Abstract
دراسات المشبك التصحيح من العقد الجذرية الظهرية (DRGs) الخلايا العصبية زادت فهمنا للنظام العصبي المحيطي. حاليا، تجري معظم التسجيلات على الخلايا العصبية DRG فصل، وهو إعداد القياسي لمعظم المختبرات. خصائص الخلايا العصبية، ومع ذلك، يمكن أن تتغير من إصابة محور عصبي الناتجة عن الهضم انزيم المستخدمة في الحصول على الخلايا العصبية فصلها. وعلاوة على ذلك، يمكن أن الاستعدادات الخلايا العصبية نأت لا تمثل تماما المكروية من DRG منذ فقدان الاتصال مع الخلايا الدبقية الأقمار الصناعية التي تحيط الخلايا العصبية الحسية الأولية هي نتيجة لا مفر من هذا الأسلوب. للتغلب على القيود في استخدام الخلايا العصبية DRG فصل التقليدية للتسجيلات المشبك التصحيح، في هذا التقرير ونحن تصف طريقة لإعداد DRGs سليمة وإجراء التسجيلات المشبك التصحيح على الفردية الخلايا العصبية الحسية الأولية المجراة سابقا. يسمح هذا النهج إعداد سريع ومباشر من DRGs سليمة، ومحاكاة فيفيفو الشروط عن طريق الحفاظ على الخلايا العصبية DRG المرتبطة خلاياها الدبقية الأقمار الصناعية المحيطة والغشاء القاعدي. وعلاوة على ذلك، فإن الطريقة يتجنب إصابة محور عصبي من التلاعب وانزيم الهضم مثل عندما النأي DRGs. بالإضافة إلى ذلك يمكن إعداد هذا المجراة سابقا أن تستخدم لدراسة التفاعل بين الخلايا العصبية الحسية الأولية والخلايا الدبقية الأقمار الصناعية.
Introduction
الإحساس هو ضروري لبقاء الكائن الحي والرفاه. نقل المحفزات يعتمد على المسارات الحسية ابتداء من النهايات الطرفية من المحاور من الخلايا العصبية الحسية الأولية. الخلايا العصبية الحسية الأولية، مع استثناء من نواة الدماغ المتوسط للعصب مثلث التوائم، وتقع في مثلث التوائم العقد والجذر الظهري العقد (DRGs). وهي بمثابة حراس المعلومات الحسية 1. في غشاء perikarial، تماما كما في المحطات المركزية والطرفية، والخلايا العصبية DRG تعبر عن مستقبلات والقنوات الأيونية، مثل مستقبلات الغلوتامات، TNF مستقبلات ألفا، مستقبلات عابرة المحتملين قناة الموجبة أعضاء فصيلة V 1 (TRPV1)، وقنوات الصوديوم، الخ 2 -7. التسجيلات المشبك التصحيح في الغشاء perikarial تسمح فهم التغيرات الوظيفية للعديد من هذه المستقبلات والقنوات في جميع أنحاء الخلايا العصبية.
تقنية تسجيل المشبك التصحيح هو أداة قوية لستوالموت أنشطة القنوات أو مستقبلات وعدد كبير من الدراسات قد أجريت من خلال تطبيق هذه التقنية على الخلايا العصبية DRG 8-10. في معظم الدراسات إزالة DRG عن طريق خفض rootlets ظهري وعلى مقربة العصب الشوكي إلى العقدة. بعد تنميق، ثم يتم وضع العقدة في الانزيمات الهاضمة التي تؤدي إلى تفكك الخلايا العصبية DRG، والتي يمكن بعد ذلك يتم تسجيلها على الفور أو مثقف لعدة أيام قبل التسجيل. للأسف، تفكك الخلايا العصبية DRG ينطوي على axotomy الضروري على مقربة من perikarya. مرة واحدة فصل وaxotomized، الخلايا العصبية DRG تخضع التغيرات المظهرية وكذلك التغيرات في غشاء استثارة 11،12. فقدان الاتصال بين perikarya من الخلايا العصبية الفردية والخلايا الدبقية الأقمار الصناعية التي تحيط عادة لهم ومن المرجح أن يسهم في هذه التغيرات 13. الحديث المتبادل بين الخلايا العصبية والخلايا الدبقية الأقمار الصناعية على حد سواء أساسيا في الظروف الفسيولوجية وفي مجال التكيف مع pathologشروط كال مثل تلك التي تؤدي إلى آلام مستعصية على الحل 14،15. وسيكون تحديا لدراسة التفاعل بين الخلايا العصبية والخلايا الدبقية الأقمار الصناعية باستخدام إعداد DRG فصلها.
DRGs سليمة، من ناحية أخرى، توفر أقرب إلى الأوضاع في الجسم الحي. في السنوات القليلة الماضية، مختبرنا، وكذلك بعض المجموعات الأخرى، وقد تم استخدام DRGs سليمة من الفئران البالغة لتحقيق التغييرات من الخلايا العصبية الحسية الأولية في ظروف مختلفة تترافق مع الألم المزمن 3-5،11،15-17. على الرغم من أن التقنيات المستخدمة في هذه الدراسات يتم تأسيس نوعا ما، لم يتم بعد نشر وصفا خطوة بخطوة. في هذا المخطوط، وصفنا وسيلة مريحة وسريعة لإعداد DRGs سليمة واستخدامها للحصول على تسجيلات المشبك التصحيح.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
أخلاقيات الإعلان: جميع الإجراءات اللازمة لصيانة واستخدام حيوانات التجارب يتفق مع لوائح لجان طبية جديدة للبحوث الحيوانية ونفذت وفقا للمبادئ التوجيهية للوائح المعاهد الوطنية للصحة في استخدام الحيواني والرعاية (النشر 85-23، منقحة 1996 ). وافقت لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي UCSF البروتوكولات المستخدمة في هذه الدراسة.
1. إعداد الأدوات والحلول وصحون
- تحضير السائل النخاعي الاصطناعي (ACSF).
- إعداد 500 مل من 10X حل الموجبة منخفض، و 500 مل من 10X حل البيكربونات (انظر الجدول رقم 1 و 2 لإعداد الحل). تخزينها في 4 درجة مئوية واستخدام خلال شهر واحد.
- إعداد 600 مل من ACSF جديدة عن طريق خلط 60 مل من 10X حل الموجبة منخفض مع 60 مل من محلول البيكربونات، ثم قم بإضافة 480 مل من الماء منزوع الأيونات لتصل إلى الحجم النهائي من 600 مل. فقاعة ACSF مع كربوجين(5٪ O 2 و 95٪ CO 2) لمدة 10 دقيقة على الأقل قبل الاستخدام.
- سحب تصحيح ماصة من الزجاج الشعرية.
- وضع رقيقة من الزجاج الشعرية الجدران إلى مجتذب ماصة للتحضير الماصات تسجيل.
ملاحظة: في المختبر، يتم استخدام المعلمات وضع التالية من مجتذب لتحقيق الشكل المثالي ماصة: الحرارة (510)، والسرعة (32). يجب أن يكون شكل ماصة مثالية لتسجيل DRG سليمة تفتق مرهف تدريجيا مع زاوية مخروط منخفضة، وهذا يمكن أن يكون أفضل تحقيق ذلك عن طريق التجربة والخطأ. - تأكد من أن مقاومة ماصة 3-5 MΩ عندما تمتلئ الحلول الداخلية (انظر الجدول 3 لإعداد الحل). يرجى الرجوع إلى دليل أكسون للأسلوب مفصل على قياس المقاومة ماصة 18.
- وضع رقيقة من الزجاج الشعرية الجدران إلى مجتذب ماصة للتحضير الماصات تسجيل.
- إضافة 1 ملغ من كولاجيناز إلى 400 ميكرولتر من ACSF، لإعطاء تركيز النهائي من 13 وحدة / مل. ثم ملء كل ماصة الزجاج مع حوالي 20 ميكرولتر من محلول كولاجيناز. متجرماصات شغل في -20 درجة مئوية الفريزر واستخدامها في غضون ثلاثة أسابيع.
- إعداد 200 مل من ACSF البارد (حوالي 4 درجة مئوية). لتبريد ACSF بسرعة وضعه في كوب، وختم مع غلاف بلاستيكي وضعها في -20 درجة مئوية الثلاجة لمدة حوالي 20 دقيقة حتى يبدأ لتجميد. ضع الدورق في حمام الثلج وفقاعة مع كربوجين لمدة 10 دقيقة. فقاعة المتبقية 400 مل من ACSF مع كربوجين في RT.
- في حين يتم تبريد ACSF، وقطع نهاية نقل المتاح البلاستيكية ماصة للتكبير فتحة قطرها 5 ملم (وسوف تستخدم هذه لنقل DRG). جمع الأدوات الجراحية التالية: مشرط (# 15)، مايو مستقيمة ومنحنية مقص، ودفع غرامة 2 مم طرف مقراض، أدسون (أسنان) ملقط، مقص القزحية، مقص الربيع واثنين من ملقط غرامة. صب ACSF الباردة المؤكسج في أطباق بتري 3 الزجاج (القطر الخارجي: 10 سم).
2. DRG تشريح
- تخدير الفئران (200-220 ز) مع المؤسسة العامة الصوديومntobarbital (100 ملغ / كلغ، والملكية الفكرية) وتأكد من أن مستوى التخدير كافية عن طريق اختبار رد الفعل دواسة والعين العاكسة وميض.
- بعد التحقق من أن يتم تخدير الفئران، حلق منطقة أسفل الظهر وشق الجلد والنسيج تحت الجلد على طول خط الوسط. فصل عضلات محيطة بالنخاع من العمليات الشائكة على مستوى L1-S2 باستخدام رافعة السمحاق على ما يرام.
- استخدام مقص منحنية لخفض العمليات الشائكة من L1 إلى S2. استخدام مقص مايو على التوالي لجعل التخفيضات عرضية في العمود الفقري تتعرض في حوالي L1 و S1 و إزالة هذا الجزء من العمود الفقري ككل، وسرعان ما يغرق في ACSF الباردة (المعد في الخطوة 1.5) لمدة 2-3 دقيقة. بعد إزالة DRGs قطني، ويتم القتل الرحيم من قبل بضع الصدر الثنائي في حين أن الفئران لا يزال تحت التخدير بنتوباربيتال عميق.
- مطاردة قبالة الدم من العمود الفقري إزالة والأنسجة المرفقة ونقل إلى طبق بتري مع ACSF الباردة. Uحد ذاتها مقراض غرامة لإزالة الصفائح. قطع جافية على طول خط الوسط مع microscissors لفضح الحبل الشوكي. رفع بلطف الحبل الشوكي، وقطع جذور الأعصاب عند نقطة دخولها في الحبل الشوكي باستخدام مقص القزحية، ثم إزالة الحبل الشوكي.
- نقل فقرة المتبقية مع DRGs إلى طبق بتري الثاني مملوءة ACSF الباردة. التعرف على L4 و L5 DRGs بناء على الوضع النسبي لعمليات عرضية والعصب الوركي.
ملاحظة: سيتم الحفاظ على العصب الوركي سليمة تساعد على تحديد L4 و L5 DRG (العصب الوركي تنبع من الأعصاب في العمود الفقري L4-6). - استخدام ملقط دومون ومقص نويس لتحرير DRGs من الأنسجة الضامة المحيطة بها. الحفاظ على جذر العصب والعصبية في العمود الفقري تعلق على DRGs.
- استخدام ماصة نقل لنقل DRGs في طبق بتري الثالث لمزيد من تشريح.
- تحت المجهر تشريح، وإزالة بعناية أكبر قدر ممكن من عشر المحيطة غلافالبريد DRG.
- استخدام مقص الربيع نويس لقطع فتح حيث ظهري وبطني جذور الانضمام إلى DRG وفصل جذر بطني من DRG. استخدام دومون # 5 ملقط مع نصائح صريحة لعقد غلاف، واستخدام ملقط غرامة أخرى للفة DRG من غلاف.
- الاستمرار في إزالة أكبر قدر ممكن من غلاف تعلق على DRGs باستخدام ملقط غرامة.
ملاحظة: DRG تشريح جيدا المهم للحصول على هضم جيد في الخطوة التالية.
3. DRG الهضم
- نقل DRG إلى غرفة تسجيل. التأكد من جانب DRG حيث جذور الأعصاب تنشأ جوه أسفل.
ملاحظة: في هذه الطريقة، فإن معظم الخلايا العصبية يمكن الوصول إليها. - استخدام مرساة للاستقرار DRG. يروي DRG مع الاوكسيجين ACSF بمعدل 0.5 مل / دقيقة من خلال أنابيب بلاستيكية متصلة مع مضخة تحوي، التي يتم وضعها على طاولة بجانب تلاعب تسجيل.
- الانتظار لمدة 30 دقيقة للسماح للخلايا لاسترداد. تقييم جودة DRG تحت الأشعة تحت الحمراء واجهة التفاضلية النقيض (IR-DIC) البصريات في 40X التكبير موضوعي من خلال كاميرا CCD.
ملاحظة: DRGs جيدة وعادة ما يتضمن الكثير من جولة، يتناقض بشكل جيد، والخلايا العصبية وتحيط بها خلايا الدبقية الفضائية على سطحه. - هضم مساحة صغيرة من سطح DRG.
ملاحظة: يتم وضع الماصات الزجاجية التصحيح في أصحاب ماصة، والتي هي وصلات الصغيرة التي تسمح الأنابيب إلى أن تعلق على ماصة الزجاج مع ختم محكم.- اتصال فردي اثنين 1 مل الحقن لأصحاب ماصة من خلال قطعتين الصغيرة أنابيب قطرها المطاط. وضع ماصة كوب واحد مليئة كولاجيناز في واحدة من أصحاب ماصة وماصة زجاجية فارغة إلى الآخر.
- استخدام micromanipulator لوضع ماصات فقط فوق DRG. ثم، تحت التكبير المجهر، تصطدم نصائح من اثنين من الماصات ضد بعضها البعض بلطف لتوسيع فتحات نصائح ماصة (ومن الناحية المثالية يبلغ قطرها 5-10 ميكرون).
- نقل ماصة مليئة الانزيم على مقربة من سطح DRG لفترة وجيزة تطبيق ضغط إيجابي على ماصة تحتوي على كولاجيناز من خلال الأنبوب الذي يربط بين حامل والحقنة من خلال طرد المكبس حوالي 0.5 مل.
ملاحظة: تحت الضغط، وتدفق الإنزيم من ماصة تكبير قليلا الفراغ بين الخلايا العصبية DRG، والتي يمكن أن تكون بمثابة علامة للتطبيق الانزيم. - بعد 10 إلى 15 دقيقة، وعندما لوحظ حطام غلاف المتبقية، والضغط السلبي لطيف لماصة فارغة لامتصاص بعيدا عن الحطام.
ملاحظة: في هذه الطريقة، والخلايا العصبية والخلايا المحيطة الدبقية الأقمار الصناعية سوف يتعرض بوضوح وعلى استعداد لتسجيل التصحيح. - تجاهل ماصات اثنين في وعاء الحادة.
4. تصحيح تسجيلات المشبك
- وضع حل القطب (انظر الجدول 3) على الجليد لمنع تدهور. ملء ماصة الزجاج التصحيح معحل تصفيتها داخل الخلايا (فلتر حقنة، حجم المسام: 0.2 ميكرون)، ووضع ماصة في حامل headstage ماصة. تطبيق الضغط الايجابي لطيف لماصة من خلال حقنة 5 مل من تشريد المكبس حوالي 1 مل قبل تخفيض ماصة في حل حمام.
ملاحظة: هذا يمنع ماصة من أن تصبح مسدودة. - اختيار "V-المشبك" واسطة من خلال تحويل مقبض وضع على مكبر للصوت، ثم فتح "غشاء اختبار" واجهة في البرنامج. نقل ماصة على مقربة من الخلايا العصبية الهدف تحت المجهر التفتيش.
ملاحظة: في إعداد DRG سليمة، طبقة رقيقة من الخلايا الدبقية الفضائية بتغليف كل الخلايا العصبية. - استخدام الضغط الايجابي من ماصة لاجتياز طبقة الخلايا الدبقية الأقمار الصناعية حتى توسيع المفاجئ من الفضاء بين الخلايا العصبية وطبقة المحيطة الخلايا الدبقية الأقمار الصناعية لوحظ. مواصلة التحرك نحو ماصة الخلايا العصبية حتى لوحظ "الدمل" في الخلايا العصبية.
ملاحظة: بالمقارنة معتسجيلات من الخلايا العصبية نأت، يحتاج الضغط الإيجابي ليكون أكبر قليلا، والتي سوف تساعد على اختراق طبقة الخلايا الدبقية الأقمار الصناعية وزيادة فرص ترميم ناجحة. - تخفيف الضغط الإيجابي. التالي، وتحقيق ختم جيجا أوم مع طيف الامتصاص.
ملاحظة: مع هذا الأسلوب، فإن معدل نجاح تسجيل هو 70٪ على الأقل. - الحصول على التكوين تسجيل خلية كاملة كما هو موضح سابقا (19).
- لفترة وجيزة، اختراق غشاء الخلية العصبية عن طريق الشفط قصيرة ولكن قوية. بدلا من ذلك، استخدم الدالة "انطلق" على مكبر للصوت في حين يتم تطبيق الشفط.
- مرة واحدة يتم تأسيس وضع خلية كاملة، تعويض السعة خلية كاملة والمقاومة سلسلة (روبية) من خلال تحويل السعة والتعويض المقاومة المقابض على مكبر للصوت.
ملاحظة: روبية هي عادة 5-20 MΩ. - التخلي عن الخلية إذا روبية في البداية أكبر من 30 MΩ. أو روبية التغييرات بأكثر من 20٪ خلال التسجيل. أيضاقياس إمكانات غشاء يستريح. التخلي عن خلية إذا كان غشاء المحتملة يستريح أكثر من -50 بالسيارات.
- إغلاق إطار "اختبار غشاء". اختيار "I-المشبك الطبيعي" واسطة من خلال تحويل مقبض وضع على مكبر للصوت.
- انقر على "بروتوكول مفتوحة" في البرنامج، حدد وتحميل بروتوكول لقياس قرارة التيار. انقر على "سجل" لبدء التسجيل. قياس مقاومة المدخلات وقرارة التيار للنظر في استثارة الخلايا العصبية عن طريق حقن سلسلة متدرجة من depolarizing التيارات في الخطوات من 100 سلطة الفلسطينية.
- انقر على "بروتوكول مفتوحة" مرة أخرى وحدد بروتوكول لقياس عتبة الغشاء. سيتم حقن 500 مللي depolarizing منحدر الحالي (2000 السلطة الفلسطينية / ق) إلى الخلايا العصبية.
- استخدام الحصول على البيانات وبرامج التحليل (مثل Clampfit) لتحليل آثار تسجيلها وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. استخدام البرنامج لحساب مقاومة المدخلات (رين) على أساس الرابع تعصب ثابتة للدولةionship خلال التيارات hyperpolarizing تسليمها. حرك المؤشر لقياس قيمة قرارة التيار وغشاء العتبة.
ملاحظة: يتم تعريف السعة الحالية اللازمة لحمل AP كما قرارة التيار، ويتم تعريف أدنى جهد لإحداث AP كما عتبة الغشاء.
- تسجيل يجند المستحثة التيارات.
- ملء ماصة مع مستقبلات معينة.
ملاحظة: في التقرير الحالي، استخدمنا 100 ميكرومتر الغلوتامات و 100 ميكرومتر AITC للحث على التيارات بوساطة مستقبلات الغلوتامات ومستقبلات TRPA1 على التوالي. - تحقق ماصة للتأكد من عدم وجود فقاعات الهواء داخل. وضع ماصة في حامل ماصة. توصيل حامل ماصة مع أنبوب موصول إلى نظام صرف الدواء.
- استخدام مناور لتحريك ماصة ضمن 50 ميكرون من الخلايا العصبية. ضبط ضغط النظام بتوزيع الأدوية إلى 1 رطل والمدة إلى 1 ثانية. تبديل وضع التسجيل على المشبك الجهد، والمشبك في -70 بالسيارات. لفترة وجيزة تطبيق الضغط عن طريق نظام صرف الدواء لتسجيل تيار المخدرات التي يسببها.
- ملء ماصة مع مستقبلات معينة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويبين الشكل 1 عملية إعداد DRG سليمة لتسجيل التصحيح. ويبين الشكل 1A التعرض ومكان العقد بعد الثقب. Figure1B يظهر L3، L4 و L5 DRGs مع جذور الأعصاب تعلق بعد إزالة الحبل الشوكي. ثم يتم تشريح L4 و 5 DRGs بعناية وحررت من الفقرات. وبعد ذلك، تتم إزالة غلاف، وهي غشاء شفاف يحيط DRG، (السهم الأصفر، 1D الشكل). أفضل مكان لفصل غلاف من خلال الموقع حيث ظهري والجذور البطنية الانضمام في DRG، كما يدل على ذلك السهم الأسود في الشكل 1D بعد تقشير قبالة غلاف، تتم إزالة الجذر البطني والتخلص منها، وترك rootlets الظهرية ، العصب الشوكي وDRG، كما هو مبين في الشكل 1E. الهضم مع كولاجيناز يزيل غلاف المتبقية، وتعريض الخلايا العصبية والخلايا الأقمار الصناعية تيقبعة تحيط بهم (الشكل 1F).
بعد الانتهاء من إعداد DRG، يتم فحص استثارة الخلايا العصبية صغيرة قطرها DRG عن طريق قياس عتبة قرارة التيار والغشاء. كما هو مبين في الشكل 2A، وقرارة التيار هو 260 في السلطة الفلسطينية. ويبين الشكل 2B عتبة غشاء يقاس مع هذا الأسلوب. مع التيار وزيادة، واستقطابها الغشاء بشكل مستمر حتى يتم أثار أب. في هذا المثال عتبة غشاء (القدرة على الذي أثار ا ف ب) هي -11.9 بالسيارات. لذلك، من خلال الحفاظ على العلاقة بين الخلايا العصبية والخلايا الدبقية الأقمار الصناعية، وإعداد لدينا هو أقرب إلى الوضع في الجسم الحي. وبناء على نتائجنا، وقرارة التيار المسجلة من الخلايا العصبية DRG صغيرة حوالي 300 سلطة الفلسطينية، ومقاومة الإدخال 451.3 ± 27.3 MΩ. وأعلى بالمقارنة مع كل من تلك التي تقاس من الخلايا العصبية فصل (حوالي 150 السلطة الفلسطينية و 635 MΩ)، مما يشير إلىارتفع هذا التفكك استثارة الخلايا العصبية DRG 11.
مع هذا المستحضر، ونحن أيضا قياس التيارات الداخل الناجم عن الغلوتامات والأليل ثيوسيانات (AITC)، والتي هي مستقبلات لمستقبلات الغلوتامات ومستقبلات عابرة المحتملين A1 (TRPA1) عضوا قناة الموجبة على التوالي. فإن اتساع التيارات الداخل الناجمة عن هذه بروابط تعكس عدد من المستقبلات وزعت في الخلايا العصبية. ويبين الشكل 3A تيار الداخل في صغيرة الخلايا العصبية قطر DRG الناجم عن 1 ثانية تطبيق نفخة من الغلوتامات (1 ملم). الغلوتامات التي يسببها تيار الداخل (198 سنويا)، والتي يمكن أن يكون قد تم حظره بشكل كبير عن طريق المشاركة في تطبيق NMDA APV مستقبلات وأمبا / kainate مستقبلات CNQX (لا تظهر البيانات)، مما يؤكد التيار بوساطة مستقبلات الغلوتامات على DRG الخلايا العصبية. أنشأت هذه البيانات أن هناك مستقبلات الغلوتامات وظيفية على الخلايا العصبية DRG. في شمال شرقأظهرت uron موضح في الشكل 3B التيارات الداخل (260 سنويا) الناجم عن 1 ثانية تطبيق نفخة من الأليل ثيوسيانات (AITC، و 100 ميكرومتر)، وTRPA1 ناهض انتقائية. تم حجب التيار الداخل من قبل انتقائية TRPA1 خصم 10 ميكرومتر HC 030031 (لا تظهر البيانات)، مؤكدا التيارات تم بوساطة مستقبلات TRPA1 ويؤسس وجود مستقبلات TRPA1 على الخلايا العصبية DRG.
الشكل 1: إعداد DRGs سليمة (A) تعرض الحبل الشوكي بعد الثقب وتجزئة DRGs. السهام من اليمين إلى اليسار وتشير L3-5 DRGs على التوالي. شريط مقياس = 1 سم. (ب) تعرض L3، L4، L5 وDRGs وجذور الأعصاب تعلق بعد إزالة الحبل الشوكي. تشير الأسهم DRGs L3، L4، L5 ومن اليمين إلى اليسار. شريط مقياس = 1 سم. (C) إنتDRGs ط م مع جذور الأعصاب تعلق بعد أن تشريح من الحبل الشوكي. تشير الأسهم L4 و L5 DRGs من اليمين إلى اليسار. شريط مقياس = 1 سم. (D) DRG سليمة مع غلاف المرفقة. في هذه الصورة، وغلاف غير سليمة، ويظهر السهم الأصفر على غلاف شبه شفاف التي عقدت من قبل ملقط دومون. ويشير السهم الأسود تقاطع شكلتها الجذر الظهري وجذر بطني، والتي هي بمثابة نقطة انطلاق جيدة لتقشر غلاف. شريط مقياس = 1 مم. (E) نفس DRG مع الجذر الظهري تعلق بعد على غلاف والجذر البطني قد أزيلت. شريط مقياس = 1 مم. الصور المجهر (F) الأشعة تحت الحمراء من DRG التالية الهضم مع كولاجيناز. الخلايا العصبية الصغيرة والمتوسطة الحجم مرئية. خلية الدبقية الأقمار الصناعية (السهم الأصفر) مرئيا المحيطة الخلايا العصبية (النجمة). يشير السهم الأحمر إلى ماصة. شريط النطاق = 10 ميكرون. (G) تكوين أجهزة تسجيل. وتشير السهام السوداء والعشرينه أصحاب ماصة. واحد اليسار يحمل المخدرات شغل ماصة، وتسجيل ماصة على اليمين. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
وقد تم قياس قياس العصبية استثارة في الحالي المشبك الوضع (A) قرارة التيار عن طريق حقن سلسلة من التيارات داخل الخلية العصبية DRG (اللوحة العليا): الشكل 2. أقل كثافة الحالية، والتي يمكن أن تحفز إمكانات العمل، هو الذي يعرف بأنه قرارة التيار، كما يشير إليه السهم في اللوحة السفلى. في قرارة التيار لهذه الخلايا العصبية هو 300 في السلطة الفلسطينية. (B). وقد تم قياس عتبة الغشاء عن طريق حقن منحدر الحالية. احتمال، عندما أثار إمكانات العمل، هو الذي يعرف بأنه عتبة الغشاء، كما وصفت من قبل خط متقطع في لوحة العليا.عتبة غشاء لهذه الخلايا العصبية هي -11.9 بالسيارات. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 3: التيارات يجند المستحثة في المنشآت الصغيرة DRG الخلايا العصبية التيارات الناجمة عن تطبيق نفخة من الغلوتامات (1 ملم) أو ثيوسيانات الآليل (ناهض TRPA1، AITC، و 100 ميكرومتر) لمدة 1 ثانية. كلا منبهات يسببها الداخل التيارات، مما يشير إلى وجود مستقبلات الغلوتامات ومستقبلات TRPA1 على الخلايا العصبية DRG الصغيرة. يسببها تطبيق الغلوتامات تيار الداخل من 198 باسكال (أ)، وAITC الناجم عن تيار الداخل من 260 باسكال (B). وفرضت الخلايا العصبية في -70 بالسيارات. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. < / P>
| 2 ليتر من 10X الاسهم المنخفضة للالموجبة | |||
| تركيز النهائي (ملم) | مكون | ميغاواط | الوزن (ز) |
| 3 | بوكل | 74.6 | |
| 11 | جلوكوز | 180.2 | |
| 123 | كلوريد الصوديوم | 58.4 | |
| 1.25 | ناه 2 ص 4 * H 2 O | 138 | |
| 1 | MgCl 2 * 6H 2 O | 203.3 | |
| 2 | CaCl 2 * 2H 2 O | 147 | |
الجدول 1
| 1 لتر من 10X الأسهم البيكربونات | |||
| تركيز النهائي (ملم) | مكون | ميغاواط | الوزن (ز) |
| 26 | NaHCO 3 | 84.01 | 21.84 |
الجدول 2
| 100 مل من محلول داخل الخلايا | |||
| تركيز (ملم) | مكون | ميغاواط | ز |
| 130 | KGluconate | 234.24 | |
| 10 | بوكل | 74.55 | |
| 10 | HEPES | 238.3 | |
| 10 EGTA | |||
| 2 | MgCl 2 * 6H 2 O | 203.3 | |
| ملاحظات: ضبط درجة الحموضة إلى 7.4 مع KOH، والأسمولية إلى 260-280 ملي أوزمول مع السكروز والماء المقطر. إضافة 2 ملي MgATP، 0.5 ملي نا 2 GTP وتصفية قبل استخدام الفوري. | |||
الجدول 3
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
نحن الإبلاغ عن طريقة لإعداد DRGs كاملة للدراسات المشبك التصحيح. وهناك العديد من العناصر الأساسية لإعداد نموذج مثالي. أولا، من المهم أن تشريح DRGs مع الجذور الظهرية المرفقة. بعد ذلك، غلاف تحتاج إلى إزالتها بعناية مع تجنب الأضرار التي لحقت الخلايا العصبية. وأخيرا، لفضح الخلايا العصبية والخلايا المحيطة الدبقية الفضائية، فمن الضروري لهضم النسيج الضام المتبقية. سوف DRGs سليمة من الفئران الكبار أعدت مع الطريقة الموصوفة هنا الحفاظ على استمرارية جيدة لمدة 6 إلى 8 ساعات، ويمكن سجلت مستقر خلال تلك الفترة. ويمكن استخدامها في العديد من الدراسات المختلفة من DRGs بما في ذلك التسجيلات المشبك التصحيح على الخلايا العصبية أو الخلايا الدبقية الأقمار الصناعية، أو ردود أثار من الخلايا العصبية DRG.
أثناء إجراء تشريح، فمن المهم أن تشريح بسرعة DRG والاحتفاظ بها في درجة حرارة منخفضة (4 درجة مئوية) لإبطاء عملية التمثيل الغذائي الخلايا العصبية وبالتالي يحافظ على استمراريته. خلالانه تشريح DRGs، ينبغي للمرء تجنب تمتد على ظهري أو أعصاب العمود الفقري تدخل DRGs. خطوة رئيسية أخرى في هذا الإعداد هو إزالة غلاف المحيطة DRG. منذ غلاف من الصعب اختراق، فإن أي غلاف المتبقية على DRG منع ماصات التصحيح من الوصول إلى الخلايا العصبية. تطبيق كولاجيناز هو خطوة هامة لنجاح الأعمال التحضيرية. سوف كولاجيناز هضم غلاف المتبقية وتنظيف سطح الخلايا في الوقت نفسه، وكلاهما لا غنى لترميم ناجحة. لتجنب الإفراط في هضم الأنسجة، ثلاثة عوامل تحتاج إلى النظر فيها. أولا، كولاجيناز تأتي في عدة أشكال مختلفة. انظر جدول المواد لتوصياتنا، واحدة تستخدم حاليا هو قوي ولكن لطيف، وبالتالي تجنب الإفراط في الهضم. ثانيا، يجب أن يتم تسليم الانزيم في الضغط الخفيف لتجنب تشتيت للانزيم خارج منطقة تسجيل. لقد وجدنا الضغط ينتج من تطبيق 0.5 مل منالأشعة تحت الحمراء من حقنة 1ml من كافية. ثالثا، أفضل مجموعة تركيز لكولاجيناز هو 10-13 وحدة / مل. قد يؤدي تركيزات أعلى إلى الإفراط في الهضم وتدهور أسرع من الأنسجة، في حين أن تركيزات أقل تنطوي على الوقت الهضم طويلة دون داع. في تجربتنا، بتركيز 13 وحدة / مل ووقت الهضم حوالي 15 دقيقة تنتج أفضل النتائج. بعد تطبيق انزيم غلاف المتبقية المحيطة DRG ينبغي أن تصبح فضفاضة، ويمكن مسح بعيدا مع طيف الامتصاص. كولاجيناز حساسة لتكرار دورات تجميد ذوبان، وبالتالي تضعف مرة واحدة يجب تقسيم الحل الانزيم في قسامات واستخدامها في غضون 3 أسابيع.
كانت تشانغ وزملاؤه أول من وصف طريقة لتسجيل المشبك التصحيح من DRGs سليمة. الفئران التي استخدموها، ولكن كانت مبكرة جدا (10-15 أيام بعد الولادة) 20 التي لديها ميزة أن DRGs هي أسهل لإعداد بالنظر إلى أن لديهم برنامج التحصين الموسع أرقneurium ولديهم زيادة قدرتها على البقاء. DRGs من الفئران حديثي الولادة، ومع ذلك، فقد العيب أن التعبير عن البروتينات والقنوات الأيونية مثل TRPV1 وNaV1.8 تختلف عن تلك الفئران الكبار 21،22. أيضا، وتجرى الدراسات السلوكية والدوائية عادة في الفئران البالغة. وهكذا طريقة تسجيل مفصلة هنا يسمح مما يجعل وجود علاقة بين الكهربية والسلوك في الحيوانات البالغة. استخدام سليمة العقد الجذرية الظهرية تمهيدا لإجراء التسجيلات المشبك التصحيح خارج الحي زادت مؤخرا 15-17،23،24، واستخدمت بعض الدراسات في تسجيلات فيفو 25. معظم التسجيلات خارج الحي فضح الخلايا العصبية DRG التي يحتضنها DRG كله إلى كوكتيل انزيم لحوالي 30-60 دقيقة. في حين أن هذا الأسلوب ينتج المزيد من الخلايا العصبية، فإنه ينطوي على خطر الإفراط في هضم الخلايا العصبية في الطبقات السطحية. أسلوبنا يقلل من احتمال الإفراط في الهضم باستخدام الفحص البصري لمراقبة السابقخيمة الهضم، وهي طريقة تستخدم أيضا من قبل ما آخرون في الجسم الحي تسجيلات 25.
مقارنة مع الخلايا العصبية DRG فصلها، واحدة من المزايا من إعداد DRG سليمة يأتي من المحافظة على كل من الخلايا العصبية والخلايا الدبقية الأقمار الصناعية (الشكل 1). ليست هذه هي الحال في الاستعدادات التقليدية التي تستخدم الخلايا العصبية DRG فصلها. الأقمار الصناعية الخلايا الدبقية تشكل حاجزا المحيطة الخلايا العصبية DRG الفردية، وجودهم ضروري للحفاظ على البيئة الفسيولوجية من هذه الخلايا العصبية (13). كما لوحظ في نتائج الخصائص الكهربية للخلايا العصبية لهذا أعدت وسائل تختلف عن تلك التي تم الحصول عليها من الدراسات باستخدام الخلايا فصلها.
واحدة من الاتجاهات الأكثر إثارة للاهتمام في المستقبل لهذا المستحضر هو للتحقيق في الحديث المتبادل بين الخلايا العصبية DRG والخلايا الدبقية الأقمار الصناعية. بعد إصابة العصب، على سبيل المثال، وقد ثبت أن الخلايا الدبقية الفضائية رس تغيرات البلاستيك، والتي ترتبط ارتباطا وثيقا السلوك الألم الذي تستتبعه 13-15،26. الحفاظ على الخلايا الدبقية الأقمار الصناعية في DRGs سليمة، سوف تمكننا من تحديد ما إذا كانت مستقبلات الإرسال مثل مستقبلات الغلوتامات، أو مستقبلات ATP موجودة على الخلايا الدبقية الأقمار الصناعية وكيفية استجابتها لتغيير في نشاط الخلايا العصبية. عن طريق تصحيح الخلايا الدبقية الأقمار الصناعية وتحفيز الخلايا العصبية في وقت واحد، ويمكن للخلايا الدبقية الفضائية بمثابة الاستشعار البيولوجي وتبين ما إذا كان هناك إطلاق مرسل من الخلايا العصبية المجاورة. وعلاوة على ذلك، وإعداد DRG سليمة تحافظ على حد سواء وارد وصادر جذور الأعصاب. هذا يوسع الى حد كبير في نطاق تجريبي بإضافة إمكانية تحفيز المحاور التي تدخل أو تخرج من الخلايا العصبية مع القطب الشفط، والذي من شأنه أن يكون أفضل تقليد في الجسم الحي الحالة.
هناك بعض القيود على التحضيرات الجارية. وجود حاجز شكلتها GLI الأقمار الصناعيةخلايا القاعدة ويجعل الأمر أكثر صعوبة للخلايا العصبية التصحيح واحد يجب أن تكون على علم أنه قد يحد من تركيز الأدوية الوصول إلى الخلايا العصبية. لذلك، للوصول إلى الخلايا العصبية في إعداد لدينا من المهم للحفاظ على ماصة تحت ضغط إيجابي للمساعدة اختراق الأقمار الصناعية الخلايا الدبقية طبقة. الحد الآخر هو أن جذور الظهرية والأعصاب في العمود الفقري يجب أن تكون قطع من أجل تشريح خارج DRG. ولذلك، فإنه من المستحيل أن يترك محور عصبي سليمة تماما. ومع ذلك، فإن وجود محور عصبي المتبقية ينبغي النظر فيها، كما لا يجوز فرضت المحاور الطرفية أو المركزية إلى نفس الجهد كما سوما، والتي يمكن أن تسبب خطأ تسجيل المحتملين أو التدخل عندما يجري المشبك الجهد. أيضا من أجل الحصول على التعرض جيدة من الخلايا العصبية، والهضم لطيف مع كولاجيناز ضروري وعلى الرغم من أن هذا يمكن السيطرة عليها من ذوي الخبرة، فإنه من المستحيل لحماية الخلايا العصبية تماما من التعرض لانزيم هضم. مقارنة مع د التقليديالخلايا العصبية issociated DRG، ومع ذلك، DRGs كله هي أسرع لإعداد (حوالي 30 دقيقة)، ويمكن استخدامها في العديد من التطبيقات ويحاكي بشكل وثيق في ظروف الجسم الحي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pentobarbital sodium | vortech Pharmaceuticals | ||
| syringe | BD | 309659 | 1 ml, 5 ml. |
| scalpel | BD | size: 15 | |
| Mayo straight scissor | Fine Science Tools | 14010-15 | |
| Mayo curved scissor | Fine Science Tools | 14011-15 | |
| Rongeur | Fine Science Tools | 16021-14 | |
| Adson toothed forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Iris Scissor | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Noyes spring scissor | Fine Science Tools | 15124-12 | |
| Bone scissors | Fine Science Tools | 16044-10 | Special for cutting the bones. |
| Forceps: Dumont, Dumoxel Biologie #5 | Fine Science Tools | 11252-30 | These have the fine tips that do not need sharpening when first purchased. |
| periosteal elevator | Sklar | 97-0530 | |
| Dissection microscope | WILD | ||
| Transfer pipette | Fisher brand | 13-711-5AM | |
| Petri dish (10 cm) | Pyrex | Glass petri dish can avoid damaging the tips of fine forceps | |
| Collagenase (Liberase TM) | Roche | 05-401-119-001 | dissolve at the concentration of 13 U/ml, aliquot into glass pipette. Avoid repeated freeze and thaw. |
| filter | Thermo scientific | 7232520 | Filter the internal solutions for patch clamp recording to avoid clog. |
| Glass pipette | Sutter | BF150-110-7.5 | |
| Anchor | Havard apparatus | 64-0250 | stabilize the DRG to avoid drift. |
| Peristaltic pump | WPI | ||
| Pipette puller | Sutter | P97 | |
| Amplifier | Molecular devices | Axopatch 200B | |
| Digitizer | Molecular devices | 1440D | |
| Microscope | NIKON | FN600 | |
| Micro-manipulator | Sutter | MPC200 | |
| microinjection dispense system | General Valve | Picrospitzer II | fast drug application system |
| Carbogen (95% O2, 5% CO2) | Local Medical Gas supplier |
References
- Basbaum, A. I., Bautista, D. M., Scherrer, G., Julius, D. Cellular and molecular mechanisms of pain. Cell. 139, 267-284 (2009).
- Caterina, M. J., et al. The capsaicin receptor: a heat-activated ion channel in the pain pathway. Nature. 389, 816-824 (1997).
- Gong, K., Bhargava, A., Jasmin, L. GluN2B N-methyl-D-aspartate receptor and excitatory amino acid transporter 3 are upregulated in primary sensory neurons after 7 days of morphine administration in rats: implication for opiate-induced hyperalgesia. Pain. 157, 147-158 (2016).
- Gong, K., Kung, L. H., Magni, G., Bhargava, A., Jasmin, L. Increased response to glutamate in small diameter dorsal root ganglion neurons after sciatic nerve injury. PloS one. 9, 95491 (2014).
- Gong, K., Zou, X., Fuchs, P. N., Lin, Q. Minocycline inhibits neurogenic inflammation by blocking the effects of tumor necrosis factor-alpha. Clin Exp Pharmacol Physiol. , (2015).
- Ohtori, S., Takahashi, K., Moriya, H., Myers, R. R. TNF-alpha and TNF-alpha receptor type 1 upregulation in glia and neurons after peripheral nerve injury: studies in murine DRG and spinal cord. Spine. 29, 1082-1088 (2004).
- Waxman, S. G., Cummins, T. R., Dib-Hajj, S., Fjell, J., Black, J. A. Sodium channels, excitability of primary sensory neurons, and the molecular basis of pain. Muscle nerve. 22, 1177-1187 (1999).
- Zhang, J. M., Song, X. J., LaMotte, R. H. Enhanced excitability of sensory neurons in rats with cutaneous hyperalgesia produced by chronic compression of the dorsal root ganglion. J Neurophysiol. 82, 3359-3366 (1999).
- Dib-Hajj, S. D., et al. Plasticity of sodium channel expression in DRG neurons in the chronic constriction injury model of neuropathic pain. Pain. 83, 591-600 (1999).
- Cummins, T. R., et al. A novel persistent tetrodotoxin-resistant sodium current in SNS-null and wild-type small primary sensory neurons. J Neurosci. 19, RC43 (1999).
- Zheng, J. H., Walters, E. T., Song, X. J. Dissociation of dorsal root ganglion neurons induces hyperexcitability that is maintained by increased responsiveness to cAMP and cGMP. J Neurophysiol. 97, 15-25 (2007).
- Schoenen, J., Delree, P., Leprince, P., Moonen, G. Neurotransmitter phenotype plasticity in cultured dissociated adult rat dorsal root ganglia: an immunocytochemical study. J Neurosci Res. 22, 473-487 (1989).
- Hanani, M. Satellite glial cells: more than just 'rings around the neuron'. Neuron Glia Biol. 6, 1-2 (2010).
- Takeda, M., Nasu, M., Kanazawa, T., Shimazu, Y. Activation of GABA(B) receptors potentiates inward rectifying potassium currents in satellite glial cells from rat trigeminal ganglia: in vivo patch-clamp analysis. Neuroscience. 288, 51-58 (2015).
- Zhang, H., et al. Altered functional properties of satellite glial cells in compressed spinal ganglia. Glia. 57, 1588-1599 (2009).
- Fan, N., Donnelly, D. F., LaMotte, R. H. Chronic compression of mouse dorsal root ganglion alters voltage-gated sodium and potassium currents in medium-sized dorsal root ganglion neurons. J Neurophysiol. 106, 3067-3072 (2011).
- Fan, N., Sikand, P., Donnelly, D. F., Ma, C., Lamotte, R. H. Increased Na+ and K+ currents in small mouse dorsal root ganglion neurons after ganglion compression. J Neurophysiol. 106, 211-218 (2011).
- The Axon Guide. Sherman-Gold, R. , Axon Instruments. Foster City, CA. (2008).
- Cummins, T. R., Rush, A. M., Estacion, M., Dib-Hajj, S. D., Waxman, S. G. Voltage-clamp and current-clamp recordings from mammalian DRG neurons. Nat Protoc. 4, 1103-1112 (2009).
- Zhang, J. M., Donnelly, D. F., LaMotte, R. H. Patch clamp recording from the intact dorsal root ganglion. J Neurosci Methods. 79, 97-103 (1998).
- Benn, S. C., Costigan, M., Tate, S., Fitzgerald, M., Woolf, C. J. Developmental expression of the TTX-resistant voltage-gated sodium channels Nav1.8 (SNS) and Nav1.9 (SNS2) in primary sensory neurons. J Neurosci. 21, 6077-6085 (2001).
- Funakoshi, K., et al. Differential development of TRPV1-expressing sensory nerves in peripheral organs. Cell Tissue Res. 323, 27-41 (2006).
- Hayar, A., Gu, C., Al-Chaer, E. D. An improved method for patch clamp recording and calcium imaging of neurons in the intact dorsal root ganglion in rats. J Neurosci Methods. 173, 74-82 (2008).
- Yagi, J., Sumino, R. Inhibition of a hyperpolarization-activated current by clonidine in rat dorsal root ganglion neurons. J Neurophysiol. 80, 1094-1104 (1998).
- Ma, C., Donnelly, D. F., LaMotte, R. H. In vivo visualization and functional characterization of primary somatic neurons. J Neurosci Methods. 191, 60-65 (2010).
- Vit, J. P., Jasmin, L., Bhargava, A., Ohara, P. T. Satellite glial cells in the trigeminal ganglion as a determinant of orofacial neuropathic pain. Neuron Glia Biol. 2, 247-257 (2006).
