Abstract
Patch klemme studier fra ryggmargen (DRG) neuroner har økt vår forståelse av det perifere nervesystemet. Foreløpig er de fleste av opptakene gjennomført på dissosierte DRG nevroner, som er en standard forberedelse for de fleste laboratorier. Neuronal egenskaper, men kan endres ved aksonal skade som følge av enzymoppløsning som brukes i å skaffe dissosierte neuroner. Videre kan dissosierte nervemidler, ikke fullt ut representerer mikromiljøet av DRG-siden tap av kontakt med satellitt gliaceller som omgir de primære sensoriske nevroner er en uunngåelig konsekvens av denne metoden. For å overvinne begrensninger i bruk av konvensjonelle dissosierte DRG nevroner for patch clamp opptak, i denne rapporten beskriver vi en metode for å forberede intakte DRG og gjennomføre patch clamp opptak på enkelt primære sensoriske nerveceller ex vivo. Denne tilnærmingen tillater rask og enkel tilberedning av intakte DRG, hermet ivivo betingelser ved å holde DRG nevroner i forbindelse med sine omkringliggende satellitt gliaceller og basalmembran. Videre unngår fremgangsmåten aksonal skade fra håndtering og enzymbehandling, for eksempel ved å dissosiere DRG. Denne eks vivo preparat kan i tillegg brukes til å studere interaksjonen mellom primære sensoriske neuroner og satellitt gliaceller.
Introduction
Sensation er avgjørende for en organismes overlevelse og velvære. Transmisjonen av stimuli er avhengig av de sensoriske baner som starter på omkretsender av axoner fra primære sensoriske nevroner. Primære sensoriske neuroner, med unntak av mesencefalisk kjernen av trigeminal nerve, er plassert i den trigeminal ganglia og dorsale rotganglier (DRG). De tjener som portvoktere for sensorisk informasjon 1. På perikarial membran, akkurat som på de sentrale og perifere terminaler, DRG nevroner uttrykker reseptorer og ionekanaler, som for eksempel glutamat reseptorer, TNF alfa-reseptorene, transient receptor potensielle kasjon kanal underfamilie V medlem 1 (TRPV1), natriumkanaler, etc. 2 -7. Patch klemme opptak av perikarial membranen tillater forstå funksjonelle endringer på mange av disse reseptorene og kanaler i hele nervecellen.
Plasteret klemme opptaksteknikk er et kraftig verktøy for studøende virksomhet kanaler eller reseptorer og et stort antall studier har blitt utført ved å bruke denne teknikken på DRG nevroner 8-10. I de fleste studiene DRG fjernes ved å kutte dorsal rootlets og spinal nerve nær ganglion. Etter hakking, blir ganglion deretter plassert i fordøyelsesenzymer som fører til dissosiasjon av DRG-neuroner, som kan deretter bli tatt opp umiddelbart eller dyrket i flere dager før opptak. Dessverre er dissosiasjon av DRG-neuroner innebærer en nødvendig aksotomi nær perikarya. Når dissosiert og axotomized, DRG nevroner gjennomgå fenotypiske endringer samt endringer i membran oppstemthet 11,12. Tapet av kontakt mellom perikarya av individuelle neuroner og satellitt gliaceller som normalt omgir dem er egnet til å bidra til disse endringene 13. Crosstalk mellom nevroner og satellitt gliaceller er både viktig i fysiologiske forhold og i tilpasning til pathologiCal forhold som de som fører til vanskelige smerter 14,15. Det ville være utfordrende å studere samspillet mellom nevroner og satellitt gliaceller ved hjelp av en dissosiert DRG forberedelse.
Intakte DRG, på den annen side, gir nærmere in vivo-betingelser. I de siste årene har vårt laboratorium, samt noen andre grupper, brukt intakte DRG fra voksne rotter for å undersøke endringer av primære sensoriske nevroner i ulike forhold knyttet til kroniske smerter 3-5,11,15-17. Selv om teknikker som brukes i disse studiene er noe etablert, en steg-for-steg beskrivelse er ennå ikke publisert. I den nåværende manuskriptet, beskriver vi en enkel og rask måte å forberede intakte DRG og deres bruk for patch clamp opptak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etikk Uttalelse: Alle prosedyrer for vedlikehold og bruk av forsøksdyr dannet forskrift av UCSF komiteer på forsøksdyr og ble utført i samsvar med retningslinjene i NIH forskrift om bruk av dyr og omsorg (Publication 85-23, revidert 1996 ). UCSF Institutional Animal Care og bruk komité godkjente protokollene som brukes i denne studien.
1. Utarbeidelse av instrumenter, løsninger og Retter
- Forbered kunstig cerebrospinalvæsken (aCSF).
- Fremstille 500 ml 10x lav kation-løsning, og 500 ml 10x bikarbonat-løsning (se tabell 1 og 2 for fremstilling løsning). Oppbevar ved 4 o C og bruk innen en måned.
- Fremstille 600 ml frisk aCSF ved å blande 60 ml av 10x lav kation-løsning med 60 ml av bikarbonat-oppløsning, og deretter legge til 480 ml deionisert vann for å oppnå et sluttvolum på 600 ml. Bubble den aCSF med carbogen(5% O2 og 95% CO2) i minst 10 minutter før bruk.
- Trekk Patch Pipette fra Capillary Glass.
- Plasser tynne vegger kapillær glass inn i en pipette avtrekker for å forberede innspillingen pipetter.
Merk: I vårt laboratorium, er følgende innstillings parametere for avtrekker brukes for å oppnå den ideelle pipette form: varme (510), hastighet (32). Den ideelle form for pipette intakt DRG opptak bør ha en gradvis slank konus med en lav kjeglevinkel, og dette kan best oppnås ved prøving og feiling. - Pass på at motstanden av pipetten er 3-5 Megohm når de er fylt med interne løsninger (se tabell 3 for løsning forberedelse). Vennligst referer til Guide Axon for detaljert metode for måling pipette motstand 18.
- Plasser tynne vegger kapillær glass inn i en pipette avtrekker for å forberede innspillingen pipetter.
- Tilsett 1 mg kollagenase til 400 ul aCSF, for å gi en sluttkonsentrasjon på 13 enheter / ml. Deretter fyller hvert glass pipette med om lag 20 pl kollagenase-løsning. Lagerde fylte pipetter i en -20 o C fryser og bruke dem i løpet av tre uker.
- Forbered 200 ml kald aCSF (ca. 4 o C). For å kjøle ned aCSF raskt plassere den i et beger, forsegle med plastfolie og legg i en -20 o C fryseren i ca 20 min til det begynner å fryse. Sett begerglass i et isbad og boble med carbogen i 10 min. Boble de resterende 400 ml aCSF med karbogen ved RT.
- Mens aCSF er kjøling, skjæres i enden av en plast engangs overføring pipette for å forstørre åpningen til en diameter på 5 mm (dette vil bli brukt til å overføre den DRG). Samle følgende kirurgiske instrumenter: skalpell (# 15), Mayo rett og buet saks, fine 2 mm spiss rongeur, Adson (tann) tang, iris saks, våren saks og to fine tang. Hell oksygen kaldt aCSF inn tre glass petriskåler (Ytre diameter: 10 cm).
2. DRG Dissection
- Anesthetize en rotte (200-220 g) med natrium pentobarbital (100 mg / kg, ip) og bekrefter at nivået av anestesi er tilstrekkelig ved å teste pedal refleks og øye blunkerefleksen.
- Når du har kontrollert at rotta er bedøvet, barbere lumbar området og langsgående snitt i hud og underhud langs midtlinjen. Løsne paraspinal musklene fra spinous prosesser på L1-S2 nivå med en fin periostal heis.
- Bruk buet saks for å klippe spinous prosesser fra L1 til S2. Bruk rette Mayo saks for å lage tverrgående snitt i den eksponerte virvelsøylen på ca L1 og S1 og fjerne denne delen av ryggsøylen en bloc og raskt senke den i kaldt aCSF (utarbeidet i trinn 1.5) i 2-3 min. Etter fjerning av lumbale DRG, blir eutanasi utføres ved bilateral torakotomi mens rotte er fremdeles under dyp pentobarbital anestesi.
- Skyll av blod fra den fjernede ryggsøylen og festet vev og overføre til en petriskål med kaldt aCSF. Use en fin rongeur å fjerne lameller. Skjær dura mater langs midtlinjen med microscissors å eksponere ryggmargen. Løft forsiktig ryggmargen, og kuttet nerverøttene på deres inngangspunkt i ryggmargen ved hjelp av iris saks, og deretter fjerne ryggmargen.
- Overfør den gjenværende vertebra med DRG til den andre petriskål fylt med kald aCSF. Identifiser L4 og L5 DRG basert på deres relative posisjon til tverrgående prosesser og isjiasnerven.
Merk: Opprettholde isjiasnerven intakt vil bidra til å identifisere L4 og L5 DRG (isjiasnerven stammer fra L4-6 spinal nerver). - Bruk Dumont pinsett og Noyes saks for å frigjøre DRG fra omkringliggende bindevev. Hold nerve rot og spinal nerve knyttet til DRG.
- Bruk overføringspipetten å flytte DRG inn i den tredje petriskål for videre disseksjon.
- Under disseksjon mikroskop, forsiktig fjerne så mye som mulig av epineurium rundt the DRG.
- Bruk Noyes våren saks for å klippe en åpning der rygg og ventral røtter delta i DRG og skille ventral rot fra DRG. Bruk Dumont # 5 tang med sløv tips for å holde epineurium, og bruke en annen fin pinsett til å rulle DRG fra epineurium.
- Fortsett å fjerne så mye som mulig av epineurium festet til DRG ved hjelp av fin pinsett.
Merk: En godt dissekert DRG er viktig å få en god fordøyelse i neste trinn.
3. DRG Fordøyelse
- Overfør DRG til opptakskammeret. Pass på at den siden av DRG der nerverøttene kommer ansikter ned.
Merk: På denne måten de fleste nerveceller er tilgjengelige. - Bruk et anker for å stabilisere DRG. Perfuse DRG med oksygenert aCSF i en hastighet på 0,5 ml / min gjennom plastrørene er forbundet med en peristaltisk pumpe, som er plassert på et bord ved siden av opptaket riggen.
- Vent i 30 minutter for å tillate cellene å utvinne. Vurdere kvaliteten på DRG henhold infrarødt grensesnitt differensial kontrast (IR-DIC) optikk ved 40X objektiv forstørrelse gjennom et CCD-kamera.
Merk: Gode DRG inneholder vanligvis mange runde, vel kontrast, nevroner omgitt av satellitt gliacellene på overflaten. - Fordøye et lite område av overflaten av DRG.
Merk: glass patch pipetter er plassert i pipettes holdere, som er små koplinger som tillater produksjonsrøret til å bli festet til glasset pipette med en lufttett forsegling.- Individuelt koble to 1 ml sprøyter til pipetteseierne gjennom to stykker av små gummi diameter slangen. Sette en glasspipette fylt med kollagenase inn i en av holderne pipette og en tom glass pipette inn i den andre.
- Bruk mikromanipluatoren å posisjonere pipettene like over DRG. Deretter under mikroskop forstørrelse, kolliderer tips av to pipetter mot hverandre forsiktig for å forstørre åpninger av pipetter (Ideelt sett en diameter av 5-10 mikrometer).
- Bevege pipetten fylt med enzym nær overflaten av DRG og kort anvende positivt trykk til pipetten som inneholder kollagenase gjennom røret som forbinder holderen og sprøyten ved å forskyve stempelet ca. 0,5 ml.
Merk: Under trykk, vil strømmen av enzymet fra pipetten litt større plass mellom DRG-neuroner, som kan tjene som tegn for enzymet anvendelse. - Etter 10 til 15 minutter, da rester av den gjenværende epineurium observeres, bruke milde negativt trykk til den tomme pipette for å suge bort avfallet.
Merk: På denne måten vil nervecellene og omkringliggende satellitt gliaceller være tydelig eksponert og klar for patch opptak. - Kast de to pipettene i beholderen for spisse gjenstander.
4. Patch Clamp Recordings
- Plassere elektroden løsning (se tabell 3) på is for å forhindre nedbrytning. Fyll glasset lapp pipette medfiltrert intracellulære løsning (sprøytefilter, porestørrelse 0,2 mikrometer) og plassere pipetten i heads pipette holderen. Påfør en mild positivt trykk til pipetten gjennom en 5 ml sprøyte ved å forskyve stempelet om 1 ml før du senker pipette i badekaret løsning.
Merk: Dette hindrer pipetten infatter. - Velg "V-klemme" modus ved å vri modusvelgeren på forsterkeren, og deretter åpne "Membrane test" grensesnitt i programvaren. Flytt pipette nær målet nervecellen i henhold mikroskop inspeksjon.
Merk: I intakt DRG forberedelse, et tynt lag med satellitt gliacellene omslutter hver nervecelle. - Bruk positivt press fra pipetten å traversere satellitt glial celle laget inntil en plutselig utvidelse av plass mellom nevroner og omkringliggende lag av satellitt gliacellene er observert. Hold deg i bevegelse pipetten mot nevron til et "smilehull" er observert på nervecellen.
Merk: Sammenlignet medopptak fra dissosierte nevroner, må positivt press for å være en litt større, noe som vil bidra til å trenge gjennom satellitt glial cellelaget og øke sjansene for vellykket patching. - Redusere det positive trykket. Deretter oppnå en giga ohm forsegling med lett sug.
Merk: Med denne metoden suksessrate på opptak er minst 70%. - Skaff hel-celle opptak konfigurasjon som beskrevet tidligere 19.
- I korthet, trenge inn i nervecellen cellemembranen via en kort men sterk sugekraft. Alternativt kan du bruke "zappe" -funksjonen på forsterkeren mens suge er brukt.
- Når en hel celle-modus er etablert, kompensere hel-celle kapasitans og seriemotstand (RS) ved å dreie kapasitans og motstand kompensasjon knottene på forsterkeren.
Merk: Rs er normalt 5-20 Megohm. - Forlate cellen hvis Rs er i utgangspunktet større enn 30 Megohm; eller RS endres med mer enn 20% i løpet av innspillingen. Ogsåmåle det hvilende membranpotensial; forlate en celle hvis det hvilende membranpotensial er mer enn -50 mV.
- Lukk "Membrane test" vinduet. Velg "Jeg-klemme normal" modus ved å vri modusvelgeren på forsterkeren.
- Klikk "åpen protokoll" i programvaren, velge og laste protokollen for måling rheobase. Klikk på "record" for å starte innspillingen. Mål inngangsmotstand og rheobase å undersøke nevronale eksitabilitet ved å injisere en gradert serie depolariserende strømninger i trinn på 100 pA.
- Klikk "åpen protokoll" igjen og velg protokollen for måling av membran terskel. A 500 ms depolariserende rampe strøm (2000 pA / s) vil bli injisert i nervecellen.
- Bruk datainnsamling og analyse programvare (f.eks Clampfit) for å analysere de registrerte spor i henhold til produsentens instruksjoner. Bruk programvare for å beregne inngangsmotstand (Rin) på grunnlag av den steady-state IV relationship under hyperpolariserer strøm levert. Flytt markøren for å måle verdien for rheobase og membran terskel.
Merk: Amplituden av strøm som kreves for å indusere AP er definert som rheobase, og den laveste spenning for å indusere AP er definert som membran terskel.
- Spill liganden indusert strøm.
- Fyll en pipette med de spesifikke agonister.
Merk: I dagens rapport, vi brukte 100 mikrometer glutamat og 100 mikrometer AITC å indusere strømmer mediert av henholdsvis glutamatreseptorer og TRPA1 reseptorer. - Sjekk pipetten for å sørge for at det ikke er luftbobler inne. Sett pipetten i pipetten holderen. Koble pipetten holderen med et rør som er koblet til et medikament doseringssystemet.
- Bruk manipulatoren for å bevege pipetten i løpet av 50 um av nervecellen. Angi at medikamentet utleveringssystemtrykket til en psi og varigheten til 1 sek. Skifte opptaksmodus til spenning klemme og klemme på -70 mV. I korte trekk gjelder trykket via stoffet doseringssystemet for å spille inn en narkotika-indusert strøm.
- Fyll en pipette med de spesifikke agonister.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser prosessen med å utarbeide intakt DRG for patch opptak. Figur 1A viser eksponering og plasseringen av gangliene etter laminektomi. Figure1B viser L3, L4 og L5 DRG med nerve røttene festet etter fjerning av ryggmargen. Deretter L4 og 5 DRG blir omhyggelig dissekert og frigjort fra ryggvirvler. Det neste er at epineurium, en gjennomsiktig hinne rundt DRG, fjernet (gul pil, figur 1D). Det beste stedet å skille epineurium er gjennom området der rygg og ventral røtter delta på DRG, som indikert av den svarte pilen i figur 1D. Etter peeling av epineurium, ventral roten fjernes og kastes, forlater rygg rootlets , spinal nerve og DRG, som vist på figur 1E. Spaltning med kollagenase fjerner den gjenværende epineurium, utsette neuroner og satellittceller T-hat omgir dem (figur 1F).
Etter endt DRG fremstillingen, er eksitabilitet med liten diameter DRG-nevroner undersøkt ved å måle rheobase og membranen terskel. Som vist i figur 2A, er det rheobase 260 pA. Figur 2B viser membranen terskel målt med denne metoden. Med den økende strøm, er membranen kontinuerlig depolarisert inntil en AP er fremkalt. I dette eksempel er membranen terskel (potensialet ved hvilken AP er fremkalt) er -11,9 mV. Derfor, ved å opprettholde forholdet mellom neuroner og satellitt gliaceller, er vårt preparat nærmere in-vivo situasjon. Basert på våre resultater, rheobase registrert fra små DRG nevroner er rundt 300 pA, og inngangsmotstanden er 451,3 ± 27,3 Megohm. Begge er høyere sammenlignet med de som er målt fra dissosiert nevroner (rundt 150 pA og 635 Megohm), noe som tyderat dissosiasjon økt eksitabilitet av DRG nevroner 11.
Med denne forberedelse, har vi også målt innover strømmer indusert av glutamat og allyl- isotiocyanat (AITC), som er agonister for glutamatreseptorer og transient receptor potensiell kation kanalelementet A1 (TRPA1) respektivt. Amplituden av indre strømmer indusert av disse ligander vil reflektere antall reseptorer fordelt i neuronene. Figur 3A viser en indre strøm i en liten diameter DRG-nevroner som induseres av en 1 sek drag anvendelse av glutamat (1 mM). Glutamatindusert en innoverstrøm (198 pA), som kan være stor grad blokkert ved samtidig anvendelse av NMDA reseptor-antagonist APV og AMPA / kainat-reseptor-antagonist CNQX (data ikke vist), noe som bekrefter den nåværende er mediert av glutamatreseptorer på DRG nevroner. Disse data fastslått at det er funksjonelle glutamatreseptorer på DRG-neuroner. den neuron illustrert i figur 3B viste innover strømmer (260 Pa) indusert ved 1 sek drag anvendelse av allyl- isotiocyanat (AITC, 100 uM), en selektiv agonist TRPA1. Den innadrettede strøm ble blokkert ved selektiv antagonist TRPA1 10 uM HC 030031 (data ikke vist), noe som bekrefter strømmene ble formidlet av TRPA1 reseptorer og etablerer tilstedeværelsen av TRPA1 reseptorer på DRG-neuroner.
Figur 1: Fremstilling av intakte DRG (A) Eksponering av ryggmargen etter laminektomi og segmentering av DRG.. Piler fra høyre mot venstre indikere L3-5 DRG hhv. Scale bar = 1 cm. (B) eksponering av L3, L4, L5 og DRG og de vedlagte nerverøtter etter fjerning av ryggmargen. Pilene viser L3, L4 og L5 DRG fra høyre til venstre. Scale bar = 1 cm. (C) Intact DRG med nerverøtter festet etter å ha blitt dissekert fra ryggmargen. Pilene viser L4 og L5 DRG fra høyre til venstre. Scale bar = 1 cm. (D) Intakt DRG med epineurium vedlagt. I dette bildet er det epineurium intakt, og den gule pilen viser semi-transparent epineurium holdt av en Dumont tang. Den svarte pilen indikerer krysset dannet av dorsal root og ventral rot, som fungerer som et godt utgangspunkt for å skrelle av epineurium. Scale bar = 1 mm. (E) Den samme DRG med den dorsale monteres etter at epineurium og ventrale rot er fjernet. Scale bar = 1 mm. (F) Infrarød mikroskop bilder av DRG følgende fordøyelse med kollagenase. Små og mellomstore nevroner er synlige. En satellitt gliacelle (gul pil) er synlig rundt et nevron (stjerne). Den røde pilen peker på pipetten. Scale bar = 10 mikrometer. (G) Opptaksutstyr konfigurasjon. De svarte pilene indikerer the pipettes holdere. Den til venstre inneholder stoffet fylt pipette, og opptak pipette er på høyre side. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2:. Måling av neuronal Excitability i strømtang Mode (A) Rheobase ble målt ved å injisere en rekke strømmer inn i DRG nervecellen (øvre panel). Den laveste strømstyrke, noe som kan indusere et aksjonspotensial, er definert som rheobase, som antydet med pilen i nedre panel. Den rheobase for dette neuron er 300 pA. (B). Membranen terskel ble målt ved å injisere en rampe strøm. Potensialet, når et aksjonspotensial er fremkalt, er definert som membran terskel, som er merket med den stiplede linje i det øvre felt.Membranen terskel for dette neuron er -11,9 mV. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Ligand induserte strømmer i Small DRG-nevroner strømmer indusert av drag anvendelse av glutamat (1 mM) eller allyl isotiocyanat (TRPA1 agonist, AITC, 100 pM) i 1 sek.. Både agonister induserte strømmer innover, noe som tyder på tilstedeværelsen av glutamatreseptorer og TRPA1 reseptorer på små DRG-neuroner. Glutamat søknad induserte en innoverstrøm på 198 pA (A), og AITC induserte en innoverstrøm på 260 pA (B). Nerveceller er fastspent på -70 mV. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. </ P>
| 2 liter 10x lav kationisk lager | |||
| Endelig konsentrasjon (mM) | Komponent | MW | Vekt (g) |
| 3 | KCl | 74.6 | |
| 11 | glukose | 180,2 | |
| 123 | NaCl | 58.4 | |
| 1,25 | NaH 2PO 4 * H 2 O | 138 | |
| 1 | MgCl2 * 6 H 2 O | 203,3 | |
| 2 | CaCl2 * 2 H 2 O | 147 | |
Tabell 1
| 1 liter av 10x bikarbonat lager | |||
| Endelig konsentrasjon (mM) | Komponent | MW | Vekt (g) |
| 26 | NaHCO3 | 84.01 | 21.84 |
Tabell 2
| 100 ml oppløsning intracellulære | |||
| Konsentrasjon (mM) | Komponent | MW | g |
| 130 | KGluconate | 234,24 | |
| 10 | KCl | 74.55 | |
| 10 | HEPES | 238,3 | |
| 10 EGTA | |||
| 2 | MgCl2 * 6 H 2 O | 203,3 | |
| Merknader: Juster pH til 7,4 med KOH, og osmolaritet til 260-280 mOsm med sukrose og destillert vann. Tilsett 2 mM MgATP, 0,5 mM Na-2-GTP og filter før umiddelbar bruk. | |||
Tabell 3
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi rapporterer en metode for å forberede hele DRG for patch clamp studier. Det er flere viktige elementer for å forberede en ideell prøven. For det første er det viktig å dissekere DRG med Dorsalrøttene vedlagt. Etter det må den epineurium fjernes forsiktig mens du unngår skade på nerveceller. Til slutt, for å eksponere de nevroner og deres omkringliggende satellitt gliaceller, er det nødvendig å fordøye den resterende bindevev. Intakte DRG fra voksne rotter tilberedt med metoden beskrevet her vil opprettholde god levedyktighet for 6-8 timer og kan bli stabilt registrert i denne perioden. De kan brukes til mange ulike studier av DRG inkludert patch clamp opptak på nevroner eller satellitt gliaceller, eller fremkalte responser av DRG nevroner.
Under disseksjon prosedyren, er det viktig å raskt dissekere DRG og holde den ved en lav temperatur (4 ° C) for å redusere neuronal forbrenningen og således opprettholder sin levedyktighet. under than disseksjon av DRG, bør man unngå å strekke rygg eller spinalnerver går inn i DRG. Et annet viktig steg i dette preparatet er fjerning av epineurium som omgir DRG. Siden epineurium er vanskelig å trenge gjennom, vil en hvilken som helst epineurium som blir igjen på DRG hindrer lappen pipettene fra å nå neuronene. Påføring av kollagenase er et viktig skritt for vellykket forberedelser. Kollagenase vil fordøye den gjenværende epineurium og rengjør overflaten av celler på samme tid, som begge er kritiske for vellykket lapp. For å unngå over-fordøyelse av vevet, må tre faktorer tas i betraktning. Først kommer kollagenase i flere forskjellige former; se Tabell over Materialer for vår anbefaling, er det en dag brukes potent men milde, og dermed unngår over fordøyelsen. For det andre bør enzymet bli levert ved et lett trykk for å unngå sprøyting av enzymet utenfor opptaksområdet. Vi har funnet at trykket som produseres fra å anvende 0,5 ml av enir ut av en 1 ml sprøyte med er tilstrekkelig. For det tredje er den beste konsentrasjonsområde for kollagenase fra 10-13 enheter / ml. Høyere konsentrasjoner kan føre til over-fordøyelse og raskere nedbrytning av vev, mens lavere konsentrasjoner medfører en unødvendig lang tid fordøyelse. I vår erfaring, en konsentrasjon på 13 enheter / ml og en fordøyelse tid rundt 15 min gir de beste resultatene. Etter bruk av enzymet de rester epineurium rundt DRG skal løsne, og kan bli ryddet unna med lett sug. Kollagenase er følsom å gjenta fryse-tine-sykluser, derfor, når fortynnet enzym-oppløsningen bør være oppdelt i alikvoter og benyttet i løpet av 3 uker.
Zhang og kollegene var de første til å beskrive en metode for patch clamp opptak fra intakte DRG. Rottene de brukte, men var svært unge (10-15 dager etter fødselen) 20 som har den fordel at de DRG er lettere å fremstille, gitt at de har en tynnere epineurium og de har en økt levedyktighet. DRG fra neonatale rotter, men har den ulempen at uttrykket av proteiner og ionekanaler som TRPV1 og NaV1.8 skiller seg fra voksne rotter 21,22. Dessuten er atferdsmessige og farmakologiske undersøkelser utføres vanligvis i voksne rotter. Således kan metoden for opptak beskrevet her gjør det mulig å lage en sammenheng mellom elektro og oppførsel hos voksne dyr. Bruken av intakt ryggmargen som en forberedelse til å gjennomføre patch clamp opptak ex vivo har økt den siste tiden 15-17,23,24, og noen studier har brukt in vivo innspillinger 25. De fleste av ex vivo innspillinger utsett DRG nevroner ved inkubasjon hele DRG inn enzym cocktail for rundt 30-60 min. Selv om denne fremgangsmåten gir flere neuroner, er det en fare for over-fordøyelse av neuronene ved overfladiske lag. Vår metode reduserer muligheten for over fordøyelse ved hjelp av visuell inspeksjon for å overvåke extelt av fordøyelsen, en metode som også brukes av Ma et al for in vivo-opptak 25.
Sammenlignet med dissosierte DRG-neuroner, en av fordelene med den intakte DRG fremstillingen kommer fra bevaring av både neuroner og satellitt gliaceller (figur 1). Dette er ikke tilfelle i konvensjonelle preparater som bruker dissosierte DRG nevroner. Satellitt gliaceller danner en barriere som omgir de enkelte DRG-neuroner, og deres tilstedeværelse er nødvendig for å opprettholde fysiologisk miljø av disse nevronene 13. Som nevnt i resultatene de elektrofysiologiske egenskaper av nerveceller fremstilt på denne måten skiller seg fra de som oppnås ved studier med dissosierte celler.
En av de mest interessante fremtidige retninger for dette preparatet er å undersøke crosstalk mellom DRG nevroner og satellitt gliaceller. Etter nerveskade, for eksempel satellitt gliacellene er vist to gjennomgå plast endringer, som er nært knyttet til smerteatferd som følger 13-15,26. Bevaring av satellitt gliacellene i intakte DRG, vil gjøre oss i stand til å avgjøre om sende reseptorer som glutamatreseptoren, eller ATP reseptorer finnes på satellitt gliaceller og hvordan de reagerer på endringer i neuronal aktivitet. Ved lapping satellitt gliaceller og stimulere nervecellen samtidig, kan satellitt gliacellene fungere som en biologisk sensor og vise om det er transmitter-frigjøring fra de nærliggende nerveceller. Videre holder intakt DRG forberedelse både afferente og efferente nerverøtter. Dette utvider i høy grad eksperimentelle omfang ved å legge til mulighet for å stimulere aksonene inn i eller ut neuronene med suge elektrode, noe som ville være en bedre etterligner in vivo-situasjon.
Det er noen begrensninger i dagens forberedelse. Eksistensen av barrieren dannet av satellitt glial celler, gjør det vanskeligere å patch nevroner og man bør være oppmerksom på at det kan begrense konsentrasjonen av narkotika nådde nervecellene. Derfor, for å få tilgang til nervecellen i vårt preparat er det viktig å holde pipetten under positivt trykk for å hjelpe til å trenge inn satellitt gliaceller lag. En annen begrensning er at rygg røtter og spinal nerver må kuttes for å dissekere ut DRG. Derfor er det umulig å forlate axon fullstendig intakt. Imidlertid bør tilstedeværelse av gjenværende axon betraktes, som det perifere eller sentrale axoner ikke kan klemmes fast til samme spenning som den soma, noe som kan føre til potensielt opptak feil eller forstyrrelser når spennings-klemme er gjennomført. Også for å få god eksponering av neuroner, er svak spaltning med kollagenase nødvendig, og selv om dette kan kontrolleres med erfaring, er det umulig å beskytte neuroner fra eksponering til oppslutnings enzymet. Sammenlignet med konvensjonelle dissociated DRG-neuroner, men hele DRG er raskere å fremstille (ca. 30 min), kan brukes i mange anvendelser og etterligner in vivo-betingelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pentobarbital sodium | vortech Pharmaceuticals | ||
| syringe | BD | 309659 | 1 ml, 5 ml. |
| scalpel | BD | size: 15 | |
| Mayo straight scissor | Fine Science Tools | 14010-15 | |
| Mayo curved scissor | Fine Science Tools | 14011-15 | |
| Rongeur | Fine Science Tools | 16021-14 | |
| Adson toothed forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Iris Scissor | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Noyes spring scissor | Fine Science Tools | 15124-12 | |
| Bone scissors | Fine Science Tools | 16044-10 | Special for cutting the bones. |
| Forceps: Dumont, Dumoxel Biologie #5 | Fine Science Tools | 11252-30 | These have the fine tips that do not need sharpening when first purchased. |
| periosteal elevator | Sklar | 97-0530 | |
| Dissection microscope | WILD | ||
| Transfer pipette | Fisher brand | 13-711-5AM | |
| Petri dish (10 cm) | Pyrex | Glass petri dish can avoid damaging the tips of fine forceps | |
| Collagenase (Liberase TM) | Roche | 05-401-119-001 | dissolve at the concentration of 13 U/ml, aliquot into glass pipette. Avoid repeated freeze and thaw. |
| filter | Thermo scientific | 7232520 | Filter the internal solutions for patch clamp recording to avoid clog. |
| Glass pipette | Sutter | BF150-110-7.5 | |
| Anchor | Havard apparatus | 64-0250 | stabilize the DRG to avoid drift. |
| Peristaltic pump | WPI | ||
| Pipette puller | Sutter | P97 | |
| Amplifier | Molecular devices | Axopatch 200B | |
| Digitizer | Molecular devices | 1440D | |
| Microscope | NIKON | FN600 | |
| Micro-manipulator | Sutter | MPC200 | |
| microinjection dispense system | General Valve | Picrospitzer II | fast drug application system |
| Carbogen (95% O2, 5% CO2) | Local Medical Gas supplier |
References
- Basbaum, A. I., Bautista, D. M., Scherrer, G., Julius, D. Cellular and molecular mechanisms of pain. Cell. 139, 267-284 (2009).
- Caterina, M. J., et al. The capsaicin receptor: a heat-activated ion channel in the pain pathway. Nature. 389, 816-824 (1997).
- Gong, K., Bhargava, A., Jasmin, L. GluN2B N-methyl-D-aspartate receptor and excitatory amino acid transporter 3 are upregulated in primary sensory neurons after 7 days of morphine administration in rats: implication for opiate-induced hyperalgesia. Pain. 157, 147-158 (2016).
- Gong, K., Kung, L. H., Magni, G., Bhargava, A., Jasmin, L. Increased response to glutamate in small diameter dorsal root ganglion neurons after sciatic nerve injury. PloS one. 9, 95491 (2014).
- Gong, K., Zou, X., Fuchs, P. N., Lin, Q. Minocycline inhibits neurogenic inflammation by blocking the effects of tumor necrosis factor-alpha. Clin Exp Pharmacol Physiol. , (2015).
- Ohtori, S., Takahashi, K., Moriya, H., Myers, R. R. TNF-alpha and TNF-alpha receptor type 1 upregulation in glia and neurons after peripheral nerve injury: studies in murine DRG and spinal cord. Spine. 29, 1082-1088 (2004).
- Waxman, S. G., Cummins, T. R., Dib-Hajj, S., Fjell, J., Black, J. A. Sodium channels, excitability of primary sensory neurons, and the molecular basis of pain. Muscle nerve. 22, 1177-1187 (1999).
- Zhang, J. M., Song, X. J., LaMotte, R. H. Enhanced excitability of sensory neurons in rats with cutaneous hyperalgesia produced by chronic compression of the dorsal root ganglion. J Neurophysiol. 82, 3359-3366 (1999).
- Dib-Hajj, S. D., et al. Plasticity of sodium channel expression in DRG neurons in the chronic constriction injury model of neuropathic pain. Pain. 83, 591-600 (1999).
- Cummins, T. R., et al. A novel persistent tetrodotoxin-resistant sodium current in SNS-null and wild-type small primary sensory neurons. J Neurosci. 19, RC43 (1999).
- Zheng, J. H., Walters, E. T., Song, X. J. Dissociation of dorsal root ganglion neurons induces hyperexcitability that is maintained by increased responsiveness to cAMP and cGMP. J Neurophysiol. 97, 15-25 (2007).
- Schoenen, J., Delree, P., Leprince, P., Moonen, G. Neurotransmitter phenotype plasticity in cultured dissociated adult rat dorsal root ganglia: an immunocytochemical study. J Neurosci Res. 22, 473-487 (1989).
- Hanani, M. Satellite glial cells: more than just 'rings around the neuron'. Neuron Glia Biol. 6, 1-2 (2010).
- Takeda, M., Nasu, M., Kanazawa, T., Shimazu, Y. Activation of GABA(B) receptors potentiates inward rectifying potassium currents in satellite glial cells from rat trigeminal ganglia: in vivo patch-clamp analysis. Neuroscience. 288, 51-58 (2015).
- Zhang, H., et al. Altered functional properties of satellite glial cells in compressed spinal ganglia. Glia. 57, 1588-1599 (2009).
- Fan, N., Donnelly, D. F., LaMotte, R. H. Chronic compression of mouse dorsal root ganglion alters voltage-gated sodium and potassium currents in medium-sized dorsal root ganglion neurons. J Neurophysiol. 106, 3067-3072 (2011).
- Fan, N., Sikand, P., Donnelly, D. F., Ma, C., Lamotte, R. H. Increased Na+ and K+ currents in small mouse dorsal root ganglion neurons after ganglion compression. J Neurophysiol. 106, 211-218 (2011).
- The Axon Guide. Sherman-Gold, R. , Axon Instruments. Foster City, CA. (2008).
- Cummins, T. R., Rush, A. M., Estacion, M., Dib-Hajj, S. D., Waxman, S. G. Voltage-clamp and current-clamp recordings from mammalian DRG neurons. Nat Protoc. 4, 1103-1112 (2009).
- Zhang, J. M., Donnelly, D. F., LaMotte, R. H. Patch clamp recording from the intact dorsal root ganglion. J Neurosci Methods. 79, 97-103 (1998).
- Benn, S. C., Costigan, M., Tate, S., Fitzgerald, M., Woolf, C. J. Developmental expression of the TTX-resistant voltage-gated sodium channels Nav1.8 (SNS) and Nav1.9 (SNS2) in primary sensory neurons. J Neurosci. 21, 6077-6085 (2001).
- Funakoshi, K., et al. Differential development of TRPV1-expressing sensory nerves in peripheral organs. Cell Tissue Res. 323, 27-41 (2006).
- Hayar, A., Gu, C., Al-Chaer, E. D. An improved method for patch clamp recording and calcium imaging of neurons in the intact dorsal root ganglion in rats. J Neurosci Methods. 173, 74-82 (2008).
- Yagi, J., Sumino, R. Inhibition of a hyperpolarization-activated current by clonidine in rat dorsal root ganglion neurons. J Neurophysiol. 80, 1094-1104 (1998).
- Ma, C., Donnelly, D. F., LaMotte, R. H. In vivo visualization and functional characterization of primary somatic neurons. J Neurosci Methods. 191, 60-65 (2010).
- Vit, J. P., Jasmin, L., Bhargava, A., Ohara, P. T. Satellite glial cells in the trigeminal ganglion as a determinant of orofacial neuropathic pain. Neuron Glia Biol. 2, 247-257 (2006).
