Abstract
dorsal kök ganglionlar yama kelepçe çalışmaları (DRG) nöronlar periferik sinir sisteminin anlayışımızı artmıştır. Şu anda, kayıtların çoğunluğu çoğu laboratuvarlar için standart bir hazırlık ayrışmış DRG nöronlar üzerinde yapılmaktadır. Nöronal özellikleri, yine de, ayrışmış nöronların elde kullanılan enzim sindiriminden elde edilen aksonal yaralanma değiştirilebilir. birincil duyu nöronları çevreleyen uydu glial hücreleri ile temas kaybı bu yöntemin kaçınılmaz bir sonuçtur çünkü Dahası, ayrışmış nöron hazırlıkları tam DRG mikro temsil edemez. Bu raporda, yama kelepçe kayıtları için geleneksel ayrışmış DRG nöronlarını kullanarak sınırlamaları aşmak için biz sağlam DRG'ler hazırlamak ve bireysel primer duyu nöronlar ex vivo yama kelepçe kayıtları yapmak için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yaklaşım içinde taklit, bozulmamış DRG'lerde hızlı ve basit hazırlık izinonların çevredeki uydu glial hücreler ve bazal membran ile ilişkili DRG nöronlarını tutarak koşulları vivo. Ayrıca, yöntem manipülasyon aksonal yaralanma önler ve bu tür DRG'ler dissociating olduğu gibi sindirim enzim. Ex vivo olarak preparat ek olarak birincil duyu nöronları ve uydu glial hücreler arasındaki etkileşimi incelemek için kullanılabilir.
Introduction
Duyum bir organizmanın hayatta kalması ve iyiliği için gereklidir. uyaranların iletimi birincil duyu nöronların akson periferal uçlarından başlayan duyu yollarıyla bağlıdır. Birincil duyu nöronları, trigeminal sinir mezensefalik çekirdeğin dışında, üçlü gangliyon ve dorsal kök ganglion (DRG) yer almaktadır. Bunlar duyusal bilginin 1 bekçisi olarak hizmet vermektedir. Perikarial membran, sadece santral ve periferal terminallerinde olduğu gibi, DRG nöronlar vb glutamat reseptörleri, TNF alfa reseptörleri, geçici reseptör potansiyeli katyon kanalı alt ailesi V üyesi 1 (TRPV1), sodyum kanallarının, 2 olarak reseptörler ve iyon kanallarını ifade -7. perikarial membran yama kelepçe kayıtları nöron boyunca bu reseptörlerin ve kanalların birçoğu fonksiyonel değişiklikleri anlamaya olanak sağlar.
yama kelepçe kayıt tekniği stu için güçlü bir araçtırkanal veya reseptörlerin ve çalışmaların çok sayıda faaliyetlerini ölen DRG nöronlar 8-10 bu tekniği uygulanarak yapılmıştır. Çalışmaların çoğunda DRG dorsal rootlets ve ganglion spinal sinir yakın kesilerek çıkarılır. Ufalamadan sonra ganglion daha sonra kayıttan önce birkaç gün hemen veya kültürlenmiş kaydedilebilir DRG nöronlarının, ayrışma neden sindirim enzimleri yerleştirilir. Ne yazık ki, DRG nöronlarının ayrışma perikaryada yakın gerekli Axotomy içerir. Bir kez ayrışmış ve axotomized, DRG nöronlar membran eksitabilite 11,12 fenotipik değişiklikler yanı sıra değişikliklere uğrarlar. Normalde onları çevreleyen bireysel nöronların perikaryada ve uydu glial hücreleri arasındaki temas kaybı bu değişikliklerden 13 katkıda muhtemeldir. nöronlar ve uydu glial hücreler arasındaki çapraz-karışma fizyolojik koşullarda önemli ve patholog adaptasyonda hemBöyle zorlu ağrı 14,15 lider gibi ical koşullar. Ayrışmış DRG hazırlık kullanarak nöronlar ve uydu glial hücreler arasındaki etkileşimi incelemek için zor olurdu.
Bozulmamış DRG Öte yandan, in vivo koşullarında daha yakın bulunur. Son birkaç yıl içinde, laboratuar, hem de başka bir grubu, kronik ağrı 3-5,11,15-17 ile bağlantılı farklı koşullarda birincil duyu nöronlarının değişiklikleri belirlemek amacıyla, yetişkin sıçanlardan sağlam DRG'ler kullanmaktadır. Bu çalışmalarda kullanılan teknikler biraz kurulmuş olmasına rağmen, bir adım-adım bir tanım yapılmamış yayımlanmamıştır. Mevcut yazıda, sağlam DRG'ler ve yama kelepçe kayıtları için kullanımını hazırlamak için uygun ve hızlı bir şekilde açıklanmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik Beyanı: Deney hayvanlarının bakım ve kullanımı için tüm işlemler Hayvan Araştırma UCSF Komitelerinin düzenlemelerine uyulur ve hayvan kullanımı ve bakımı (Yayın 85 NIH düzenlemeleri kurallarına uygun olarak yürütülmüştür - 23 1996 Revize ). UCSF Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi, bu çalışmada kullanılan protokoller onayladı.
Göstergeler, Çözümler ve Yemekleri 1. Hazırlık
- Yapay beyin omurilik sıvısı (CSF) hazırlayın.
- 10x Düşük katyon çözeltisi, 500 ml ve 10 x bikarbonat çözeltisi (çözelti hazırlanması için Tablo 1 ve 2'ye bakınız) 500 ml hazırlayın. Bir ay içinde 4 o C ve kullanım saklayın.
- bikarbonat çözeltisi, 60 ml 10x Düşük katyon çözeltisi 60 ml karıştırılarak taze aCSF 600 ml hazırlayın ve daha sonra, 600 ml'lik bir nihai hacim elde etmek için deiyonize su 480 ml ekle. Kabarcık aCSF karbojen ileKullanımdan önce en az 10 dakika süre ile (% 5 O2 ve% 95 CO2).
- Kılcal Camından Patch Pipet çekin.
- kayıt pipetler hazırlamak için bir pipet çektirmenin içine ince duvarlı kılcal cam yerleştirin.
Laboratuvarda, çektirmenin aşağıdaki ayar parametreleri ideal bir pipet şekli elde etmek için kullanılır: Not: Isı (510), hız (32). bozulmamış DRG kayıt için ideal bir pipet şekli, düşük koni açısına sahip bir kademeli ince konik olmalı, ve bu en iyi deneme yanılma yoluyla elde edilebilir. - İç çözümleri (çözüm hazırlanması için Tablo 3) ile dolu olduğunda pipet direnci 3-5 MQ olduğundan emin olun. Pipet direnci 18 ölçüm detaylı yöntemi Akson Kılavuzuna bakınız.
- kayıt pipetler hazırlamak için bir pipet çektirmenin içine ince duvarlı kılcal cam yerleştirin.
- 13 birim / ml bir nihai konsantrasyon vermek üzere, aCSF 400 ul kolajenaz 1 mg ekleyin. Daha sonra kolajenaz çözeltisi 20 ul ile her bir cam pipet doldurun. mağaza-20 o C dondurucuda dolu pipetler ve üç hafta içinde bunları kullanmak.
- Soğuk aCSF (yaklaşık 4 ° C) 200 ml hazırlayın. O dondurmak başlayana dek hızla aCSF serin bir beher içine yerleştirmek için, yaklaşık 20 dakika boyunca -20 o C dondurucuda plastik wrap ve yer ile mühür. 10 dakika karbojen bir buz banyosu ve kabarcık behere koyun. Kabarcık oda sıcaklığında karbojen ile aCSF 400 ml kalan.
- CSF soğurken 5 mm bir çapa açıklığı (bu DRG aktarmak için kullanılır) hali için bir plastik tek aktarım pipet ucu kesin. Aşağıdaki cerrahi aletler toplayın: neşter (# 15), Mayo düz ve eğimli makas, ince 2 mm uç rongeur, Adson (dişli) forseps, iris makas, yaylı makas ve iki ince forseps. 3 cam petri içine oksijenli soğuk aCSF (: 10 cm Dış çap) dökün.
2. DRG Diseksiyon
- sodyum pe ile bir sıçan (200-220 gr) uyutmakntobarbital (100 mg / kg, ip) ve anestezi düzeyi pedal refleks ve göz kırpma refleksi test ederek yeterli olduğunu doğrulayın.
- sıçan anestezi olduğunu doğruladıktan sonra, bel alanı tıraş ve orta hat boyunca deri ve deri altı doku insizyon. ince periost Asansör kullanarak L1-S2 düzeyinde spinöz süreçlerden paraspinal kasları ayırın.
- S2'ye L1 spinöz süreçleri kesmek için kavisli makas kullanın. 2-3 dakika boyunca (adım 1.5 hazırlanmış) maruz vertebra yaklaşık L1 ve S1 enine kesimler yapmak ve en blok vertebral kolonun bu segmenti kaldırmak ve hızlı bir şekilde soğuk aCSF içine daldırın düz Mayo makas kullanın. Sıçan derin pentobarbital anestezisi altında iken lomber DRG'lerde çıkarılmasının ardından, ötenazi ikili torakotomi tarafından yürütülmektedir.
- Kaldırılan vertebral kolon kan ve bağlı doku kapalı yıkayın ve soğuk aCSF ile bir petri transfer. Ulaminalar kaldırmak için iyi bir rongeur se. omurilik maruz microscissors orta hat boyunca dura mater kesin. Yavaşça omuriliği kaldırın ve iris makas kullanarak omurilik kendi giriş noktasında sinir kökleri kesmek, daha sonra omurilik çıkarın.
- Soğuk aCSF ile dolu ikinci petri DRG'li kalan omur aktarın. L4 ve enine süreçler ve siyatik sinir göreceli konumuna göre L5 DRG'ler tanımlayın.
Not: sağlam siyatik siniri bakımı L4 ve L5 DRG (siyatik sinir L4-6 spinal sinirlerden kaynaklanan) tanımlamak için yardımcı olacaktır. - çevreleyen bağ dokulardan DRG'ler boşaltmak için Dumont forseps ve Noyes makas kullanın. DRG'lerde bağlı sinir kökü ve omurilik sinir tutun.
- Daha fazla diseksiyon için üçüncü bir petri içine DRG'ler taşımak için transfer pipet kullanın.
- diseksiyon mikroskobu altında dikkatlice epinöriyuma çevreleyen th mümkün olduğu kadar ortadan kaldırmake DRG.
- dorsal ve ventral kökleri DRG katılmak ve DRG ventral kök ayrı bir açılış kesmek için Noyes yaylı makas kullanın. epinöriyum tutmak için Dumont # künt ipuçları ile 5 forseps kullanabilir ve epinöriumun gelen DRG rulo başka ince forseps kullanabilir.
- ince forseps kullanarak DRG'lerde olarak çok epinöriumun mümkün olduğunca bağlı kaldırmak için devam edin.
Not: iyi parçalara DRG sonraki aşamada iyi bir sindirim edinmek önemlidir.
3. DRG Sindirim
- kayıt odasına DRG aktarın. sinir kökleri aşağı yüzleri köken DRG emin tarafını olun.
Not: Bu şekilde, çok nöronlar erişilebilir. - DRG stabilize bir çapa kullanın. Kayıt teçhizat yanındaki bir masa üzerine yerleştirilir, bir peristaltik pompa ile bağlantılı plastik tüpler aracılığıyla, 0.5 ml / dk'lık bir oranda oksijenli ACSF perfüze DRG.
- Hücreler geri izin 30 dakika bekleyin. CCD kamera aracılığıyla 40X objektif büyütme kızılötesi diferansiyel arayüzü kontrast altında DRG kalitesini (IR-DIC) optik değerlendirin.
Not: İyi DRG genellikle birçok yuvarlak, iyi tezat, yüzeyinde uydu glial hücrelerin çevrili nöronlar içerir. - DRG yüzeyinde küçük bir alanda sindiremez.
Not: Cam yama pipetler boru hava geçirmez bir mühür ile cam pipet bağlı izin küçük kaplinlerdir pipet sahipleri, yerleştirilir.- Bireysel küçük çaplı kauçuk tüp iki adet aracılığıyla pipet sahiplerine iki 1 ml'lik şırınga bağlayın. pipet sahiplerinin birinin diğeri içine boş bir cam pipet içine kollajenaz ile dolu bir cam pipet koyun.
- Sadece DRG üzerinde pipetler konumlandırmak için Mikromanipülatör kullanın. Sonra, mikroskop büyütme altında, 5- İdeal bir çap pipet uçları (açıklıklar büyütmek için hafifçe birbirine karşı iki pipetler ipuçları çarpışır10 mikron).
- tutucu ve piston yaklaşık 0.5 ml yerinden şırıngayı bağlayan tüp aracılığıyla pipet içeren kollajenaz pozitif basınç uygulayın kısaca yakın DRG yüzeyine enzim dolu pipet hareket ettirin.
Not: baskısı altında, pipetle enzimin akışını biraz enzim uygulaması için işareti olarak hizmet verebilir DRG nöronlar arasındaki boşluk büyütmek olacaktır. - 10 ila 15 dakika sonra, kalan epinöriumun enkaz gözlendiğinde, enkaz emmek için boş pipet nazik negatif basınç uygulayın.
Not: Bu şekilde, nöronlar ve çevresindeki uydu glial hücreler açık maruz kalacağı ve yama kayıt için hazırdır. - kesici kabına iki pipetler atın.
4. Patch Kelepçe Kayıtlar
- Bozulmasını önlemek için buz üzerinde, elektrot çözeltisi (bakınız Tablo 3) yerleştirin. cam yama pipet doldurunsüzülmüş hücre içi çözeltisi (şırınga filtresi, gözenek boyutu: 0.2 um) ve headstage pipet tutucu pipet yerleştirin. banyo çözeltisi içine pipet indirmeden önce 1 ml ilgili pistonu yerinden bir 5 ml şırınga yoluyla pipet nazik bir pozitif basınç uygulayın.
Not: Bu taåmadan pipet engeller. - Daha sonra yazılımı "Membran testi" arayüzü açık, amplifikatör mod düğmesini çevirerek "V-kelepçe" modunu seçin. mikroskop denetiminde hedef nöron yakın pipet hareket ettirin.
Not: sağlam TİG hazırlık olarak, uydu glial hücrelerin ince bir tabaka her nöron kapsüller. - görülmektedir nöron ve uydu glial hücre çevreleyen tabaka arasındaki boşluk ani bir genişleme kadar uydu glial hücre katmanı geçiş yapmak için pipet pozitif basınç uygulayın. Bir "gamze" nöron gözlenen kadar nöron doğru pipet hareket tutun.
Not: ile karşılaştırıldığındailişkisiz nöronların kayıtları, pozitif basınç uydu glial hücre tabakası nüfuz ve başarılı yama için şansını artırmak için yardımcı olacak, biraz daha büyük olması gerekir. - pozitif basınç azaltın. Sonraki, nazik vakum ile bir giga ohm mühür elde.
Not: Bu yöntemde, kayıt başarı oranı en az 70% 'dir. - Daha önce 19 açıklandığı gibi tüm hücre kayıt yapılandırmasını alın.
- Kısaca, bir kısa ama güçlü emme yoluyla nöron hücre zarı nüfuz. emme uygulanırken Alternatif olarak, amplifikatör "zap" işlevini kullanın.
- bir bütün hücre modu kurulduktan sonra, amplifikatör kapasitans ve direnç tazminat düğmeleri çevirerek tüm hücre kapasitans ve seri direnç (Rs) telafi.
Not: Rs normalde 5-20 MQ olduğunu. - Rs başlangıçta 30'dan MQ ise hücreyi terk; kayıt sırasında% 20'den fazla ya da Rs değişir. Ayrıcaistirahat membran potansiyeli ölçmek; istirahat membran potansiyeli mV fazla -50 ise bir hücreyi terk.
- "Membran testi" penceresini kapatın. amplifikatör mod düğmesini çevirerek "Ben-kelepçe normal" modunu seçin.
- , Yazılımda "açık protokolü" tıklayın seçin ve rheobase ölçmek için protokol yükleyin. Kaydı başlatmak için "kayıt" tıklayın. giriş direncini ölçün ve 100 pA adımlarla akımları depolarizan kademeli bir dizi enjekte edilerek nöronal uyarılabilirliği incelemek rheobase.
- Yine "açık protokolü" tıklayın ve membran eşik ölçmek için protokol seçin. rampa akımı (2.000 pA / s) depolarize edici bir 500 ms nöron enjekte edilecektir.
- Üreticinin talimatlarına göre kaydedilen izleri analiz etmek için veri toplama ve analiz yazılımı (örneğin Clampfit) kullanın. Kararlı durum IV relat temelinde giriş direnci (Rin) hesaplamak için yazılımı kullanınteslim hiperpolarizan akımlar sırasında ionship. rheobase ve membran eşik değerini ölçmek için imleci hareket ettirin.
Not: AP oluşturmak için gereken akım genliği rheobase olarak tanımlanır ve AP indüklemek için en düşük voltaj membran eşik olarak tanımlanır.
- Ligand Kaynaklı Currents kaydedin.
- Belirli agonistleri ile bir pipet doldurun.
Not: Mevcut yazıda, sırasıyla glutamat reseptörleri ve TRPA1 reseptörlerinin aracılık ettiği akımları ikna etmek için 100 mcM glutamat ve 100 uM AITC kullanılır. - içinde hiç hava kabarcığı olmadığından emin olmak için pipet kontrol edin. pipet tutucu pipet yerleştirin. ilaç tevzi sistemine bağlanmış bir boru ile pipet tutucu bağlayın.
- nöronun 50 mikron içinde pipet hareket etmek manipülatör kullanın. 1 psi ilaç dağıtım sistem basıncını ve 1 sn süresini ayarlayın. gerilim kelepçe kayıt moduna geçmek ve -70 mV kelepçe. Kısaca bir ilaca bağlı akımı kaydetmek için ilaç dağıtım sistemi üzerinden basınç uygulayın.
- Belirli agonistleri ile bir pipet doldurun.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1 yama kayıt için sağlam DRG hazırlama sürecini göstermektedir. Şekil 1A laminektomi. Figure1B sonra ganglionlar maruz kalmasını ve konumunu omuriliği çıkardıktan sonra ekli sinir kökleri ile L3, L4 ve L5 DRG'ler gösterir gösterir. Sonra L4 ve 5 DRG dikkatle disseke ve omurları kurtulmuş oldular. Sonraki, epinöriyuma, DRG çevreleyen şeffaf bir zar, (sarı ok, Şekil 1D) çıkarılır. Epinöriyum ayırmak için en iyi yer dorsal ve ventral kökleri DRG de katılmak sitesi aracılığıyla olduğu Şekil 1D siyah okla gösterildiği gibi. Epinöriyum soyulması sonra, ventral kök dorsal rootlets bırakarak çıkarılır ve atılır Şekil 1E 'de gösterildiği gibi, spinal sinir ve DRG. kolajenaz ile sindirim nöronlar ve uydu hücreleri, T maruz kalan epinöriyum kaldırırşapka (Şekil 1F) onları kuşatır.
DRG hazırlık tamamladıktan sonra, küçük çaplı DRG nöron eksitabilite- rheobase ve membran eşik ölçerek incelenmiştir. Şekil 2A'da gösterildiği gibi, rheobase 260 pA. Şekil 2B, bu yöntemle ölçülen membran eşik değerleri görülebilir. AP uyarılmış kadar artan akım ile, zar sürekli depolarize edilir. Bu örnekte membran eşik (AP uyarılmış edildiği potansiyeli) -11,9 mV. Bu nedenle, nöronlar ve uydu glial hücreler arasındaki ilişkiyi sürdürmek, bizim hazırlanması in vivo duruma daha yakındır. Bizim sonuçlara dayanarak, küçük DRG nöronlar kaydedilen rheobase yaklaşık 300 pA ve giriş direnci 451.3 ± 27.3 M? olduğunu. Her ikisi de yüksek düşündüren, (150 pA ve 635 M? Civarında) ayrışmış nöronlar ölçülen olanlarla karşılaştırıldığındaBu ayrılma DRG nöronlarının 11 uyarılabilirliğini artmıştır.
Bu preparasyon ile, aynı zamanda, glutamat reseptörleri, sırasıyla geçici reseptör potansiyel katyon kanal parçası A1 (TRPA1) için agonistleridir glutamat ve alil izotiosiyanat (AITC) ile indüklenen içeri doğru akımlar ölçülebilir. Bu ligandların neden içeri doğru akımların amplitüdü. Nöronlarda dağıtılmış reseptörlerinin sayısını yansıtmaktadır 3A glutamat 1 sn puf (1 mm) ile indüklenen, küçük çaplı DRG nöron içe doğru akım göstermektedir olacaktır. Glutamat DRG glutamat alıcıları tarafından aracılık edilen akım teyit ölçüde NMDA reseptör antagonisti APV ve AMPA / kainat reseptör antagonistleri CNKX (veriler gösterilmemiştir) birlikte uygulanması ile bloke edilebilir içe doğru bir akım (198 pA), indüklenen nöronlar. Bu veriler DRG nöronlar üzerinde fonksiyonel glutamat reseptörleri olduğunu kurdu. neŞekil 3B'de gösterilen uron alil izotiyosiyanat (AITC, 100 uM), seçici bir TRPA1 agonisti 1 sn puf uygulanmasıyla elde içeri doğru akımlar (260 pA) göstermiştir. içeri doğru akımı, seçici TRPA1 antagonisti 10 uM HC 030.031 tarafından engellendi akımları teyit (veriler gösterilmemiştir) TRPA1 alıcıları tarafından aracılık edilen ve DRG nöronları üzerindeki TRPA1 reseptörlerinin varlığı kurar edildi.
Şekil 1: bozulmamış DRG'ler Hazırlanması laminektomi sonrası omurilik ve DRG'ler segmentasyonu (A) Poz.. sağdan sola oklar sırasıyla L3-5 DRG'ler göstermektedir. Ölçek çubuğu = 1 cm. Omurilik çıkarılmasından sonra L3, L4, L5 DRG'ler ve bağlı sinir köklerine (B) maruz bırakma. Oklar sağdan sola L3, L4, L5 ve DRG'ler gösterir. Ölçek çubuğu = 1 cm. (C) Intaomurilik disseke edildikten sonra bağlı sinir kökleri ile ct DRG. Oklar sağdan sola L4 ve L5 DRG'ler gösterir. Ölçek çubuğu = 1 cm. (D) bağlı epinöriumun ile bozulmamış DRG. Bu resimde, epinöriyuma bozulmamış ve sarı ok Dumont forseps tarafından tutulan yarı saydam epinöriyum gösterir. siyah ok epinöriyum kalkmasına iyi bir başlangıç noktası olarak hizmet dorsal kök ve ventral kök, oluşan kavşak gösterir. Ölçek çubuğu = 1 mm. (E) epinöriyum ve ventral kök sonra ekli dorsal kök aynı DRG kaldırıldı. Ölçek çubuğu = 1 mm. Kolajenaz ile yumuşatıldıktan sonra DRG (F) Kızılötesi mikroskop ve görüntüler. Küçük ve orta ölçekli nöronlar görebilir. Bir uydu glial hücre (sarı ok) Bir nöron (yıldız) çevreleyen görülebilir. pipet kırmızı ok işaret eder. Ölçek çubuğu 10 mikron =. (G) Kayıt ekipmanları yapılandırması. siyah oklar inci gösterire pipet sahipleri. Sol bir ilaç dolu pipet tutar ve kayıt pipet sağda. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2:. Mevcut Baskılı modu (A) Rheobase Nöronal uyarılabilirliğinin ölçüm DRG nöron (üst panel) halinde akımlar, bir dizi enjeksiyon ile ölçülmüştür. alt panelde okla gösterildiği gibi bir eylem potansiyelini indükleyebilir düşük akım yoğunluğu,, rheobase olarak tanımlanır. Bu nöron için rheobase 300 pA olduğunu. (B). Membran eşik rampa akımı enjekte edilmesi ile ölçüldü. bir eylem potansiyeli uyarılmış zaman üst panel de kesikli çizgi ile işaretlenmiş gibi potansiyel, membran eşik olarak tanımlanır.Bu nöron için membran eşik -11,9 mV. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3: Küçük DRG Nöronlar Ligand Başlatılan Akımlar 1 saniye glutamat puf uygulaması (1 mM) ya da alil izotiosiyanat (TRPA1 agonisti, AITC, 100 uM) tarafından uyarılan akımlar.. Her iki agonistler, küçük DRG nöronları üzerinde glutamat reseptörleri ve TRPA1 reseptörlerinin varlığını düşündürmektedir içeri doğru akımlar indükledi. Glutamat uygulaması 198 Pa (A) 'nın içe doğru akım indüklenen ve AITC 260 Pa (B)' nin içe doğru akım neden olmuştur. Nöronlar -70 mV olarak sıkıştırılır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. </ P>
| 10x düşük katyonik stokunun 2 litre | |||
| Nihai konsantrasyon (mM) | Bileşen | MW | Ağırlık (g) |
| 3 | KCI | 74.6 | |
| 11 | glikoz | 180.2 | |
| 123 | NaCI | 58.4 | |
| 1.25 | NaH 2 PO 4 * H 2 O | 138 | |
| 1 | MgCI2 * 6H 2 O | 203,3 | |
| 2 | CaCl2 * 2H 2 O | 147 | |
tablo 1
| 10x bikarbonat Stokta 1 litre | |||
| Nihai konsantrasyon (mM) | Bileşen | MW | Ağırlık (g) |
| 26 | NaHCO 3 | 84,01 | 21.84 |
Tablo 2
| hücre içi çözelti 100 mi | |||
| Konsantrasyon (mM) | Bileşen | MW | g |
| 130 | Kglikonat | 234,24 | |
| 10 | KCI | 74,55 | |
| 10 | HEPES | 238,3 | |
| 10 EGTA | |||
| 2 | MgCI2 * 6H 2 O | 203,3 | |
| Notlar: - sukroz ve damıtılmış su ile 280 mOsm ile 260 KOH ile pH 7.4 ve osmolarite ayarlayın. Hemen kullanımdan önce 2 mM MgATP, 0.5 mM Na 2 GTP ve filtre ekleyin. | |||
Tablo 3
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu yama kelepçe çalışmaları için bütün DRG'ler hazırlamak için bir yöntem sunulmaktadır. İdeal numune hazırlamak için birkaç önemli unsur vardır. İlk olarak, ekteki dorsal kökleri DRG'ler incelemek için önemlidir. Bundan sonra, epinöriyuma nöronların zarar gelmesini de önler dikkatli bir şekilde çıkarılması gereklidir. Son olarak, nöronlar ve çevreleyen uydu glial hücreler ortaya çıkarmak için, kalan bağ dokusu sindirimi gereklidir. Burada tarif edilen yöntem ile hazırlanan yetişkin farelerin bozulmamış DRG'ler 6 ila 8 saat boyunca iyi bir canlılığını korumak ve kararlı bir şekilde, bu süre içinde kaydedilebilir. Bu nöronların veya uydu glia hücreleri veya DRG nöronlarının uyarılmış yanıtları yama kelepçe kayıtları içeren DRG'ler birçok farklı çalışmaları için kullanılabilir.
Diseksiyon işlemi sırasında, hızla DRG incelemek ve nöronal metabolizmayı yavaşlatmak için düşük bir sıcaklıkta (4 o C) tutmak için önemlidir ve dolayısıyla canlılığı muhafaza eder. t sırasındaTİG'lerin o diseksiyonu, bir dorsal germe kaçınması veya spinal sinirler DRG'ler girme. Bu hazırlık bir diğer önemli adım DRG çevreleyen epinöriumun çıkarılmasıdır. epinöriyuma nüfuz zor olduğundan, DRG üzerinde kalan epinöriyuma nöronları ulaşmasını yama pipetler önleyecektir. kollajenaz uygulaması başarılı hazırlıkları için önemli bir adımdır. Kolajenaz, kalan epinöriyum sindirimi ve başarılı yama için kritik olan, her ikisi de aynı anda hücre yüzeyi temiz olacaktır. doku aşırı sindirim önlemek için, üç faktör göz önünde bulundurulması gerekir. İlk olarak, kolajenaz çeşitli şekillerde gelir; Bizim öneri Malzemelerin Tabloya bakınız, şu anda kullanılan bir nedenle aşırı sindirimi kaçınarak, güçlü ama nazik olduğunu. İkinci olarak, enzim kayıt alanı dışında enzimin dağıtıcı önlemek için hafif bir basınçta teslim edilmelidir. Bir 0.5 ml uygulanması üretilen basınç buldukBir 1ml şırınga dışında ir yeterlidir. Üçüncü olarak, kollajenaz için en iyi konsantrasyon aralığı 10-13 ünite / ml arasındadır. daha düşük konsantrasyonlarda, bir gereksiz yere uzun zaman sindirim içerirken yüksek konsantrasyonlarda, aşırı sindirim ve doku hızlı bozulmaya neden olabilir. Bizim tecrübelerimize göre, ml 13 adet / bir konsantrasyon ve sindirim süresi yaklaşık 15 dakika iyi sonuçlar üretir. enzim uygulandıktan sonra DRG çevreleyen kalan epinöriyuma gevşek olması gerektiğini, ve uzak hafif bir emme ile silinebilir. Kollajenaz nedenle, bir kez enzim çözeltisi kısma bölünmüş ve 3 hafta içinde kullanılmalıdır seyreltildi donma-çözülme döngüleri tekrar duyarlıdır.
Zhang ve arkadaşları bozulmamış DRG'lerde yama kelepçe kayıt için bir yöntem tanımlamak için ilk idi. DRG daha kolay bir avantaja sahiptir kullandıkları sıçanlar, ancak çok gençtik (10-15 gün doğum sonrası) 20 onlar daha ince epi var göz önüne alındığında hazırlamak içinneurium ve artan canlılığı sahiptir. DRG'ler neonatal sıçanların Ancak, proteinler ve TRPV1 ve NaV1.8 gibi iyon kanallarının ekspresyon Yetişkin farelerin 21,22 arasında farklılık dezavantajına sahiptir. Ayrıca, davranışsal ve farmakolojik çalışmalar genellikle erişkin sıçanlarda yapılmaktadır. Böylece burada ayrıntılı kayıt yöntemi yetişkin hayvanlarda elektrofizyolojik ve davranış arasında bir korelasyon yapılmasını sağlar. Bir hazırlık olarak bozulmamış arka kök ganglionlar kullanımı ex vivo son zamanlarda 15-17,23,24 arttı ve bazı çalışmalar in vivo kayıtları 25 kullandığım yama kelepçe kayıtları yapmak. Ex vivo kayıtların çoğu etrafında 30-60 dakika süreyle enzim kokteyl içine bütün DRG kuluçkaya alarak DRG nöronlarını maruz kalmaktadır. Bu yöntem daha nöronları üretirken, bunun aşırı sindirim yüzeysel katmanları nöronların bir riski vardır. Bizim yöntem eski izlemek için görsel kontrol kullanılarak aşırı sindirim olasılığını en aza indirirsindirim çadır, in vivo kayıtları 25 Ma ve diğerleri tarafından kullanılan bir yönteme ilişkindir.
Ayrışmış DRG nöronları ile karşılaştırıldığında, sağlam DRG hazırlama avantajlarından biri nöronlar ve uydu glial hücreler (Şekil 1), her iki muhafaza gelir. Bu ayrışmış DRG nöronlarını kullanan geleneksel hazırlıklar söz konusu değildir. Uydu glial hücreleri bireysel DRG nöronlarını çevreleyen bir engel oluşturur ve bunların varlığı bu nöronların 13 fizyolojik ortamı muhafaza etmek için gereklidir. Sonuçlar belirtildiği gibi, bu hazırlanan nöron elektrofizyolojik özellikleri ayrışmış hücreler kullanılarak çalışmalar ile elde edilen farklı demektir.
Bu hazırlık için en ilginç gelecek yönlerinden biri DRG nöronlar ve uydu glial hücreler arasındaki karışma araştırmaktır. sinir hasarı sonra, örneğin, uydu, glial hücreler, T gösterilmiştiro yakından 13-15,26 ensues ağrı davranışı ile ilgili plastik değişiklikler, tabi. sağlam DRG'lerde uydu glial hücrelerin korunması, örneğin glutamat reseptörü olarak verici reseptörleri veya ATP reseptörleri uydu glial hücreler üzerinde mevcut olup olmadığını belirlemek için bize sağlayacak ve onlar nasıl tepki nöronal aktivitenin değiştirmek. Uydu glial hücreler yama ve eş zamanlı olarak nöron uyararak, uydu glial hücreler biyolojik sensör olarak hareket eder ve yakın nöronlardan verici sürümü olup olmadığını gösterebilir. Ayrıca, bozulmamış DRG hazırlama afferent ve efferent sinir kökleri hem tutar. Bu büyük ölçüde aksonlar uyarıcı girerek veya in vivo durumun daha iyi taklit olacağını emme elektrodu ile nöronların çıkarken olasılığını ekleyerek deneysel kapsamını genişletir.
Geçerli hazırlık için bazı sınırlamalar vardır. Uydu GLI oluşturduğu bariyer varlığıal hücreleri, yama nöronlar daha zor hale getirir ve bir o nöronların ulaşan ilaçların konsantrasyonunu sınırlayabilir farkında olmalıdır. Nedenle, uydu glial hücreler katmanından nüfuz ederek yardımcı olmak için pozitif bir basınç altında pipet muhafaza etmek önemlidir eden hazırlanmasında nöron erişmek için. Başka bir sınırlama dorsal kökler ve spinal sinirleri DRG teşrih için kesilecek olması. Bu nedenle, tamamen sağlam akson bırakmak mümkün değildir. Periferik veya merkezi aksonlar voltaj kenetleme yürütüldüğünde, potansiyel kayıt hatası veya etkileşime neden olabilir soma aynı gerilime kenetlenmiş olabilir Ancak, geri kalan akson varlığı kabul edilmelidir. Ayrıca nöron iyi etkiyi elde etmek için, kollajenaz ile hafif bir sindirim 'gerekli olan ve bu yolla kontrol edilebilir, ancak tamamen sindirici enzim maruz nöronları korumak için mümkün değildir. Geleneksel d karşılaştırıldığındaissociated DRG nöronları, ancak, bütün DRG (30 dakika civarında) hazırlamak için daha hızlı, birçok uygulama ve in vivo koşullarında yakın taklit kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pentobarbital sodium | vortech Pharmaceuticals | ||
| syringe | BD | 309659 | 1 ml, 5 ml. |
| scalpel | BD | size: 15 | |
| Mayo straight scissor | Fine Science Tools | 14010-15 | |
| Mayo curved scissor | Fine Science Tools | 14011-15 | |
| Rongeur | Fine Science Tools | 16021-14 | |
| Adson toothed forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Iris Scissor | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Noyes spring scissor | Fine Science Tools | 15124-12 | |
| Bone scissors | Fine Science Tools | 16044-10 | Special for cutting the bones. |
| Forceps: Dumont, Dumoxel Biologie #5 | Fine Science Tools | 11252-30 | These have the fine tips that do not need sharpening when first purchased. |
| periosteal elevator | Sklar | 97-0530 | |
| Dissection microscope | WILD | ||
| Transfer pipette | Fisher brand | 13-711-5AM | |
| Petri dish (10 cm) | Pyrex | Glass petri dish can avoid damaging the tips of fine forceps | |
| Collagenase (Liberase TM) | Roche | 05-401-119-001 | dissolve at the concentration of 13 U/ml, aliquot into glass pipette. Avoid repeated freeze and thaw. |
| filter | Thermo scientific | 7232520 | Filter the internal solutions for patch clamp recording to avoid clog. |
| Glass pipette | Sutter | BF150-110-7.5 | |
| Anchor | Havard apparatus | 64-0250 | stabilize the DRG to avoid drift. |
| Peristaltic pump | WPI | ||
| Pipette puller | Sutter | P97 | |
| Amplifier | Molecular devices | Axopatch 200B | |
| Digitizer | Molecular devices | 1440D | |
| Microscope | NIKON | FN600 | |
| Micro-manipulator | Sutter | MPC200 | |
| microinjection dispense system | General Valve | Picrospitzer II | fast drug application system |
| Carbogen (95% O2, 5% CO2) | Local Medical Gas supplier |
References
- Basbaum, A. I., Bautista, D. M., Scherrer, G., Julius, D. Cellular and molecular mechanisms of pain. Cell. 139, 267-284 (2009).
- Caterina, M. J., et al. The capsaicin receptor: a heat-activated ion channel in the pain pathway. Nature. 389, 816-824 (1997).
- Gong, K., Bhargava, A., Jasmin, L. GluN2B N-methyl-D-aspartate receptor and excitatory amino acid transporter 3 are upregulated in primary sensory neurons after 7 days of morphine administration in rats: implication for opiate-induced hyperalgesia. Pain. 157, 147-158 (2016).
- Gong, K., Kung, L. H., Magni, G., Bhargava, A., Jasmin, L. Increased response to glutamate in small diameter dorsal root ganglion neurons after sciatic nerve injury. PloS one. 9, 95491 (2014).
- Gong, K., Zou, X., Fuchs, P. N., Lin, Q. Minocycline inhibits neurogenic inflammation by blocking the effects of tumor necrosis factor-alpha. Clin Exp Pharmacol Physiol. , (2015).
- Ohtori, S., Takahashi, K., Moriya, H., Myers, R. R. TNF-alpha and TNF-alpha receptor type 1 upregulation in glia and neurons after peripheral nerve injury: studies in murine DRG and spinal cord. Spine. 29, 1082-1088 (2004).
- Waxman, S. G., Cummins, T. R., Dib-Hajj, S., Fjell, J., Black, J. A. Sodium channels, excitability of primary sensory neurons, and the molecular basis of pain. Muscle nerve. 22, 1177-1187 (1999).
- Zhang, J. M., Song, X. J., LaMotte, R. H. Enhanced excitability of sensory neurons in rats with cutaneous hyperalgesia produced by chronic compression of the dorsal root ganglion. J Neurophysiol. 82, 3359-3366 (1999).
- Dib-Hajj, S. D., et al. Plasticity of sodium channel expression in DRG neurons in the chronic constriction injury model of neuropathic pain. Pain. 83, 591-600 (1999).
- Cummins, T. R., et al. A novel persistent tetrodotoxin-resistant sodium current in SNS-null and wild-type small primary sensory neurons. J Neurosci. 19, RC43 (1999).
- Zheng, J. H., Walters, E. T., Song, X. J. Dissociation of dorsal root ganglion neurons induces hyperexcitability that is maintained by increased responsiveness to cAMP and cGMP. J Neurophysiol. 97, 15-25 (2007).
- Schoenen, J., Delree, P., Leprince, P., Moonen, G. Neurotransmitter phenotype plasticity in cultured dissociated adult rat dorsal root ganglia: an immunocytochemical study. J Neurosci Res. 22, 473-487 (1989).
- Hanani, M. Satellite glial cells: more than just 'rings around the neuron'. Neuron Glia Biol. 6, 1-2 (2010).
- Takeda, M., Nasu, M., Kanazawa, T., Shimazu, Y. Activation of GABA(B) receptors potentiates inward rectifying potassium currents in satellite glial cells from rat trigeminal ganglia: in vivo patch-clamp analysis. Neuroscience. 288, 51-58 (2015).
- Zhang, H., et al. Altered functional properties of satellite glial cells in compressed spinal ganglia. Glia. 57, 1588-1599 (2009).
- Fan, N., Donnelly, D. F., LaMotte, R. H. Chronic compression of mouse dorsal root ganglion alters voltage-gated sodium and potassium currents in medium-sized dorsal root ganglion neurons. J Neurophysiol. 106, 3067-3072 (2011).
- Fan, N., Sikand, P., Donnelly, D. F., Ma, C., Lamotte, R. H. Increased Na+ and K+ currents in small mouse dorsal root ganglion neurons after ganglion compression. J Neurophysiol. 106, 211-218 (2011).
- The Axon Guide. Sherman-Gold, R. , Axon Instruments. Foster City, CA. (2008).
- Cummins, T. R., Rush, A. M., Estacion, M., Dib-Hajj, S. D., Waxman, S. G. Voltage-clamp and current-clamp recordings from mammalian DRG neurons. Nat Protoc. 4, 1103-1112 (2009).
- Zhang, J. M., Donnelly, D. F., LaMotte, R. H. Patch clamp recording from the intact dorsal root ganglion. J Neurosci Methods. 79, 97-103 (1998).
- Benn, S. C., Costigan, M., Tate, S., Fitzgerald, M., Woolf, C. J. Developmental expression of the TTX-resistant voltage-gated sodium channels Nav1.8 (SNS) and Nav1.9 (SNS2) in primary sensory neurons. J Neurosci. 21, 6077-6085 (2001).
- Funakoshi, K., et al. Differential development of TRPV1-expressing sensory nerves in peripheral organs. Cell Tissue Res. 323, 27-41 (2006).
- Hayar, A., Gu, C., Al-Chaer, E. D. An improved method for patch clamp recording and calcium imaging of neurons in the intact dorsal root ganglion in rats. J Neurosci Methods. 173, 74-82 (2008).
- Yagi, J., Sumino, R. Inhibition of a hyperpolarization-activated current by clonidine in rat dorsal root ganglion neurons. J Neurophysiol. 80, 1094-1104 (1998).
- Ma, C., Donnelly, D. F., LaMotte, R. H. In vivo visualization and functional characterization of primary somatic neurons. J Neurosci Methods. 191, 60-65 (2010).
- Vit, J. P., Jasmin, L., Bhargava, A., Ohara, P. T. Satellite glial cells in the trigeminal ganglion as a determinant of orofacial neuropathic pain. Neuron Glia Biol. 2, 247-257 (2006).
