afhankelijk van de mate van hechting aan het kweekoppervlak. Anderzijds, wanneer de monocyten differentiëren in macrofagen, verhoogde adhesie van de macrofagen meer nodig trypsinebehandeling te verwijderen,of een cel lifter kan worden gebruikt om afgifte na de eerste behandeling met trypsine te vergemakkelijken. Wanneer monocyten niet prolifereren en differentiëren, kan dit te wijten zijn aan een aantal ongewone eigenschap van de monocyt donor, verlies van activiteit van M-CSF, of door de vele FBS gebruikt. Ook mogelijke zorg bij het kweken niet ontwikkelen, is besmetting van reagentia met endotoxine, een middel dat macrofaag proliferatie 22 remt.
Differentiatie van de gecryopreserveerde monocyten in kolven met M-CSF maakt hun omvang differentiatie in macrofagen. Vervolgens kan de macrofagen worden geoogst en gezaaid in kweekputjes bij celdichtheden vereist voor het uitvoeren van experimenten. Het gebruik van gedefinieerde aantallen macrofagen plaats bepaald aantal monocyten tot macrofagen culturen initiëren experimenten levert macrofaagkweken waarin de gewenste celdichtheid consistenter kan worden bereikt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cellbind 12-well culture plate | Corning | 3336 | |
| CELLSTAR, T-75 flask, tissue culture treated | Greiner Bio-One North America | 658157 | |
| RPMI 1640 culture medium | Cellgro Mediatech | 15-040-CM | warmed to 37 °C |
| L-Glutamine | Cellgro Mediatech | 25-005-CI | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000-036 | |
| M-CSF | PeproTech | 300-25 | |
| GM-CSF | PeproTech | 300-03 | |
| IL-10 | PeproTech | 200-10 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Cryovial | Thermo Scientific | 375418 | |
| DPBS without Ca2+ and Mg2+ | Corning cellgro | 21-031-CV | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| 50 ml polypropylene conical tube | Falcon | 352070 | |
| Trypan Blue | Lonza | 17-942E | |
| Neubauer-improved bright light hemocytometer | Paul Marienfeld GmbH & Co. KG | 610031 | http://www.marienfeld-superior.com/index.php/counting-chambers/articles/counting-chambers.html |
| CoolCell LX cell freezing container | BioCision | BCS-405 | other freezing containers also should be adequate for this step |
| Liquid Nitrogen Storage System, CryoPlus 1 | Thermo Scientific | 7400 | any liquid nitrogen tank should be adequate |
References
- Dey, A., Allen, J., Hankey-Giblin, P. A. Ontogeny and polarization of macrophages in inflammation: blood monocytes versus tissue macrophages. Front. Immunol. 5, 683 (2014).
- Waldo, S. W., et al. Heterogeneity of human macrophages in culture and in atherosclerotic plaques. Am. J. Pathol. 172, 1112-1126 (2008).
- Akagawa, K. S. Functional heterogeneity of colony-stimulating factor-induced human monocyte-derived macrophages. Int. J. Hematol. 76, 27-34 (2002).
- Akagawa, K. S., et al. Functional heterogeneity of colony-stimulating factor-induced human monocyte-derived macrophages. Respirology. 11 Suppl, S32-S36 (2006).
- Fleetwood, A. J., Lawrence, T., Hamilton, J. A., Cook, A. D. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (CSF) and macrophage CSF-dependent macrophage phenotypes display differences in cytokine profiles and transcription factor activities: implications for CSF blockade in inflammation. J. Immunol. 178, 5245-5252 (2007).
- Lacey, D. C., et al. Defining GM-CSF- and macrophage-CSF-dependent macrophage responses by in vitro models. J. Immunol. 188, 5752-5765 (2012).
- Strasser, E. F., Eckstein, R. Optimization of leukocyte collection and monocyte isolation for dendritic cell culture. Transfus. Med. Rev. 24, 130-139 (2010).
- Kim, S., et al. Monocyte enrichment from leukapheresis products by using the Elutra cell separator. Transfusion (Paris). 47, 2290-2296 (2007).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr. Protoc. Immunol. Appendix 3 (Appendix 3B), (2001).
- Anzinger, J. J., et al. Native low-density lipoprotein uptake by macrophage colony-stimulating factor-differentiated human macrophages is mediated by macropinocytosis and micropinocytosis. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 30, 2022-2031 (2010).
- Zhao, B., et al. Constitutive receptor-independent low density lipoprotein uptake and cholesterol accumulation by macrophages differentiated from human monocytes with macrophage-colony-stimulating factor (M-CSF). J. Biol. Chem. 281, 15757-15762 (2006).
- Freeman, S. R., et al. ABCG1-mediated generation of extracellular cholesterol microdomains. J. Lipid Res. 55, 115-127 (2014).
- Kruth, H. S. Receptor-independent fluid-phase pinocytosis mechanisms for induction of foam cell formation with native low-density lipoprotein particles. Curr. Opin. Lipidol. 22, 386-393 (2011).
- Jin, X., et al. ABCA1 contributes to macrophage deposition of extracellular cholesterol. J. Lipid Res. 56, 1720-1726 (2015).
- Ong, D. S., et al. Extracellular cholesterol-rich microdomains generated by human macrophages and their potential function in reverse cholesterol transport. J. Lipid Res. 51, 2303-2313 (2010).
- Hashimoto, S., Yamada, M., Motoyoshi, K., Akagawa, K. S. Enhancement of macrophage colony-stimulating factor-induced growth and differentiation of human monocytes by interleukin-10. Blood. 89, 315-321 (1997).
- Hashimoto, S. I., Komuro, I., Yamada, M., Akagawa, K. S. IL-10 inhibits granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-dependent human monocyte survival at the early stage of the culture and inhibits the generation of macrophages. J. Immunol. 167, 3619-3625 (2001).
- Lund, P. K., Joo, G. B., Westvik, A. B., Ovstebo, R., Kierulf, P. Isolation of monocytes from whole blood by density gradient centrifugation and counter-current elutriation followed by cryopreservation: six years' experience. Scand. J. Clin. Lab. Invest. 60, 357-365 (2000).
- Weiner, R. S., Normann, S. J. Functional integrity of cryopreserved human monocytes. J. Natl. Cancer Inst. 66, 255-260 (1981).
- Hansen, J. B., et al. Retention of phagocytic functions in cryopreserved human monocytes. J. Leukoc. Biol. 57, 235-241 (1995).
- Seager Danciger, J., et al. Method for large scale isolation, culture and cryopreservation of human monocytes suitable for chemotaxis, cellular adhesion assays, macrophage and dendritic cell differentiation. J. Immunol. Methods. 288, 123-134 (2004).
- Jin, X., Xu, Q., Champion, K., Kruth, H. S. Endotoxin contamination of apolipoprotein A-I: effect on macrophage proliferation--a cautionary tale. Atherosclerosis. 240, 121-124 (2015).
