Abstract
पृष्ठीय रूट ganglia से पैच दबाना स्टडीज (DRGs) न्यूरॉन्स परिधीय तंत्रिका तंत्र के बारे में हमारी समझ को बढ़ा दिया है। वर्तमान में, रिकॉर्डिंग के बहुमत अलग डीआरजी न्यूरॉन्स, जो सबसे अधिक प्रयोगशालाओं के लिए एक मानक तैयारी है पर आयोजित की जाती हैं। Neuronal गुण, तथापि, axonal चोट एंजाइम अलग न्यूरॉन्स प्राप्त करने में इस्तेमाल किया पाचन से उत्पन्न द्वारा बदला जा सकता है। इसके अलावा, अलग न्यूरॉन की तैयारी पूरी तरह से डीआरजी का microenvironment का प्रतिनिधित्व नहीं कर सकते हैं क्योंकि उपग्रह glial कोशिकाओं है कि प्राथमिक संवेदी न्यूरॉन्स के चारों ओर के साथ संपर्क के नुकसान के लिए इस विधि का एक अपरिहार्य परिणाम है। पैच दबाना रिकॉर्डिंग के लिए पारंपरिक अलग डीआरजी न्यूरॉन्स का उपयोग करते हुए, इस रिपोर्ट में सीमाओं को पार करने के लिए हम बरकरार DRGs तैयार है और अलग-अलग प्राथमिक संवेदी न्यूरॉन्स पूर्व vivo पर पैच दबाना रिकॉर्डिंग संचालन करने के लिए एक विधि का वर्णन। यह दृष्टिकोण, अक्षत DRGs के तेजी से और सीधा तैयारी परमिट में नकल उतारडीआरजी अपने आसपास उपग्रह glial कोशिकाओं और तहखाने झिल्ली के साथ जुड़े न्यूरॉन्स रखकर शर्तों विवो। इसके अलावा, विधि हेरफेर से axonal चोट से बचा जाता है और इस तरह जब DRGs अलग कर के रूप में पाचन एंजाइम। इस पूर्व vivo तैयारी अतिरिक्त प्राथमिक संवेदी न्यूरॉन्स और उपग्रह glial कोशिकाओं के बीच बातचीत का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
Introduction
सनसनीखेज एक जीव के अस्तित्व और भलाई के लिए आवश्यक है। उत्तेजनाओं के संचरण प्राथमिक संवेदी न्यूरॉन्स से axons की परिधीय अंत में शुरू संवेदी रास्ते पर निर्भर है। प्राथमिक संवेदी न्यूरॉन्स, trigeminal तंत्रिका के mesencephalic नाभिक के अपवाद के साथ, त्रिपृष्ठी ganglia और पृष्ठीय रूट ganglia (DRGs) में स्थित हैं। वे संवेदी जानकारी 1 के द्वारपाल के रूप में सेवा करते हैं। Perikarial झिल्ली में सिर्फ मध्य और परिधीय टर्मिनलों पर के रूप में, डीआरजी न्यूरॉन्स ऐसे ग्लूटामेट रिसेप्टर्स, टीएनएफ अल्फा रिसेप्टर्स, क्षणिक रिसेप्टर संभावित केशन चैनल उपप्रजाति वी सदस्य 1 (TRPV1), सोडियम चैनल, आदि के रूप में 2 रिसेप्टर्स और आयन चैनल, एक्सप्रेस -7। perikarial झिल्ली के पैच दबाना रिकॉर्डिंग इन रिसेप्टर्स और चैनलों न्यूरॉन भर के कई के कार्यात्मक परिवर्तन को समझने के लिए अनुमति देते हैं।
पैच दबाना रिकॉर्डिंग तकनीक अध्ययन के लिए एक शक्तिशाली उपकरण हैचैनल या रिसेप्टर्स और अध्ययन की एक बड़ी संख्या की गतिविधियों मर डीआरजी न्यूरॉन्स 8-10 पर इस तकनीक को लागू करने से आयोजित किया गया है। ज्यादातर अध्ययनों में डीआरजी पृष्ठीय rootlets और नाड़ीग्रन्थि करने के लिए रीढ़ की हड्डी में तंत्रिका बंद काटने से निकाल दिया जाता है। क़ीमा के बाद, नाड़ीग्रन्थि तो पाचन एंजाइमों कि डीआरजी न्यूरॉन्स, तो रिकॉर्डिंग से पहले कई दिनों के लिए तुरंत या सुसंस्कृत दर्ज किया जा सकता है, जो की हदबंदी में परिणाम में रखा गया है। दुर्भाग्य से, डीआरजी न्यूरॉन्स की हदबंदी perikarya के करीब एक आवश्यक axotomy शामिल है। एक बार अलग और axotomized, डीआरजी न्यूरॉन्स झिल्ली excitability 11,12 में प्ररूपी परिवर्तन के साथ ही परिवर्तन से गुजरना। कि आम तौर पर उन्हें घेर व्यक्तिगत न्यूरॉन्स की perikarya और उपग्रह glial कोशिकाओं के बीच संपर्क के नुकसान इन परिवर्तनों 13 में योगदान करने की संभावना है। न्यूरॉन्स और उपग्रह glial कोशिकाओं के बीच crosstalk शारीरिक स्थितियों में दोनों जरूरी है और अनुकूलन patholog करने में हैइस तरह के असभ्य दर्द 14,15 के लिए अग्रणी के रूप में उन राजनैतिक परिस्थितियों। यह न्यूरॉन्स और उपग्रह glial कोशिकाओं को एक अलग डीआरजी तैयारी का उपयोग कर के बीच बातचीत का अध्ययन करने के लिए चुनौतीपूर्ण होगा।
बरकरार DRGs, दूसरे हाथ पर, इन विवो की स्थिति के करीब हैं। पिछले कई वर्षों में, हमारी प्रयोगशाला, साथ ही कुछ अन्य समूहों, वयस्क चूहों से बरकरार DRGs का उपयोग किया गया पुराने दर्द 3-5,11,15-17 के साथ जुड़े विभिन्न परिस्थितियों में प्राथमिक संवेदी न्यूरॉन्स के परिवर्तन की जांच करने के लिए। हालांकि इन अध्ययनों में इस्तेमाल की तकनीक कुछ हद तक स्थापित कर रहे हैं, एक कदम-दर-कदम विवरण अभी तक प्रकाशित नहीं किया गया है। वर्तमान पांडुलिपि में, हम बरकरार DRGs और पैच दबाना रिकॉर्डिंग के लिए उनके उपयोग को तैयार करने के लिए एक सुविधाजनक और तेजी से रास्ते का वर्णन है।
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Protocol
आचार कथन: प्रायोगिक पशुओं के रखरखाव और उपयोग के लिए सभी प्रक्रियाओं पशु अनुसंधान पर UCSF समितियों के नियमों के लिए पुष्टि और पशुओं के उपयोग और देखभाल (प्रकाशन 85 पर एनआईएच नियमों के दिशा निर्देशों के अनुसार किया गया - 23 1996 संशोधित )। UCSF संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति इस अध्ययन में इस्तेमाल किया प्रोटोकॉल को मंजूरी दे दी।
1. उपकरण, समाधान और व्यंजन की तैयारी
- कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव (ACSF) तैयार करें।
- 10x कम केशन समाधान के 500 मिलीलीटर, और 10x बाइकार्बोनेट समाधान (समाधान तैयार करने के लिए तालिका 1 और 2 देखें) की 500 मिलीलीटर की तैयारी। 4 ओ सी और उपयोग एक माह के भीतर पर स्टोर।
- बाइकार्बोनेट समाधान के 60 मिलीलीटर के साथ 10x कम केशन समाधान के 60 मिलीलीटर मिश्रण से ताजा aCSF की 600 मिलीलीटर की तैयारी, और फिर 600 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा तक पहुँचने के लिए विआयनीकृत पानी की 480 मिलीलीटर जोड़ें। बुलबुला aCSF carbogen साथ(5% 2 हे और 95% सीओ 2) उपयोग करने से पहले कम से कम 10 मिनट के लिए।
- केशिका ग्लास से पैच पिपेट खींचो।
- रिकॉर्डिंग pipettes तैयार करने के लिए एक विंदुक खींचने में पतली दीवारों केशिका गिलास रखें।
नोट: हमारी प्रयोगशाला में, डांड़ी के निम्नलिखित मानकों को स्थापित करने के लिए आदर्श पिपेट आकार को प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं: गर्मी (510), वेग (32)। बरकरार डीआरजी रिकॉर्डिंग के लिए आदर्श पिपेट आकार एक कम शंकु कोण के साथ एक क्रमिक पतला घटना नहीं होनी चाहिए, और यह सबसे अच्छा परीक्षण और त्रुटि के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है। - सुनिश्चित करें कि पिपेट के विरोध को 3-5 MΩ है जब आंतरिक समाधान (समाधान तैयार करने के लिए 3 टेबल देखें) के साथ भर दिया। पिपेट प्रतिरोध 18 को मापने का विस्तृत विधि के लिए एक्जॉन गाइड को देखें।
- रिकॉर्डिंग pipettes तैयार करने के लिए एक विंदुक खींचने में पतली दीवारों केशिका गिलास रखें।
- collagenase के 1 मिलीग्राम aCSF के 400 μl जोड़ें, 13 इकाइयों / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता देने के लिए। तब collagenase समाधान के बारे में 20 μl के साथ प्रत्येक गिलास पिपेट भरें। दुकानएक -20 ओ सी फ्रीजर में भरा pipettes और उन्हें तीन सप्ताह के भीतर का उपयोग करें।
- ठंड aCSF (लगभग 4 ओ सी) के 200 मिलीलीटर की तैयारी। ACSF शांत जल्दी से एक बीकर में यह जगह, लगभग 20 मिनट के लिए प्लास्टिक की चादर और एक -20 ओ सी फ्रीजर में जगह के साथ सील जब तक यह फ्रीज करने के लिए शुरू होता है। एक बर्फ स्नान और carbogen साथ बुलबुले में बीकर 10 मिनट के लिए रखें। बुलबुला आरटी पर carbogen साथ aCSF के 400 मिलीलीटर शेष।
- aCSF ठंडा है, वहीं 5 मिमी की एक व्यास के लिए खोलने (इस डीआरजी हस्तांतरण करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा) विस्तार करने के लिए एक प्लास्टिक डिस्पोजेबल हस्तांतरण पिपेट के अंत में कटौती। निम्नलिखित सर्जिकल उपकरणों लीजिए: छुरी (# 15), मेयो सीधे और घुमावदार कैंची, ठीक 2 मिमी टिप rongeur, Adson (दांतेदार) संदंश, आईरिस कैंची, वसंत कैंची और दो ठीक संदंश। 3 गिलास पेट्री डिश में ऑक्सीजन ठंड ACSF (: 10 सेमी बाहरी व्यास) डालो।
2. डीआरजी विच्छेदन
- सोडियम पे के साथ एक चूहे (200-220 ग्राम) anesthetizentobarbital (100 मिलीग्राम / किग्रा, आईपी) और पुष्टि करते हैं कि संज्ञाहरण के स्तर पेडल पलटा और आँख झपकी पलटा परीक्षण द्वारा पर्याप्त है।
- पुष्टि है कि चूहे anesthetized है के बाद, काठ का क्षेत्र दाढ़ी और त्वचा और midline के साथ चमड़े के नीचे ऊतक काटकर अलग कर देना। ठीक एक periosteal लिफ्ट का उपयोग एल 1-S2 स्तर पर spinous प्रक्रियाओं से paraspinal मांसपेशियों को अलग करें।
- एस 2 के लिए एल 1 से spinous प्रक्रियाओं में कटौती करने के घुमावदार कैंची का प्रयोग करें। (1.5 चरण में तैयार) 2-3 मिनट के लिए खुल कशेरुका स्तंभ पर लगभग एल 1 और एस 1 में अनुप्रस्थ कटौती करने और एन ब्लॉक कशेरुका स्तंभ के इस खंड को दूर करने और जल्दी से ठंड aCSF में डूब सीधे मेयो कैंची का प्रयोग करें। काठ का DRGs को हटाने के बाद, इच्छामृत्यु द्विपक्षीय thoracotomy द्वारा किया जाता है, जबकि चूहे गहरी pentobarbital संज्ञाहरण के तहत अब भी है।
- हटा कशेरुका स्तंभ से रक्त और ऊतकों को संलग्न बंद फ्लश और ठंड ACSF के साथ एक पेट्री डिश के लिए स्थानांतरण। यूठीक एक laminae दूर करने के लिए rongeur se। microscissors के साथ midline के साथ ड्यूरा मेटर कट रीढ़ की हड्डी का पर्दाफाश करने के लिए। धीरे रीढ़ की हड्डी उठा, और आइरिस कैंची का उपयोग रीढ़ की हड्डी में उनके प्रवेश बिंदु पर तंत्रिका जड़ों में कटौती, तो रीढ़ की हड्डी को हटा दें।
- ठंड ACSF के साथ भरा दूसरी पेट्री डिश के लिए DRGs के साथ शेष बांस स्थानांतरण। L4 और अनुप्रस्थ प्रक्रियाओं और sciatic तंत्रिका करने के लिए उनके रिश्तेदार की स्थिति के आधार पर L5 DRGs को पहचानें।
नोट: sciatic तंत्रिका अक्षुण्ण बनाए रखने के L4 और L5 डीआरजी (sciatic तंत्रिका L4-6 रीढ़ की नसों से निकलती है) की पहचान करने में मदद मिलेगी। - आसपास के संयोजी ऊतक से DRGs मुक्त करने के लिए Dumont संदंश और Noyes कैंची का प्रयोग करें। तंत्रिका जड़ और रीढ़ की हड्डी में तंत्रिका DRGs से जुड़ी रखें।
- आगे विच्छेदन के लिए तीसरे पेट्री डिश में DRGs स्थानांतरित करने के लिए हस्तांतरण पिपेट का प्रयोग करें।
- विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत, ध्यान से epineurium आसपास वें के रूप में संभव के रूप में ज्यादा दूरई डीआरजी।
- एक खोलने जहां पृष्ठीय और उदर जड़ों डीआरजी में शामिल होने और डीआरजी से उदर जड़ अलग कटौती करने के लिए Noyes वसंत कैंची का प्रयोग करें। epineurium धारण करने के लिए प्रयोग करें Dumont # कुंद सुझावों के साथ 5 संदंश, और epineurium से डीआरजी रोल करने के लिए एक और ठीक संदंश का उपयोग करें।
- के रूप में ज्यादा epineurium के संभव के रूप में संलग्न दूर करने के लिए ठीक संदंश का उपयोग DRGs करने के लिए आगे बढ़ें।
नोट: एक अच्छी तरह से विच्छेदित डीआरजी अगले चरण में एक अच्छा पाचन प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है।
3. डीआरजी पाचन
- रिकॉर्डिंग कक्ष डीआरजी स्थानांतरण। यकीन डीआरजी जहां तंत्रिका जड़ों नीचे उत्पन्न चेहरे की ओर करें।
नोट: इस तरह, सबसे न्यूरॉन्स पहुंच रहे हैं। - डीआरजी स्थिर करने के लिए एक लंगर का प्रयोग करें। प्लास्टिक एक क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप, जो रिकॉर्डिंग रिग के बगल में एक मेज पर रखा जाता है के साथ जुड़ा हुआ ट्यूब के माध्यम से 0.5 मिलीग्राम / मिनट की दर से ऑक्सीजन ACSF के साथ छिड़कना डीआरजी।
- 30 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें कोशिकाओं को ठीक करने के लिए अनुमति देने के लिए। एक सीसीडी कैमरा के माध्यम से अवरक्त अंतर इंटरफ़ेस विपरीत तहत डीआरजी की गुणवत्ता 40x उद्देश्य बढ़ाई (आईआर डीआईसी) प्रकाशिकी का आकलन करें।
नोट: अच्छा DRGs आमतौर पर कई दौर, अच्छी तरह से विपरीत, इसकी सतह पर उपग्रह glial कोशिकाओं से घिरा हुआ न्यूरॉन्स होते हैं। - डीआरजी की सतह के एक छोटे से क्षेत्र को पचाने।
नोट: कांच पैच pipettes पिपेट धारकों, जो छोटे कपलिंग कि ट्यूबिंग एक airtight सील के साथ कांच पिपेट से जुड़े होने की अनुमति देते हैं में रखा जाता है।- व्यक्तिगत रूप से छोटे व्यास रबर टयूबिंग के दो टुकड़ों के माध्यम से पिपेट धारकों के लिए दो 1 मिलीलीटर सीरिंज कनेक्ट। एक गिलास पिपेट धारकों में से एक है और एक दूसरे में एक खाली गिलास पिपेट में collagenase के साथ भरा पिपेट रखो।
- सिर्फ डीआरजी ऊपर pipettes की स्थिति के लिए micromanipulator का प्रयोग करें। फिर, माइक्रोस्कोप बढ़ाई के तहत, पिपेट टिप्स (आदर्श रूप में 5 की एक व्यास के उद्घाटन के विस्तार करने के लिए धीरे एक दूसरे के खिलाफ दो pipettes के सुझावों के टकराने10 माइक्रोन)।
- ट्यूब धारक और सवार लगभग 0.5 मिलीलीटर विस्थापित द्वारा सिरिंज के माध्यम से जोड़ने के पिपेट युक्त कोलैजिनेज़ करने के लिए सकारात्मक दबाव लागू डीआरजी की सतह के करीब एंजाइम के साथ भरा पिपेट ले जाएँ और संक्षेप।
नोट: दबाव के तहत, पिपेट से एंजाइम का प्रवाह थोड़ा डीआरजी न्यूरॉन्स, जो एंजाइम आवेदन के लिए संकेत के रूप में सेवा कर सकते हैं के बीच अंतरिक्ष बढ़ाना होगा। - 10 से 15 मिनट के बाद, जब शेष epineurium के मलबे में मनाया जाता है, कोमल नकारात्मक दबाव खाली पिपेट को दूर चूसना करने के लिए मलबे लागू होते हैं।
नोट: इस तरह, न्यूरॉन्स और आसपास के उपग्रह glial कोशिकाओं स्पष्ट रूप से अवगत कराया और पैच रिकॉर्डिंग के लिए तैयार हो जाएगा। - तेजधार कंटेनर में दो pipettes त्यागें।
4. पैच दबाना रिकॉर्डिंग
- इलेक्ट्रोड समाधान (3 टेबल देखें) बर्फ पर गिरावट को रोकने के लिए रखें। साथ कांच पैच पिपेट भरेंफ़िल्टर intracellular समाधान (सिरिंज फिल्टर, ताकना आकार: 0.2 माइक्रोन) और headstage पिपेट धारक में पिपेट जगह है। स्नान समाधान में पिपेट कम करने से पहले 1 मिलीलीटर के बारे में सवार विस्थापित द्वारा एक 5 मिलीलीटर सिरिंज के माध्यम से पिपेट करने के लिए एक सौम्य सकारात्मक दबाव लागू करें।
नोट: यह अवरुद्ध बनने से पिपेट रोकता है। - एम्पलीफायर पर मोड घुंडी बदल कर 'वी दबाना "मोड चुनें, तो सॉफ्टवेयर में खुलेगा" झिल्ली परीक्षण "इंटरफेस। पिपेट माइक्रोस्कोप निरीक्षण के तहत लक्ष्य न्यूरॉन के करीब ले जाएँ।
नोट: बरकरार डीआरजी तैयारी में, उपग्रह glial कोशिकाओं की एक पतली परत प्रत्येक न्यूरॉन encapsulates। - न्यूरॉन और उपग्रह glial कोशिकाओं के आसपास के परत के बीच अंतरिक्ष के अचानक बढ़ने को मनाया जाता है जब तक उपग्रह glial सेल परत पार करने के लिए पिपेट से सकारात्मक दबाव का प्रयोग करें। जब तक एक "डिंपल" न्यूरॉन पर मनाया जाता है न्यूरॉन की ओर पिपेट चलते रहो।
नोट: के साथ तुलना मेंdisassociated न्यूरॉन्स से रिकॉर्डिंग, सकारात्मक दबाव एक थोड़ा बड़ा है, जो उपग्रह glial सेल परत घुसना और सफल पट्टी के लिए अवसरों में वृद्धि करने में मदद मिलेगी की जरूरत है। - सकारात्मक दबाव कम करें। अगले, कोमल चूषण के साथ एक गीगा ओम मुहर हासिल।
नोट: इस विधि के साथ, रिकॉर्डिंग की सफलता की दर कम से कम 70% है। - पूरे सेल रिकॉर्डिंग विन्यास को पाने के रूप में पहले 19 में वर्णित है।
- संक्षेप में, एक छोटी लेकिन मजबूत चूषण के माध्यम से न्यूरॉन कोशिका झिल्ली घुसना। वैकल्पिक रूप से, जबकि सक्शन लागू किया जाता है एम्पलीफायर पर "जैप" समारोह का उपयोग करें।
- एक बार एक पूरे सेल मोड की स्थापना की है, एम्पलीफायर पर समाई और प्रतिरोध मुआवजा knobs मोड़ से पूरे सेल समाई और श्रृंखला प्रतिरोध (रुपये) क्षतिपूर्ति।
नोट: रुपये सामान्य रूप से 5-20 MΩ है। - सेल को छोड़ अगर रुपये में शुरू में 30 MΩ से अधिक है; या रुपये रिकॉर्डिंग के दौरान अधिक से अधिक 20% से बदल जाता है। भीआराम झिल्ली क्षमता को मापने; एक सेल को छोड़ अगर आराम झिल्ली संभावित -50 से भी अधिक है एम वी।
- "झिल्ली परीक्षण" विंडो बंद करें। एम्पलीफायर पर मोड घुंडी बदल कर "मैं दबाना सामान्य" मोड चुनें।
- सॉफ्टवेयर में 'खुले प्रोटोकॉल "पर क्लिक करें का चयन करें और rheobase को मापने के लिए प्रोटोकॉल लोड। रिकॉर्डिंग शुरू करने के लिए "रिकॉर्ड" पर क्लिक करें। उपाय इनपुट प्रतिरोध और 100 फिलीस्तीनी अथॉरिटी के चरणों में धाराओं depolarizing के एक वर्गीकृत श्रृंखला इंजेक्शन द्वारा neuronal excitability जांच करने के लिए rheobase।
- "खुला प्रोटोकॉल" फिर से क्लिक करें और झिल्ली सीमा को मापने के लिए प्रोटोकॉल का चयन करें। रैंप वर्तमान (2,000 पीए / एस) depolarizing ए 500 एमएस न्यूरॉन को इंजेक्ट किया जाएगा।
- डाटा अधिग्रहण और विश्लेषण सॉफ्टवेयर (जैसे Clampfit) का उपयोग करें निर्माता के निर्देशों के अनुसार दर्ज की निशान का विश्लेषण करने के लिए। स्थिर राज्य चतुर्थ relat के आधार पर इनपुट प्रतिरोध (रिन) की गणना करने के लिए सॉफ्टवेयर का प्रयोग करेंछुड़ाया hyperpolarizing धाराओं के दौरान ionship। rheobase और झिल्ली दहलीज के लिए मूल्य को मापने के लिए कर्सर ले जाएँ।
नोट: एपी प्रेरित करने के लिए आवश्यक वर्तमान के आयाम rheobase के रूप में परिभाषित किया गया है, और एपी उत्प्रेरण के लिए सबसे कम वोल्टेज झिल्ली सीमा के रूप में परिभाषित किया गया है।
- रिकॉर्ड Ligand प्रेरित धाराओं।
- विशिष्ट एगोनिस्ट के साथ एक विंदुक भरें।
नोट: वर्तमान रिपोर्ट में, हम 100 माइक्रोन के ग्लूटामेट और 100 माइक्रोन के AITC इस्तेमाल किया धाराओं ग्लूटामेट रिसेप्टर्स और TRPA1 रिसेप्टर्स क्रमशः द्वारा मध्यस्थता प्रेरित करने के लिए। - सुनिश्चित करें कि कोई हवा के बुलबुले के अंदर देखते हैं बनाने के लिए पिपेट की जाँच करें। पिपेट धारक में पिपेट रखें। एक दवा वितरण प्रणाली से जुड़े एक ट्यूब के साथ पिपेट धारक कनेक्ट करें।
- न्यूरॉन के 50 माइक्रोन के भीतर पिपेट स्थानांतरित करने के लिए जोड़तोड़ का प्रयोग करें। 1 साई दवा वितरण प्रणाली के दबाव और 1 सेकंड के लिए अवधि निर्धारित करें। वोल्टेज क्लैंप को रिकॉर्डिंग मोड स्विच, और -70 एम वी पर शिकंजा कसने। संक्षेप में एक दवा प्रेरित वर्तमान रिकॉर्ड करने के लिए दवा वितरण प्रणाली के माध्यम से दबाव लागू होते हैं।
- विशिष्ट एगोनिस्ट के साथ एक विंदुक भरें।
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Representative Results
चित्रा 1 पैच रिकॉर्डिंग के लिए बरकरार डीआरजी तैयार करने की प्रक्रिया से पता चलता है। चित्रा 1 ए जोखिम और बाद laminectomy। Figure1B गैन्ग्लिया के स्थान तंत्रिका रीढ़ की हड्डी को हटाने के बाद जुड़ी जड़ों के साथ L3, L4 और L5 DRGs से पता चलता चलता। तब L4 और 5 DRGs ध्यान से विच्छेदित और कशेरुकाओं से मुक्त कर रहे हैं। अगले, epineurium, एक पारदर्शी डीआरजी आसपास झिल्ली, (पीले तीर, चित्रा -1) निकाल दिया जाता है। सबसे अच्छा स्थान epineurium अलग करने के लिए साइट है जहाँ पृष्ठीय और उदर जड़ों डीआरजी में शामिल होने के माध्यम से है, के रूप में चित्रा -1 में काला तीर द्वारा संकेत दिया। Epineurium बंद छीलने के बाद, उदर जड़ निकाल दिया जाता है और त्याग, पृष्ठीय rootlets छोड़ने रीढ़ की हड्डी में तंत्रिका और डीआरजी के रूप में चित्रा 1E में दिखाया गया है। कोलैजिनेज़ साथ पाचन अवशिष्ट epineurium हटा, न्यूरॉन्स और उपग्रह कोशिकाओं टी उजागरटोपी उन्हें (चित्रा 1F) के चारों ओर।
डीआरजी तैयारी पूरी करने के बाद, छोटे व्यास डीआरजी न्यूरॉन के excitability rheobase और झिल्ली सीमा को मापने के द्वारा जांच की है। जैसा कि चित्र में दिखाया गया है 2A, rheobase 260 Pa। चित्रा 2 बी झिल्ली दहलीज इस विधि के साथ मापा पता चलता है। बढ़ती वर्तमान के साथ, झिल्ली लगातार depolarized जब तक एक एपी पैदा की है। इस उदाहरण में झिल्ली सीमा (संभावित है, जिस पर एपी पैदा किया जाता है) -11.9 एम वी है। इसलिए, न्यूरॉन्स और उपग्रह glial कोशिकाओं के बीच संबंधों को बनाए रखने के द्वारा, हमारी तैयारी में vivo स्थिति के करीब है। हमारे परिणामों के आधार पर, rheobase छोटे डीआरजी न्यूरॉन्स से दर्ज लगभग 300 प्रति वर्ष है, और इनपुट प्रतिरोध 451.3 ± 27.3 MΩ है। दोनों उच्च अलग न्यूरॉन्स से मापा (लगभग 150 पीए और 635 MΩ) उन लोगों के साथ तुलना कर रहे हैं, सुझावकि हदबंदी डीआरजी न्यूरॉन्स 11 के excitability वृद्धि हुई है।
इस तैयारी के साथ, हम भी जो ग्लूटामेट रिसेप्टर्स और क्षणिक रिसेप्टर संभावित केशन चैनल सदस्य A1 (TRPA1) क्रमश: एगोनिस्ट हैं ग्लूटामेट और एलिल आइसोथियोसाइनेट (AITC) द्वारा प्रेरित आवक धाराओं, मापा। इन ligands से प्रेरित आवक धाराओं के आयाम रिसेप्टर्स न्यूरॉन्स में वितरित की संख्या को प्रतिबिंबित करेगा। चित्रा 3A एक छोटे व्यास डीआरजी न्यूरॉन ग्लूटामेट की एक 1 सेकंड कश आवेदन (1 मिमी) द्वारा प्रेरित में एक आवक वर्तमान पता चलता है। ग्लूटामेट एक आवक वर्तमान (198 PA) है, जो काफी हद तक NMDA रिसेप्टर प्रतिपक्षी APV और AMPA / kainate रिसेप्टर प्रतिपक्षी CNQX (डेटा नहीं दिखाया गया है) के सह आवेदन के द्वारा अवरुद्ध किया जा सकता है, वर्तमान की पुष्टि प्रेरित डीआरजी पर ग्लूटामेट रिसेप्टर्स द्वारा मध्यस्थता है न्यूरॉन्स। इस डाटा को स्थापित डीआरजी न्यूरॉन्स पर कार्यात्मक ग्लूटामेट रिसेप्टर्स देखते हैं कि। neuron चित्रा 3 बी में सचित्र आवक धाराओं (260 PA) एलिल आइसोथियोसाइनेट (AITC, 100 माइक्रोन) के एक चयनात्मक TRPA1 agonist के 1 सेकंड कश आवेदन से प्रेरित दिखाया। आवक वर्तमान चयनात्मक TRPA1 प्रतिपक्षी 10 माइक्रोन कोर्ट 030031 द्वारा अवरुद्ध किया गया था (डेटा नहीं दिखाया गया है), धाराओं की पुष्टि TRPA1 रिसेप्टर्स द्वारा मध्यस्थता और डीआरजी न्यूरॉन्स पर TRPA1 रिसेप्टर्स की उपस्थिति स्थापित किया गया था।
चित्रा 1: बरकरार DRGs की तैयारी (ए) laminectomy के बाद रीढ़ की हड्डी और DRGs के विभाजन का एक्सपोजर।। दाईं से बाईं ओर तीर क्रमश L3-5 DRGs संकेत मिलता है। स्केल बार = 1 सेमी। (बी) रीढ़ की हड्डी को हटाने के बाद L3, L4, और L5 DRGs और संलग्न तंत्रिका जड़ों का एक्सपोजर। तीर छोड़ दिया सही से L3, L4, और L5 DRGs संकेत मिलता है। स्केल बार = 1 सेमी। (सी) Intaतंत्रिका रीढ़ की हड्डी से विच्छेदित किए जाने के बाद जुड़ी जड़ों के साथ सीटी DRGs। तीर छोड़ दिया सही से L4 और L5 DRGs संकेत मिलता है। स्केल बार = 1 सेमी। (डी) संलग्न epineurium के साथ बरकरार डीआरजी। इस तस्वीर में, epineurium बरकरार है, और पीले तीर एक Dumont संदंश द्वारा आयोजित अर्द्ध पारदर्शी epineurium पता चलता है। काला तीर जंक्शन पृष्ठीय रूट और उदर जड़ है, जो एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु epineurium बंद छील करने के रूप में कार्य करता द्वारा गठित इंगित करता है। स्केल बार = 1 मिमी। (ई) पृष्ठीय epineurium और उदर जड़ के बाद संलग्न रूट के साथ ही डीआरजी हटा दिया गया है। स्केल बार = 1 मिमी। कोलैजिनेज़ साथ पाचन निम्नलिखित डीआरजी (एफ) इन्फ्रारेड माइक्रोस्कोप छवियों। छोटे और मध्यम आकार के न्यूरॉन्स दिखाई दे रहे हैं। एक उपग्रह glial सेल (पीले तीर) एक न्यूरॉन (तारांकन) के आस-पास दिखाई दे रहा है। पिपेट के लिए लाल तीर अंक। स्केल बार 10 माइक्रोन =। (G) रिकॉर्डिंग उपकरण विन्यास। काला तीर वीं का संकेतई पिपेट धारकों। छोड़ एक दवा भरा पिपेट रखती है, और रिकॉर्डिंग पिपेट सही पर है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2:। वर्तमान दबाना मोड (ए) Rheobase में neuronal excitability के मापन डीआरजी न्यूरॉन (ऊपरी पैनल) में धाराओं की एक श्रृंखला के इंजेक्शन लगाने के द्वारा मापा गया था। सबसे कम वर्तमान तीव्रता है, जो एक संभावित कार्रवाई के लिए प्रेरित कर सकते हैं, के रूप में कम पैनल में तीर द्वारा संकेत, rheobase के रूप में परिभाषित किया गया है। इस न्यूरॉन के लिए rheobase 300 प्रति वर्ष है। (बी)। झिल्ली सीमा एक रैंप वर्तमान इंजेक्शन लगाने के द्वारा मापा गया था। क्षमता, जब एक संभावित कार्रवाई पैदा किया जाता है, झिल्ली सीमा के रूप में, के रूप में ऊपरी पैनल में धराशायी लाइन द्वारा लेबल परिभाषित किया गया है।इस न्यूरॉन के लिए झिल्ली सीमा -11.9 एम वी है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3: छोटे डीआरजी न्यूरॉन्स में ligand प्रेरित धाराओं 1 सेकंड के लिए ग्लूटामेट का कश आवेदन (1 मिमी) या एलिल आइसोथियोसाइनेट (TRPA1 एगोनिस्ट, AITC, 100 माइक्रोन) के द्वारा प्रेरित धाराओं।। दोनों एगोनिस्ट धाराओं आवक प्रेरित, छोटे डीआरजी न्यूरॉन्स पर ग्लूटामेट रिसेप्टर्स और TRPA1 रिसेप्टर्स की उपस्थिति का सुझाव दे। ग्लूटामेट आवेदन 198 फिलीस्तीनी अथॉरिटी (ए) के एक आवक वर्तमान प्रेरित, और AITC 260 फिलीस्तीनी अथॉरिटी (बी) के एक आवक वर्तमान प्रेरित किया। न्यूरॉन्स -70 एम वी पर clamped रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। </ P>
| 10x कम cationic शेयर के 2 लीटर | |||
| अंतिम एकाग्रता (मिमी) | अंग | मेगावॉट | वजन (छ) |
| 3 | KCl | 74.6 | |
| 1 1 | शर्करा | 180.2 | |
| 123 | NaCl | 58.4 | |
| 1.25 | नः 2 पीओ 4 * एच 2 ओ | 138 | |
| 1 | 2 MgCl * 6H 2 ओ | 203.3 | |
| 2 | 2 CaCl * 2H 2 ओ | 147 | |
तालिका एक
| 10x बिकारबोनिट शेयर का 1 लीटर | |||
| अंतिम एकाग्रता (मिमी) | अंग | मेगावॉट | वजन (छ) |
| 26 | 3 NaHCO | 84.01 | 21.84 |
सारणी 2
| intracellular समाधान की 100 मिलीलीटर | |||
| एकाग्रता (मिमी) | अंग | मेगावॉट | जी |
| 130 | KGluconate | 234.24 | |
| 10 | KCl | 74.55 | |
| 10 | HEPES | 238.3 | |
| 10 EGTA | |||
| 2 | 2 MgCl * 6H 2 ओ | 203.3 | |
| नोट: - सुक्रोज और आसुत जल से 280 mOsm 260 KOH के साथ 7.4 पीएच, और परासारिता को समायोजित करें। 2 मिमी MgATP, 0.5 मिमी ना 2 जीटीपी और फिल्टर तत्काल उपयोग करने से पहले जोड़े। | |||
टेबल तीन
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Discussion
हम पैच दबाना अध्ययन के लिए पूरे DRGs तैयार करने के लिए एक विधि की रिपोर्ट। वहाँ एक आदर्श नमूना तैयार करने के लिए कई महत्वपूर्ण तत्व हैं। सबसे पहले, यह पृष्ठीय जुड़ी जड़ों के साथ DRGs टुकड़े करना महत्वपूर्ण है। उसके बाद, epineurium जबकि न्यूरॉन्स को होने वाले नुकसान से बचने के ध्यान से हटा दिया जाना चाहिए। अंत में, न्यूरॉन्स और उनके आसपास के उपग्रह glial कोशिकाओं को बेनकाब करने के लिए, यह आवश्यक है शेष संयोजी ऊतक को पचाने के लिए है। विधि यहाँ वर्णित के साथ तैयार वयस्क चूहों से बरकरार DRGs 6 से 8 घंटे के लिए अच्छा व्यवहार्यता को बनाए रखने और स्थिरतापूर्वक उस अवधि के दौरान दर्ज की जा सकती है। वे न्यूरॉन्स या उपग्रह glia कोशिकाओं, या डीआरजी न्यूरॉन्स की पैदा की प्रतिक्रियाओं पर पैच दबाना रिकॉर्डिंग सहित DRGs के कई अलग अलग अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
विच्छेदन प्रक्रिया के दौरान, इसे जल्दी डीआरजी काटना और neuronal चयापचय धीमा करने के लिए एक कम तापमान (4 ओ सी) में इसे रखने के लिए महत्वपूर्ण है और इस तरह इसकी व्यवहार्यता बनाए रखता है। टी के दौरानवह DRGs के विच्छेदन, एक पृष्ठीय खींच से बचना चाहिए या रीढ़ की नसों DRGs में प्रवेश। इस तैयारी में एक और महत्वपूर्ण कदम डीआरजी आसपास के epineurium को हटाने की है। चूंकि epineurium घुसना मुश्किल है, किसी भी डीआरजी पर शेष epineurium न्यूरॉन्स तक पहुँचने से पैच pipettes पाएगा। collagenase के आवेदन सफल तैयारी के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है। कोलेजिनेस शेष epineurium पचाने और एक ही समय में कोशिकाओं की सतह को साफ, जो दोनों के सफल पट्टी के लिए महत्वपूर्ण हैं जाएगा। ऊतक के ओवर-पाचन से बचने के लिए, तीन कारकों पर विचार करने की जरूरत है। सबसे पहले, कोलैजिनेज़ कई अलग अलग रूपों में आता है; हमारी सिफारिश के लिए सामग्री की तालिका देखें, एक वर्तमान में इस्तेमाल किया, शक्तिशाली लेकिन कोमल है, इस प्रकार के ऊपर पाचन से परहेज। दूसरा, एंजाइम एक हल्के दबाव में दिया जाना चाहिए रिकॉर्डिंग क्षेत्र से परे एंजाइम के dispersing से बचने के लिए। हम दबाव एक के 0.5 मिलीलीटर लागू करने से उत्पादित पाया हैकी एक 1ml सिरिंज से बाहर आईआर पर्याप्त है। तीसरा, कोलैजिनेज़ के लिए अच्छी एकाग्रता रेंज 10-13 इकाइयों / मिलीलीटर से है। उच्च सांद्रता, अधिक पाचन और ऊतकों की तेजी से गिरावट के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, जबकि कम सांद्रता एक अनावश्यक रूप से लंबे समय पाचन शामिल है। हमारे अनुभव में, 13 इकाइयों / एमएल की एकाग्रता और एक पाचन समय लगभग 15 मिनट के लिए सबसे अच्छा परिणाम पैदा करता है। एंजाइम लगाने के बाद डीआरजी आसपास के शेष epineurium ढीला हो जाना चाहिए, और कोमल चूषण के साथ दूर मंजूरी दे दी जा सकती है। कोलेजिनेस ठंड विगलन के चक्र को दोहराने के प्रति संवेदनशील है, इसलिए, एक बार पतला एंजाइम समाधान aliquots में विभाजित है और 3 सप्ताह के भीतर किया जाना चाहिए।
जांग और उनके सहयोगियों पहले बरकरार DRGs से पैच दबाना रिकॉर्डिंग के लिए एक विधि का वर्णन करने के लिए थे। चूहों वे प्रयोग किया जाता है, तथापि, बहुत छोटे थे (10-15 दिनों प्रसव के बाद) 20 जो लाभ यह है कि DRGs कर रहे हैं आसान है को देखते हुए तैयार है कि वे एक पतली महामारी हैneurium और वे एक वृद्धि की व्यवहार्यता की है। DRGs नवजात चूहों से, हालांकि, नुकसान यह है कि प्रोटीन और TRPV1 और NaV1.8 तरह आयन चैनल की अभिव्यक्ति वयस्क चूहों 21,22 के उन लोगों से अलग है। इसके अलावा, व्यवहार और औषधीय अध्ययन आमतौर पर वयस्क चूहों में आयोजित की जाती हैं। इस प्रकार की रिकॉर्डिंग की विधि यहाँ विस्तृत वयस्क पशुओं में इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी और व्यवहार के बीच एक संबंध बनाने की अनुमति देता है। एक तैयारी के रूप में बरकरार पृष्ठीय रूट ganglia के उपयोग पैच दबाना रिकॉर्डिंग का संचालन करने के पूर्व vivo हाल ही में वृद्धि हुई है 15-17,23,24, और कुछ अध्ययनों विवो रिकॉर्डिंग 25 में इस्तेमाल किया है। पूर्व vivo रिकॉर्डिंग के अधिकांश के आसपास 30-60 मिनट के लिए एंजाइम कॉकटेल में पूरी डीआरजी incubating द्वारा डीआरजी न्यूरॉन्स बेनकाब। हालांकि इस पद्धति अधिक न्यूरॉन्स पैदा करता है, यह खत्म पाचन ऊपरी परत में न्यूरॉन्स की एक जोखिम है। हमारे विधि दृश्य निरीक्षण का उपयोग कर पूर्व की निगरानी के लिए से अधिक-पाचन की संभावना को कम करता हैपाचन के तम्बू, भी इन विवो रिकॉर्डिंग 25 मा एट अल द्वारा विधि का इस्तेमाल किया।
अलग डीआरजी न्यूरॉन्स के साथ तुलना में, अक्षत डीआरजी तैयारी के लाभ में से एक दोनों न्यूरॉन्स और उपग्रह glial कोशिकाओं (चित्रा 1) के संरक्षण से आता है। इस पारंपरिक तैयारी में मामला अलग डीआरजी न्यूरॉन्स का उपयोग करता है नहीं है। सैटेलाइट glial कोशिकाओं व्यक्ति डीआरजी न्यूरॉन्स के आसपास के एक बाधा रूपों, और उनकी उपस्थिति इन न्यूरॉन्स 13 के मनोवैज्ञानिक वातावरण बनाए रखने के लिए आवश्यक है। के रूप में परिणाम में विख्यात इस द्वारा तैयार न्यूरॉन्स की electrophysiological गुण अलग कोशिकाओं का उपयोग अध्ययन से प्राप्त उन लोगों से अलग मतलब है।
इस तैयारी के लिए सबसे दिलचस्प भविष्य दिशाओं में से एक डीआरजी न्यूरॉन्स और उपग्रह glial कोशिकाओं के बीच crosstalk जांच करने के लिए है। तंत्रिका चोट के बाद, उदाहरण के लिए, उपग्रह glial कोशिकाओं टी दिखाया गया हैओ प्लास्टिक परिवर्तन, जो निकट दर्द व्यवहार कि 13-15,26 ensues से संबंधित हैं गुज़रना पड़ता है। बरकरार DRGs में उपग्रह glial कोशिकाओं के संरक्षण, निर्धारित करने के लिए कि क्या इस तरह ग्लूटामेट रिसेप्टर के रूप में ट्रांसमीटर रिसेप्टर्स, या एटीपी रिसेप्टर्स उपग्रह glial कोशिकाओं पर मौजूद हैं हमें सक्षम हो जाएगा और neuronal गतिविधि में बदलने के लिए वे किस तरह से प्रतिक्रिया। उपग्रह glial कोशिकाओं पट्टी और एक साथ न्यूरॉन उत्तेजक करके, उपग्रह glial कोशिकाओं एक जैविक संवेदक के रूप में कार्य और दिखाने के लिए पास के न्यूरॉन्स से ट्रांसमीटर जारी है कि क्या वहाँ कर सकते हैं। इसके अलावा, अक्षत डीआरजी तैयारी दोनों अभिवाही और अपवाही तंत्रिका जड़ों रहता है। यह बहुत उत्तेजक एक्सोन में प्रवेश करने या सक्शन इलेक्ट्रोड, जो इन विवो स्थिति को बेहतर ढंग से नकल हो जाएगा के साथ न्यूरॉन्स बाहर निकलने की संभावना को जोड़कर प्रयोगात्मक दायरे का विस्तार।
वहाँ वर्तमान तैयारी के लिए कुछ सीमाएं हैं। बाधा के अस्तित्व के लिए उपग्रह Gli द्वारा गठितअल कोशिकाओं, इसे और अधिक पैच न्यूरॉन्स के लिए कठिन बना देता है और एक पता है कि यह न्यूरॉन्स तक पहुँचने दवाओं की एकाग्रता सीमित कर सकता है किया जाना चाहिए। इसलिए, हमारी तैयारी में न्यूरॉन के लिए पहुँच प्राप्त करने के लिए यह सकारात्मक दबाव में पिपेट बनाए रखने के लिए उपग्रह glial कोशिकाओं की परत मर्मज्ञ सहायता करने के लिए महत्वपूर्ण है। एक और सीमा पृष्ठीय जड़ों और रीढ़ की हड्डी में तंत्रिकाओं आदेश डीआरजी काटना करने में कटौती करने के लिए किया है। इसलिए, यह पूरी तरह से अक्षतंतु बरकरार छोड़ने के लिए असंभव है। हालांकि, शेष अक्षतंतु की उपस्थिति पर विचार किया जाना चाहिए के रूप में परिधीय या केंद्रीय एक्सोन सोमा, जो संभावित रिकॉर्डिंग त्रुटि या हस्तक्षेप का कारण बन सकता है जब वोल्टेज दबाना आयोजित किया जाता है के रूप में एक ही वोल्टेज के clamped नहीं किया जा सकता है। इसके अलावा आदेश न्यूरॉन्स के अच्छे प्रदर्शन पाने के लिए, collagenase के साथ कोमल पाचन के लिए आवश्यक है और हालांकि इस अनुभव के साथ नियंत्रित किया जा सकता है, यह असंभव है पूरी तरह से पचाने के एंजाइम को जोखिम से न्यूरॉन्स की रक्षा के लिए। पारंपरिक घ के साथ तुलना मेंissociated डीआरजी न्यूरॉन्स, हालांकि, पूरे DRGs (30 मिनट के आसपास) तैयार करने के लिए तेजी से कर रहे हैं, कई अनुप्रयोगों और बारीकी विवो परिस्थितियों में mimics में इस्तेमाल किया जा सकता है।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pentobarbital sodium | vortech Pharmaceuticals | ||
| syringe | BD | 309659 | 1 ml, 5 ml. |
| scalpel | BD | size: 15 | |
| Mayo straight scissor | Fine Science Tools | 14010-15 | |
| Mayo curved scissor | Fine Science Tools | 14011-15 | |
| Rongeur | Fine Science Tools | 16021-14 | |
| Adson toothed forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Iris Scissor | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Noyes spring scissor | Fine Science Tools | 15124-12 | |
| Bone scissors | Fine Science Tools | 16044-10 | Special for cutting the bones. |
| Forceps: Dumont, Dumoxel Biologie #5 | Fine Science Tools | 11252-30 | These have the fine tips that do not need sharpening when first purchased. |
| periosteal elevator | Sklar | 97-0530 | |
| Dissection microscope | WILD | ||
| Transfer pipette | Fisher brand | 13-711-5AM | |
| Petri dish (10 cm) | Pyrex | Glass petri dish can avoid damaging the tips of fine forceps | |
| Collagenase (Liberase TM) | Roche | 05-401-119-001 | dissolve at the concentration of 13 U/ml, aliquot into glass pipette. Avoid repeated freeze and thaw. |
| filter | Thermo scientific | 7232520 | Filter the internal solutions for patch clamp recording to avoid clog. |
| Glass pipette | Sutter | BF150-110-7.5 | |
| Anchor | Havard apparatus | 64-0250 | stabilize the DRG to avoid drift. |
| Peristaltic pump | WPI | ||
| Pipette puller | Sutter | P97 | |
| Amplifier | Molecular devices | Axopatch 200B | |
| Digitizer | Molecular devices | 1440D | |
| Microscope | NIKON | FN600 | |
| Micro-manipulator | Sutter | MPC200 | |
| microinjection dispense system | General Valve | Picrospitzer II | fast drug application system |
| Carbogen (95% O2, 5% CO2) | Local Medical Gas supplier |
References
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