Protocol
La cytaphérèse a été réalisée dans le cadre du protocole de recherche d'un sujet humain approuvé par un National Institutes of Health Institutional Review Board.
1. Isolement et Cryoconservation des monocytes
- Obtenir des cellules mononucléaires par cytaphérèse de donneurs humains, et d' enrichir les monocytes par contre-courant continu élutriation de centrifugation des cellules mononucléaires telles que décrites dans les références 7,8. Obtenir environ 100 x 10 6 cellules décanté (environ 80 - 90% de monocytes) dans un tampon d'élutriation spécifié par le fabricant. Compter les cellules en utilisant un hémocytomètre.
- monocytes centrifuger dans un tube de 15 ml de polypropylène à 300 xg pendant 5 min à température ambiante.
- Eliminer le surnageant et remettre en suspension doucement les cellules dans du FBS suivi par le sulfoxyde de diméthyle pour obtenir une concentration finale de 90% de FBS / 10% de diméthylsulfoxyde et 50 x 10 6 cellules / ml.
- Ajouter chaque ml de suspension cellulaire to un cryovial individuel.
- Placer les cryotubes dans un récipient de congélation de cellules et les transférer vers un congélateur à -80 ° C pendant 24 h avant de les transférer vers un réservoir de stockage d'azote liquide cryofiole pour le stockage à long terme.
2. Différenciation de monocytes en Macrophages
- Décongeler un cryotube de cellules en transférant rapidement dans un bain-marie à 37 ° C, puis immédiatement après l'élimination de la suspension cellulaire a décongelé environ 70%.
- Immédiatement après décongélation complète à la température ambiante, transférer les 1 ml contenus cryovial dans 50 ml de 37 ° C réchauffé Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 moyenne avec 2 mM de L-glutamine, 50 ng / ml de M-CSF, 25 ng / ml interleukine-10 (IL-10) et 10% de FBS (milieu complet).
- Prélever 25 ml de suspension de monocyte dans chacun de deux flacons de 75 cm2 de culture cellulaire en plastique.
- Incuber les cultures à 37 ° C , une culture cellulaire incubateur avec 5% de CO2 / 95% d' air pendant 48 heures.
- Rincer la cultures 3 fois avec 10 ml de milieu RPMI 1640 (préchauffée à 37 ° C), en éliminant doucement le milieu de culture afin d'éviter de déloger toutes les cellules faiblement fixées.
- Après rinçage, ajouter un milieu complet frais, changeant moyenne tous les 2 jours jusqu'à ce que les monocytes se différencient et prolifèrent suffisamment pour devenir confluentes. Ce qui nécessite environ une semaine de culture.
3. Récolte Macrophages pour lancer des expériences
- Rincer les macrophages différenciés dans un ballon 3 fois avec 10 ml de pré-chauffé à tampon phosphate une solution saline de 37 ° C Dulbecco sans Ca2 + et Mg2 + avant d' ajouter 10 ml préchauffée acide trypsine éthylènediaminetétraacétique (EDTA) , solution à 37 ° C de 0,25%.
- Placer dans fiole de culture cellulaire incubateur pendant 10 - 15 min, à laquelle environ 90% des macrophages aurait arrondi et détaché. Vérifiez ceci par un examen microscopique du flacon.
- Ajouter 10 ml de RPMI 1640 contenant 10% de FBS à stop trypsinisation.
- Transférer la suspension cellulaire macrophage de la fiole dans un tube de polypropylene de 50 ml, centrifuger 300 g pendant 5 min, et jeter le surnageant.
- Resuspendre doucement les macrophages dans 1 ml de milieu complet.
- Mélanger 10 ul de suspension cellulaire avec 10 ul macrophage solution bleu Trypan et déterminer le nombre de cellules et la viabilité de macrophage (typiquement> 95%) en utilisant un hémocytomètre.
- Sur la base du comptage des cellules (habituellement environ 15 - 18 x 10 5 macrophages), ajouter un milieu complet supplémentaire pour atteindre la densité cellulaire d'ensemencement souhaitée. Note: 1 x 10 5 macrophages dans 1,5 ml de milieu par puits d'une plaque de 12 puits produira une culture quasi-confluentes.
- À la suite de l' ensemencement, les macrophages incuber pendant une nuit dans une culture de cellules C incubateur à 37 ° avec 5% de CO2 / 95% d' air pour permettre la fixation des cellules. Ensuite, commencer les expériences souhaitées.
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Representative Results
La viabilité des monocytes frais ou cryoconservés est supérieure à 95% telle que déterminée par coloration au bleu Trypan 9. La figure 1 et la figure 2 compare à des grossissements inférieurs et supérieurs, respectivement, la progression de la différenciation des monocytes frais et cryoconservés ( par exemple, congelé) dans les macrophages. Notez que les frais comparé à monocytes cryoconservés montrent une sous-population de différencier les monocytes qui ne se propage pas, mais restent arrondis. vacuoles Phase-lucent se produisent dans les macrophages dérivés de monocytes dans les deux conditions. Ces caractéristiques représentent les vacuoles macropinosomes de M-CSF des macrophages de type comme décrit précédemment 10,11.
les macrophages cryoconservation après leur récolte à partir des flacons dans lesquels ils ont été différenciées à partir de monocytes ne produisent pas de cultures de macrophages avec succès ( Le protocole ci-dessus pour la production de M-CSF des macrophages de type fait sans la présence de contamination du GM-CSF des macrophages de type qui se produit parfois lorsque des cultures sont établies directement à partir de monocytes sans leur cryoconservation et la différenciation de M-CSF des macrophages de type dans des flacons. Cependant, les monocytes cryoconservés différenciées avec FBS + GM-CSF produisent d' excellentes cultures de type GM-CSF (Figure 4). 
Figure 1: Comparaison des frais par rapport monocytes cryoconservés utilisé pour produire des macrophages (faible grossissement) à contraste de phase des images microscopiques de monocytes cryoconservés (congelés) et frais lors de leur M-CSF induit la différenciation i. macrophages nto. Sont représentées les monocytes en culture dans des flacons à 3 et 7 jours, et le jour 8, un jour après leur récolte et de réensemencement dans des plaques de culture 12 puits. Bar = 100 um et applique à tous. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. 
Figure 2:. Comparaison des frais par rapport monocytes cryoconservés utilisées pour produire des macrophages (fort grossissement) Les monocytes ont été cultivées comme décrit dans la figure 1 légende et montré ici à plus fort grossissement. vacuoles Phase-lucent sont macropinosomes (flèches blanches). Bar = 50 um et applique à tous. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. 
Figure 3: cryoconservée les macrophages ne parviennent pas à produire des cultures fraîches suffisantes monocytes ont été ensemencées dans un flacon et différenciées 7 jours avec du M-CSF comme indiqué sur les figures 1 et 2 ci - dessus.. Ensuite, les macrophages différenciés ont été récoltées à partir de flacons et cryoconservés. Ensuite, les macrophages cryoconservés ont été ensemencées dans des plaques à 12 puits comme décrit dans le protocole pour les macrophages non cultivées et cryopréservées 1 jour (jour 8). Contraste de phase image microscopique de la culture 1 jour montre que très peu des macrophages attach après leur cryoconservation (comparer à jour 8 résultats pour les macrophages non cryoconservés dans la figure 1 ci - dessus). Bar = 100 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4:. Monocytes cryoconservés sont également appropriés pour produire des macrophages dérivés des monocytes de type GM-CSF de monocytes cryoconservés (25 x 10 6) ont été ensemencées dans un flacon et différenciées 8 jours avec 10% de FBS contenant 50 ng / ml de GM-CSF. l'image à contraste de phase montre le "œuf frit" morphologie typique de GM-CSF macrophages de type. Bar = 100 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Génération types de macrophage définis peut clarifier certains des résultats contradictoires obtenus par les enquêteurs lors de l'étude de la biologie macrophage. L'utilisation de différentes conditions de culture et des facteurs de différenciation pour générer des macrophages humains primaires peuvent conduire à des types très différents macrophage, un fait qui ne peut être apprécié par le chercheur. Par exemple, les macrophages sont parfois produites à partir de monocytes humains en utilisant pas de sérum, le sérum humain seul, le sérum humain supplémenté avec du M-CSF, FBS seul, ou du FBS contenant du M-CSF ou le GM-CSF. Comme rapporté précédemment , et comme nous l' avons également observé, monocytes en culture pendant une semaine sans sérum ou avec du FBS sans facteurs de différenciation ajoutés ne restent pas viable 3. Comme il est mentionné ci-dessus, les monocytes cultivés avec du sérum humain seul ou additionné de M-CSF générer des macrophages qui indiquent le "oeuf sur le plat" morphologie caractéristique des monocytes différenciés avec du FBS plus GM-CSF. Ainsi, en présence de sérum humain, le M-Type CSF macrophage montrant une morphologie plus allongée est pas obtenue même si les monocytes ont été différenciés avec M-CSF.
Fait intéressant, nous avons observé que la différenciation des monocytes avec du FBS contenant à la fois M-CSF et le GM-CSF, génère à la fois le M-CSF allongé et GM-CSF "frit oeuf" phénotypes morphologiques dans la même culture. Ceci suggère que les sous-populations de monocytes distincts donnent naissance à ces deux types macrophage. Des études antérieures ont montré que des facteurs de différenciation GM-CSF et le M-CSF affectent non seulement la morphologie du macrophage, mais aussi une influence sur l' expression des gènes et la fonction des cellules, ce qui est sensiblement différent pour ces deux types macrophage 2-6. Immunocoloration pour le marqueur CD68 des macrophages en liaison avec le CD14 qui est exprimé par M-CSF des macrophages de type et 25F9 qui est exprimée par les macrophages GM-CSF peut être utilisé pour confirmer le type macrophage comme indiqué précédemment 2. Ces deux types macrophage may être particulièrement pertinent pour l'étude de l' athérosclérose où des types différents de macrophages se produisent dans les plaques athéroscléreuses et peuvent présenter des différences dans le métabolisme du cholestérol et l' expression de médiateurs de l' inflammation 2,12,13. Par exemple, les macrophages de type M-CSF sont uniques en ce que ces macrophages dépôt de cholestérol dans la matrice extracellulaire lorsque les macrophages sont enrichis avec le cholestérol 12,14,15.
Dans le protocole présenté, au cours de la culture avec du M-CSF, l' IL-10 a été ajouté de façon routinière comme décrit précédemment 16. Cette cytokine favorise la croissance et la différenciation des macrophages et produit une morphologie allongée plus homogène des macrophages. En outre, l' IL-10 inhibe la survie des monocytes GM-CSF-dépendante en inhibant les événements de signalisation induite par le GM-CSF 17. Cependant, les enquêteurs devraient envisager que l'IL-10 peut affecter d'autres réponses cellulaires à l'étude, et par conséquent, peuvent souhaiter omettre l'IL-10. Avanten utilisant le protocole actuel en utilisant la prolifération et la différenciation des monocytes dans un flacon, les cultures de macrophages ont été initiés par étalement directement monocytes séparés par décantation dans des puits de culture et de les différencier pendant 7 jours avant d'entreprendre des expériences. Cependant, même avec l'addition d'IL-10, certains de ces cultures de macrophages ont montré un petit nombre (habituellement moins de 10%) des macrophages "oeuf sur le plat" de type GM-CSF qui contaminent les macrophages allongés de type M-CSF. Avec le protocole actuel, GM-CSF contamination type macrophage ne se produit pas pour des raisons qui ne sont pas claires. Cependant, il est non pas parce que les monocytes précurseurs GM-CSF de type macrophage sont perdues lors de la congélation, comme la culture des monocytes cryoconservés avec FBS + GM-CSF produit d' excellentes cultures de type GM-CSF (voir Figure 4).
Le protocole décrit utilise cryoconservation des monocytes avant leur différenciation en macrophages. Monocyte cryoconservation a été previously montré de ne pas affecter la fonction des monocytes et est couramment employée 18-21. À cet égard, nous avons découvert que les macrophages générés par le protocole ci - dessus le dépôt de cholestérol dans l'espace extracellulaire similaire à ce qu'on a décrit précédemment avec des monocytes non cryoconservés qui ont été cultivées directement dans les macrophages 12. Avec monocytes cryoconservation, monocytes sont toujours disponibles pour initier des expériences, indépendamment du moment où les monocytes peuvent être obtenus à partir d'un donneur. Bien qu'il ne soit pas essentiel à la cryoconservation des monocytes avant de poursuivre avec le protocole, la cryoconservation a produit des cultures de macrophages plus homogènes en ce que tous les macrophages ont été plus étalée plutôt que d'être à la fois arrondies et réparties comme ce fut le cas lorsque les monocytes frais ont été utilisés pour initier des cultures. Nous avons réussi à générer des cultures de monocytes macrophages qui ont été maintenus congelés jusqu'à 6 mois, (le plus long temps testé). D'autre part, l'ensemencement de macr cryoconservésophages dans la culture des puits pour les expériences ne produisaient pas des cultures de macrophages adéquates.
Les étapes critiques du protocole comprennent immédiatement placer monocytes dans le congélateur après addition de diméthylsulfoxyde, et transférer immédiatement monocytes décongelés au milieu de culture. Bien qu'il soit courant pour éliminer le DMSO par centrifugation les cellules congelées avant d'être ensemencées dans la culture, on n'a pas trouvé cela était une étape nécessaire dans la culture réussie des monocytes. Cependant, les enquêteurs peuvent avoir besoin de faire cela si la concentration de DMSO résiduel (2 pl / ml) est plus élevé que ce qui a été utilisé dans le protocole ci-dessus. Il est important de ne pas rincer monocytes jusqu'à 48 heures après leur ensemencement dans des flacons de culture. Dans le cas contraire, des monocytes peuvent être perdus en fonction de leur degré d'adhérence à la surface de culture. D'autre part, une fois que les monocytes se différencient en macrophages, augmente l'adhérence des macrophages peut exiger plus traitement à la trypsine pour les supprimer,un dispositif de levage ou de cellules peut être utilisé pour faciliter la libération après le traitement par la trypsine de départ. Si les monocytes ne prolifèrent et se différencient, cela pourrait être dû à une caractéristique inhabituelle du donneur monocytaire, une perte d'activité de M-CSF, ou en raison du grand nombre de FBS utilisé. Aussi, peut - être préoccupante lorsque les cultures ne se développent pas est la contamination des réactifs avec l' endotoxine, un agent qui inhibe la prolifération des macrophages 22.
Différencier les monocytes cryoconservés dans des flacons avec M-CSF permet leur différenciation en vrac dans les macrophages. Ensuite, les macrophages peuvent être récoltées et ensemencées dans des puits de culture à des densités cellulaires nécessaires à la réalisation des expériences. L'utilisation des nombres définis de macrophages, plutôt que des nombres définis de monocytes pour initier des cultures de macrophages pour les expériences, on obtient des cultures de macrophages dans lequel la densité cellulaire souhaitée peut être plus uniformément atteint.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cellbind 12-well culture plate | Corning | 3336 | |
| CELLSTAR, T-75 flask, tissue culture treated | Greiner Bio-One North America | 658157 | |
| RPMI 1640 culture medium | Cellgro Mediatech | 15-040-CM | warmed to 37 °C |
| L-Glutamine | Cellgro Mediatech | 25-005-CI | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000-036 | |
| M-CSF | PeproTech | 300-25 | |
| GM-CSF | PeproTech | 300-03 | |
| IL-10 | PeproTech | 200-10 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Cryovial | Thermo Scientific | 375418 | |
| DPBS without Ca2+ and Mg2+ | Corning cellgro | 21-031-CV | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| 50 ml polypropylene conical tube | Falcon | 352070 | |
| Trypan Blue | Lonza | 17-942E | |
| Neubauer-improved bright light hemocytometer | Paul Marienfeld GmbH & Co. KG | 610031 | http://www.marienfeld-superior.com/index.php/counting-chambers/articles/counting-chambers.html |
| CoolCell LX cell freezing container | BioCision | BCS-405 | other freezing containers also should be adequate for this step |
| Liquid Nitrogen Storage System, CryoPlus 1 | Thermo Scientific | 7400 | any liquid nitrogen tank should be adequate |
References
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