Protocol
Leukapherese wurde unter einem menschlichen Subjekt Forschungsprotokoll, das von einem National Institutes of Health Institutional Review Board genehmigt durchgeführt.
1. Isolierung und Kryokonservierung von Monozyten
- Erhalten einkernigen Zellen durch Leukapherese von menschlichen Spendern und bereichern Monozyten durch kontinuierliche Gegenstrom - Zentrifugation Auswaschung von einkernigen Zellen als 7,8 in den Referenzen beschrieben. Erhalten ca. 100 x 10 6 aufgeschlämmt Zellen (etwa 80 bis 90% Monozyten) in Elutriation Puffer vom Hersteller angegeben. Zählen von Zellen mit einer Zählkammer.
- Zentrifuge Monozyten in einem 15 ml Polypropylen-Röhrchen bei 300 xg für 5 min bei Raumtemperatur.
- Entfernen Sie den Überstand und die Zellen vorsichtig in FBS resuspendieren von Dimethylsulfoxid , gefolgt in einer Endkonzentration von 90% FBS / 10% Dimethylsulfoxid zu erreichen , und 50 x 10 6 Zellen / ml.
- In jeder ml der Zellsuspension to eine individuelle Cryovial.
- Platzieren Sie die Kryoröhrchen in einer Zelle Gefrierbehälter und in einen -80 ° C Gefrierschrank für 24 h vor Kryoröhrchen Vorratsbehälter für die Langzeitlagerung zu einem flüssigen Stickstoff übertragen.
2. Differenzierung von Monozyten in Makrophagen
- Auftauen ein Kryoröhrchen von Zellen durch zu einem 37 ° C Wasserbad schnell übertragen und dann sofort zu entfernen, wenn die Zellsuspension etwa 70% aufgetaut ist.
- Unmittelbar nach dem vollständigen Auftauen bei Raumtemperatur, übertragen Sie die 1 ml Kryoröhrchen Inhalt in 50 ml 37 ° C erwärmt Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640-Medium mit 2 mM L-Glutamin, 50 ng / ml M-CSF, 25 ng / ml Interleukin-10 (IL-10) und 10% FBS (komplettes Medium).
- Transfer 25 ml Monozyten - Suspension in jeweils zwei 75 cm 2 Plastikzellkulturflaschen.
- Inkubieren Kulturen in einem 37 ° C Zellkultur - Inkubator mit 5% CO 2/95% Luft für 48 Stunden.
- Spülen Sie die cultures 3 mal mit 10 ml RPMI 1640-Medium (vorgewärmt auf 37 ° C), sanft das Kulturmedium Entfernen jeglicher lose anhaftenden Zellen zu vermeiden Verdrängen.
- Nach dem Spülen, fügen Sie frisches komplettes Medium, Mediumwechsel alle 2 Tage bis Monozyten differenzieren und ausreichend zu konfluieren vermehren. Dies erfordert etwa eine Woche der Kultur.
3. Ernte Makrophagen Experimente zu initiieren
- Spülen differenzierten Makrophagen in Kolben 3 mal mit 10 ml vorgewärmten 37 ° C Dulbeccos phosphatgepufferter Salzlösung ohne Ca 2+ und Mg 2+ , bevor die Zugabe von 10 ml vorgewärmten 37 ° C 0,25% Trypsin-Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) -Lösung.
- Danach wird der Kolben in der Zellkultur-Inkubator 10 - 15 min zu diesem Zeitpunkt etwa 90% der Makrophagen abzurunden und abgelöst. Überprüfen dies durch mikroskopische Untersuchung des Kolbens.
- 10 ml RMPI 1640-Medium mit 10% FBS zu sTop Trypsinierung.
- Übertragen Sie die Makrophagen-Zellsuspension aus dem Kolben in ein 50 ml Polypropylenröhrchen, Zentrifuge 300 xg für 5 min, und den Überstand verwerfen.
- resuspendieren Sie vorsichtig die Makrophagen in 1 ml Vollmedium.
- Mischen 10 ul Makrophagenzellsuspension mit 10 ul Trypanblau-Lösung und bestimmen Makrophagenzellzahl und Lebensfähigkeit (typischerweise> 95%) unter Verwendung eines Hämozytometers.
- Auf der Grundlage der Zellzahl ( in der Regel etwa 15 - 18 x 10 5 Makrophagen), fügen Sie zusätzliche Komplettmedium die gewünschte Seedingzelldichte zu erreichen. Anmerkung: 1 x 10 5 Makrophagen in 1,5 ml Medium pro Well einer 12-Well - Platte wird eine nahezu konfluenten Kultur herzustellen.
- Folgende Aussäen über Nacht inkubieren Makrophagen in einem 37 ° C Zellkultur - Inkubator mit 5% CO 2/95% Luft Zellanheftung zu ermöglichen. Dann beginnen die gewünschten Experimente.
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Representative Results
Die Lebensfähigkeit von frischen oder kryokonserviert Monozyten war größer als 95% , wie mit bestimmt Trypanblau 9 Färbung. Abbildung 1 und Abbildung 2 vergleichen bei niedrigeren und höheren Vergrößerungen bzw. der Fortschritt der frischen und kryokonservierten (dh gefroren) Monozytendifferenzierung in Makrophagen. Beachten Sie, dass die frisch im Vergleich mit kryokonservierten Monozyten eine Subpopulation der Differenzierung Monozyten zeigen, die sich nicht ausbreiten, sondern gerundet bleiben. Phase-lucent Vakuolen treten in den Monozyten abgeleiteten Makrophagen in beiden Bedingungen. Diese Vakuolen repräsentieren macropinosomes charakteristisch M-CSF - Typ Makrophagen wie zuvor beschrieben 10,11.
Kryokonservierung Makrophagen nach der Ernte aus den Flaschen, in denen sie aus Monozyten differenziert wurden nicht produzieren erfolgreiche Makrophagenkulturen ( Das obige Protokoll für die Herstellung von Makrophagen M-CSF-Typ tut dies ohne die Anwesenheit von kontaminierenden GM-CSF-Typ Makrophagen, die manchmal auftritt, wenn Kulturen ohne ihre Kryokonservierung und Differenzierung zu M-CSF-Typ Makrophagen in Flaschen direkt von Monozyten etabliert sind. Allerdings differenziert kryokonservierten Monozyten mit FBS + GM-CSF produzieren hervorragende GM-CSF Typ Kulturen (Abbildung 4). 
Abbildung 1: Vergleich von frischem gegen kryokonservierten Monozyten verwendet Makrophagen (geringe Vergrößerung) Phasenkontrastmikroskopische Aufnahmen von kryokonserviert (eingefroren) und frische Monozyten während der M-CSF induzierte Differenzierung i zu erzeugen. nto Makrophagen. Dargestellt sind Monozyten während der Kultur in Kolben bei 3 und 7 Tagen, und am 8. Tag, einen Tag nach ihrer Ernte und replating in 12-Well-Kulturplatten. Bar = 100 & mgr; m und gilt für alle. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen. 
Abbildung . 2: Vergleich von frischem gegen kryokonservierten Monozyten verwendet , um Makrophagen (hohe Vergrößerung) produzieren Monozyten wurden wie in Abbildung 1 Legende beschrieben und hier bei höherer Vergrößerung dargestellt. Phase-lucent Vakuolen sind macropinosomes (weiße Pfeile). Bar = 50 & mgr; m und gilt für alle. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen. 
Abbildung 3: Kryokonservierte Makrophagen nicht ausreichende Kulturen zu produzieren Frische Monozyten wurden in einen Kolben ausgesät und differenzierte 7 Tage mit M-CSF , wie in den 1 und 2 oben gezeigt.. Dann wurden die differenzierten Makrophagen aus Kolben und kryokonserviert geerntet. Als nächstes wurden die kryokonservierten Makrophagen in 12-Well-Platten ausgesät, wie in dem Protokoll für nicht-kryokonservierten kultivierten Makrophagen und 1 Tag (Tag 8) beschrieben. Phasenkontrastmikroskopische Aufnahme der 1-Tages - Kultur zeigt , dass nur sehr wenige der Makrophagen ihre Kryokonservierung attach folgenden (vergleiche Tag 8 Ergebnisse für nicht-kryokonservierten Makrophagen in Figur 1 oben). Bar = 100 & mgr; m. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abb . 4: Kryokonservierte Monozyten waren ebenfalls geeignet GM-CSF Aktivität von Monozyten abgeleiteten Makrophagen , Monozyten Kryokonservierte (25 x 10 6) zu erzeugen , wurden in einen Kolben beimpft und 8 Tage differenzierten mit 10% FBS , enthaltend 50 ng / ml GM-CSF. Phasenkontrast-Bild zeigt den typischen "Spiegelei" Morphologie von GM-CSF Typ Makrophagen. Bar = 100 & mgr; m. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
definiert Makrophagen-Typen generieren können von den Forschern erhalten einige der widersprüchlichen Ergebnisse verdeutlichen, wenn Makrophagen Biologie zu studieren. Die Verwendung von verschiedenen Kulturbedingungen und Differenzierungsfaktoren Makrophagen primären humanen erzeugen eine Tatsache zu sehr unterschiedlichen Makrophagen-Typen führen kann, die nicht durch den Forscher schätzen. Zum Beispiel werden manchmal Makrophagen aus humanen Monozyten erzeugt allein kein Serum, menschlichem Serum unter Verwendung von Humanserum, supplementiert mit M-CSF, FBS alleine oder FBS M-CSF oder GM-CSF enthält. Wie bereits berichtet und wie auch wir beobachtet haben, kultiviert Monozyten für eine Woche ohne Serum oder mit FBS ohne Zusatz von Differenzierungsfaktoren bleiben nicht rentabel 3. Wie oben erwähnt, kultiviert Monozyten mit menschlichem Serum allein oder mit M-CSF Makrophagen, die die "Spiegelei" charakteristische Morphologie von Monozyten differenziert mit FBS und GM-CSF zeigen, erzeugen ergänzt. Somit wird in Gegenwart von Humanserum das M-CSF Typ Makrophagen eine längliche Morphologie zeigt, ist nicht erhalten, obwohl Monozyten mit M-CSF differenziert worden.
Interessanterweise haben wir festgestellt, dass die Differenzierung von Monozyten mit FBS, die sowohl M-CSF und GM-CSF, erzeugt sowohl die M-CSF verlängert und GM-CSF "Spiegelei" morphologische Phänotypen in der gleichen Kultur. Dies deutet darauf hin, dass unterschiedliche Monozytensubpopulationen Anlass zu diesen beiden Makrophagen-Typen geben. Frühere Studien haben gezeigt , dass M-CSF und GM-CSF die Differenzierung Faktoren beeinflussen nicht nur die Morphologie der Makrophagen, sondern auch die Genexpression und die Zellfunktion beeinflussen, die für diese beiden Makrophagen - Typen 2-6 im wesentlichen verschieden ist. Immunostaining für den CD68 - Makrophagen - Marker in Verbindung mit CD14, die von M-CSF Typ Makrophagen und 25F9 exprimiert wird , das die Makrophagen - Typ zu bestätigen werden kann durch GM-CSF Makrophagen exprimiert wird verwendet , wie zuvor 2 gezeigt. Diese beiden Makrophagen-Typen May als besonders relevant für die Untersuchung von Atherosklerose , wo verschiedene Arten von Makrophagen in atherosklerotischen Plaques auftreten und 2,12,13 Unterschiede in den Cholesterinstoffwechsel und die Expression von Entzündungsmediatoren zeigen. Beispielsweise M-CSF - Typ Makrophagen sind einzigartig darin , dass diese Makrophagen Ablagerung Cholesterol in die extrazelluläre Matrix , wenn die Makrophagen , die mit Cholesterin 12,14,15 angereichert sind.
In dem Protokoll vorgestellt, während der Kultivierung mit M-CSF, IL-10 , wie beschrieben wurde zuvor 16 routinemßig zugegeben. Dieses Zytokin fördert das Wachstum und die Differenzierung von Makrophagen und erzeugt ein homogeneres längliche Morphologie der Makrophagen. Darüber hinaus hemmt IL-10 - GM-CSF-abhängige Monozyten Überleben durch die Signalereignisse von GM-CSF 17 induzierte hemmen. Jedoch sollte Ermittler berücksichtigen, dass IL-10 andere Zellantworten untersuchten beeinflussen können und daher wünschen kann IL-10 wegzulassen. Vorunter Verwendung der aktuellen Protokoll einsetzt Proliferation und Differenzierung der Monozyten in einem Kolben wurden Makrophagenkulturen durch direktes Plattieren ausgewaschenen Monozyten in Kulturvertiefungen initiiert und sie für 7 Tage vor Beginn der Versuche zu differenzieren. Aber auch bei der Zugabe von IL-10, einige dieser Makrophagenkulturen zeigten eine kleine Anzahl (in der Regel weniger als 10%) von "Spiegelei" GM-CSF-Typ Makrophagen kontaminierenden die langgestreckten M-CSF-Typ Makrophagen. Mit dem aktuellen Protokoll, GM-CSF Typ Makrophagen-Kontamination tritt nicht aus Gründen, die nicht klar sind. Allerdings ist es nicht , weil GM-CSF - Makrophagen - Typ Vorläufer Monozyten während des Einfrierens verloren gehen, wie die Kultivierung der kryokonservierten Monozyten mit FBS + GM-CSF ausgezeichnete GM-CSF Typ Kulturen produziert (siehe Abbildung 4).
Das beschriebene Protokoll verwendet Kryokonservierung von Monozyten vor ihrer Differenzierung zu Makrophagen. Monozyt Kryokonservierung hat i.Vj. geweseniously gezeigt nicht Monocytenfunktion zu beeinflussen und häufig 18-21 eingesetzt wird. In dieser Hinsicht haben wir gefunden , dass durch das Protokoll über Ablagerung Cholesterins in den extrazellulären Raum erzeugt Makrophagen ähnlich dem , was wir zuvor mit nicht-kryokonservierten Monozyten beschrieben haben , die direkt in Makrophagen 12 kultiviert. Mit Monozyten Kryokonservierung sind Monozyten immer verfügbar Experimente zu initiieren, unabhängig davon, wann die Monozyten können von einem Spender erhalten werden. Während es nicht wesentlich ist, um die Monozyten zu Kryokonservierung, bevor sie mit dem Protokoll fortfahren, tat Kryokonservierung homogener Makrophagenkulturen, dass alle Makrophagen mehr eher verteilt waren produzieren, als beide abgerundet sind und verbreitet wie es der Fall war, als frische Monozyten wurden verwendet, um Kulturen zu initiieren. Wir haben erfolgreich Makrophagenkulturen aus Monozyten generiert, die bis zu 6 Monaten eingefroren gehalten wurden, (die längste Zeit getestet). Auf der anderen Seite, Säen von kryokonservierten macrophages in Kulturvertiefungen für Experimente führten nicht zu adäquaten Makrophagenkulturen.
Kritische Schritte in dem Protokoll umfassen sofort Monozyten in den Gefrierschrank nach Zugabe von Dimethylsulfoxid platzieren und sofort aufgetauten Monozyten Kulturmedium zu übertragen. Obwohl es üblich ist, DMSO zu entfernen, indem gefrorenen Zellen zentrifugiert, bevor sie in die Kultur beimpft sind, haben wir nicht, dass dies ein notwendiger Schritt in der erfolgreichen Kultur der Monozyten war. Jedoch müssen Forscher dies zu tun, wenn die Konzentration an restlichem DMSO (2 & mgr; l / ml) höher als das, was in dem obigen Protokoll verwendet wurde. Es ist wichtig, nicht in Kulturflaschen nach ihrer seeding Monozyten bis 48 Stunden zu spülen. Andernfalls können einige Monozyten in Abhängigkeit von dem Grad der Haftung an der Kulturoberfläche verloren. Auf der anderen Seite, wenn die Monozyten zu Makrophagen differenzieren, eine erhöhte Haftung der Makrophagen kann erfordern längere Behandlungs Trypsin, sie zu entfernen,oder eine Zelle Heber Freisetzung nach der anfänglichen Behandlung mit Trypsin zu erleichtern eingesetzt werden. Wenn Monozyten vermehren und differenzieren nicht, könnte dies aufgrund einiger ungewöhnliche Eigenschaft des Monozyten Spender, Verlust der Aktivität von M-CSF, oder aufgrund der Menge FBS verwendet. Auch mögliche Sorge , wenn die Kulturen nicht entwickeln , ist eine Kontamination der Reagenzien mit Endotoxin, ein Mittel , das Makrophagen - Proliferation 22 hemmt.
Differenzieren der kryokonservierten Monozyten in Kolben mit M-CSF ermöglicht deren bulk Differenzierung in Makrophagen. Dann kann die Makrophagen geerntet und in Kulturvertiefungen in erforderlichen Zelldichten für Durchführung von Experimenten ausgesät werden. Die Verwendung von definierten Anzahl von Makrophagen und nicht definierte Zahl von Monozyten-Makrophagen-Kulturen für Experimente zu initiieren, ergibt Makrophagenkulturen, in denen die gewünschte Zelldichte konsistenter erreicht werden kann.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cellbind 12-well culture plate | Corning | 3336 | |
| CELLSTAR, T-75 flask, tissue culture treated | Greiner Bio-One North America | 658157 | |
| RPMI 1640 culture medium | Cellgro Mediatech | 15-040-CM | warmed to 37 °C |
| L-Glutamine | Cellgro Mediatech | 25-005-CI | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000-036 | |
| M-CSF | PeproTech | 300-25 | |
| GM-CSF | PeproTech | 300-03 | |
| IL-10 | PeproTech | 200-10 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Cryovial | Thermo Scientific | 375418 | |
| DPBS without Ca2+ and Mg2+ | Corning cellgro | 21-031-CV | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| 50 ml polypropylene conical tube | Falcon | 352070 | |
| Trypan Blue | Lonza | 17-942E | |
| Neubauer-improved bright light hemocytometer | Paul Marienfeld GmbH & Co. KG | 610031 | http://www.marienfeld-superior.com/index.php/counting-chambers/articles/counting-chambers.html |
| CoolCell LX cell freezing container | BioCision | BCS-405 | other freezing containers also should be adequate for this step |
| Liquid Nitrogen Storage System, CryoPlus 1 | Thermo Scientific | 7400 | any liquid nitrogen tank should be adequate |
References
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