Protocol
백혈구 성분 채집은 보건 기관 검토위원회의 국립 연구소의 승인을 인간 대상의 연구 프로토콜에 따라 수행 하였다.
1. 분리 및 단핵구의 냉동 보존
- 인간의 기증자의 백혈구 성분 채집하여 단핵 세포를 확보하고, 참고 문헌 7,8에 설명 된대로 단핵 세포의 연속 역류 원심 분리 세광에 의해 단핵구을 풍부. 제조자가 지정한 세광 버퍼 - (90 % 단핵구 약 80) 약 100 × 106 씻겨져 걸러진 세포를 얻습니다. 혈구를 사용하여 세포를 계산합니다.
- 300 XG에 15 ml의 폴리 프로필렌 튜브에 원심 분리기 단핵구 실온에서 5 분간.
- 최종 90 % FBS / 10 % 디메틸 술폭 시드 농도 50 × 106 세포 / ml를 달성하는 디메틸 술폭 시드 이어 FBS에서 세포를 재현 탁 조심스럽게 상층 액을 제거하고.
- 세포 현탁액의 t의 각 ML을 추가개인 cryovial을 오.
- 셀 냉동 컨테이너에 배치 크리오 바이알 (cryovial)로 전송하고 -80 ° C의 냉동고에 24 시간 동안의 장기 저장을 위해 액체 질소 cryovial 저장 탱크로 전환하기 전에.
대 식세포에 단핵구 2. 차별화
- 빠르게 37 ℃의 수조에 전달하고, 세포 현탁액은 약 70 % 융해되었을 때 즉시 제거하여 세포를 해동 cryovial.
- 즉시 실온에서 완전 해동시에 C가 로스웰 파크 메모리얼 연구소 (RPMI) 2 mM L- 글루타민, 50 NG / ㎖ M-CSF, 25 ng의 / ㎖와 1640 가온 37 50 ㎖로 한 용액을 cryovial 내용을 전송 인터루킨 10 (IL-10) 및 10 % FBS (완전 배지).
- 전송이 75cm이 플라스틱 세포 배양 플라스크 각각에 단구 현탁액 25 ㎖.
- 48 시간 동안 5 % CO 95분의 2 %의 공기와 37 ℃ 세포 배양 인큐베이터에서 배양 물을 인큐베이션.
- CU를 씻어RPMI 1640 배지를 부드럽게 느슨하게 붙어있는 세포를 빠지 않도록 배지를 제거하고 (37 ℃로 미리 가온) 10 mL로 3 회 ltures.
- 세정 후, 단핵 세포가 분화 될 때까지 중간마다 이일을 변경, 신선한 완전 배지를 추가 합류가 충분히 증식. 이것은 문화의 약 1 주일이 필요합니다.
3. 수확 식세포는 실험을 시작합니다
- 10 ㎖의 플라스크에 3 회 분화 된 대 식세포 린스 예열 37 ° C, 0.25 % 트립신 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA) 용액 10 ㎖를 첨가하기 전에 2 + Mg를 칼슘 2 않고 37 ° C 둘 베코 인산염 완충 식염수를 예열.
- 대 식세포의 약 90 %가 반올림과 분리해야하는 시간에 15 분 - 10 세포 배양 인큐베이터에 넣어 플라스크. 플라스크의 현미경 검사하여이를 확인합니다.
- 10 % FBS를 포함 RMPI 1640 배지 10 ㎖의에 추가상단 트립신.
- 5 분 동안 원심 분리기, 50 ml의 폴리 프로필렌 튜브에 플라스크에서 300 XG를 대식 세포 현탁액을 전송하고, 상층 액을 버린다.
- 부드럽게 완전 배지 1 ㎖에 재현 탁 식세포.
- 10 ㎕의 트리 판 블루 용액으로 대식 세포 현탁액 10 μL를 혼합하고 혈구를 사용 대식 세포 수 및 생존율 (전형적으로> 95 %)를 결정한다.
- 셀 수에 기초하여 (일반적으로 약 15-18 × 105 식세포) 원하는 시딩 세포 밀도를 달성하기 위해 추가적인 완전 배지를 추가한다. 참고 : 12 웰 플레이트의 웰 당 1.5 ml의 배지에서 1 × 10 5 대 식세포를 거의 합류 문화를 생성합니다.
- 접종 후, 세포 부착을 허용하기 위해 5 % CO 95분의 2 %의 공기와 37 ℃ 세포 배양 인큐베이터에서 밤새 배양 한 대 식세포. 그런 다음, 원하는 실험을 시작한다.
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Representative Results
트리 판 블루 (9) 염색으로 결정 신선 또는 냉동 보존 단핵 세포의 생존 도표 1. 95 % 이상이고 그림 2는 낮은과 높은 배율에서 비교, 각각 식세포에 신선하고 냉동 보관 (즉, 냉동) 단핵구의 분화의 진행. 냉동 보관 단핵구 확산하지만 반올림 남아 있지 않습니다 단핵 세포를 분화의 모집단을 보여와 신선한 비교합니다. 상 - 루슨트의 공포는 두 조건에서 단핵구 유래 대 식세포에서 발생한다. 이전 10, 11 설명 된대로이 액포는 M-CSF 형 식세포의 macropinosomes 특성을 나타냅니다.
그들은 단핵 세포에서 분화 된의 플라스크에서 자신의 수확 후 Cryopreserving 대 식세포는 (성공 식세포 문화를 생산하지 않았다 M-CSF 형 식세포 제조 상기 프로토콜은 배양 물 플라스크에서 M-CSF 형 식세포 그들의 냉동 보존 및 분화없이 단핵구에서 직접 설정 될 때 종종 발생하는 GM-CSF 형 식세포 오염의 존재없이 그렇게. 그러나, 동결 보존은 + 단핵구 GM-CSF 우수한 GM-CSF 식 배양 (도 4)을 생성 FBS 미분. 
그림 1 : 냉동 보관 단핵구 대 신선한의 비교는 대 식세포 (저배율)을 생성하는 데 사용되는 냉동 보관 (냉동)와 신선한 단핵 세포의 위상 대비 현미경 이미지를 자신의 M-CSF 유도 분화 내가 중. NTO의 대 식세포. 3 7 일에서 플라스크에 문화 동안 단핵구가있는 도시, 일 8, 일일 12 웰 배양 판에 자신의 수확 및 replating 후. = 100 μm의 모든 적용 바. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 
그림 2.도 1의 범례에 기술 된 높은 배율에서 다음과 같이 (고배율)를 대 식세포를 제조하는데 사용 동결 보존 단핵구 대 신선한 단핵구 비교 배양 하였다. 상 - 루슨트 액포는 macropinosomes (흰색 화살표)입니다. = 50 μm의 모든 적용 바. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 
도 3 : 냉동 보존 식세포 적절한 배양 물을 생산하지 신선한 단핵구는 M-CSF와 함께 플라스크 차별화 칠일로 시딩 상기도 1 및도 2에 도시 된 바와 같이.. 그리고, 차별화 식세포 형틀 및 냉동 보존에서 수확 하였다. 비 - 냉동 보관 마크로파지 배양 일일 (8 일)에 대한 프로토콜에 기술 된 바와 같이 다음에 냉동 보관 된 대 식세포는 12 웰 플레이트에 접종 하였다. 1 일 문화의 위상차 현미경 이미지는 대 식세포의 거의 (위 그림 1에서 하루에 비 냉동 보관 식세포 8 결과를 비교) 자신의 냉동 보존에 따라 장착하는 것이 보여줍니다. 바 = 100 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 :. 냉동 보관 된 단핵 세포는 GM-CSF 형 단핵구 유래 대 식세포를 생산하기에 적합했다 냉동 보관 된 단핵구 (25 × 10 6) 50 NG / ml의 GM-CSF를 포함하는 10 % FBS와 플라스크와 차별화 된 팔일에 접종 하였다. 위상 대비 이미지는 GM-CSF 형 식세포의 전형적인 "기름에 튀긴 된 계란"형태를 보여줍니다. 바 = 100 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
정의 식세포 유형을 생성하는 대 식세포 생물학을 연구 할 때 조사자에 의해 얻어진 결과가 충돌의 일부를 명확하게 할 수있다. 다양한 배양 조건 및 분화 인자의 사용은 차 인간 대 식세포는 아주 다른 식세포 타입을 초래할 수 연구자에 의해 인식되지 않을 수있는 점을 생성한다. 예를 들어, 대 식세포는 때때로 어떤 혈청, 인간 혈청 형, FBS 만 M-CSF, 또는 M-CSF 또는 GM-CSF를 함유 FBS 보충 된 인간 혈청을 사용하지 않고, 인간 단핵 세포에서 생성된다. 이전에보고 우리가 관찰 한 바와 같이, 단핵구 3 가능한 남아 있지 않은 추가 분화 인자없이 FBS 혈청없이 또는 함께 일주일 동안 배양로. 전술 한 바와 같이, 단핵구는 단독으로 인간 혈청 배양 또는 FBS 플러스 GM-CSF로 분화 단핵구의 "튀김 달걀"형태 특성을 보여 식세포를 생성 M-CSF로 보충. 따라서, 인간 혈청 M-의 존재단핵 세포는 M-CSF로 분화되었다하더라도 더 긴 형태를 도시 CSF 형 식세포는 얻어지지 않는다.
흥미롭게도, 우리가 관찰하는 것과 동일한 배양 형태 학적 표현형 "달걀 튀김"M-CSF 및 GM-CSF 생성 양쪽으로 긴 M-CSF 및 GM-CSF를 모두 포함 FBS와 단핵 세포의 분화. 이것은 별개의 단핵 세포 개체군이 두 식세포 타입을 야기 할 것을 제안한다. 이전의 연구는 M-CSF 및 GM-CSF 분화 인자는 식세포의 단지 형태에 영향을 미칠뿐만 아니라, 유전자 발현이 두 식세포 유형 2-6 실질적으로 다른 세포 기능을 좌우 것으로 나타났다. 이전 두 바와 같이 GM-CSF의 대 식세포에 의해 발현되는 M-CSF 형 식세포 및 25F9로 표현 CD14과 결합 식세포 마커 CD68에 대한 면역 염색하는 대식 세포 유형을 확인하는데 사용될 수있다. 이 두 대 식세포 종류가 있어요바깥 다른 식세포 유형은 동맥 경화성 플라크 발생과 콜레스테롤 대사 및 염증 매개체 2,12,13의 발현의 차이를 보여줄 수있는 죽상 경화증의 연구에 특히 관련. 대 식세포는 콜레스테롤 12,14,15 풍부 할 때 예를 들어, M-CSF 형 대식 세포는 세포 외 기질에 이들 식세포 예금 콜레스테롤 고유합니다.
이전 16 설명 된대로 M-CSF와 문화 동안 제시된 프로토콜에서, IL-10은 정기적으로 추가되었습니다. 이러한 사이토 카인은 대 식세포의 증식 및 분화를 촉진하고, 대 식세포의보다 균일 한 긴 형태를 생성한다. 또한, IL-10, GM-CSF (17)에 의해 유도 된 신호 전달 사건을 억제함으로써 GM-CSF 의존성 단핵구 생존을 억제한다. 그러나 연구자들은 IL-10을 생략 할 수있다, IL-10 따라서 연구에서 다른 세포 반응에 영향을, 그리고 수 있음을 고려해야한다. 전에증식 및 플라스크 내의 단핵구 분화를 이용하는 현재의 프로토콜을 이용하여, 대 식세포 배양액 직접 배양 웰에 씻겨져 걸러진 단핵구 도금 실험을 개시하기 전에 7 일간을 미분함으로써 개시 하였다. 그러나, IL-10을 첨가하여,이 마크로파지 배양 중 일부는 연장 된 M-CSF 형 식세포 오염 "튀김 달걀"GM-CSF 형 식세포의 수가 적은 경우 (일반적으로 10 % 미만)을 보였다. 현재의 프로토콜로, GM-CSF 형 대식 세포 오염은 명확하지 않다 이유로 발생하지 않습니다. GM-CSF의 마크로파지 형 전구체 단핵구를 GM-CSF 우수한 GM-CSF 식 배양 (도 4 참조)를 생성한다 + FBS로 동결 보존 단핵구를 배양으로, 냉동 중에 손실되기 때문에, 그렇지 않다.
기술 된 프로토콜은 대 식세포로 분화하기 전에 단핵 세포의 동결 보존을 사용한다. 단핵 세포의 동결 보존은 이전했습니다iously 단핵 세포 기능에 영향을 미치지 않도록 도시되고 일반적으로 18-21을 사용한다. 이와 관련하여, 본 발명자들은 우리 식세포 (12)에 직접 배양 하였다 비 동결 보존 단핵구으로 전술 한 것과 유사한 세포 외 공간으로 증착 콜레스테롤 상기 프로토콜에 의해 생성 된 대 식세포. 단핵구 동결으로 단핵구 항상 단핵구가 공여자로부터 수득 할 수있는 경우의 독립적 인 실험을 개시 할 수있다. 이 프로토콜 진행하기 전에 단핵 세포를 cryopreserve하는 것이 필수적 아니지만, 냉동 보존은 더 둥근 신선한 단핵 세포가 문화를 시작하는 데 사용 때 경우가 있다는 확산 둘 것보다 오히려 확산 된 모든 식세포에보다 균일 대식 문화를 생산했다. 우리는 성공적으로 6개월 (테스트 가장 긴 시간)까지 냉동 보관 된 단핵 세포에서 대 식세포 문화를 생성했다. 동결 보존 macr의 한편, 시드ophages 문화에 실험 우물 적절한 대식 문화를 생산하지 않았다.
프로토콜의 중요한 단계는 즉시 디메틸 술폭 시드 첨가 한 다음 냉동으로 단핵구를 배치하고, 즉시 배지에 해동 단핵구 전사를 포함한다. 그들은 문화에 시드되기 전에 냉동 세포를 원심 분리하여 DMSO를 제거하는 것이 일반적이지만, 우리는이 단핵구의 성공적인 문화에 필요한 단계였다 찾지 못했습니다. 하지만, 연구자들은 잔류 DMSO (2 μL / ㎖)의 농도는 상기 프로토콜에서 사용 된 것보다 높을 경우이 작업을 수행 할 필요가있다. 문화 플라스크에서의 파종 다음 48시간까지 단핵 세포를 씻어하지 않는 것이 중요합니다. 그렇지 않으면, 일부는 단핵구 배양 표면에 부착 그 정도에 따라 손실 될 수있다. 한편, 단핵 식세포로 분화되면, 대 식세포의 밀착성을 제거하는 처리를 요구할 수 트립신 이상 증가또는 셀 리프터 초기 트립신 처리 후 방출을 용이하게하기 위해 사용될 수있다. 단핵 세포 증식 및 분화하지 않는 경우,이 때문에 단핵 세포 기증자의 일부 특이한 특성, M-CSF의 활동의 손실, 또는 인해 사용 FBS의 많은으로 될 수있다. 또한, 문화가 발전하지 가능한 문제의 독소와 시약의 오염, 대 식세포의 증식 (22)를 억제하는 에이전트입니다.
M-CSF와 플라스크에 냉동 보관 단핵 세포를 차별화하는 대 식세포에 자신의 벌크 차별화를 할 수 있습니다. 이어서, 대 식세포를 수확하고 실험을 수행하는데 필요한 세포 밀도로 배양 웰에 접종 할 수있다. 실험 마크로파지 배양을 개시 식세포 정의 숫자보다는 단핵구 정의 된 수의 사용은 원하는 세포 밀도보다 일관되게 달성 할 수있는 대식 세포 배양을 산출한다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cellbind 12-well culture plate | Corning | 3336 | |
| CELLSTAR, T-75 flask, tissue culture treated | Greiner Bio-One North America | 658157 | |
| RPMI 1640 culture medium | Cellgro Mediatech | 15-040-CM | warmed to 37 °C |
| L-Glutamine | Cellgro Mediatech | 25-005-CI | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000-036 | |
| M-CSF | PeproTech | 300-25 | |
| GM-CSF | PeproTech | 300-03 | |
| IL-10 | PeproTech | 200-10 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Cryovial | Thermo Scientific | 375418 | |
| DPBS without Ca2+ and Mg2+ | Corning cellgro | 21-031-CV | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| 50 ml polypropylene conical tube | Falcon | 352070 | |
| Trypan Blue | Lonza | 17-942E | |
| Neubauer-improved bright light hemocytometer | Paul Marienfeld GmbH & Co. KG | 610031 | http://www.marienfeld-superior.com/index.php/counting-chambers/articles/counting-chambers.html |
| CoolCell LX cell freezing container | BioCision | BCS-405 | other freezing containers also should be adequate for this step |
| Liquid Nitrogen Storage System, CryoPlus 1 | Thermo Scientific | 7400 | any liquid nitrogen tank should be adequate |
References
- Dey, A., Allen, J., Hankey-Giblin, P. A. Ontogeny and polarization of macrophages in inflammation: blood monocytes versus tissue macrophages. Front. Immunol. 5, 683 (2014).
- Waldo, S. W., et al. Heterogeneity of human macrophages in culture and in atherosclerotic plaques. Am. J. Pathol. 172, 1112-1126 (2008).
- Akagawa, K. S. Functional heterogeneity of colony-stimulating factor-induced human monocyte-derived macrophages. Int. J. Hematol. 76, 27-34 (2002).
- Akagawa, K. S., et al. Functional heterogeneity of colony-stimulating factor-induced human monocyte-derived macrophages. Respirology. 11 Suppl, S32-S36 (2006).
- Fleetwood, A. J., Lawrence, T., Hamilton, J. A., Cook, A. D. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (CSF) and macrophage CSF-dependent macrophage phenotypes display differences in cytokine profiles and transcription factor activities: implications for CSF blockade in inflammation. J. Immunol. 178, 5245-5252 (2007).
- Lacey, D. C., et al. Defining GM-CSF- and macrophage-CSF-dependent macrophage responses by in vitro models. J. Immunol. 188, 5752-5765 (2012).
- Strasser, E. F., Eckstein, R. Optimization of leukocyte collection and monocyte isolation for dendritic cell culture. Transfus. Med. Rev. 24, 130-139 (2010).
- Kim, S., et al. Monocyte enrichment from leukapheresis products by using the Elutra cell separator. Transfusion (Paris). 47, 2290-2296 (2007).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr. Protoc. Immunol. Appendix 3 (Appendix 3B), (2001).
- Anzinger, J. J., et al. Native low-density lipoprotein uptake by macrophage colony-stimulating factor-differentiated human macrophages is mediated by macropinocytosis and micropinocytosis. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 30, 2022-2031 (2010).
- Zhao, B., et al. Constitutive receptor-independent low density lipoprotein uptake and cholesterol accumulation by macrophages differentiated from human monocytes with macrophage-colony-stimulating factor (M-CSF). J. Biol. Chem. 281, 15757-15762 (2006).
- Freeman, S. R., et al. ABCG1-mediated generation of extracellular cholesterol microdomains. J. Lipid Res. 55, 115-127 (2014).
- Kruth, H. S. Receptor-independent fluid-phase pinocytosis mechanisms for induction of foam cell formation with native low-density lipoprotein particles. Curr. Opin. Lipidol. 22, 386-393 (2011).
- Jin, X., et al. ABCA1 contributes to macrophage deposition of extracellular cholesterol. J. Lipid Res. 56, 1720-1726 (2015).
- Ong, D. S., et al. Extracellular cholesterol-rich microdomains generated by human macrophages and their potential function in reverse cholesterol transport. J. Lipid Res. 51, 2303-2313 (2010).
- Hashimoto, S., Yamada, M., Motoyoshi, K., Akagawa, K. S. Enhancement of macrophage colony-stimulating factor-induced growth and differentiation of human monocytes by interleukin-10. Blood. 89, 315-321 (1997).
- Hashimoto, S. I., Komuro, I., Yamada, M., Akagawa, K. S. IL-10 inhibits granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-dependent human monocyte survival at the early stage of the culture and inhibits the generation of macrophages. J. Immunol. 167, 3619-3625 (2001).
- Lund, P. K., Joo, G. B., Westvik, A. B., Ovstebo, R., Kierulf, P. Isolation of monocytes from whole blood by density gradient centrifugation and counter-current elutriation followed by cryopreservation: six years' experience. Scand. J. Clin. Lab. Invest. 60, 357-365 (2000).
- Weiner, R. S., Normann, S. J. Functional integrity of cryopreserved human monocytes. J. Natl. Cancer Inst. 66, 255-260 (1981).
- Hansen, J. B., et al. Retention of phagocytic functions in cryopreserved human monocytes. J. Leukoc. Biol. 57, 235-241 (1995).
- Seager Danciger, J., et al. Method for large scale isolation, culture and cryopreservation of human monocytes suitable for chemotaxis, cellular adhesion assays, macrophage and dendritic cell differentiation. J. Immunol. Methods. 288, 123-134 (2004).
- Jin, X., Xu, Q., Champion, K., Kruth, H. S. Endotoxin contamination of apolipoprotein A-I: effect on macrophage proliferation--a cautionary tale. Atherosclerosis. 240, 121-124 (2015).
