Protocol
Leucoféresis se llevó a cabo bajo el protocolo de investigación de un sujeto humano aprobado por los Institutos Nacionales de Salud junta de revisión institucional.
1. Aislamiento y la criopreservación de los monocitos
- Obtener células mononucleares por leucoféresis de donantes humanos, y enriquecer los monocitos por centrifugación de contracorriente continua de elutriación de las células mononucleares tal como se describe en las referencias 7,8. Obtener aproximadamente 100 x 10 6 células elutriated (aproximadamente 80 - 90% monocitos) en tampón de elutriación especificado por el fabricante. Recuento de células utilizando un hemocitómetro.
- monocitos de centrífuga en un tubo de polipropileno de 15 ml a 300 xg durante 5 min a temperatura ambiente.
- Eliminar el sobrenadante y resuspender las células suavemente en FBS seguido de sulfóxido de dimetilo para lograr una concentración final de 90% de FBS / 10% de dimetilsulfóxido y 50 x 10 6 células / ml.
- Añadir cada ml de suspensión de células to un criovial individual.
- Coloque los crioviales en un recipiente de congelación de células y la transferencia a un congelador a -80ºC durante 24 horas antes de transferir a un tanque de almacenamiento criovial nitrógeno líquido para almacenamiento a largo plazo.
2. La diferenciación de monocitos en macrófagos
- Descongelar un criovial de las células mediante la transferencia rápidamente a un baño de agua C 37 ° y luego retirar inmediatamente cuando la suspensión de células se ha descongelado sobre 70%.
- Inmediatamente después de la descongelación completa a temperatura ambiente, transferir 1 ml contenidos criovial en 50 ml de 37 ° C se calentó Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 con 2 mM L-glutamina, 50 ng / ml de M-CSF, 25 ng / ml interleucina-10 (IL-10), y 10% de FBS (medio completo).
- 25 ml de la suspensión de monocitos en cada uno de dos 75 cm 2 frascos de cultivo celular de plástico.
- Incubar culturas en un 37 ° C incubadora de cultivo de células con 5% de CO2 / 95% de aire durante 48 hr.
- Enjuague el cultures 3 veces con 10 ml de medio RPMI 1640 (pre-calentado a 37 ° C), eliminando suavemente el medio de cultivo para evitar que se desprenda cualquier célula poco adheridas.
- Tras el aclarado, se añade medio completo fresco, el cambio de medio cada 2 días hasta que los monocitos se diferencian y proliferan suficientemente para convertirse en confluentes. Esto requiere aproximadamente una semana de cultivo.
3. Los macrófagos de cosecha para iniciar experimentos
- Enjuague los macrófagos diferenciados en un matraz de 3 veces con 10 ml de pre-calentado solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco 37 ° C sin Ca 2+ y Mg 2+ antes de añadir 10 ml de solución de pre-calentado (EDTA) 37 ° C 0,25% de ácido etilendiaminotetraacético tripsina.
- Place matraz en una incubadora de cultivo celular durante 10 - 15 min, en cuyo momento aproximadamente 90% de los macrófagos debería haber redondeado y distante. Verificar esta por examen microscópico del matraz.
- Añadir 10 ml de RPMI 1640 que contiene 10% de FBS a sla parte superior de la tripsinización.
- Transferir la suspensión celular de macrófagos del matraz en un tubo de 50 ml de polipropileno, de centrifugación 300 xg durante 5 min, y descartar el sobrenadante.
- resuspender suavemente los macrófagos en 1 ml de medio completo.
- Mezclar 10 l de suspensión celular de macrófagos con 10 l solución de azul de tripano y determinar el número de células de macrófagos y la viabilidad (típicamente> 95%) utilizando un hemocitómetro.
- Basado en el número de células (por lo general alrededor de 15 - 18 x 10 5 macrófagos), añadir medio completo adicional para alcanzar la densidad celular de siembra deseada. Nota: 1 x 10 5 macrófagos en 1,5 ml de medio por pocillo de una placa de 12 pocillos producirá una cultura casi confluentes.
- Después de la siembra, incubar los macrófagos durante la noche en un 37 ° C incubadora de cultivo celular con 5% de aire de CO2 / 95% para permitir la unión celular. A continuación, iniciar los experimentos deseados.
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Representative Results
La viabilidad de los monocitos frescos o crioconservados era mayor que 95% según se determinó con azul de tripano tinción 9. Figura 1 y la Figura 2 compara a aumentos inferiores y superiores, respectivamente, el progreso de frescos y criopreservados (es decir, congelada) diferenciación de los monocitos en macrófagos. Tenga en cuenta que la fresca en comparación con los monocitos criopreservados muestran una subpoblación de monocitos diferenciar que no se propagan, pero siguen siendo redondeadas. vacuolas Fase-Lucent se producen en los macrófagos derivados de monocitos en ambas condiciones. Estas vacuolas representan característica macropinosomes de los macrófagos de tipo M-CSF tal como se describe previamente 10,11.
macrófagos crioconservación después de su recolección de los frascos en los que se diferenciaron a partir de monocitos no producían cultivos de macrófagos exitosas ( El protocolo anterior para la producción de macrófagos de tipo M-CSF hace sin la presencia de contaminación de los macrófagos de tipo GM-CSF que a veces se produce cuando se establecieron cultivos de monocitos directamente sin su crioconservación y la diferenciación a los macrófagos de tipo M-CSF en frascos. Sin embargo, los monocitos criopreservados diferenciados con FBS + GM-CSF producir excelentes cultivos de tipo GM-CSF (Figura 4). 
Figura 1: Comparación de fresco frente a monocitos criopreservados utiliza para producir los macrófagos (bajo aumento) de contraste de fase imágenes microscópicas de monocitos criopreservados (congelados) y frescas durante su inducida M-CSF i diferenciación. macrófagos de las ONT. Se muestran los monocitos durante el cultivo en matraces a los 3 y 7 días, y en el día 8, un día después de su cosecha y replating en placas de cultivo de 12 pocillos. Barra = 100 micras y se aplica a todos. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 
Figura 2: Comparación de la. Fresco frente a monocitos criopreservados utilizados para producir los macrófagos (de gran aumento) Los monocitos se cultivaron como se describe en la Figura 1 la leyenda y se muestra aquí con mayor ampliación. vacuolas de fase-Lucent son macropinosomes (flechas blancas). Bar = 50 micras y se aplica a todos. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 
Figura 3: Criopreservados macrófagos no producen cultivos adecuados monocitos frescos se sembraron en un matraz y diferenciadas 7 días con M-CSF como se muestra en las Figuras 1 y 2 anteriores.. A continuación, los macrófagos diferenciados se recogieron de los matraces y criopreservados. A continuación, los macrófagos criopreservados fueron sembradas en placas de 12 pocillos como se describe en el protocolo para los macrófagos no crioconservados y se cultivaron 1 día (día 8). Fase de contraste de imagen microscópica de la cultura de 1 día muestra que muy pocos de los macrófagos adjuntar después de su crioconservación (comparar con el día 8 resultados para los macrófagos no crioconservados en la Figura 1 anterior). Barra = 100 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4:. Monocitos crioconservadas también eran adecuados para producir de tipo GM-CSF macrófagos derivados de monocitos monocitos criopreservados (25 x 10 6) se sembraron en un matraz y diferenciados 8 días con 10% de FBS que contiene 50 ng / ml de GM-CSF. Imagen de contraste de fases muestra la morfología típica de "huevo frito" de los macrófagos de tipo GM-CSF. Barra = 100 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La generación de los tipos definidos de macrófagos puede aclarar algunos de los resultados contradictorios obtenidos por los investigadores en el estudio de la biología de los macrófagos. El uso de varias condiciones de cultivo y los factores de diferenciación para generar los macrófagos humanos primarios pueden conducir a muy diferentes tipos de macrófagos, un hecho que no se puede apreciar por el investigador. Por ejemplo, los macrófagos a veces se generan a partir de monocitos humanos usando no suero, suero humano solo, suero humano suplementado con M-CSF, FBS solo, o FBS que contienen M-CSF o GM-CSF. Como se informó anteriormente, y como también hemos observado, los monocitos cultivados durante una semana sin suero o con FBS y sin factores de diferenciación adicionales no siendo viable 3. Como se mencionó anteriormente, los monocitos cultivados con suero humano solo o complementados con M-CSF generar macrófagos que muestran el "huevo frito" morfología característica de los monocitos diferenciados con FBS más GM-CSF. Por lo tanto, en presencia de suero humano la M-no se obtiene CSF de tipo macrófago que muestra una morfología más alargada a pesar de que los monocitos se han diferenciado con M-CSF.
Curiosamente, se ha observado que diferenciación de los monocitos con FBS que contienen tanto M-CSF y GM-CSF, genera tanto el M-CSF alargada y GM-CSF "frito de huevo" fenotipos morfológicos en la misma cultura. Esto sugiere que las subpoblaciones de monocitos distintas dan lugar a estos dos tipos de macrófagos. Estudios anteriores han demostrado que el M-CSF y factores de diferenciación GM-CSF no sólo afectan a la morfología de los macrófagos, pero también influyen en la expresión génica y la función celular, que es sustancialmente diferente para estos dos tipos de macrófagos 2-6. La inmunotinción para el marcador CD68 de los macrófagos en combinación con CD14 que se expresa por los macrófagos de tipo M-CSF y 25F9 que se expresa por los macrófagos GM-CSF se puede utilizar para confirmar el tipo de los macrófagos, como se muestra anteriormente 2. Estos dos tipos de macrófagos may ser especialmente relevante para el estudio de la aterosclerosis, donde diferentes tipos de macrófagos se producen en las placas ateroscleróticas y pueden mostrar diferencias en el metabolismo del colesterol y la expresión de mediadores de la inflamación 2,12,13. Por ejemplo, de tipo M-CSF macrófagos son únicos en que estos macrófagos depositan el colesterol en la matriz extracelular, cuando los macrófagos se enriquecen con el colesterol 12,14,15.
En el protocolo presentado, durante el cultivo con M-CSF, IL-10 se ha añadido rutinariamente como se ha descrito previamente 16. Esta citocina promueve el crecimiento y la diferenciación de los macrófagos y produce una morfología alargada más homogénea de los macrófagos. Además, la IL-10 inhibe la supervivencia de monocitos GM-CSF dependiente mediante la inhibición de los eventos de señalización inducidos por GM-CSF 17. Sin embargo, los investigadores deben considerar que la IL-10 puede afectar a otras respuestas de las células bajo estudio, y por lo tanto, tal vez desee omitir IL-10. antes deusando el protocolo actual empleando la proliferación y diferenciación de los monocitos en un matraz, cultivos de macrófagos se iniciaron en placas directamente monocitos elutriados en pocillos de cultivo y la diferenciación de ellos durante 7 días antes de iniciar los experimentos. Sin embargo, incluso con la adición de IL-10, algunos de estos cultivos de macrófagos mostraron pequeñas cantidades (generalmente menos de 10%) de los macrófagos "huevo frito" de tipo GM-CSF contaminantes los macrófagos de tipo M-CSF alargados. Con el protocolo actual, la contaminación de tipo macrófago GM-CSF no se produce por razones que no están claras. Sin embargo, no se debe a que los monocitos precursores GM-CSF de tipo macrófago se pierden durante la congelación, como el cultivo de las monocitos criopreservados con FBS + GM-CSF produce excelentes de células tipo, GM-CSF (véase la Figura 4).
El protocolo descrito utiliza la criopreservación de los monocitos antes de su diferenciación en macrófagos. criopreservación de monocitos ha sido previamente demostrado no afectar la función de los monocitos y es comúnmente empleado 18-21. En este sentido, se ha encontrado que los macrófagos generados por el protocolo anterior colesterol depósito en el espacio extracelular similar a lo que hemos descrito previamente con monocitos no crioconservados que se cultivaron directamente en los macrófagos 12. Con la criopreservación de los monocitos, los monocitos son siempre disponible para iniciar los experimentos, independientemente de cuando los monocitos pueden ser obtenidos de un donante. Si bien no es esencial para criopreservar los monocitos antes de proceder con el protocolo, la criopreservación hizo producir cultivos de macrófagos más homogéneas en que todos los macrófagos fueron más extendido en lugar de ser tanto redondeada y se extendió como fue el caso cuando se utilizaron monocitos frescos para iniciar los cultivos. Hemos generado con éxito cultivos de macrófagos a partir de monocitos que se mantuvieron congeladas hasta 6 meses, (el tiempo más largo estudiado). Por otro lado, la siembra de macr criopreservadosophages en la cultura pozos para experimentos no produjeron cultivos de macrófagos adecuados.
Los pasos críticos en el protocolo incluyen la colocación de los monocitos de inmediato en el congelador después de la adición de dimetilsulfóxido, y de inmediato la transferencia de monocitos descongeladas al medio de cultivo. Aunque es común para eliminar el DMSO mediante la centrifugación de las células congeladas antes de que se siembran en la cultura, no hemos encontrado este era un paso necesario en la cultura exitosa de los monocitos. Sin embargo, los investigadores pueden tener que hacer esto si la concentración de DMSO residual (2 l / ml) es más alto que lo que se utilizó en el protocolo anterior. Es importante no para enjuagar los monocitos hasta 48 horas después de su siembra en matraces de cultivo. De lo contrario, algunos monocitos se pueden perder en función de su grado de adhesión a la superficie de cultivo. Por otra parte, una vez que los monocitos se diferencian en macrófagos, aumento de la adherencia de los macrófagos puede requerir más tiempo tratamiento con tripsina para eliminarlos,o un levantador de células se puede emplear para facilitar la liberación después del tratamiento inicial tripsina. Si monocitos no proliferan y se diferencian, esto podría ser debido a alguna característica inusual de la donante de monocitos, la pérdida de actividad de M-CSF, o debido a la gran cantidad de FBS utilizado. También, de posible preocupación cuando los cultivos no desarrollan es la contaminación de los reactivos con la endotoxina, un agente que inhibe la proliferación de los macrófagos 22.
La diferenciación de los monocitos criopreservados en frascos con M-CSF permite su diferenciación mayor en macrófagos. A continuación, los macrófagos pueden ser cosechadas y se sembraron en pocillos de cultivo a densidades celulares necesarios para la realización de experimentos. El uso de números definidos de macrófagos en lugar de números definidos de monocitos para iniciar cultivos de macrófagos para los experimentos, produce cultivos de macrófagos en el que la densidad celular deseada puede alcanzarse de forma más consistente.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cellbind 12-well culture plate | Corning | 3336 | |
| CELLSTAR, T-75 flask, tissue culture treated | Greiner Bio-One North America | 658157 | |
| RPMI 1640 culture medium | Cellgro Mediatech | 15-040-CM | warmed to 37 °C |
| L-Glutamine | Cellgro Mediatech | 25-005-CI | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000-036 | |
| M-CSF | PeproTech | 300-25 | |
| GM-CSF | PeproTech | 300-03 | |
| IL-10 | PeproTech | 200-10 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Cryovial | Thermo Scientific | 375418 | |
| DPBS without Ca2+ and Mg2+ | Corning cellgro | 21-031-CV | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| 50 ml polypropylene conical tube | Falcon | 352070 | |
| Trypan Blue | Lonza | 17-942E | |
| Neubauer-improved bright light hemocytometer | Paul Marienfeld GmbH & Co. KG | 610031 | http://www.marienfeld-superior.com/index.php/counting-chambers/articles/counting-chambers.html |
| CoolCell LX cell freezing container | BioCision | BCS-405 | other freezing containers also should be adequate for this step |
| Liquid Nitrogen Storage System, CryoPlus 1 | Thermo Scientific | 7400 | any liquid nitrogen tank should be adequate |
References
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