Protocol
Leukapheresis एक मानव विषय के अनुसंधान स्वास्थ्य संस्थागत समीक्षा बोर्ड के एक राष्ट्रीय संस्थान द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के तहत बाहर किया गया था।
1. अलगाव और monocytes की cryopreservation
- मानव दाताओं की leukapheresis द्वारा mononuclear कोशिकाओं प्राप्त है, और कोशिकाओं mononuclear संदर्भों 7.8 में वर्णित के रूप में की सतत जवाबी प्रवाह centrifugation धावन से monocytes समृद्ध। धावन बफर निर्माता द्वारा निर्दिष्ट में - (90% monocytes लगभग 80) लगभग 100 x 10 6 elutriated कोशिकाओं को प्राप्त। एक hemocytometer का उपयोग कोशिकाओं की गणना।
- 300 XG पर एक 15 मिलीलीटर polypropylene ट्यूब में अपकेंद्रित्र monocytes कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए।
- सतह पर तैरनेवाला निकालें और धीरे 90% FBS / 10% डाइमिथाइल sulfoxide के अंतिम एकाग्रता और 50 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल प्राप्त करने के लिए FBS में कोशिकाओं डाइमिथाइल sulfoxide के द्वारा पीछा resuspend।
- सेल निलंबन टी के प्रत्येक मिलीलीटर जोड़ेंओ एक व्यक्ति cryovial।
- एक सेल ठंड कंटेनर में cryovials जगह है और लंबी अवधि के भंडारण के लिए एक तरल नाइट्रोजन cryovial भंडारण टैंक के लिए स्थानांतरित करने से पहले 24 घंटे के लिए एक के लिए स्थानांतरण -80 सेल्सियस फ्रीजर।
मैक्रोफेज में monocytes के 2. भेदभाव
- जल्दी से एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान के लिए स्थानांतरित करने के लिए और फिर तुरंत हटाने जब सेल निलंबन के बारे में 70% thawed गया है द्वारा कोशिकाओं का एक cryovial गला लें।
- तुरंत कमरे के तापमान पर पूरा विगलन पर, का 37 डिग्री सेल्सियस गर्म रोसवेल पार्क मेमोरियल संस्थान (RPMI) 2 मिमी एल glutamine, 50 एनजी / एमएल एम-सीएसएफ, 25 एनजी / एमएल के साथ 1,640 मध्यम 50 मिलीलीटर में 1 मिलीलीटर cryovial सामग्री को स्थानांतरित इंटरल्यूकिन 10 (आईएल -10), और 10% FBS (पूरा मध्यम)।
- स्थानांतरण दो 75 सेमी 2 प्लास्टिक सेल संस्कृति बोतल में से प्रत्येक में monocyte निलंबन के 25 मिलीलीटर।
- 48 घंटे के लिए 5% सीओ 2/95% हवा के साथ एक 37 डिग्री सेल्सियस सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में संस्कृतियों सेते हैं।
- घन कुल्लाltures 10 के साथ 3 बार मिलीलीटर RPMI 1640 मध्यम (37 डिग्री सेल्सियस के लिए पूर्व गर्म), धीरे संस्कृति के माध्यम से दूर करने के लिए किसी भी शिथिल संलग्न कोशिकाओं dislodging से बचने के लिए।
- rinsing के बाद, ताजा पूरा मध्यम जोड़ने बदलते मध्यम हर 2 दिन तक monocytes अंतर और पर्याप्त रूप से पैदा मिला हुआ हो जाते हैं। इस संस्कृति के बारे में एक सप्ताह की आवश्यकता है।
3. कटाई मैक्रोफेज प्रयोगों को आरंभ करने के
- 10 मिलीलीटर के साथ फ्लास्क में भेदभाव मैक्रोफेज कुल्ला 3 बार पूर्व गर्म 37 डिग्री सेल्सियस 0.25% trypsin ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) समाधान 10 मिलीलीटर जोड़ने से पहले सीए 2 और 2 मिलीग्राम + बिना पूर्व गर्म 37 डिग्री सेल्सियस Dulbecco फॉस्फेट बफर खारा।
- 15 मिनट के समय में जो मैक्रोफेज का लगभग 90% गोल और अलग हो जाना चाहिए था - 10 के लिए सेल कल्चर इनक्यूबेटर में रखें कुप्पी। कुप्पी का सूक्ष्म परीक्षण करके यह सत्यापित करें।
- एस के लिए 10% FBS युक्त RMPI 1640 के माध्यम के 10 मिलीलीटर जोड़ेंशीर्ष trypsinization।
- 5 मिनट के लिए एक 50 मिलीलीटर polypropylene ट्यूब में कुप्पी से मैक्रोफेज सेल निलंबन स्थानांतरण, सेंट्रीफ्यूज 300 XG, और सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
- धीरे पूरा माध्यम से 1 मिलीलीटर में मैक्रोफेज resuspend।
- 10 μl Trypan ब्लू समाधान के साथ बृहतभक्षककोशिका सेल निलंबन के 10 μl मिक्स और बृहतभक्षककोशिका सेल नंबर और व्यवहार्यता (आमतौर> 95%) एक hemocytometer का उपयोग का निर्धारण।
- कोशिकाओं की संख्या के आधार पर (आमतौर पर के बारे में 15 - 18 x 10 5 मैक्रोफेज), वांछित बोने सेल घनत्व को प्राप्त करने के लिए अतिरिक्त पूरा मध्यम जोड़ें। नोट: 1 एक्स 5 10 12 अच्छी तरह से थाली के प्रति अच्छी तरह से 1.5 मिलीलीटर माध्यम में मैक्रोफेज एक के पास मिला हुआ संस्कृति का उत्पादन होगा।
- बोने के बाद, 5% सीओ 2/95% हवा के साथ एक 37 डिग्री सेल्सियस सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में रातोंरात सेते मैक्रोफेज सेल लगाव की अनुमति है। फिर, वांछित प्रयोगों शुरू करते हैं।
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Representative Results
ताजा या cryopreserved monocytes की व्यवहार्यता का 95% से अधिक Trypan ब्लू धुंधला 9 के साथ चुना गया था। चित्रा 1 और चित्रा 2 कम और उच्च आवर्धन पर की तुलना में क्रमश:, मैक्रोफेज में ताजा और cryopreserved (यानी, फ्रोजन) एककेंद्रकश्वेतकोशिका भेदभाव की प्रगति की। ध्यान दें कि ताजा तुलना cryopreserved monocytes साथ monocytes कि फैल नहीं है, लेकिन गोल रहने के फर्क की एक उप-जनसंख्या दिखा। पहले चरण प्रकाशमान रिक्तिकाएं दोनों स्थितियों में monocyte व्युत्पन्न मैक्रोफेज में होते हैं। ये रिक्तिकाएं एम-सीएसएफ प्रकार मैक्रोफेज के macropinosomes विशेषता का प्रतिनिधित्व के रूप में पहले 10,11 वर्णित है।
बोतल जिसमें वे monocytes से भेदभाव कर रहे थे से उनकी फसल कटाई के बाद Cryopreserving मैक्रोफेज सफल बृहतभक्षककोशिका संस्कृतियों का उत्पादन नहीं किया है ( एम-सीएसएफ प्रकार मैक्रोफेज के उत्पादन के लिए ऊपर प्रोटोकॉल जीएम- CSF प्रकार मैक्रोफेज contaminating की उपस्थिति है कि कभी कभी होता है जब संस्कृतियों उनकी cryopreservation और बोतल में एम-सीएसएफ प्रकार मैक्रोफेज करने के भेदभाव के बिना monocytes से सीधे स्थापित कर रहे हैं के बिना ऐसा करता है। हालांकि, cryopreserved monocytes FBS के साथ भेदभाव कर + जीएम- CSF उत्कृष्ट जीएम- CSF प्रकार संस्कृतियों (चित्रा 4) का उत्पादन। 
चित्रा 1: cryopreserved monocytes बनाम ताजा की तुलना में उनके M-सीएसएफ प्रेरित भेदभाव के दौरान मैक्रोफेज (कम बढ़ाई) का उत्पादन किया जाता cryopreserved (स्थिर) और ताजा monocytes के चरण विपरीत सूक्ष्म छवियों। Nto मैक्रोफेज। दिखाया गया हैं 3 और 7 दिनों में बोतल में संस्कृति के दौरान monocytes, और 8 दिन, एक दिन उनकी कटाई और 12 अच्छी तरह से संस्कृति प्लेटों में replating के बाद। बार = 100 माइक्रोन और सभी के लिए लागू होता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। 
चित्रा 2:। Cryopreserved मैक्रोफेज उत्पादन करने के लिए (उच्च वृद्धि) का इस्तेमाल किया monocytes बनाम ताजा monocytes की तुलना सुसंस्कृत चित्रा 1 कथा में वर्णित है और उच्च बढ़ाई यहाँ दिखाया गया के रूप में थे। पहले चरण प्रकाशमान रिक्तिकाएं macropinosomes (सफेद तीर) कर रहे हैं। बार = 50 माइक्रोन और सभी के लिए लागू होता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। 
चित्रा 3: Cryopreserved मैक्रोफेज पर्याप्त संस्कृतियों का उत्पादन करने में विफल ताजा monocytes एक कुप्पी और एम सीएसएफ के साथ भेदभाव 7 दिन में वरीयता प्राप्त थे, जैसा कि ऊपर आंकड़े 1 और 2 में दिखाया गया है।। फिर, विभेदित मैक्रोफेज बोतल और cryopreserved से काटा गया। अगले, cryopreserved मैक्रोफेज गैर cryopreserved मैक्रोफेज और सुसंस्कृत 1 दिन (8 दिन) के लिए प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में 12 अच्छी तरह से प्लेटों में वरीयता प्राप्त थे। 1 दिन संस्कृति के चरण विपरीत सूक्ष्म छवि कि मैक्रोफेज से बहुत कुछ उनकी cryopreservation निम्नलिखित देते हैं (ऊपर चित्र 1 में 8 परिणाम गैर cryopreserved मैक्रोफेज के लिए दिन के लिए तुलना) से पता चलता है। बार = 100 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 4:। Cryopreserved monocytes भी जीएम- CSF प्रकार monocyte व्युत्पन्न मैक्रोफेज के उत्पादन के लिए उपयुक्त थे Cryopreserved monocytes (25 x 10 6) एक फ्लास्क और 10% 50 एनजी / एमएल जीएम- CSF युक्त FBS के साथ भेदभाव 8 दिनों में वरीयता प्राप्त कर रहे थे। पहले चरण विपरीत छवि जीएम- CSF प्रकार मैक्रोफेज के ठेठ "तला हुआ अंडा 'आकृति विज्ञान से पता चलता है। बार = 100 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
परिभाषित बृहतभक्षककोशिका प्रकार उत्पन्न जांचकर्ताओं द्वारा प्राप्त जब बृहतभक्षककोशिका जीव विज्ञान का अध्ययन परस्पर विरोधी परिणामों में से कुछ स्पष्ट कर सकते हैं। विभिन्न संस्कृति की स्थिति और भेदभाव कारकों का उपयोग एक तथ्य यह है कि शोधकर्ता द्वारा की सराहना नहीं की जा सकती है उत्पन्न करने के लिए प्राथमिक मानव मैक्रोफेज बहुत अलग बृहतभक्षककोशिका प्रकार के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। उदाहरण के लिए, मैक्रोफेज कभी कभी कोई सीरम, अकेले मानव सीरम, मानव सीरम एम-सीएसएफ, FBS हम अकेले हैं, या युक्त एम-सीएसएफ या जीएम- CSF FBS के साथ पूरक का उपयोग मानव monocytes से उत्पन्न कर रहे हैं। जैसा कि पहले बताया और जैसा कि हम यह भी कहा है, monocytes जोड़ा भेदभाव कारकों के बिना सीरम के बिना या FBS के साथ एक सप्ताह के लिए सुसंस्कृत 3 व्यवहार्य नहीं रहते हैं। जैसा कि ऊपर कहा, monocytes अकेले मानव सीरम के साथ सुसंस्कृत या एम-सीएसएफ के साथ पूरक मैक्रोफेज कि FBS प्लस जीएम-सीएसएफ के साथ भेदभाव monocytes की "तला हुआ अंडा 'आकृति विज्ञान लक्षण दिखाने उत्पन्न करते हैं। इस प्रकार, मानव सीरम एम की उपस्थिति मेंसीएसएफ प्रकार एक अधिक लम्बी आकृति विज्ञान दिखा बृहतभक्षककोशिका प्राप्त नहीं है, भले ही monocytes एम-सीएसएफ के साथ भेदभाव किया गया है।
दिलचस्प है, हमने देखा है कि दोनों M-सीएसएफ और जीएम-सीएसएफ, उत्पन्न दोनों M-सीएसएफ लम्बी और जीएम-सीएसएफ एक ही संस्कृति में "तला हुआ अंडा" रूपात्मक phenotypes युक्त FBS के साथ monocytes के भेदभाव। यह पता चलता है कि अलग एककेंद्रकश्वेतकोशिका उप-जनसंख्या इन दो प्रकार के बृहतभक्षककोशिका को जन्म दे। पिछले अध्ययनों से पता चला है कि M-सीएसएफ और जीएम-सीएसएफ भेदभाव कारकों न केवल मैक्रोफेज की आकृति विज्ञान प्रभावित है, लेकिन यह भी जीन अभिव्यक्ति और सेल समारोह है, जो इन दोनों बृहतभक्षककोशिका प्रकार 2-6 के लिए काफी हद तक अलग है प्रभावित करते हैं। CD14 कि M-सीएसएफ प्रकार मैक्रोफेज और 25F9 कि जीएम-सीएसएफ मैक्रोफेज द्वारा व्यक्त की है द्वारा व्यक्त की है के साथ संयोजन के रूप में बृहतभक्षककोशिका मार्कर CD68 के लिए Immunostaining के रूप में पहले 2 दिखाए बृहतभक्षककोशिका प्रकार की पुष्टि करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। ये दो प्रकार के बृहतभक्षककोशिका मीप्र विशेष रूप से atherosclerosis के अध्ययन जहां विभिन्न प्रकार के बृहतभक्षककोशिका atherosclerotic सजीले टुकड़े में होते हैं और कोलेस्ट्रॉल चयापचय और सूजन मध्यस्थों 2,12,13 की अभिव्यक्ति में मतभेद दिखा सकते हैं के लिए प्रासंगिक हो। उदाहरण के लिए, एम-सीएसएफ प्रकार मैक्रोफेज बाह्य मैट्रिक्स में है कि इन मैक्रोफेज जमा कोलेस्ट्रॉल में अद्वितीय हैं जब मैक्रोफेज कोलेस्ट्रॉल 12,14,15 से समृद्ध है।
प्रस्तुत, एम-सीएसएफ के साथ संस्कृति के दौरान प्रोटोकॉल में, आईएल -10 नियमित रूप के रूप में पहले 16 में वर्णित जोड़ा गया है। इस साइटोकाइन विकास और मैक्रोफेज के भेदभाव को बढ़ावा देता है और मैक्रोफेज के एक अधिक सजातीय लम्बी आकृति विज्ञान पैदा करता है। इसके अलावा, आईएल -10 संकेत घटनाओं जीएम- CSF 17 से प्रेरित बाधा जीएम- CSF निर्भर एककेंद्रकश्वेतकोशिका अस्तित्व को रोकता है। हालांकि, जांचकर्ताओं को विचार करना चाहिए कि आईएल -10 अध्ययन के तहत अन्य सेल प्रतिक्रिया को प्रभावित कर सकता है, और इसलिए, आईएल -10 चूकना चाह सकते हैं। से पहलेवर्तमान प्रोटोकॉल प्रसार और एक फ्लास्क में monocytes के भेदभाव को रोजगार का उपयोग कर, बृहतभक्षककोशिका संस्कृतियों सीधे संस्कृति कुओं में elutriated monocytes चढ़ाना और उन्हें 7 दिनों के प्रयोगों की शुरुआत से पहले फर्क द्वारा शुरू किए गए थे। हालांकि, यहां तक आईएल -10 के अलावा के साथ, इन बृहतभक्षककोशिका संस्कृतियों के कुछ लम्बी एम-सीएसएफ प्रकार मैक्रोफेज दूषित "तला हुआ अंडा 'जीएम-सीएसएफ प्रकार मैक्रोफेज की कम संख्या (आमतौर पर कम से कम 10%) दिखाया। वर्तमान प्रोटोकॉल के साथ, जीएम-सीएसएफ प्रकार बृहतभक्षककोशिका संदूषण कारण है कि स्पष्ट नहीं हैं के लिए नहीं होती है। हालांकि, यह क्योंकि जीएम- CSF बृहतभक्षककोशिका प्रकार अग्रदूत monocytes FBS + जीएम- CSF उत्कृष्ट जीएम- CSF प्रकार संस्कृतियों (चित्रा 4 देखें) उत्पादन के साथ cryopreserved monocytes संवर्धन के रूप में, ठंड के दौरान खो रहे हैं नहीं है।
वर्णित प्रोटोकॉल मैक्रोफेज में उनके भेदभाव से पहले monocytes के cryopreservation का इस्तेमाल करता है। Monocyte cryopreservation आखिरी किया गया हैiously एककेंद्रकश्वेतकोशिका समारोह को प्रभावित करने के लिए नहीं दिखाया गया है और आमतौर पर 18-21 कार्यरत है। इस संबंध में, हमने पाया है कि क्या हम गैर cryopreserved monocytes कि सीधे मैक्रोफेज 12 में सुसंस्कृत थे के साथ पहले से वर्णित है के समान बाह्य अंतरिक्ष में जमा कोलेस्ट्रॉल ऊपर प्रोटोकॉल द्वारा उत्पन्न मैक्रोफेज। एककेंद्रकश्वेतकोशिका cryopreservation के साथ, monocytes हमेशा प्रयोगों, जब monocytes एक दाता से प्राप्त किया जा सकता है की स्वतंत्र आरंभ करने के लिए उपलब्ध हैं। हालांकि यह जरूरी प्रोटोकॉल के साथ आगे बढ़ने से पहले monocytes cryopreserve के लिए नहीं है, cryopreservation अधिक दोनों गोल और मामले के रूप में किया गया था जब ताजा monocytes संस्कृतियों आरंभ करने के लिए इस्तेमाल किया गया प्रसार किया जा रहा बजाय फैल रहे थे कि सभी मैक्रोफेज में अधिक सजातीय बृहतभक्षककोशिका संस्कृतियों का उत्पादन किया था। हम सफलतापूर्वक monocytes रखा है कि 6 महीने, (सबसे लंबे समय परीक्षण) के लिए ऊपर से जमे हुए थे बृहतभक्षककोशिका संस्कृतियों उत्पन्न किया है। दूसरी ओर, cryopreserved macr के बोनेophages संस्कृति में प्रयोगों के लिए कुओं पर्याप्त बृहतभक्षककोशिका संस्कृतियों का उत्पादन नहीं किया।
प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम तुरंत बाद डाइमिथाइल sulfoxide के अलावा के फ्रीजर में रखने monocytes शामिल हैं, और तुरंत संस्कृति के माध्यम से Thawed monocytes स्थानांतरित। हालांकि यह जमे हुए कोशिकाओं centrifuging द्वारा DMSO दूर करने के लिए आम बात है इससे पहले कि वे संस्कृति में वरीयता प्राप्त कर रहे हैं, हम इस monocytes के सफल संस्कृति में एक आवश्यक कदम था नहीं मिल रहा था। हालांकि, जांचकर्ताओं को ऐसा करने के लिए अगर अवशिष्ट DMSO (2 μl / एमएल) की एकाग्रता क्या ऊपर प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया गया था की तुलना में अधिक है आवश्यकता हो सकती है। यह 48 घंटे तक monocytes कुल्ला करने के लिए नहीं संस्कृति बोतल में उनकी बोने निम्नलिखित महत्वपूर्ण है। अन्यथा, कुछ monocytes संस्कृति की सतह के लिए आसंजन की उनकी डिग्री के आधार पर खो दिया जा सकता है। दूसरी ओर, एक बार monocytes मैक्रोफेज में अंतर, बढ़ मैक्रोफेज के आसंजन लंबे समय तक इलाज trypsin उन्हें हटाने के लिए आवश्यकता हो सकती है,या एक सेल चोर प्रारंभिक trypsin उपचार के बाद रिलीज की सुविधा के लिए नियोजित किया जा सकता है। monocytes पैदा करना नहीं है और अंतर, इस एककेंद्रकश्वेतकोशिका दाता के कुछ असामान्य लक्षण, एम-सीएसएफ की गतिविधि की कमी के कारण, या इस्तेमाल FBS की बहुत की वजह से हो सकता है। इसके अलावा, संभव चिंता का विषय है जब संस्कृतियों विकसित नहीं की endotoxin साथ अभिकर्मकों के प्रदूषण, एक एजेंट है कि बृहतभक्षककोशिका प्रसार 22 को रोकता है।
एम-सीएसएफ के साथ बोतल में cryopreserved monocytes फर्क मैक्रोफेज में उनके थोक भेदभाव की अनुमति देता है। फिर, मैक्रोफेज काटा और प्रयोगों से बाहर ले जाने के लिए आवश्यक सेल घनत्व में संस्कृति कुओं में वरीयता प्राप्त किया जा सकता है। मैक्रोफेज की संख्या में परिभाषित बजाय monocytes की परिभाषित संख्या के प्रयोग के प्रयोगों के लिए बृहतभक्षककोशिका संस्कृतियों आरंभ करने के लिए, बृहतभक्षककोशिका संस्कृतियों, जिसमें वांछित सेल घनत्व अधिक लगातार प्राप्त किया जा सकता अर्जित करता है।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cellbind 12-well culture plate | Corning | 3336 | |
| CELLSTAR, T-75 flask, tissue culture treated | Greiner Bio-One North America | 658157 | |
| RPMI 1640 culture medium | Cellgro Mediatech | 15-040-CM | warmed to 37 °C |
| L-Glutamine | Cellgro Mediatech | 25-005-CI | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000-036 | |
| M-CSF | PeproTech | 300-25 | |
| GM-CSF | PeproTech | 300-03 | |
| IL-10 | PeproTech | 200-10 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Cryovial | Thermo Scientific | 375418 | |
| DPBS without Ca2+ and Mg2+ | Corning cellgro | 21-031-CV | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| 50 ml polypropylene conical tube | Falcon | 352070 | |
| Trypan Blue | Lonza | 17-942E | |
| Neubauer-improved bright light hemocytometer | Paul Marienfeld GmbH & Co. KG | 610031 | http://www.marienfeld-superior.com/index.php/counting-chambers/articles/counting-chambers.html |
| CoolCell LX cell freezing container | BioCision | BCS-405 | other freezing containers also should be adequate for this step |
| Liquid Nitrogen Storage System, CryoPlus 1 | Thermo Scientific | 7400 | any liquid nitrogen tank should be adequate |
References
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