Summary
Une culture primaire de cellules endothéliales de cornée bovine a été utilisée pour étudier le mécanisme de transition endotheliale de la cornée mésenchymateuses. En outre, un modèle d'endothélium cornéen cryolésion de rat a été utilisé pour démontrer la transition de l' endothélium de la cornée mésenchymateuses in vivo.
Protocol
Toutes les procédures suivies dans cette étude accordée à l'Association pour la recherche en vision et ophtalmologie Déclaration pour l'utilisation des animaux dans ophtalmique et Vision Research et ont été approuvés par le soin et l'utilisation des animaux Commission institutionnelle du National Taiwan University Hospital.
1. Isolement, Culture Préparation primaire, et immunocoloration de Bovine CECs
- Acquérir les yeux frais de bovins à partir d'un abattoir local.
- Désinfecter les yeux d'une solution aqueuse à 10% p / v povidone-iode pendant 3 min. les laver avec une solution saline (PBS), une solution tamponnée au phosphate.
- Récolter le bouton cornéen avec un scalpel et les ciseaux dans des conditions stériles. la membrane de Peel Descemet avec une pince sous un microscope à dissection (à noter que dans cette étude, les yeux bovins ont été énucléés par un abattoir local et, par conséquent, la première procédure d'étude était la désinfection des yeux preenucleated dans le laboratoire).
- Incuber la membrane de Descemet dans 1 ml d'essayerPSIN à 37 ° C pendant 30 min. Ramassez les CECs bovine par centrifugation à 112 g pendant 5 min. Remettre en suspension les cellules dans 1 ml de milieu supplémenté épithéliale hormonale (SHEM) contenant des volumes égaux de tampon HEPES milieu Eagle modifié par Dulbecco et du milieu F12 de Ham, supplémenté avec 5% de sérum fœtal bovin, 0,5% de diméthylsulfoxyde, 2 ng / ml de l'épiderme humain facteur de croissance, 5 mg / ml d'insuline, 5 mg / ml de transferrine, 5 ng / ml de sélénium, 1 nmole / l de la toxine du choléra, 50 mg / ml de gentamicine et 1,25 mg / ml d'amphotéricine B.
- Ensemencer les cellules (environ 1 x 10 5 cellules par oeil) dans un plat de 6 cm. Culture eux dans la SHEM. Incuber le plat à 37 ° C dans une atmosphère de 5% de CO 2 dans l' air. Changer le milieu de culture tous les 3 jours.
- Lorsque les cellules atteignent la confluence, lavez-les dans du PBS et incuber dans 1 ml de trypsine à 37 ° C pendant 5 min. Collectionnez-les par centrifugation à 112 g pendant 5 min. Remettre en suspension le culot cellulaire dans 1 ml de la SHEM.
2. Modèle de rat cornéenne endothéliale cryolésion et injection intracamérulaire
- Anesthésier 12 semaines vieux rats mâles Sprague-Dawley par une injection intramusculaire de xylazine à 2% (5,6 mg / kg) et de la tilétamine, plus zolazepam (18 mg / kg). Pincez doucement la peau des animaux pour confirmer l'anesthésie appropriée en l'absence de contractions de la peau.
- Instiller une goutte de 0,5% de chlorhydrate de proparacaine à l'oeil droit de chaque rat pour réduire au minimum la douleur oculaire et le réflexe de clignement. Insufflertétracycline pommade à l'œil gauche pour prévenir la sécheresse de la cornée.
- Refroidir une sonde en acier inoxydable (diamètre = 3 mm) dans de l'azote liquide. Appliquer la sonde en acier inoxydable à la cornée centrale de l'oeil droit pendant 30 sec. Fréquemment instiller PBS à l'oeil droit lors de la procédure pour prévenir la sécheresse de la cornée.
- Instiller 0,1% atropine et 0,3% de sulfate de gentamicine immédiatement après cryolésion et une fois par jour pour soulager la douleur oculaire résultant de ciliaire spasme et pour prévenir l'infection.
- Après la procédure, garder les rats chaud à l'aide d'une lampe de chaleur, et d'observer leur récupération toutes les 15 min après l'anesthésie jusqu'à ce qu'ils reprennent le contrôle du moteur. En outre, appliquer la pommade tétracycline à l'oeil droit pour prévenir la sécheresse de la cornée au cours de la période de récupération.
- Répétez l'cryolésion cornéenne pendant 3 jours consécutifs.
- Pour délivrer le marimastat ou bFGF dans la chambre antérieure de l'œil de rat, anesthésier les rats comme décrit précédemment. Instiller une gouttede 0,5% de chlorhydrate de proparacaine dans l'œil droit de réduire au minimum la douleur oculaire et le réflexe de clignement.
- Irriguer la surface oculaire avec du PBS stérile. Effectuer la chambre antérieure paracentèse sous un microscope opératoire en insérant une aiguille 30 G attachée à une seringue de 1 ml à la cornée claire paralimbiques dans un plan au-dessus et parallèle à l'iris.
- Tourner l'aiguille biseau vers le haut, et légèrement appuyer sur la plaie cornéenne pour drainer une certaine humeur aqueuse et réduire la pression intra-oculaire. Injecter 0,02 ml du médicament intracamérulaire. comprimer doucement le tube de l'aiguille avec une pointe de coton pendant le retrait de l'aiguille.
- Photographie de l'œil externe à un point de temps indiqué sous le microscope opératoire.
3. La récolte du Rat Bouton cornéenne et immunocoloration
- Pour euthanasier les rats, les placer dans une chambre de l' euthanasie et laisser infuser 100% de CO 2 à un taux de 10-30% du volume de la chambre par minute de remplissage. Maintenir le CO 2 pour une perfusionminute supplémentaire suite à l'absence de la respiration et la couleur des yeux fané.
- Pénétrer l'œil de rat au limbe avec une lame tranchante. Couper les cornées avec des ciseaux cornéens le long du limbe. Aplatir les cornées sur une diapositive. Faire des incisions radiales supplémentaires si les cornées se recroquevillent.
- Fixer les cornées avec 250 pi de paraformaldehyde à 4%, pH 7,4, pendant 30 min à température ambiante. Perméabiliser avec 250 ul de 0,5% de Triton X-100 pendant 5 min, et de bloquer 10% de sérumalbumine bovine pendant 30 min.
- Incuber les cornées avec des anticorps primaires contre ABC pendant une nuit à 4 ° C avec une dilution de 1: 200 dans le diluant d'anticorps. Laver les cornées fois avec du PBS pendant 15 min, et de les laisser incuber avec l'anticorps secondaire (1: 100 dans le diluant d'anticorps) à la température ambiante pendant 1 h. Contre-coloration dans le noyau cellulaire, en recouvrant les cellules avec 2 ug / ml de 4 ', 6-diamidino-2-phénylindole, et laver les cellules deux fois avec du PBS pendant 15 min.
- Monter les cornées en anti-fading solution de montage. Obnir les images d'immunofluorescence aux longueurs d'onde d'excitation de 405 et 561 nm avec un microscope confocal à balayage laser à un grossissement de 20x objectif.
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Representative Results
Après l'isolement du PEC bovine, les cellules ont été cultivées in vitro. La figure 1 présente les images de contraste de phase de la CEC bovine. La forme hexagonale des cellules à confluence indiqué que les cellules ne sont pas contaminés par la cornée fibroblaste stromale lors de l' isolement cellulaire. La figure 2 représente la immunocoloration qui a été effectuée en utilisant des anticorps contre ABC, escargot, et slug à un point de temps indiqué. Outre les modifications phénotypiques dans la culture in vitro, une translocation nucléaire correspondant de ABC et EMT régulateurs a été observée. La figure 3 illustre l'effet de marimastat, un inhibiteur de MMP à large spectre, le procédé EnMT des CECs bovine en culture in vitro. La figure 4 comprend les photographies oculaires externes des rats après une cryolésion suivie d' une injection intracamérulaire. la figure 5 montre l'immunocoloration de la r au bouton cornéen qui a été réalisée en utilisant des anticorps contre ABC après cryolésion suivie d'une injection intracamérulaire. La translocation nucléaire de ABC a été observée dans le groupe PBS et était significativement augmenté dans le groupe bFGF, indiquant l'activation de la signalisation / β-caténine et le processus EnMT. Après l'injection intracamérulaire de bFGF suivi par injection marimastat, la coloration nucléaire de ABC a été diminuée, ce qui suggère l'effet EnMT-inhibiteur de marimastat.
Figure 1:. Phase images de contraste de in vitro CECs culture bovine Après avoir été ensemencées sur la plaque de culture, la CEC bovine initialement apparus fibroblaste aux jours 3 et 6. Ils est devenu plus hexagonal après avoir atteint la confluence complète le jour 9. Barre d'échelle = 50 um. Des images représentatives de 3 répétitions.4329fig1large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: Immunomarquage de CECs culture bovine Au cours de la culture in vitro de la CECs bovine, la translocation nucléaire de ABC, escargot, et slug a été détectée au jour 14. ABC in vitro:. Actif β-caténine. Barre d'échelle = 100 um. Des images représentatives de 3 répétitions. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3:. Immunocoloration de CECs bovins cultivés in vitro avec ou sans marimastat à différents niveaux de confluence des cellules immunocoloration démonstré que ABC, escargot et slug étaient évidents dans le noyau des CECs bovine avec ou sans 10 pM de marimastat le jour 3. Cependant, marimastat considérablement réduit la coloration nucléaire de ABC, escargot, et slug le jour 9 lorsque le de CECs bovine est devenu pleinement confluentes. Barre d'échelle = 100 um. Des images représentatives de 3 répétitions. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4:. Photographies oculaires externes de rats à des points de temps indiqués après cryolésion Après cryolésion pendant 3 jours consécutifs, les rats ont été soumis à l' injection intracamérulaire de 0,02 ml de PBS ou 50 ng ml bFGF / le jour 3. Le jour 6, 0,02 ml de 10 uM marimastat a été injectée dans le groupe intracamérulaire bFGF / Mari, tandis que le PBS a été injecté dans les 2 autres groups (n = 9 par groupe). Des images oculaires externes ont montré une diminution oedème de la cornée après l' injection bFGF, tandis que l' œdème cornéen marimastat encore réduit comparé avec le bFGF seul. N = 9 dans chaque groupe. Barre d' échelle = 1 mm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5:. Immunocoloration de boutons de rat cornéenne immunocoloration des boutons de la cornée de rats qui ont été récoltés le jour 9 a révélé peu de coloration nucléaire de ABC dans le groupe PBS. Dans le groupe bFGF, il y avait une vaste coloration nucléaire de ABC, qui a été significativement réduite dans le groupe bFGF / Mari. Barre d'échelle = 100 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version agrandie de this figure.
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Discussion
CECs sont connus pour leur propension à subir des EnMT pendant la prolifération cellulaire. Pour élaborer des stratégies pour supprimer le processus EnMT à des fins thérapeutiques, une compréhension approfondie du mécanisme EnMT est nécessaire. Nous avons décrit 2 modèles pour étudier EnMT, à savoir la CCE bovine dans le modèle de culture in vitro et le rat endothélium cornéen modèle cryolésion. Nos résultats ont démontré le processus EnMT dans les deux modèles. En outre, l'effet de suppression de EnMT marimastat a été reproduit dans les deux modèles, ce qui suggère que ces 2 modèles partagent le même mécanisme.
La CCE bovine dans le modèle de culture in vitro offre une facilité de manipulation. En outre, par rapport à la CEC humaine ou primate dans les modèles de culture in vitro utilisés dans des études antérieures 17,18, les yeux bovins sont plus grandes et plus faciles à acquérir, et ont donc plus de CECs disponibles. Dans notre étude, nous avons acquis les yeux énucléés bovine à partir d'un abattoir local. En raison des fres h nature des yeux bovins, le nombre exact de CECs bovine récolté est soumis à variation, à environ 1 x 10 5 cellules par oeil. En revanche, le nombre de CECs humains dans une cornée normale est d' environ 3 x 10 5 par oeil. Ce nombre est plus faible dans les cornées étude de qualité et est encore plus faible dans les jantes cornéennes résiduelles après la transplantation. Les manipulations au cours de la procédure de récolte permettra de réduire encore le nombre de cellules obtenues. En outre, les CEC bovins peuvent proliférer et se soumettre à EnMT spontanément; par conséquent, la CEC bovine dans le modèle de culture in vitro est utile pour enquêter sur le mécanisme EnMT et le dépistage des produits chimiques EnMT-suppresseurs, tels que marimastat. Bien qu'il subsiste préoccupation concernant les différences liées à l' espèce, comme la capacité proliférative des pays d' Europe centrale, nos résultats ont démontré que la voie de signalisation de EnMT CECs bovine est similaire à celle de la CEC humaines, y compris l'activation de la voie Wnt / β-caténine 18,19.
tente "> Pendant l'isolement de CECs bovin, le pelage de la membrane de Descemet est critique. Dans certains yeux de bovins, la membrane de Descemet peut avoir une adhérence étroite avec le stroma de la cornée, ce qui conduit à un tissu de stroma excessive sur la membrane de Descemet décortiquées. En outre trypsinisation peut conduire à la libération de kératocytes stromales qui se transforment en fibroblastes cornéens, qui affectent la pureté des cellules et donc les résultats expérimentaux. dans notre étude, nous pelés soigneusement la membrane de Descemet sous un microscope. Pour continuer à assurer la pureté des cellules, nous avons d'abord cultivé les cellules récoltées dans un 6 cm plat jusqu'à la confluence des cellules. Seulement lorsque les cellules étaient de forme hexagonale étaient-ils utilisés dans d'autres expériences.Pour étayer davantage les conclusions de la CCE bovine dans le modèle de culture in vitro, nous avons utilisé l'endothélium cornéen modèle cryolésion de rat adopté dans les études antérieures 20,21. Après cryolésion, les CECs de rats ont subi EnMT lors de la régénération, manifested par la translocation nucléaire de la β-caténine actif, ce qui indique que l'activation de la signalisation Wnt / β-caténine est conservée parmi les espèces au cours de la régénération KEK. En outre, ce modèle est utile pour étudier la fonction de CECs parce que la faible fonction CEC conduit à un œdème cornéen évident. Combiné avec d'autres équipements, tels que l'échographie biomicroscope, segment antérieur tomographie par cohérence optique et la microscopie confocale, épaisseur de la cornée peut être quantitativement évaluée et reflète ainsi la fonction CEC.
Pour stimuler la régénération des CEC et de supprimer EnMT après la guérison des plaies, nous avons administré des injections intracamérulaire de bFGF suivi par injection marimastat. Le traitement a réduit de manière significative l'étendue de l'oedème de la cornée. Des études antérieures ont utilisé l'application topique d'agents CEC stimulateurs de croissance, tels que les inhibiteurs de ROCK, et les agents EnMT-suppresseurs, tels que les inhibiteurs de Notch 21,22. Cependant, la pénétration des médicaments dans le CEC étaiter est limitée par l'épithélium et stroma cornéen, ce qui peut influer sur l'efficacité du traitement 23. Contrairement à l'application topique, l'injection intracamérulaire permet un accès direct à l'endothélium cornéen en introduisant des médicaments directement dans la chambre antérieure. Par conséquent, l'effet des produits chimiques stimulant la croissance et EnMT-suppression peut être évaluée sans biais suivant cryolésion. Dans notre étude, nous avons effectué la chambre antérieure paracentèse pour abaisser la pression intra-oculaire avant l'injection intracamérulaire. Sans paracentèse, une brusque augmentation de la pression intraoculaire provoque un œdème cornéen ou même un prolapsus de l'iris à travers le tube de l'aiguille. comprimant doucement l'appareil pendant les aides de retrait de l'aiguille pour sceller la plaie et la prévention de l'infection intra-oculaire.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| trypsin | ThermoFisher Scientific | 12604-013 | |
| Dulbecco’s modified Eagle medium and Ham's F12 medium | ThermoFisher Scientific | 11330 | |
| fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | 26140-079 | |
| dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| human epidermal growth factor | ThermoFisher Scientific | PHG0311 | |
| insulin, transferrin, selenium | ThermoFisher Scientific | 41400-045 | |
| cholera toxin | Sigma | C8052-1MG | |
| gentamicin | ThermoFisher Scientific | 15750-060 | |
| amphotericin B | ThermoFisher Scientific | 15290-026 | |
| paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 111219 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| bovine serum albumin | Sigma | A7906 | |
| marimastat | Sigma | M2699-25MG | |
| anti-active beta-catenin antibody | Millpore | 05-665 | |
| anti-snail antibody | Santa cruz | sc28199 | |
| anti-slug antibody | Santa cruz | sc15391 | |
| goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody | ThermoFisher Scientific | A-11001 | for staining of ABC of bovine CECs |
| goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody | ThermoFisher Scientific | A-11003 | for staining of ABC of rat corneal endothelium |
| goat anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody | ThermoFisher Scientific | A-11008 | for staining of snail and slug of bovine CECs |
| antibody diluent | Genemed Biotechnologies | 10-0001 | |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole | ThermoFisher Scientific | D1306 | |
| mounting medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| laser scanning confocal microscope | ZEISS | LSM510 | |
| xylazine | Bayer | N/A | |
| tiletamine plus zolazepam | Virbac | N/A | veterinary drug |
| proparacaine hydrochloride ophthalmic solution | Alcon | N/A | veterinary drug |
| 0.1% atropine | Wu-Fu Laboratories Co., Ltd | N/A | clinical drug |
| 0.3% gentamicin sulfate | Sinphar Group | N/A | clinical drug |
| basic fibroblast growth factor | ThermoFisher Scientific | PHG0024 | clinical drug |
References
- Maurice, D. M. The location of the fluid pump in the cornea. J Physiol. 221 (1), 43-54 (1972).
- Joyce, N.
- Morishige, N., Sonoda, K. H. Bullous keratopathy as a progressive disease: evidence from clinical and laboratory imaging studies. Cornea. 32, Suppl 1 77-83 (2013).
- Bates, A. K., Cheng, H., Hiorns, R. W. Pseudophakic bullous keratopathy: relationship with endothelial cell density and use of a predictive cell loss model. A preliminary report. Curr Eye Res. 5 (5), 363-366 (1986).
- Wilson, S. E., Lloyd, S. A. Epidermal growth factor and its receptor, basic fibroblast growth factor, transforming growth factor beta-1, and interleukin-1 alpha messenger RNA production in human corneal endothelial cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 32 (10), 2747-2756 (1991).
- Chen, K. H., Harris, D. L., Joyce, N. C. TGF-beta2 in aqueous humor suppresses S-phase entry in cultured corneal endothelial cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 40 (11), 2513-2519 (1999).
- Senoo, T., Obara, Y., Joyce, N. C. EDTA: a promoter of proliferation in human corneal endothelium. Invest Ophthalmol Vis Sci. 41 (10), 2930-2935 (2000).
- Yue, B. Y., Sugar, J., Gilboy, J. E., Elvart, J. L. Growth of human corneal endothelial cells in culture. Invest Ophthalmol Vis Sci. 30 (2), 248-253 (1989).
- Peh, G. S., Beuerman, R. W., Colman, A., Tan, D. T., Mehta, J. S. Human corneal endothelial cell expansion for corneal endothelium transplantation: an overview. Transplantation. 91 (8), 811-819 (2011).
- Zhu, C., Rawe, I., Joyce, N. C. Differential protein expression in human corneal endothelial cells cultured from young and older donors. Mol Vis. 14, 1805-1814 (2008).
- Ko, M. K., Kay, E. P. Regulatory role of FGF-2 on type I collagen expression during endothelial mesenchymal transformation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (12), 4495-4503 (2005).
- Lee, H. T., Kay, E. P. FGF-2 induced reorganization and disruption of actin cytoskeleton through PI 3-kinase, Rho, and Cdc42 in corneal endothelial cells. Mol Vis. 9, 624-634 (2003).
- Pipparelli, A., et al. ROCK Inhibitor Enhances Adhesion and Wound Healing of Human Corneal Endothelial Cells. PloS one. 8 (4), e62095 (2013).
- Roy, O., Leclerc, V. B., Bourget, J. M., Theriault, M., Proulx, S. Understanding the process of corneal endothelial morphological change in vitro. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (2), 1228-1237 (2015).
- Jakobiec, F. A., Bhat, P. Retrocorneal membranes: a comparative immunohistochemical analysis of keratocytic, endothelial, and epithelial origins. Am J Ophthalmol. 150 (2), 230-242 (2010).
- Okumura, N., et al. Involvement of ZEB1 and Snail1 in excessive production of extracellular matrix in Fuchs endothelial corneal dystrophy. Lab Invest. 95 (11), 1291-1304 (2015).
- Okumura, N., et al. Enhancement on primate corneal endothelial cell survival in vitro by a ROCK inhibitor. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (8), 3680-3687 (2009).
- Zhu, Y. T., Chen, H. C., Chen, S. Y., Tseng, S. C. G. Nuclear p120 catenin unlocks mitotic block of contact-inhibited human corneal endothelial monolayers without disrupting adherent junctions. J Cell Sci. 125 (15), 3636-3648 (2012).
- Ho, W. T., et al. Inhibition of Matrix Metalloproteinase Activity Reverses Corneal Endothelial-Mesenchymal Transition. Am J Pathol. 185 (8), 2158-2167 (2015).
- Kay, E. D., Cheung, C. C., Jester, J. V., Nimni, M. E., Smith, R. E. Type I collagen and fibronectin synthesis by retrocorneal fibrous membrane. Invest Ophthalmol Vis Sci. 22 (2), 200-212 (1982).
- Li, C., et al. Notch Signal Regulates Corneal Endothelial-to-Mesenchymal Transition. Am J Pathol. 183 (3), 786-795 (2013).
- Okumura, N., et al. The ROCK Inhibitor Eye Drop Accelerates Corneal Endothelium Wound Healing. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (4), 2493-2502 (2013).
- Mannermaa, E., Vellonen, K. S., Urtti, A. Drug transport in corneal epithelium and blood-retina barrier: emerging role of transporters in ocular pharmacokinetics. Adv Drug Deliv Rev. 58 (11), 1136-1163 (2006).
