Abstract
Des études de patch-clamp de ganglions de la racine dorsale (DRG) neurones ont accru notre compréhension du système nerveux périphérique. À l'heure actuelle, la majorité des enregistrements sont effectués sur les neurones de DRG dissociés, ce qui est une préparation standard pour la plupart des laboratoires. propriétés neuronales, cependant, peuvent être modifiés par des lésions axonales résultant de la digestion enzymatique utilisée dans l'acquisition de neurones dissociés. En outre, les préparations de neurones dissociés ne peuvent pas représenter pleinement le microenvironnement de la DRG depuis la perte de contact avec les cellules gliales par satellite qui entourent les neurones sensoriels primaires est une conséquence inévitable de cette méthode. Pour surmonter les limitations dans l' utilisation de neurones classiques DRG dissociés pour les enregistrements de patch-clamp, dans ce rapport , nous décrivons une méthode pour préparer les DRG intactes et effectuer des enregistrements de patch-clamp sur les neurones sensoriels primaires individuels ex vivo. Cette approche permet la préparation rapide et simple des DRG intactes, imitant enconditions in vivo en gardant les neurones de DRG associés à leurs cellules gliales environnantes par satellite et de la membrane basale. En outre, le procédé permet d'éviter des lésions axonales de manipulation et de digestion avec une enzyme telle que lorsque les DRG dissociant. Cette préparation ex vivo peut en outre être utilisé pour étudier l'interaction entre les neurones sensoriels primaires et les cellules gliales par satellite.
Introduction
La sensation est essentielle à la survie et le bien-être d'un organisme. La transmission des impulsions dépend des voies sensorielles à partir des terminaisons périphériques des axones des neurones sensoriels primaires. neurones sensoriels primaires, à l'exception du noyau mésencéphalique du nerf trijumeau, sont situés dans les ganglions de la racine dorsale trijumeau (DRG). Ils servent en tant que gardiens de l'information sensorielle 1. À la membrane perikarial, tout comme au niveau des bornes centrales et périphériques, les neurones DRG expriment des récepteurs et des canaux ioniques, tels que les récepteurs du glutamate, récepteurs TNF alpha, le récepteur transitoire potentiel de canal de cations sous - famille V élément 1 (TRPV1), des canaux de sodium, etc. 2 -7. Enregistrements patch-clamp de la membrane perikarial permettent de comprendre les changements fonctionnels de plusieurs de ces récepteurs et des canaux à travers le neurone.
La technique d'enregistrement patch clamp est un outil puissant pour stumourir les activités des canaux ou des récepteurs et un grand nombre d'études ont été menées en appliquant cette technique sur les neurones DRG 8-10. Dans la plupart des études, le DRG est enlevé en coupant les radicelles dorsales et nerf spinal proche du ganglion. Après hachage, le ganglion est ensuite placé dans des enzymes digestives qui conduisent à la dissociation des neurones DRG, qui peuvent ensuite être enregistrées immédiatement ou mises en culture pendant plusieurs jours avant l'enregistrement. Malheureusement, la dissociation des neurones DRG implique une axotomie nécessaire près du péricaryons. Une fois dissociées et axotomisés, les neurones DRG subissent des modifications phénotypiques ainsi que des changements dans la membrane excitabilité 11,12. La perte de contact entre le péricaryons des neurones individuels et les cellules gliales par satellite qui entourent normalement eux est susceptible de contribuer à ces changements 13. La diaphonie entre les neurones et les cellules gliales par satellite est à la fois essentiel dans des conditions physiologiques et dans l'adaptation au pathologconditions iques telles que celles conduisant à la douleur intraitable 14,15. Il serait difficile d'étudier l'interaction entre les neurones et les cellules gliales par satellite en utilisant une préparation de DRG dissociés.
DRG intact, d'autre part, fournissent plus proche des conditions in vivo. Au cours des dernières années, notre laboratoire, ainsi que d'autres groupes, a eu recours à des DRG intacts de rats adultes pour étudier les changements de neurones sensoriels primaires dans différentes conditions associées à la douleur chronique 3-5,11,15-17. Bien que les techniques utilisées dans ces études sont peu établies, une description étape par étape n'a pas encore été publiée. Dans le présent manuscrit, nous décrivons un moyen pratique et rapide pour préparer les DRG intactes et leur utilisation pour les enregistrements de patch-clamp.
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Protocol
Déclaration éthique: Toutes les procédures pour l'entretien et l'utilisation des animaux de laboratoire conforme aux règlements des comités UCSF sur la recherche animale et ont été réalisées conformément aux lignes directrices de la réglementation des NIH sur l'utilisation et les soins (Publication 85 animaux - 23, révisée en 1996 ). Le Comité de protection et de l'utilisation des animaux Institutional UCSF a approuvé les protocoles utilisés dans cette étude.
1. Préparation des instruments, Solutions et Plats
- Préparer liquide céphalo-rachidien artificiel (LCRa).
- Préparer 500 ml de 10x faible solution de cations, et 500 ml de solution de bicarbonate 10x (voir le tableau 1 et 2 pour la préparation de la solution). Conserver à 4 o C et l' utilisation dans un mois.
- Préparer 600 ml de LCRa frais en mélangeant 60 ml de 10x à faible solution de cations avec 60 ml d'une solution de bicarbonate, puis ajouter 480 ml d'eau déminéralisée pour atteindre un volume final de 600 ml. La bulle LCRa carbogène(5% de O 2 et 95% de CO2) pendant au moins 10 minutes avant utilisation.
- Pull Patch Pipette de Capillaire en verre.
- Placez verre mince capillaire à paroi dans un extracteur de pipette pour préparer pipettes d'enregistrement.
Remarque: Dans notre laboratoire, les paramètres de réglage de l'extracteur suivants sont utilisés pour obtenir la forme de pipette idéale: la chaleur (510), la vitesse (32). La forme de pipette idéal pour l'enregistrement de DRG intact devrait avoir un cône mince progressive avec un angle de cône faible, et cela peut être mieux réalisé par essais et erreurs. - Assurez -vous que la résistance de la pipette est 3-5 MQ lorsqu'il est rempli avec des solutions internes (voir le tableau 3 pour la préparation de la solution). S'il vous plaît se référer au Guide Axon pour la méthode détaillée de mesure de la résistance de la pipette 18.
- Placez verre mince capillaire à paroi dans un extracteur de pipette pour préparer pipettes d'enregistrement.
- Ajouter 1 mg de collagénase à 400 ul d'aCSF, pour donner une concentration finale de 13 unités / ml. Ensuite, remplissez chaque pipette en verre avec environ 20 pi de solution de collagénase. boutiqueles pipettes remplies dans un -20 ° C congélateur et de les utiliser dans les trois semaines.
- Préparer 200 ml de LCRa froid (environ 4 o C). Pour refroidir le LCRa rapidement le placer dans un bécher, sceller avec une pellicule de plastique et placer dans un -20 ° C congélateur pendant environ 20 min jusqu'à ce qu'il commence à geler. Placer le bécher dans un bain de glace et bulle avec carbogène pendant 10 min. Bubble restant 400 ml de LCRa avec carbogène à la température ambiante.
- Alors que le LCRa se refroidit, couper l'extrémité d'une pipette de transfert en plastique jetable pour agrandir l'ouverture d'un diamètre de 5 mm (ce qui sera utilisé pour transférer le DRG). Recueillir les instruments chirurgicaux suivants: scalpel (# 15), Mayo droites et courbes ciseaux, fin 2 mm pointe gouges, Adson (dents) pince, iris, ciseaux à ressort et deux pinces fines. Versez le LCRa froid oxygéné dans des boîtes de Pétri 3 en verre (diamètre extérieur: 10 cm).
2. DRG Dissection
- Anesthetize un rat (200-220 g) avec pe de sodiumntobarbital (100 mg / kg, ip) et confirmer que le niveau de l'anesthésie est adéquate en testant la pédale réflexe et oeil réflexe clignement.
- Après avoir vérifié que le rat est anesthésié, de se raser la région lombaire et inciser la peau et du tissu sous-cutané le long de la ligne médiane. Détachez les muscles spinaux des apophyses épineuses au niveau L1-S2 en utilisant une rugine bien.
- Utilisez des ciseaux courbes pour couper les processus épineux de L1 à S2. Utilisez des ciseaux Mayo droites pour faire des coupes transversales dans la colonne vertébrale exposée à environ L1 et S1 et retirer ce segment de la colonne vertébrale en bloc et rapidement plonger dans LCRa froid (préparé à l' étape 1.5) pendant 2-3 min. Après la suppression des DRG lombaires, l'euthanasie est réalisée par une thoracotomie bilatérale alors que le rat est toujours sous anesthésie profonde au pentobarbital.
- Rincer hors du sang de la colonne vertébrale enlevé et tissu attaché et transférer à une boîte de Pétri avec LCRa froid. USE bien gouge pour enlever les lames. Couper la dure-mère le long de la ligne médiane avec microciseaux pour exposer la moelle épinière. Soulevez doucement la moelle épinière, et couper les racines nerveuses à leur point d'entrée dans la moelle épinière en utilisant l'iris de ciseaux, puis retirer la moelle épinière.
- Transférer la vertèbre restante avec les DRG à la seconde boîte de Pétri remplie de LCRa froid. Identifier le L4 et L5 DRG en fonction de leur position par rapport à des processus transversaux et le nerf sciatique.
Remarque: Le maintien du nerf sciatique intacte aidera à identifier L4 et L5 DRG (le nerf sciatique provient des nerfs spinaux L4-6). - Utilisez une pince Dumont et les ciseaux Noyes pour libérer les DRG des tissus conjonctifs environnants. Gardez la racine nerveuse et nerf spinal attaché aux DRG.
- Utilisez la pipette de transfert pour déplacer les DRG dans la troisième boîte de Pétri pour plus dissection.
- Sous le microscope de dissection, enlever soigneusement autant que possible de la épinèvre ème environnantee DRG.
- Utilisez les ciseaux à ressort Noyes pour couper une ouverture où la dorsale et ventrale racines rejoignent le DRG et séparent la racine ventrale de la DRG. Utilisez Dumont # 5 forceps à bouts arrondis pour maintenir le épinèvre, et d'utiliser une autre pince fine pour faire rouler le DRG du épinèvre.
- Continuer à supprimer autant que possible de épinèvre attaché à DRG en utilisant les pince fine.
Note: Un DRG bien disséqué est important d'obtenir une bonne digestion dans l'étape suivante.
3. DRG Digestion
- Transférer le DRG vers la chambre d'enregistrement. Assurez-vous que le côté de DRG où les racines nerveuses proviennent orientée vers le bas.
Remarque: De cette façon, la plupart des neurones sont accessibles. - Utilisez un point d'ancrage pour stabiliser le DRG. Perfuse DRG avec oxygénée LCRa à un débit de 0,5 ml / min à travers des tubes en plastique reliés à une pompe péristaltique, qui est placé sur une table à côté de la plate-forme d'enregistrement.
- Attendre 30 minutes pour permettre aux cellules de se rétablir. Évaluer la qualité de la DRG sous infrarouge contraste d'interface différentielle (IR-DIC) optique à 40X grossissement de l'objectif par le biais d'une caméra CCD.
Remarque: Les bons DRG contient habituellement de nombreux ronds, bien contrasté, les neurones entourés par les cellules gliales par satellite sur sa surface. - Digest une petite zone de la surface de la DRG.
Remarque: Les pipettes de patch en verre sont placés dans des supports de pipette, qui sont de petits tubes accouplements qui permettent d'être fixé à la pipette en verre avec un joint étanche à l'air.- connecter individuellement deux 1 ml seringues pour les porteurs de pipettes à travers deux morceaux de petit tube en caoutchouc de diamètre. Mettre une pipette en verre remplie avec de la collagénase dans l'un des porteurs de pipette et une pipette en verre vide dans l'autre.
- Utilisez le micromanipulateur pour positionner les pipettes juste au-dessus du DRG. Puis, sous microscope grossissement, entrer en collision les conseils de deux pipettes uns contre les autres doucement pour agrandir les ouvertures des embouts de pipette (Idéalement, un diamètre de 5-10 um).
- Déplacer la pipette remplie d'enzyme à proximité de la surface du DRG et brièvement appliquer une pression positive à la pipette contenant de la collagénase dans le tube reliant le support et la seringue par le déplacement du piston d'environ 0,5 ml.
Remarque: Sous la pression, l'écoulement de l'enzyme à partir de la pipette va légèrement agrandir l'espace entre les neurones DRG, qui peuvent servir de signe pour l'application de l'enzyme. - Après 10 à 15 min, lorsque des débris du épinèvre restant est observée, appliquer une pression négative douce à la pipette vide pour aspirer les débris.
Note: De cette façon, les neurones et les cellules gliales environnantes satellites seront clairement exposés et prêt pour l'enregistrement de patch. - Jeter les deux pipettes dans le conteneur pour objets tranchants.
4. patch clamp Recordings
- Placer la solution d'électrode (voir tableau 3) sur la glace pour empêcher la dégradation. Remplir la pipette de patch en verre avecsolution filtrée intracellulaire (filtre de seringue, la taille des pores: 0,2 um) et placez la pipette dans le support headstage de pipette. Appliquer une légère pression positive à la pipette par l'intermédiaire d'une seringue de 5 ml en déplaçant le piston d'environ 1 ml avant d'abaisser la pipette dans la solution de bain.
Note: Ceci empêche la pipette de se bloquer. - Choisissez le mode "V-clamp" en tournant le bouton de mode de l'amplificateur, puis ouvrez "test Membrane" interface dans le logiciel. Déplacer la pipette à proximité du neurone cible en cours d'inspection au microscope.
Remarque: Dans la préparation de DRG intact, une mince couche de cellules gliales par satellite encapsule chaque neurone. - Utiliser une pression positive de la pipette pour traverser la couche de cellules gliales par satellite jusqu'à ce qu'un élargissement brusque de l'espace entre le neurone et une couche périphérique de cellules gliales par le satellite est observée. Continuez à déplacer la pipette vers le neurone jusqu'à ce qu'un "fossette" est observé sur le neurone.
Remarque: par rapport auxenregistrements de neurones dissociées, la pression positive doit être un peu plus grande, ce qui aidera à pénétrer dans la couche de cellules gliales par satellite et d'augmenter les chances de succès rapiéçage. - Réduire la pression positive. Ensuite, obtenir un joint de giga ohms avec une aspiration douce.
Remarque: Avec cette méthode, le taux d'enregistrement de réussite est d'au moins 70%. - Obtenir la configuration d'enregistrement de cellules entières comme décrit précédemment 19.
- En bref, pénétrer dans la membrane cellulaire des neurones par l'intermédiaire d'une aspiration forte mais brève. Vous pouvez également utiliser la fonction "zapper" sur l'amplificateur tandis que l'aspiration est appliquée.
- Une fois qu'un mode de cellule entière est établie, compenser la capacité des cellules entières et une résistance série (Rs) en tournant la capacité du condensateur et de compensation de résistance à molettes sur l'amplificateur.
Note: Rs est normalement 5-20 MQ. - Abandonner la cellule si Rs est initialement supérieure à 30 MQ; ou Rs change de plus de 20% durant l'enregistrement. Aussimesurer le potentiel de membrane au repos; abandonner une cellule si le potentiel de membrane au repos est supérieure à -50 mV.
- Fermez la fenêtre "test Membrane". Choisissez le mode "I-clamp normal" en tournant le bouton de mode de l'amplificateur.
- Cliquez sur "protocole ouvert" dans le logiciel, sélectionner et charger le protocole de mesure de rhéobase. Cliquez sur "record" pour lancer l'enregistrement. Mesurer la résistance d'entrée et Rhéobase pour examiner l'excitabilité neuronale en injectant une série graduée de dépolarisation courants dans les étapes de 100 pA.
- Cliquez sur "protocole ouvert" et sélectionnez le protocole de mesure de seuil de membrane. A 500 ms dépolarisants courant de rampe (2 000 pA / s) seront injectés dans le neurone.
- Utilisez l' acquisition de données et de logiciels d'analyse (par exemple Clampfit) pour analyser les traces enregistrées selon les instructions du fabricant. Utilisez le logiciel pour calculer la résistance d'entrée (Rin) sur la base de l'état d'équilibre IV relationship pendant les courants hyperpolarisants livrés. Déplacer le curseur pour mesurer la valeur de rhéobase et membrane seuil.
Remarque: L'amplitude du courant nécessaire pour induire le point d'accès est défini comme étant la rhéobase et la tension la plus basse pour induire l'AP est défini comme seuil de la membrane.
- Enregistrer les Ligand Induced Currents.
- Remplir la pipette avec les agonistes spécifiques.
Note: Dans le présent rapport, nous avons utilisé 100 uM de glutamate et 100 uM AITC pour induire les courants induits par les récepteurs du glutamate et des récepteurs de TRPA1 respectivement. - Vérifiez la pipette pour assurer qu'il n'y a pas de bulles d'air à l'intérieur. Placer la pipette dans le porte-pipette. Connecter le support de pipette d'un tube relié à un système de distribution de médicament.
- Utilisez le manipulateur pour déplacer la pipette à moins de 50 um du neurone. Régler la pression du système médicament de distribution à 1 psi et la durée de 1 sec. Changez le mode d'enregistrement à la tension de serrage et serrer à -70 mV. appliquer brièvement via le système de distribution de médicament de la pression pour enregistrer un courant induit par un médicament.
- Remplir la pipette avec les agonistes spécifiques.
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Representative Results
La figure 1 montre le processus de préparation DRG intact pour l' enregistrement de patch. La figure 1A montre l'exposition et l' emplacement du ganglion après laminectomie. Figure1B montre L3, L4 et L5 DRG avec les racines nerveuses attachées après avoir enlevé la moelle épinière. Ensuite, L4 et 5 DRG sont soigneusement disséqués et libérés des vertèbres. Ensuite, le épinèvre, une membrane transparente qui entoure le DRG, est enlevé (flèche jaune, figure 1D). Le meilleur emplacement pour séparer le épinèvre est sur le site où les racines dorsales et ventrales se rejoignent au niveau du DRG, comme indiqué par la flèche noire sur la figure 1D. Après avoir enlevé le épinèvre, la racine ventrale est enlevé et jeté, laissant les radicelles dorsales nerf spinal et DRG, comme le montre la figure 1E. La digestion avec de la collagénase supprime le épinèvre résiduel, ce qui expose les neurones et les cellules satellites tchapeau les entourent (figure 1F).
Après avoir terminé la préparation de DRG, l'excitabilité des neurones petit diamètre de DRG est examiné en mesurant le seuil de rhéobase et de la membrane. Comme on le voit sur la figure 2A, la rhéobase est de 260 pA. La figure 2B montre le seuil de la membrane mesurée par cette méthode. Avec l'augmentation de courant, la membrane est dépolarisée en continu jusqu'à ce qu'un point d'accès est évoquée. Dans cet exemple, le seuil de la membrane (le potentiel auquel le point d'accès est évoqué) est -11,9 mV. Par conséquent, en maintenant la relation entre les neurones et les cellules gliales par satellite, notre préparation est plus proche de la situation in vivo. Sur la base de ces résultats, la rhéobase enregistrée à partir de petits neurones DRG est d'environ 300 Pa, et la résistance d'entrée est de 451,3 ± 27,3 MQ. Les deux sont plus élevés par rapport à ceux mesurés à partir de neurones dissociés (environ 150 pA et 635 MQ), suggérantque la dissociation a augmenté l'excitabilité des neurones DRG 11.
Avec cette préparation, nous avons mesuré aussi les courants entrants induits par le glutamate et l'isothiocyanate d'allyle (AITC), qui sont des agonistes des récepteurs du glutamate et le potentiel récepteur transitoire élément de canal de cations A1 (TRPA1), respectivement. L'amplitude des courants entrants induits par ces ligands reflète le nombre de récepteurs répartis dans les neurones. La figure 3A montre un courant entrant dans un petit diamètre DRG neurones induite par une application feuilletée 1 sec du glutamate (1 mM). Le glutamate induit un courant vers l'intérieur (198 pA), qui peut être en grande partie bloquée par une co-application de NMDA antagoniste du récepteur VPB et l'antagoniste des récepteurs AMPA / kaïnate CNQX (données non présentées), confirmant ainsi le courant est médiée par les récepteurs du glutamate sur le DRG neurones. Ces données établi qu'il existe des récepteurs de glutamate fonctionnels sur les neurones de DRG. Le neuron illustré sur la figure 3B montre des courants vers l' intérieur (260 pA) induites par 1 sec application bouffée d'isothiocyanate d'allyle (AITC, 100 uM), un agoniste de la TRPA1 sélective. Le courant actif est bloqué par l'antagoniste sélectif TRPA1 10 uM HC 030031 (données non présentées), confirmant ainsi les courants était médié par des récepteurs de TRPA1 et établit la présence de récepteurs de TRPA1 sur les neurones de DRG.
Figure 1: Préparation de DRG intactes (A) L' exposition de la moelle épinière après laminectomie et la segmentation des DRG.. Les flèches de droite à gauche indiquent L3-5 DRG respectivement. Barre d'échelle = 1 cm. (B) Exposition de L3, L4, L5 et DRG et les racines nerveuses attachées après le retrait de la moelle épinière. Les flèches indiquent DRG L3, L4, L5 et de droite à gauche. Barre d'échelle = 1 cm. (C) IntaDRG ct avec les racines nerveuses attachées après avoir été disséqués à partir de la moelle épinière. Les flèches indiquent L4 et L5 DRG de droite à gauche. Barre d'échelle = 1 cm. (D) DRG Intact avec épinèvre ci - joint. Dans cette image, l'épinèvre est intacte, et la flèche jaune montre la épinèvre semi-transparente tenue par une pince Dumont. La flèche noire indique la jonction formée par la racine dorsale et racine ventrale, ce qui constitue un bon point de départ pour décoller le épinèvre. Barre d'échelle = 1 mm. (E) Le même DRG avec la racine dorsale attachée après la épinèvre et la racine ventrale ont été enlevés. Barre d'échelle = 1 mm. (F) infrarouge images de microscope de DRG après digestion avec de la collagénase. neurones petites et moyennes sont visibles. Une cellule gliale par satellite (flèche jaune) est visible autour d'un neurone (astérisque). La flèche rouge à la pipette. Barre d'échelle = 10 pm. (G) configuration de l' équipement d'enregistrement. Les flèches noires indiquent thpipettes porte-e. Celui de gauche tient la pipette de médicament rempli, et l' enregistrement pipette est sur la droite. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2:. Mesure de Neuronal excitabilité dans Current Clamp Mode (A) Rhéobase a été mesurée par l' injection d' une série de courants dans le neurone DRG (panneau supérieur). L'intensité du courant le plus faible, ce qui peut induire un potentiel d'action est défini comme rhéobase, comme indiqué par la flèche dans le panneau inférieur. Le rhéobase pour ce neurone est 300 pA. (B). Le seuil de la membrane a été mesurée en injectant un courant de rampe. Le potentiel, lorsqu'un potentiel d'action évoqué, est définie comme seuil de la membrane, comme marqué par la ligne pointillée dans le panneau supérieur.Le seuil de membrane pour ce neurone est -11,9 mV. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: Courants Ligand induits dans les petites DRG Neurones courants induits par l' application de bouffée de glutamate (1 mM) ou isothiocyanate d' allyle (TRPA1 agoniste, AITC, 100 uM) pendant 1 sec.. Les agonistes induit des courants entrants, ce qui suggère la présence des récepteurs du glutamate et des récepteurs de TRPA1 sur les petits neurones DRG. Application Glutamate induit un courant entrant de 198 pA (A), et AITC induit un courant entrant de 260 pA (B). Neurones sont serrées à -70 mV. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure. </ P>
| 2 litres de 10x faible stock-cationique | |||
| Concentration finale (mM) | Composant | MW | Poids (g) |
| 3 | KCl | 74,6 | |
| 11 | Glucose | 180,2 | |
| 123 | NaCl | 58,4 | |
| 1.25 | NaH 2 PO 4 * H 2 O | 138 | |
| 1 | MgCl 2 , 6H 2 O * | 203,3 | |
| 2 | CaCl 2 * 2H 2 O | 147 | |
Tableau 1
| 1 litre de 10x disponible bicarbonate | |||
| Concentration finale (mM) | Composant | MW | Poids (g) |
| 26 | NaHCO3 | 84.01 | 21.84 |
Tableau 2
| 100 ml de solution intracellulaire | |||
| Concentration (mM) | Composant | MW | g |
| 130 | KGluconate | 234,24 | |
| dix | KCl | 74.55 | |
| dix | HEPES | 238,3 | |
| dix EGTA | |||
| 2 | MgCl 2 , 6H 2 O * | 203,3 | |
| Remarques: Ajuster le pH à 7,4 avec KOH, et l'osmolarité de 260-280 mOsm avec du saccharose et de l'eau distillée. Ajouter 2 mM MgATP, 0,5 mM Na 2 GTP et filtre avant utilisation immédiate. | |||
Tableau 3
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Discussion
Nous rapportons une méthode pour préparer les DRG entiers pour les études de patch-clamp. Il y a plusieurs éléments clés pour préparer un spécimen idéal. Tout d'abord, il est important de disséquer les DRG avec des racines dorsales jointes. Après cela, le épinèvre doivent être soigneusement enlevés tout en évitant des dommages aux neurones. Enfin, afin d'exposer les neurones et les cellules gliales environnantes par satellite, il est nécessaire de digérer le tissu conjonctif restant. DRG Intact de rats adultes préparés avec la méthode décrite ici maintiendront une bonne viabilité pendant 6 à 8 heures et peut être stable enregistrée au cours de cette période. Ils peuvent être utilisés pour de nombreuses études différentes de DRG, y compris des enregistrements de patch-clamp sur des neurones ou des cellules gliales par satellite, ou des réponses évoquées des neurones DRG.
Pendant la procédure de dissection, il est important de disséquer rapidement le DRG et le maintenir à une faible température (4 ° C) pour ralentir le métabolisme neuronal et maintient ainsi sa viabilité. Pendant Til dissection de DRG, il faut éviter l'étirement de la dorsale ou les nerfs spinaux entrer dans les DRG. Une autre étape clé dans cette préparation est la suppression de l'épinèvre entourant le DRG. Depuis l'épinèvre est difficile à pénétrer, tout épinèvre restant sur le DRG empêchera les pipettes de patch d'atteindre les neurones. Application de la collagénase est une étape importante pour les préparations réussies. La collagénase digère le épinèvre restant et nettoyer la surface des cellules en même temps, les deux étant essentielles pour la réussite ragréage. Pour éviter la digestion du tissu, trois facteurs doivent être pris en considération. Tout d'abord, la collagénase se présente sous plusieurs formes différentes; voir le tableau des matériaux pour notre recommandation, celle actuellement utilisée est puissante mais douce, évitant ainsi au-dessus-digestion. En second lieu, l'enzyme doit être délivrée à une légère pression pour éviter la dispersion de l'enzyme au-delà de la zone d'enregistrement. Nous avons trouvé que la pression produite à partir de l'application de 0,5 ml d'uneir sur une seringue de 1 ml de est suffisante. Troisièmement, la meilleure gamme de concentration pour la collagénase est de 10-13 unités / ml. Des concentrations plus élevées peuvent conduire à une digestion et une dégradation plus rapide du tissu, tandis que des concentrations plus faibles implique un temps de digestion inutilement long. Dans notre expérience, une concentration de 13 unités / ml et un temps de digestion d'environ 15 min produit les meilleurs résultats. Après l'application de l'enzyme l'épinèvre restant autour de la DRG devrait se desserrer, et peut être déblayés avec aspiration douce. Collagénase est sensible à répéter des cycles de congélation-décongélation, par conséquent, une fois dilué la solution d'enzyme devrait être divisé en aliquotes et utilisé dans les 3 semaines.
Zhang et ses collègues ont été les premiers à décrire une méthode pour l'enregistrement patch clamp de DRG intactes. Les rats qu'ils ont utilisés, cependant, étaient très jeunes (10-15 jours après la naissance) 20 qui a l'avantage que les DRG sont plus faciles à préparer étant donné qu'ils ont un epi plus minceneurium et ils ont une viabilité accrue. DRG de rats nouveau - nés, ont cependant l'inconvénient que l'expression des protéines et des canaux ioniques comme TRPV1 et Nav1.8 diffèrent de ceux des rats adultes 21,22. En outre, des études comportementales et pharmacologiques sont généralement menées chez des rats adultes. Ainsi, la méthode d'enregistrement détaillé ici permet de faire une corrélation entre l'électrophysiologie et de comportement chez les animaux adultes. L'utilisation de intacte ganglions de la racine dorsale comme une préparation pour effectuer des enregistrements de patch clamp ex vivo a augmenté récemment 15-17,23,24, et certaines études ont utilisé des enregistrements in vivo 25. La plupart des ex vivo enregistrements exposent les neurones DRG en incubant l'ensemble DRG en cocktail enzymatique pour environ 30-60 min. Bien que cette méthode permet d'obtenir plus de neurones, il a un risque d'une digestion par des neurones dans les couches superficielles. Notre méthode réduit le risque de sur-digestion à l'aide d'une inspection visuelle pour surveiller l'extente de la digestion, une méthode également utilisée par Ma et al pour in vivo enregistrements 25.
Par rapport aux neurones de DRG dissociés, l' un des avantages de la préparation DRG intacte provient de la conservation des deux neurones et les cellules gliales par satellite (figure 1). Cela ne veut pas le cas dans les préparations classiques utilisant des neurones de DRG dissociés. Satellite Les cellules gliales forme une barrière entourant les neurones DRG individuels, et leur présence est essentielle pour maintenir l'environnement physiologique de ces neurones 13. Comme indiqué dans les résultats des propriétés électrophysiologiques des neurones préparés par ce moyen diffèrent de ceux obtenus par des études utilisant des cellules dissociées.
L'une des orientations futures les plus intéressantes pour cette préparation est d'étudier la diaphonie entre les neurones DRG et les cellules gliales par satellite. Après une lésion nerveuse, par exemple, des cellules gliales par satellite ont été représentés to subir des changements en matière plastique, qui sont étroitement liés au comportement de la douleur qui en découle 13-15,26. La préservation des cellules gliales par satellite dans les DRG intactes, nous permettra de déterminer si les récepteurs de l'émetteur comme le récepteur du glutamate, ou des récepteurs de l'ATP sont présents sur les cellules gliales satellites et comment ils réagissent au changement dans l'activité neuronale. En corrigeant les cellules gliales par satellite et de stimuler le neurone en même temps, les cellules gliales par satellite peuvent agir comme un capteur biologique et montrer s'il y a la libération du transmetteur des neurones voisins. En outre, la préparation de DRG intacte conserve à la fois afférences et les racines nerveuses efférentes. Cela élargit considérablement le champ d' expérimentation en ajoutant la possibilité de stimuler les axones entrant ou sortant des neurones avec l' électrode d'aspiration, ce qui serait mieux mimer la situation in vivo.
Il y a des limites à la préparation en cours. L'existence de la barrière formée par gli satellitecellules al, rend plus difficile pour les neurones de patch et il faut être conscient que cela peut limiter la concentration de médicaments qui atteignent les neurones. Par conséquent, pour avoir accès au neurone dans la préparation, il est important de maintenir la pipette sous une pression positive pour faciliter la pénétration par satellite couche de cellules gliales. Une autre limitation est que les racines dorsales et les nerfs de la colonne vertébrale doivent être coupés afin de disséquer le DRG. Par conséquent, il est impossible de laisser l'axone totalement intacte. Cependant, la présence de l'axone restant doit être considéré comme axones périphériques ou centrales ne peuvent pas être fixés à la même tension que le soma, ce qui pourrait provoquer une erreur d'enregistrement potentiel ou d'interférence lorsque la tension de serrage est effectuée. Toujours dans le but d'obtenir une bonne exposition des neurones, la digestion douce avec de la collagénase est nécessaire et même si cela peut être contrôlé avec l'expérience, il est impossible de protéger complètement les neurones de l'exposition à l'enzyme de digestion. Par rapport à d conventionnelissociated neurones DRG, cependant, les DRG entières sont plus rapides à préparer (environ 30 minutes), peuvent être utilisés dans de nombreuses applications et étroitement imite les conditions in vivo.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pentobarbital sodium | vortech Pharmaceuticals | ||
| syringe | BD | 309659 | 1 ml, 5 ml. |
| scalpel | BD | size: 15 | |
| Mayo straight scissor | Fine Science Tools | 14010-15 | |
| Mayo curved scissor | Fine Science Tools | 14011-15 | |
| Rongeur | Fine Science Tools | 16021-14 | |
| Adson toothed forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Iris Scissor | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Noyes spring scissor | Fine Science Tools | 15124-12 | |
| Bone scissors | Fine Science Tools | 16044-10 | Special for cutting the bones. |
| Forceps: Dumont, Dumoxel Biologie #5 | Fine Science Tools | 11252-30 | These have the fine tips that do not need sharpening when first purchased. |
| periosteal elevator | Sklar | 97-0530 | |
| Dissection microscope | WILD | ||
| Transfer pipette | Fisher brand | 13-711-5AM | |
| Petri dish (10 cm) | Pyrex | Glass petri dish can avoid damaging the tips of fine forceps | |
| Collagenase (Liberase TM) | Roche | 05-401-119-001 | dissolve at the concentration of 13 U/ml, aliquot into glass pipette. Avoid repeated freeze and thaw. |
| filter | Thermo scientific | 7232520 | Filter the internal solutions for patch clamp recording to avoid clog. |
| Glass pipette | Sutter | BF150-110-7.5 | |
| Anchor | Havard apparatus | 64-0250 | stabilize the DRG to avoid drift. |
| Peristaltic pump | WPI | ||
| Pipette puller | Sutter | P97 | |
| Amplifier | Molecular devices | Axopatch 200B | |
| Digitizer | Molecular devices | 1440D | |
| Microscope | NIKON | FN600 | |
| Micro-manipulator | Sutter | MPC200 | |
| microinjection dispense system | General Valve | Picrospitzer II | fast drug application system |
| Carbogen (95% O2, 5% CO2) | Local Medical Gas supplier |
References
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