Protocol
Leukapheresis בוצע תחת פרוטוקול המחקר של הסובייקט אנושי שאושר בידי מכוני הלאומיים לוח סקירה מוסדית הבריאות.
1. ניתוק ו Cryopreservation של מונוציטים
- להשיג תאים mononuclear ידי leukapheresis התורמים אדם, ולהעשיר מונוציטים ידי elutriation צנטריפוגה רציפה נגד זרימה של תאים mononuclear כמתואר אזכור 7,8. השג כ 100 x 10 6 תאים elutriated (כ -80 - 90 מונוציטים%) במאגר elutriation שצוינו על ידי היצרן. ספירת תאים באמצעות hemocytometer.
- מונוציטים צנטריפוגה בתוך צינור פוליפרופילן 15 מ"ל ב 300 XG במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- הסר את supernatant בעדינות resuspend התאים FBS ואחריו sulfoxide דימתיל כדי להשיג ריכוז סופי של sulfoxide דימתיל 90% FBS / 10% ו -50 x 10 6 תאים / מ"ל.
- הוסף כל מ"ל של התא תלוי על העריסהo cryovial הפרט.
- מניחים את cryovials במיכל הקפאה תא ולהעביר מקפיא -80 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות לפני העברת טנק אחסון cryovial חנקן נוזלי עבור אחסון לטווח ארוך.
בידול 2. של מונוציטים לתוך המקרופאגים
- פשרת cryovial של תאים על ידי העברה במהירות באמבט מי 37 ° C ומייד הסרה כאשר השעית התא הפשירה כ -70%.
- מיד עם ההפשרה מלאה בטמפרטורת החדר, להעביר את 1 מ"ל תוכנו cryovial לתוך 50 מ"ל של 37 ° C חימם רוזוול פארק הזיכרון במכון (RPMI) 1640 בינוני עם 2 מ"מ L- גלוטמין, 50 ng / ml M-CSF, 25 ng / ml interleukin-10 (IL-10), ו -10% FBS (בינוני מלא).
- העברת 25 מ"ל של השעיה מונוציטים לתוך כל אחת משתי 75 ס"מ 2 צלוחיות תרבית תאים פלסטיק.
- דגירת תרבויות בתוך חממת תרבית תאי 37 ° C עם אוויר 5% CO 2/95% למשך 48 שעות.
- שוטפים את מ"קltures 3 פעמים עם 10 מיליליטר RPMI 1640 בינוניים (מחומם מראש ל 37 מעלות צלזיוס), הסרת בינוני התרבות בעדינות כדי למנוע פירוק כל תאים מחוברים באופן רופף.
- בעקבות שטיפה, להוסיף בינוני שלם טרי, שינוי בינוני כל 2 ימים עד מונוציטים להבדיל מתרבים מספיק להיות ומחוברות. זה דורש כשבוע של התרבות.
המקרופאגים קציר 3. ליזום ניסויים
- לשטוף מקרופאגים הבדיל ב הבקבוק 3 פעמים עם 10 מ"ל מראש חימם 37 ° שנאגרו מלוחים פוספט של C Dulbecco ללא Ca 2 + ו Mg 2+ לפני הוספת 10 מ"ל מראש חימם 37 ° C 0.25% טריפסין-ethylenediaminetetraacetic חומצה פתרון (EDTA).
- מקום בקבוק באינקובטור תרבית תאים עבור 10 - 15 דקות שאז כ 90% של מקרופאגים צריכים מעוגלים ומנותקות. לבדוק זאת על ידי בדיקה מיקרוסקופית של הבקבוק.
- הוסף 10 מ"ל של מדיום RMPI 1640 המכיל 10% FBS כדי strypsinization העליון.
- מעבירים את ההשעיה תא מקרופאג מהבקבוק לתוך צינור פוליפרופילן 50 מ"ל, צנטריפוגה XG 300 במשך 5 דקות, וזורקים supernatant.
- Resuspend בעדינות את מקרופאגים לתוך 1 מ"ל של מדיום מלאה.
- מערבבים 10 μl של השעיה תא מקרופאג עם 10 μl פתרון Trypan כחול לקבוע מספר הסלולרי מקרופאג הכדאיות (בדרך כלל> 95%) באמצעות hemocytometer.
- בהתבסס על ספירת התאים (בדרך כלל בערך 15 - 18 x 10 5 מקרופאגים), להוסיף בינוני מלא נוסף כדי להשיג את צפיפות תאי זריעה הרצויה. הערה: 1 x 10 5 מקרופאגים 1.5 מ"ל בינוני לכל גם צלחת 12 גם יפיק התרבות ליד ומחוברות.
- בעקבות זריעה, דגירת מקרופאגים לילה חממת תרבית תאי 37 ° C עם 5% CO 2/95% אוויר לאפשר התקשרות תא. לאחר מכן, מתחיל ניסויים רצויים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הכדאיות של מונוציטים טריים או cryopreserved היה יותר מ -95% כפי שנקבע עם Trypan כחול מכתים 9. איור 1 ואיור 2 להשוות בבית התחתון בהגדלות גדולות, בהתאמה, את ההתקדמות של בידול מונוציטים טריים cryopreserved (כלומר, קפוא) לתוך מקרופאגים. ראוי לציין, כי טרי לעומת מונוציטים cryopreserved להראות subpopulation של הבחנה מונוציטים כי אינם מתפשטים אבל להישאר מעוגל. vacuoles-לוסנט שלב להתרחש מקרופאגים הנגזרות מונוציטים בתנאים שניהם. Vacuoles אלה מייצגים מאפיין macropinosomes של מקרופאגים סוג M-CSF כפי שתואר לעיל 10,11.
מקרופאגים Cryopreserving לאחר הקטיף שלהם מן הצלוחיות שבו הם נבדלים מונוציטים לא לייצר תרבויות מקרופאג מוצלחות ( בפרוטוקול לעיל להפקת מקרופאגים סוג M-CSF עושה זאת ללא הנוכחות של זיהום מקרופאגים סוג GM-CSF שלפעמים מתרחשת כאשר תרבויות מבוססות ישירות מונוציטים ללא cryopreservation וההבחנה שלהם מקרופאגים סוג M-CSF צלוחיות. עם זאת, מונוציטים cryopreserved בדיל עם FBS + GM-CSF לייצר תרבויות סוג מעולות GM-CSF (איור 4). 
איור 1: השוואה בין טריים לעומת מונוציטים cryopreserved המשמש לייצור מקרופאגים (בהגדלה נמוכה) תמונות מיקרוסקופיות שלב בניגוד של מונוציטים cryopreserved (קפוא) ורענן במהלך i בידול M-CSF המושרה שלהם. מקרופאגים Nto. המוצגים הם מונוציטים במהלך התרבות צלוחיות ב 3 ו 7 ימים, וביום 8, יום אחד לאחר קצירת replating שלהם לתוך צלחות תרבית של 12 באר. בר = 100 מיקרומטר והוא חל על כל. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. 
איור 2:. השוואה טריה לעומת מונוציטים cryopreserved המשמשים לייצור מקרופאגים (גדלה גבוהה) מונוציטים היו בתרבית כמתואר אגדת איור 1 ו המוצגים כאן בהגדלה גבוהה יותר. vacuoles-לוסנט פזה macropinosomes (חצים לבנים). בר = 50 מיקרומטר והוא חל על כל. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. 
איור 3: cryopreserved מקרופאגים מצליחים לייצר תרבויות נאותה מונוציטים טריים היו זורעים לתוך בקבוק ו -7 ימים הבדיל עם M-CSF כפי שמוצג איורים 1 ו -2 לעיל.. לאחר מכן, מקרופאגים הבדיל נבצרו צלוחיות cryopreserved. בשלב הבא, מקרופאגים cryopreserved היו זורעים לתוך 12 גם צלחות כמתואר בפרוטוקול עבור מקרופאגים הלא cryopreserved ויום 1 תרבותיים (יום 8). תמונה מיקרוסקופית-בניגוד שלב של תרבות 1 ימים מראה כי מעט מאוד של מקרופאגים לצרף הבאים cryopreservation שלהם (להשוות עד היום 8 תוצאות עבור מקרופאגים הלא cryopreserved באיור 1 לעיל). בר = 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
ss = "jove_content" FO: keep-together.within-page = "1"> 
איור 4:. מונוציטים cryopreserved היו גם המתאימים לייצור מקרופאגים סוג GM-CSF הנגזרות מונוציטים מונוציטים cryopreserved (25 x 10 6) היו זורעים לתוך בקבוק ו -8 ימים הבדיל עם 10% FBS המכיל 50 ng / ml GM-CSF. תמונת שלב בניגוד מציגה את המורפולוגיה "ביצת עין" הטיפוסית של מקרופאגים סוג GM-CSF. בר = 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
יצירת סוגים מקרופאג מוגדר יכול להבהיר כמה תוצאות סותרות שהגיעו לידי החוקרים כאשר לומדים ביולוגיה מקרופאג. שימוש תנאי תרבות שונים וגורם בידול כדי ליצור מקרופאגים אדם מן המעלה ראשון יכולים להוביל סוגי מקרופאג שונים מאוד, עובדה כי לא יכול להיות מוערכת על ידי החוקר. לדוגמא, מקרופאגים לפעמים נוצרים מתוך מונוציטים אדם ללא שימוש בסרום, נסיוב אדם לבד, נסיוב האדם השלים עם M-CSF, FBS לבד, או FBS המכיל M-CSF או GM-CSF. כפי שדווח בעבר וכפי שאנו גם ציינו, מונוציטים מתורבתים במשך שבוע ללא סרום או עם FBS ללא גורמי בידול הוסיפו לא נשארים קיימא 3. כאמור, מונוציטים מתורבת עם נסיוב אדם לבד או בתוספת M-CSF ליצור מקרופאגים המראים את מאפיין "ביצת עין" מורפולוגיה של מונוציטים הבדיל עם FBS בתוספת GM-CSF. לפיכך, בנוכחות בסרום האנושי M-מקרופאג CSF הסוג מראה מורפולוגיה מוארכת יותר לא מתקבל למרות מונוציטים כבר הבדיל עם M-CSF.
מעניין, יש לנו ציין כי הבידול של מונוציטים עם FBS המכיל גם M-CSF ו- GM-CSF, מייצר הן את M-CSF מוארך ו- GM-CSF "מטוגן ביצה" פנוטיפים מורפולוגי באותה תרבות. הדבר מצביע על כך תת-אוכלוסיות מונוציטים ברורות להצמיח שני אלה סוגים מקרופאג. מחקרים קודמים הראו כי M-CSF וגורמים בידול GM-CSF להשפיע לא רק את המורפולוגיה של מקרופאג, אלא גם להשפיע על ביטוי גנים ותפקוד התא, אשר שונה באופן מהותי עבור שני סוגי מקרופאג אלה 2-6. Immunostaining עבור CD68 סמן מקרופאג בשיתוף עם CD14 אשר באה לידי ביטוי על ידי מקרופאגים סוג M-CSF ו 25F9 המתבטא מקרופאגים-CSF GM יכול לשמש כדי לאשר את סוג מקרופאג כמוצג 2 בעבר. סוגים מקרופאג שני אלה מay להיות רלוונטי במיוחד לחקר טרשת העורקים שבו סוגים שונים מקרופאג להתרחש פלאק טרשת עורק והוא יכול להראות הבדלי מטבוליזם כולסטרול וביטוי של מתווכי דלקת 2,12,13. לדוגמה, מקרופאגים סוג M-CSF ייחודיים בכך כולסטרול פיקדון מקרופאגים אלו לתוך תאי מטריקס כאשר מקרופאגים מועשרים עם כולסטרול 12,14,15.
בפרוטוקול שהוצג, במהלך התרבות עם M-CSF, IL-10 נוספו שגרתי כפי שתוארו לעיל 16. ציטוקינים זה מקדם צמיחה והתבדלות של מקרופאגים ומייצר מורפולוגיה מוארכת הומוגנית יותר של מקרופאגים. בנוסף, IL-10 מעכב הישרדות מונוציטים GM-CSF תלוי על ידי עיכוב אירועי האיתות מושרה על ידי GM-CSF 17. עם זאת, חוקרים צריכים לשקול כי IL-10 עשוי להשפיע תגובות תאים אחרות נחקר, ולכן, מומלצים להשמיט IL-10. לפניבאמצעות פרוטוקול העסקת התפשטות והבחנה הנוכחי של מונוציטים בבקבוק, תרבויות מקרופאג היו ביוזמת ציפוי מונוציטים elutriated ישירות לתוך בארות התרבות המבדילים אותם למשך 7 ימים לפני ייזום ניסויים. עם זאת, אפילו עם תוספת של IL-10, חלק תרבויות מקרופאג אלה הראו במספרים קטנים (בדרך כלל פחות מ -10%) של "ביצת עין" מקרופאגים GM-CSF סוג מזהם את מקרופאגים M-CSF סוג מוארך. עם הפרוטוקול הנוכחי, זיהום מקרופאג סוג GM-CSF אינה מתרחשת מסיבות שאינן ברורות. עם זאת, זה לא בגלל מונוציטים מבשר סוג מקרופאג GM-CSF הם איבדו במהלך ההקפאה, כפי culturing מונוציטים cryopreserved עם FBS + GM-CSF מייצרת תרבויות סוג GM-CSF מצוין (ראה איור 4).
הפרוטוקול המתואר מנצל cryopreservation של מונוציטים לפני הבידול שלהם לתוך מקרופאגים. cryopreservation מונוציטים כבר קודםiously הראה שלא להשפיע על תפקוד מונוציטים ומועסק 18-21 נפוץ. בהקשר זה, מצאנו כי מקרופאגים שנוצר על ידי בפרוטוקול לעיל כולסטרול פיקדון לחלל תאיים דומה למה שתיארנו קודם לכן עם מונוציטים הלא cryopreserved כי היו בתרבית ישירות לתוך מקרופאגים 12. עם cryopreservation מונוציטים, מונוציטים זמינים תמיד ליזום ניסויים, ללא תלות כאשר ניתן להשיג מונוציטים מתורם. אמנם זה לא חיוני cryopreserve מונוציטים לפני שתמשיך עם פרוטוקול, cryopreservation עשה לייצר תרבויות מקרופאג הומוגנית יותר בכל מקרופאגים פוזרו יותר במקום להיות הן מעוגלות ולהפיץ כפי שהיה כאשר מונוציטים טריים שימשו ליזום תרבויות. יש לנו שנוצרו תרבויות מקרופאג בהצלחה מונוציטים שהיו נשמרים בהקפאה עד 6 חודשים, (הזמן הארוך ביותר שנבדק). מצד שני, זריעה של macr cryopreservedophages לתוך תרבות בארות לניסויים לא לייצר תרבויות מקרופאג נאותות.
צעדים קריטיים בפרוטוקול מייד כוללים מיקום מונוציטים למקפיא בא תוספת של sulfoxide דימתיל, ומייד העברת מונוציטים מופשר עד בינוני התרבות. למרות זאת הוא נפוץ להסיר DMSO ידי צנטריפוגה תאים קפואים לפני שהם זורעים לתוך התרבות, לא מצאנו זה היה צעד הכרחי בתרבות המוצלחת של מונוציטים. עם זאת, החוקרים ייתכן שיהיה צורך לעשות זאת אם ריכוז של DMSO שיורית (2 μl / מ"ל) הוא גבוה יותר ממה שימש בפרוטוקול לעיל. חשוב לא לשטוף מונוציטים עד 48 שעות לאחר הזריעה שלהם צלוחיות תרבות. אחרת, כמה מונוציטים עלולים ללכת לאיבוד כתלות בדרגה שלהם של הידבקות אל פני שטח התרבות. מצד השני, ברגע מונוציטים להתמיין מקרופאגים, גדל הידבקות של מקרופאגים עשויה לדרוש טריפסין טיפול ארוך יותר כדי להסיר אותם,או מרים תא יכול להיות מועסק על מנת להקל שחרור לאחר טיפול טריפסין הראשוני. אם מונוציטים לא להתרבות להבדיל, זה יכול להיות בגלל כמה מאפיין יוצא דופן של תורם מונוציטים, אובדן הפעילות של M-CSF, או בשל הרבה FBS בשימוש. כמו כן, של חשש אפשרי כאשר תרבויות אינן מפתחים הוא זיהום של חומרים כימיים עם רעלן פנימי, סוכן מעכבת מקרופאג התפשטות 22.
בידול מונוציטים cryopreserved צלוחיות עם M-CSF מאפשר בידול נפחם לתוך מקרופאגים. לאחר מכן, מקרופאגים ניתן לקצור זורע לתוך בארות התרבות בצפיפויות תא הנדרשים לביצוע ניסויים. השימוש מספרים מוגדרים של מקרופאגים ולא מספרים מוגדרים של מונוציטים ליזום תרבויות מקרופאג לניסויים, מניב תרבויות מקרופאג שבו צפיפות התא הרצוי ניתן להשיג יותר באופן עקבי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cellbind 12-well culture plate | Corning | 3336 | |
| CELLSTAR, T-75 flask, tissue culture treated | Greiner Bio-One North America | 658157 | |
| RPMI 1640 culture medium | Cellgro Mediatech | 15-040-CM | warmed to 37 °C |
| L-Glutamine | Cellgro Mediatech | 25-005-CI | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000-036 | |
| M-CSF | PeproTech | 300-25 | |
| GM-CSF | PeproTech | 300-03 | |
| IL-10 | PeproTech | 200-10 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Cryovial | Thermo Scientific | 375418 | |
| DPBS without Ca2+ and Mg2+ | Corning cellgro | 21-031-CV | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| 50 ml polypropylene conical tube | Falcon | 352070 | |
| Trypan Blue | Lonza | 17-942E | |
| Neubauer-improved bright light hemocytometer | Paul Marienfeld GmbH & Co. KG | 610031 | http://www.marienfeld-superior.com/index.php/counting-chambers/articles/counting-chambers.html |
| CoolCell LX cell freezing container | BioCision | BCS-405 | other freezing containers also should be adequate for this step |
| Liquid Nitrogen Storage System, CryoPlus 1 | Thermo Scientific | 7400 | any liquid nitrogen tank should be adequate |
References
- Dey, A., Allen, J., Hankey-Giblin, P. A. Ontogeny and polarization of macrophages in inflammation: blood monocytes versus tissue macrophages. Front. Immunol. 5, 683 (2014).
- Waldo, S. W., et al. Heterogeneity of human macrophages in culture and in atherosclerotic plaques. Am. J. Pathol. 172, 1112-1126 (2008).
- Akagawa, K. S. Functional heterogeneity of colony-stimulating factor-induced human monocyte-derived macrophages. Int. J. Hematol. 76, 27-34 (2002).
- Akagawa, K. S., et al. Functional heterogeneity of colony-stimulating factor-induced human monocyte-derived macrophages. Respirology. 11 Suppl, S32-S36 (2006).
- Fleetwood, A. J., Lawrence, T., Hamilton, J. A., Cook, A. D. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (CSF) and macrophage CSF-dependent macrophage phenotypes display differences in cytokine profiles and transcription factor activities: implications for CSF blockade in inflammation. J. Immunol. 178, 5245-5252 (2007).
- Lacey, D. C., et al. Defining GM-CSF- and macrophage-CSF-dependent macrophage responses by in vitro models. J. Immunol. 188, 5752-5765 (2012).
- Strasser, E. F., Eckstein, R. Optimization of leukocyte collection and monocyte isolation for dendritic cell culture. Transfus. Med. Rev. 24, 130-139 (2010).
- Kim, S., et al. Monocyte enrichment from leukapheresis products by using the Elutra cell separator. Transfusion (Paris). 47, 2290-2296 (2007).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr. Protoc. Immunol. Appendix 3 (Appendix 3B), (2001).
- Anzinger, J. J., et al. Native low-density lipoprotein uptake by macrophage colony-stimulating factor-differentiated human macrophages is mediated by macropinocytosis and micropinocytosis. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 30, 2022-2031 (2010).
- Zhao, B., et al. Constitutive receptor-independent low density lipoprotein uptake and cholesterol accumulation by macrophages differentiated from human monocytes with macrophage-colony-stimulating factor (M-CSF). J. Biol. Chem. 281, 15757-15762 (2006).
- Freeman, S. R., et al. ABCG1-mediated generation of extracellular cholesterol microdomains. J. Lipid Res. 55, 115-127 (2014).
- Kruth, H. S. Receptor-independent fluid-phase pinocytosis mechanisms for induction of foam cell formation with native low-density lipoprotein particles. Curr. Opin. Lipidol. 22, 386-393 (2011).
- Jin, X., et al. ABCA1 contributes to macrophage deposition of extracellular cholesterol. J. Lipid Res. 56, 1720-1726 (2015).
- Ong, D. S., et al. Extracellular cholesterol-rich microdomains generated by human macrophages and their potential function in reverse cholesterol transport. J. Lipid Res. 51, 2303-2313 (2010).
- Hashimoto, S., Yamada, M., Motoyoshi, K., Akagawa, K. S. Enhancement of macrophage colony-stimulating factor-induced growth and differentiation of human monocytes by interleukin-10. Blood. 89, 315-321 (1997).
- Hashimoto, S. I., Komuro, I., Yamada, M., Akagawa, K. S. IL-10 inhibits granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-dependent human monocyte survival at the early stage of the culture and inhibits the generation of macrophages. J. Immunol. 167, 3619-3625 (2001).
- Lund, P. K., Joo, G. B., Westvik, A. B., Ovstebo, R., Kierulf, P. Isolation of monocytes from whole blood by density gradient centrifugation and counter-current elutriation followed by cryopreservation: six years' experience. Scand. J. Clin. Lab. Invest. 60, 357-365 (2000).
- Weiner, R. S., Normann, S. J. Functional integrity of cryopreserved human monocytes. J. Natl. Cancer Inst. 66, 255-260 (1981).
- Hansen, J. B., et al. Retention of phagocytic functions in cryopreserved human monocytes. J. Leukoc. Biol. 57, 235-241 (1995).
- Seager Danciger, J., et al. Method for large scale isolation, culture and cryopreservation of human monocytes suitable for chemotaxis, cellular adhesion assays, macrophage and dendritic cell differentiation. J. Immunol. Methods. 288, 123-134 (2004).
- Jin, X., Xu, Q., Champion, K., Kruth, H. S. Endotoxin contamination of apolipoprotein A-I: effect on macrophage proliferation--a cautionary tale. Atherosclerosis. 240, 121-124 (2015).
