Protocol
Leukaferese ble utført under et menneske forskning protokoll godkjent av en National Institutes of Health Institutional Review Board.
1. Isolering og kryokonservering Monocytter
- Oppnå mononukleære celler ved leukaferese av humane donorer, og berike monocytter ved kontinuerlig motstrøms sentrifugering oppslemming av mononukleære celler, som beskrevet i referansene 7,8. Skaff ca 100 x 10 6 slemmes celler (ca 80 - 90% monocytter) i oppslemming buffer spesifisert av produsenten. Telle celler ved hjelp av en hemocytometer.
- Sentrifuger monocytter i en 15 ml polypropylen rør ved 300 xg i 5 minutter ved romtemperatur.
- Fjern supernatanten og resuspender cellene forsiktig i FBS etterfulgt av dimetylsulfoksyd for å oppnå en sluttkonsentrasjon på 90% FBS / 10% dimetylsulfoksyd og 50 x 10 6 celler / ml.
- Legg hver ml av cellesuspensjon to et individ kryoampulle.
- Plasser cryovials i en celle frysing container og overføre til en -80 ° C fryser i 24 timer før du overfører til en flytende nitrogen kryoampulle lagringstank for langtidslagring.
2. Differensiering av monocytter til makrofager
- Tine en kryoampulle av celler ved raskt å overføre til et 37 ° C vannbad og deretter umiddelbart fjernet når cellesuspensjonen har tint ca. 70%.
- Umiddelbart etter fullført tining ved værelsestemperatur, overføre 1 ml kryoampulle innholdet i 50 ml 37 ° C oppvarmet Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium med 2 mM L-glutamin, 50 ng / ml M-CSF, 25 ng / ml interleukin-10 (IL-10), og 10% FBS (komplett medium).
- Overføring 25 ml monocytt suspensjon inn i hver av to 75 cm 2 plastcellekulturflasker.
- Inkuber kulturer i et 37 ° C cellekulturinkubator med 5% CO2 / 95% luft i 48 timer.
- Skyll cultures 3 ganger med 10 ml RPMI 1640 medium (forvarmet til 37 ° C), forsiktig fjerning av kulturmediet for å unngå å flytte eventuelle løst festede celler.
- Etter skylling, tilsett frisk komplett medium, endre medium hver 2 dager før monocytter differensiere og spre tilstrekkelig for å bli sammenflytende. Dette krever omtrent en uke med kultur.
3. Høsting Makrofager å Initiere Experiments
- Skyll differensierte makrofager i kolbe 3 ganger med 10 ml forvarmet 37 ° C Dulbeccos fosfatbufret saltvann uten Ca 2+ og Mg2 + før tilsetning av 10 ml forvarmet 37 ° C 0,25% trypsin-etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) løsning.
- Sted kolbe i cellekultur inkubator i 10 - 15 minutter ved hvilket tidspunkt ca. 90% av makrofager bør ha avrundede og frittliggende. Bekrefte dette ved mikroskopisk undersøkelse av kolben.
- Tilsett 10 ml RMPI 1640-medium inneholdende 10% FBS i stop trypsinering.
- Overfør makrofag cellesuspensjonen fra kolben til et 50 ml polypropylenrør, sentrifuger 300 xg i 5 minutter, og supernatanten kastes.
- Forsiktig resuspender makrofagene i 1 ml fullstendig medium.
- Bland 10 ul av makrofag cellesuspensjon med 10 ul trypanblått-oppløsning og bestemme makrofag celletall og levedyktighet (vanligvis> 95%) ved anvendelse av et hemocytometer.
- Basert på celletallet (vanligvis ca. 15 - 18 x 10 5 makrofager), legge til ekstra fullstendig medium for å oppnå den ønskede seeding celletetthet. Merk: 1 x 10 5 makrofager i 1,5 ml medium pr brønn i en 12-brønns plate vil produsere en nesten sammenflytende kultur.
- Etter såing, inkuber makrofager over natten i en 37 ° C cellekulturinkubator med 5% CO2 / 95% luft for å tillate cellefesting. Deretter begynner ønskede eksperimenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Levedyktigheten av friske eller cryopreserved monocytter var større enn 95% som bestemt med Trypan blå beising 9. Figur 1 og Figur 2 sammenligner ved lavere og høyere forstørrelser, henholdsvis, fremdriften av fersk og kryopreservert (dvs. frosset) monocyt differensiering til makrofager. Legg merke til at den ferske sammenlignet med cryopreserved monocytter viser en undergruppe av differensiering monocytter som ikke sprer seg, men forblir avrundet. Fase-LUCENT vakuoler oppstå i monocytt-avledede makrofager i begge tilstander. Disse vakuoler representerer macropinosomes karakteristisk for M-CSF-typen makrofager som beskrevet tidligere 10,11.
Kryopreservering makrofager etter deres høsting fra flaskene der de ble differensiert fra monocytter ikke produsere vellykkede makro kulturer ( Den ovennevnte protokoll for fremstilling av M-CSF-typen makrofager gjør det uten tilstedeværelse av forurensende GM-CSF-typen makrofager som noen ganger oppstår når kulturer er etablert direkte fra monocytter uten deres kryopreservering og differensiering til M-CSF-typen makrofager i kolber. Imidlertid cryopreserved monocytter differensiert med FBS + GM-CSF gir utmerkede GM-CSF typen kulturer (figur 4). 
Figur 1: Sammenligning av frisk versus cryopreserved monocytter brukes til å produsere makrofager (lav forstørrelse) Phase kontrast mikroskopiske bilder av cryopreserved (frosne) og ferske monocytter under M-CSF indusert differensiering i. NTO makrofager. Vist er monocytter under kultur i kolber ved 3 og 7 dager, og på dag 8, en dag etter at høsting og replating i 12-brønners kulturplater. Bar = 100 nm, og gjelder for alle. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. 
Fig. 2: Sammenligning av frisk versus cryopreserved monocytter som brukes for å fremstille makrofager (høy forstørrelse) Monocytter ble dyrket som beskrevet i figur 1 og forklaringen er vist her ved høyere forstørrelse. Fase-Lucent vakuoler er macropinosomes (hvite piler). Bar = 50 mikrometer og gjelder for alle. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. 
Figur 3: kryopreservert makrofager ikke klarer å fremstille tilfredsstillende kulturer Ferske monocytter ble podet inn i en kolbe og differensierte 7 dager med M-CSF, som vist i figurene 1 og 2 ovenfor.. Deretter ble de differensierte makrofager høstet fra kolber og cryopreserved. Deretter ble cryopreserved makrofagene sådd ut i 12-brønns plater som beskrevet i protokollen for ikke-cryopreserved makrofager og dyrket en dag (dag 8). Fase-kontrast mikroskopisk bilde av en-dag kulturen viser at svært få av makrofager legg ved følgende deres nedfrysing (sammenlignet med dag 8 resultater for non-cryopreserved makrofager i figur 1 ovenfor). Bar = 100 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Fig. 4: kryopreservert monocytter var også egnet til å produsere GM-CSF typen monocytt-avledede makrofager kryopreservert monocytter (25 x 10 6) ble podet inn i en kolbe og differensierte 8 dager med 10% FBS inneholdende 50 ng / ml GM-CSF. Fasekontrastbilde viser det typiske "stekt egg" morfologi av GM-CSF typen makrofager. Bar = 100 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Generering definerte makrotyper kan avklare noen av de motstridende resultatene oppnådd av etterforskere når studere makrofag biologi. Bruken av forskjellige dyrkningsbetingelser og differensieringsfaktorer for å generere primære humane makrofager kan føre til svært forskjellige makrofag typer, noe som kanskje ikke bli verdsatt av forskeren. For eksempel, makrofager og til er generert fra humane monocytter ved hjelp av ikke serum, humant serum alene, human serum supplert med M-CSF, FBS alene, eller FBS inneholdende M-CSF eller GM-CSF. Som rapportert tidligere, og som vi har også observert, monocytter dyrket for en uke uten serum eller med FBS uten tilsatt differensiering faktorer ikke være levedyktig tre. Som nevnt ovenfor, monocytter dyrket med humant serum alene eller supplert med M-CSF generere makrofager som viser den "stekt egg" morfologi som er karakteristisk for monocytter differensierte med FBS, pluss GM-CSF. Således, i nærvær av humant serum M-CSF typen makrofag som viser en mer langstrakt morfologi oppnås ikke selv om monocytter er differensiert med M-CSF.
Interessant nok har vi observert at differensieringen av monocytter med FBS inneholdende både M-CSF og GM-CSF, genererer både M-CSF langstrakt og GM-CSF "stekt egg" morfologiske fenotyper i samme kultur. Dette tyder på at forskjellige monocytt subpopulasjoner gi opphav til disse to typene makrofag. Tidligere studier har vist at M-CSF og GM-CSF-differensieringsfaktorer påvirker ikke bare morfologi av makrofagen, men også påvirker genekspresjon og cellefunksjon, noe som er vesentlig forskjellige for disse to typene makro 2-6. Farging for makrofag markør CD68 i forbindelse med CD14 som blir uttrykt av M-CSF-typen makrofager og 25F9 som blir uttrykt av GM-CSF-makrofager kan brukes for å bekrefte den makrofag-type som tidligere vist to. Disse to makro typer may være spesielt relevant for studiet av aterosklerose der ulike makrotyper forekommer i aterosklerotisk plakk og kan vise forskjeller i kolesterol stoffskiftet og uttrykk for betennelser meklere 2,12,13. For eksempel, M-CSF typen makrofager er unike i at disse makrofager innskudd kolesterol inn i den ekstracellulære matriks når makrofager er anriket med cholesterol 12,14,15.
I protokollen presentert, i løpet av kulturen med M-CSF, har IL-10 blitt rutinemessig tilsettes som beskrevet tidligere 16. Dette cytokin fremmer vekst og differensiering av makrofager og frembringer en mer homogen langstrakt morfologien til makrofager. I tillegg har IL-10 inhiberer GM-CSF-avhengige monocytt overlevelse ved inhibering av signaleringshendelser som induseres av GM-CSF 17. Men etterforskerne bør vurdere at IL-10 kan påvirke andre celle responser under studien, og derfor kan være lurt å utelate IL-10. Førved hjelp av den aktuelle protokoll ved anvendelse av proliferasjon og differensiering av monocytter i en kolbe, ble makrofag kulturer initiert ved direkte plettering oppslemmede monocytter inn i dyrkningsbrønner og skiller dem i 7 dager forut for oppstart eksperimenter. Men selv med tilsetning av IL-10, noen av disse makrofag-kulturer viste små tall (vanligvis mindre enn 10%) av "stekt egg" GM-CSF-typen makrofager kontaminerende de langstrakte M-CSF-typen makrofager. Med dagens protokollen, GM-CSF typen makrofag forurensning ikke oppstår av grunner som ikke er klart. Det er imidlertid ikke fordi GM-CSF-makrofag-forløperceller typen monocytter går tapt under frysepunktet, som kultivering av cryopreserved monocytter med FBS + GM-CSF gir utmerkete GM-CSF typen kulturer (se figur 4).
Den beskrevne protokollen bruker nedfrysing av monocytter før deres differensiering til makrofager. Monocyte nedfrysing har vært previously vist ikke å påvirke monocytt funksjon og er ofte benyttet 18-21. I denne forbindelse er det funnet at makrofager som genereres av protokollen ovenfor innskudd kolesterol inn i det ekstracellulære rom i likhet med hva vi har beskrevet tidligere med ikke-cryopreserved monocytter som ble dyrket direkte til makrofager 12. Med monocytt nedfrysing, monocytter er alltid tilgjengelig for å initiere eksperimenter, uavhengig av når de monocytter kan fås fra en donor. Selv om det ikke er vesentlig å cryopreservere monocyttene før fortsetter med protokollen, kryopreservering gjorde produsere mer homogene makrofag-kulturer ved at alle makrofagene ble mer spredt stedet for å være både avrundet og spres slik tilfellet var når ferske monocytter ble anvendt for å initiere kulturer. Vi har nå generert makro kulturer fra monocytter som ble holdt frosset inntil 6 måneder, (den lengste tiden testet). På den annen side, såing av cryopreserved macrophages i kultur brønner for eksperimenter ikke produsere tilstrekkelige makro kulturer.
Kritiske trinn i protokollen omfatter straks å plassere monocytter inn i fryseren etter tilsetning av dimetylsulfoksyd, og øyeblikkelig overføring av tinte monocytter til dyrkningsmediet. Selv om det er vanlig å fjerne DMSO ved sentrifugering frosne celler før de blir sådd i kultur, vi fant ikke dette var et nødvendig skritt i vellykket kulturen i monocytter. Imidlertid kan undersøkere må gjøre dette dersom konsentrasjonen av gjenværende DMSO (2 pl / ml) er høyere enn det som ble brukt i den ovennevnte protokoll. Det er viktig å ikke skylle monocytter inntil 48 timer etter sin seeding i kulturflasker. Ellers kan noen monocytter gå tapt avhengig av deres grad av adhesjon til kulturoverflaten. På den annen side, når monocyttene differensierer til makrofager, økt adhesjon av makrofager kan kreve lengre trypsin behandling for å fjerne dem,eller en celle løfteren kan anvendes for å lette frigivelse etter den første trypsinbehandling. Hvis monocytter ikke proliferere og differensiere, kan dette være på grunn av noe uvanlig trekk monocyttaktiveringsanalysen donor, tap av aktivitet av M-CSF, eller på grunn av den mye FBS anvendt. Også av mulig bekymring når kulturer ikke utvikler er forurensning av reagenser med endotoksin, en agent som hemmer makrofag spredning 22.
Skille de cryopreserved monocytter i kolber med M-CSF gjør sin bulk differensiering til makrofager. Deretter, kan makrofagene blir høstet og sådd ut på kulturbrønnene ved ønskede celletettheter for å utføre eksperimenter. Bruken av definerte antall makrofager i stedet for definerte antall monocytter til å initiere makrofag kulturer for forsøk, gir makro kulturene hvor den ønskede celletetthet kan mer konsekvent oppnås.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cellbind 12-well culture plate | Corning | 3336 | |
| CELLSTAR, T-75 flask, tissue culture treated | Greiner Bio-One North America | 658157 | |
| RPMI 1640 culture medium | Cellgro Mediatech | 15-040-CM | warmed to 37 °C |
| L-Glutamine | Cellgro Mediatech | 25-005-CI | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000-036 | |
| M-CSF | PeproTech | 300-25 | |
| GM-CSF | PeproTech | 300-03 | |
| IL-10 | PeproTech | 200-10 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Cryovial | Thermo Scientific | 375418 | |
| DPBS without Ca2+ and Mg2+ | Corning cellgro | 21-031-CV | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| 50 ml polypropylene conical tube | Falcon | 352070 | |
| Trypan Blue | Lonza | 17-942E | |
| Neubauer-improved bright light hemocytometer | Paul Marienfeld GmbH & Co. KG | 610031 | http://www.marienfeld-superior.com/index.php/counting-chambers/articles/counting-chambers.html |
| CoolCell LX cell freezing container | BioCision | BCS-405 | other freezing containers also should be adequate for this step |
| Liquid Nitrogen Storage System, CryoPlus 1 | Thermo Scientific | 7400 | any liquid nitrogen tank should be adequate |
References
- Dey, A., Allen, J., Hankey-Giblin, P. A. Ontogeny and polarization of macrophages in inflammation: blood monocytes versus tissue macrophages. Front. Immunol. 5, 683 (2014).
- Waldo, S. W., et al. Heterogeneity of human macrophages in culture and in atherosclerotic plaques. Am. J. Pathol. 172, 1112-1126 (2008).
- Akagawa, K. S. Functional heterogeneity of colony-stimulating factor-induced human monocyte-derived macrophages. Int. J. Hematol. 76, 27-34 (2002).
- Akagawa, K. S., et al. Functional heterogeneity of colony-stimulating factor-induced human monocyte-derived macrophages. Respirology. 11 Suppl, S32-S36 (2006).
- Fleetwood, A. J., Lawrence, T., Hamilton, J. A., Cook, A. D. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (CSF) and macrophage CSF-dependent macrophage phenotypes display differences in cytokine profiles and transcription factor activities: implications for CSF blockade in inflammation. J. Immunol. 178, 5245-5252 (2007).
- Lacey, D. C., et al. Defining GM-CSF- and macrophage-CSF-dependent macrophage responses by in vitro models. J. Immunol. 188, 5752-5765 (2012).
- Strasser, E. F., Eckstein, R. Optimization of leukocyte collection and monocyte isolation for dendritic cell culture. Transfus. Med. Rev. 24, 130-139 (2010).
- Kim, S., et al. Monocyte enrichment from leukapheresis products by using the Elutra cell separator. Transfusion (Paris). 47, 2290-2296 (2007).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr. Protoc. Immunol. Appendix 3 (Appendix 3B), (2001).
- Anzinger, J. J., et al. Native low-density lipoprotein uptake by macrophage colony-stimulating factor-differentiated human macrophages is mediated by macropinocytosis and micropinocytosis. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 30, 2022-2031 (2010).
- Zhao, B., et al. Constitutive receptor-independent low density lipoprotein uptake and cholesterol accumulation by macrophages differentiated from human monocytes with macrophage-colony-stimulating factor (M-CSF). J. Biol. Chem. 281, 15757-15762 (2006).
- Freeman, S. R., et al. ABCG1-mediated generation of extracellular cholesterol microdomains. J. Lipid Res. 55, 115-127 (2014).
- Kruth, H. S. Receptor-independent fluid-phase pinocytosis mechanisms for induction of foam cell formation with native low-density lipoprotein particles. Curr. Opin. Lipidol. 22, 386-393 (2011).
- Jin, X., et al. ABCA1 contributes to macrophage deposition of extracellular cholesterol. J. Lipid Res. 56, 1720-1726 (2015).
- Ong, D. S., et al. Extracellular cholesterol-rich microdomains generated by human macrophages and their potential function in reverse cholesterol transport. J. Lipid Res. 51, 2303-2313 (2010).
- Hashimoto, S., Yamada, M., Motoyoshi, K., Akagawa, K. S. Enhancement of macrophage colony-stimulating factor-induced growth and differentiation of human monocytes by interleukin-10. Blood. 89, 315-321 (1997).
- Hashimoto, S. I., Komuro, I., Yamada, M., Akagawa, K. S. IL-10 inhibits granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-dependent human monocyte survival at the early stage of the culture and inhibits the generation of macrophages. J. Immunol. 167, 3619-3625 (2001).
- Lund, P. K., Joo, G. B., Westvik, A. B., Ovstebo, R., Kierulf, P. Isolation of monocytes from whole blood by density gradient centrifugation and counter-current elutriation followed by cryopreservation: six years' experience. Scand. J. Clin. Lab. Invest. 60, 357-365 (2000).
- Weiner, R. S., Normann, S. J. Functional integrity of cryopreserved human monocytes. J. Natl. Cancer Inst. 66, 255-260 (1981).
- Hansen, J. B., et al. Retention of phagocytic functions in cryopreserved human monocytes. J. Leukoc. Biol. 57, 235-241 (1995).
- Seager Danciger, J., et al. Method for large scale isolation, culture and cryopreservation of human monocytes suitable for chemotaxis, cellular adhesion assays, macrophage and dendritic cell differentiation. J. Immunol. Methods. 288, 123-134 (2004).
- Jin, X., Xu, Q., Champion, K., Kruth, H. S. Endotoxin contamination of apolipoprotein A-I: effect on macrophage proliferation--a cautionary tale. Atherosclerosis. 240, 121-124 (2015).
