Summary
Первичная культура бычьих роговичных эндотелиальных клеток использовали для исследования механизма роговицы эндотелиальной-мезенхимальных перехода. Кроме того, эндотелий роговицы модель криоповреждений крыс использовали для демонстрации роговицы переход эндотелиальной-мезенхимальных в естественных условиях.
Protocol
Все процедуры, применяемые в данном исследовании был предоставлен с Ассоциацией по исследованиям в области зрения и офтальмологии Заявление для использования животных в офтальмологических и Vision Research и были одобрены Institutional Animal Care и использование комитета Национальной больницы Тайваньского университета путем.
1. Выделение, первичная культура Подготовка и Иммунологическое бычьего центральноевропейских стран
- Приобретайте свежие бычьи глаза от местной скотобойни.
- Лечить глаза в 10% вес / об повидон-йода в течение 3 мин. Промыть их раствором с фосфатным буфером (PBS).
- Заготавливают кнопку роговичный скальпелем и ножницами в стерильных условиях. Мембрана Пил Десцеметова с пинцетом под микроскопом рассекает (обратите внимание, что в данном исследовании, бычьего глаза были энуклеировали местной скотобойни, поэтому первая процедура исследования была дезинфекция preenucleated глаз в лаборатории).
- Инкубируйте мембраны Десцеметова в 1 мл попыткиpsin при 37 ° С в течение 30 мин. Собрать бычьей CECS центрифугированием при 112 мкг в течение 5 мин. Ресуспендируют клеток в 1 мл дополненной гормонального эпителиальной среды (SHEM), содержащий равные объемы HEPES-забуференной модифицированной среде Дульбекко орла и среды F12 Хэма, дополненной 5% фетальной бычьей сыворотки, 0,5% диметилсульфоксида, 2 нг / мл человеческого эпидермального фактора роста, 5 мг / мл инсулина, 5 мг / мл трансферрина, 5 нг / мл селена, 1 нмоль / л холерного токсина, 50 мг / мл гентамицина, и 1,25 мг / мл амфотерицина B.
- Семенной клетки (приблизительно 1 × 10 5 клеток на глаз) в 6 см чашку. Культура их в Шем. Инкубируйте блюдо при 37 ° С в атмосфере 5% CO 2 в воздухе. Изменение культуральной среды каждые 3 дня.
- Когда клетки достигают слияния, промыть их в PBS и инкубируют их в 1 мл трипсина при 37 ° С в течение 5 мин. Собирают их центрифугированием при 112 х г в течение 5 мин. Повторное приостановить осадок клеток в 1 мл Шем.
2. Крыса эндотелий роговицы криоповреждений Модель и внутрикамерное Инъекции
- Обезболить 12-недельных крыс-самцов Sprague-Dawley с внутримышечных инъекций 2% ксилазином (5,6 мг / кг) и tiletamine плюс zolazepam (18 мг / кг). Аккуратно ущипнуть кожу животных, чтобы подтвердить правильность анестезии при отсутствии подергивание кожи.
- Закапывание одну каплю 0,5% пропаракаина гидрохлорида в правый глаз каждой крысы, чтобы свести к минимуму боль глаза и рефлекс моргания. внушатьмазь тетрациклина в левый глаз, чтобы предотвратить сухость роговицы.
- Охлаждают зонд из нержавеющей стали (диаметр = 3 мм) в жидком азоте. Нанести стального зонда из нержавеющей к центральной роговицы правого глаза в течение 30 сек. Часто привить PBS в правый глаз во время процедуры, чтобы предотвратить сухость роговицы.
- Закапывание 0,1% атропин и 0,3% сульфата гентамицина сразу после криоповреждений и один раз в день, чтобы уменьшить глазной боли в результате цилиарного спазма и предотвратить инфекцию.
- После процедуры, держать крыс подогреть с помощью тепла лампы, и наблюдать за их восстановление через каждые 15 мин после анестезии, пока они не восстановить контроль двигателя. Кроме того, применяют мазь тетрациклина в правый глаз, чтобы предотвратить сухость роговицы в течение периода восстановления.
- Повторите роговой криоповреждений в течение 3 дней подряд.
- Для доставки маримастату или bFGF в переднюю камеру глаза крыс, анестезию крыс, как описано выше. Привить одну каплю0,5% пропаракаина гидрохлорида в правый глаз, чтобы свести к минимуму боль в глазах и рефлекс моргания.
- Промывать глазную поверхность стерильным PBS. Выполнение передней камеры парацентез под операционным микроскопом, вставляя иглу 30 G, прикрепленную к 1 мл шприца в paralimbal прозрачного роговицы в плоскости и располагалась параллельно радужки.
- Поверните иглу скосом вверх, и слегка нажмите на рану роговицы, чтобы слить некоторый водный юмор и снизить внутриглазное давление. Вводят 0,02 мл препарата intracamerally. Аккуратно сжать иглы тракта с наконечником хлопка во время снятия иглы.
- Сфотографируйте внешний глаз на указанный момент времени под операционным микроскопом.
3. Сбор Крыса Роговичная Баттон и Иммунологическое
- Для эвтаназии крыс, поместите их в эвтаназии камере и влить 100% CO 2 при скорости заполнения 10-30% от объема камеры в минуту. Поддерживать CO 2 инфузии в течениедополнительная минута после отсутствия дыхания и выцветшие глаза.
- Проникнуть глаз крысы у лимба с острым лезвием. Вырезать роговицу ножницами вдоль роговицы лимба. Свести роговицу на слайде. Сделайте дополнительные радиальные надрезы, если роговица свернуться.
- Закрепить роговицу с 250 мкл 4% параформальдегида, рН 7,4, в течение 30 мин при комнатной температуре. Проницаемыми с 250 мкл 0,5% Тритона Х-100 в течение 5 мин, и блок с 10% бычьего сывороточного альбумина в течение 30 мин.
- Выдержите в роговицу с первичными антителами против ABC в течение ночи при 4 ° С с разбавлением 1: 200 в разбавителе антител. Промыть роговицу дважды с PBS в течение 15 мин, и инкубировать их с вторичным антителом (1: 100 в разбавителе антител) при комнатной температуре в течение 1 часа. Проводят контрастное ядро клетки путем покрытия клеток с 2 мкг / мл 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндола, и промыть клетки дважды с PBS в течение 15 мин.
- Установите роговицу в анти-выцветания решение для монтажа. ОбьТайн в иммунофлуоресцентного изображения при возбуждении длинами волн 405 и 561 нм с помощью лазерной сканирующей конфокальной микроскопии при увеличении 20Х объективного.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
После выделения крупного рогатого скота центральноевропейских стран, клетки культивировали в пробирке. На рисунке 1 представлены фазовый контраст изображения говяжьих центральноевропейских стран. Шестиугольная форма клеток при слиянии показали , что клетки не были загрязнены роговичной стромы фибробластами во время выделения клеток. Рисунок 2 изображает иммунным , которая была выполнена с использованием антител против ABC, улитка, и слизня на указанный момент времени. Помимо фенотипических изменений в культуре в пробирке, наблюдалось соответствующее ядерной транслокации регуляторов ABC и ЕМТ. Рисунок 3 иллюстрирует эффект маримастату, ингибитор ММР широкого спектра действия , на процесс EnMT культивированных бычьих центральноевропейских стран в пробирке. Рисунок 4 включает внешние глазные фотографии крыс после криоповреждений с последующим внутрикамерной инъекции. на рисунке 5 показана иммунным окрашиванием г на кнопке роговичного, которая была выполнена с использованием антител против ABC после криоповреждений с последующим внутрикамерной инъекции. Ядерная транслокация ABC наблюдалась в группе PBS и была значительно выше в группе bFGF, что указывает на активацию сигнализации / β-катенина Wnt и процесса EnMT. После внутрикамерное инъекции bFGF с последующим маримастату инъекции, ядерное окрашивание ABC уменьшался, что указывает на EnMT-ингибирующий эффект маримастату.
Рисунок 1:. Фазового контраста изображения в пробирке культивированный бычьи CECs После высевают на планшет для культивирования, бычий CECs первоначально появились фибробластоподобных дни 3 и 6. Они стали более гексагональной при достижении полного слияния на день 9. Шкала бар = 50 мкм. Типичные изображения 3 повторах.4329fig1large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: Иммунологическое экстракорпорального культивированный бычьи CECs Во время культивирования в пробирке бычьего центральноевропейских стран, ядерной транслокации ABC, улитка, и слизня был обнаружен через 14 день ABC.: Активный бета-катенина. Шкала бар = 100 мкм. Типичные изображения 3 повторах. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3:. Иммунным культивируемых крупного рогатого скота центральноевропейских стран в пробирке с или без маримастату на разных уровнях клеток впадения Иммуноокрашивание демоныtrated, что ABC, улитка, и пробкового были очевидны в ядре говяжьих центральноевропейских стран с или без 10 мкМ маримастату в день 3. Однако, маримастату значительно сократить ядерное окрашивание ABC, улитка, и пули на 9-й день, когда бычьи CECS стал полностью вырожденная. Шкала бар = 100 мкм. Типичные изображения 3 повторах. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4:. Внешние глазные фотографии крыс в указанные моменты времени после криоповреждений После криоповреждений в течение 3 последовательных дней, крыс подвергали внутрикамерного инъекцией 0,02 мл PBS или 50 нг / мл bFGF в день 3. На 6 -й день, 0,02 мл 10 мкМ маримастат вводили intracamerally в группе bFGF / Мари, в то время как PBS вводили в другой 2 Гроупс (п = 9 в каждой группе). Внешние фотографии глаз показали , снижается отек роговицы после того, как bFGF инъекции, в то время как маримастат дополнительно уменьшается отек роговицы по сравнению с bFGF в покое. П = 9 в каждой группе. Шкала бар = 1 мм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рис . 5: Иммунологическое крысы роговицы кнопок Иммуноокрашивание роговицы кнопок крыс , которые были собраны на 9 -й день выявлено небольшое ядерное окрашивание ABC в группе PBS. В группе bFGF, было обширное ядерное окрашивание АВС, которая была значительно ниже в группе bFGF / Мари. Шкала бар = 100 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть большую версию Тхис фигурой.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
CECs известны своей склонностью к претерпевать EnMT во время пролиферации клеток. Для того, чтобы разработать стратегии для подавления процесса EnMT в терапевтических целях, глубокое понимание механизма EnMT необходимо. Мы описали 2 модели для исследования EnMT, а именно ЦИК крупного рогатого скота в пробирке модель культуры и крысы эндотелий роговицы модели криоповреждений. Наши результаты продемонстрировали процесс EnMT в обеих моделях. Кроме того, EnMT подавляющий эффект маримастату был воспроизведен в обеих моделях, предполагая, что эти 2 модели имеют один и тот же механизм.
ЦИК бычьего в пробирке модель культуры предлагает легкость манипулирования. Кроме того, по сравнению с человеческим или примата ЦИК в пробирке моделей культуры , используемых в предыдущих исследованиях 17,18, бычий глаз крупнее и легче приобрести, и , таким образом , имеют более CECs доступны. В нашем исследовании мы приобрели энуклеированным бычьи глаза от местного бойне. Из-за FRES ч природа бычьи глаза, точное количество крупного рогатого скота центральноевропейских стран собирают подлежит изменению, примерно в 1 х 10 5 клеток на глаз. В противоположность этому , количество человеческих центральноевропейских стран в нормальной роговицы составляет приблизительно 3 × 10 5 на каждый глаз. Это число ниже в исследовании класса роговиц и даже ниже в остаточных роговице венцов после трансплантации. Манипуляции во время процедуры сбора приведет к дальнейшему снижению числа клеток, полученных. Кроме того, бычий CECs могут размножаться и подвергаются EnMT спонтанно; Таким образом, ЦИК бычьего в пробирке модель культуры является полезным при исследовании механизма EnMT и скрининга EnMT подавляющие химические вещества, такие как маримастату. Несмотря на то, сохраняется озабоченность относительно видовых различий, например, пролиферативной способности центральноевропейских стран, наши результаты показали , что EnMT сигнальный путь бычьего центральноевропейских стран подобна человеческой центральноевропейских стран, в том числе активацию Wnt / бета-катенин 18,19.
палатка "> Во время изоляции бычьего центральноевропейских стран, шелушение мембраны Десцеметова имеет решающее значение. В некоторых коровьих глазах, мембрана Десцеметова может иметь плотное сцепление с стромы роговицы, что приводит к чрезмерной стромальной ткани на ободранной мембране Десцемета. Далее трипсинизации может привести к выпуск стромальных кератоцитами, которые превращаются в фибробласты роговицы, которые влияют на чистоту клеток и, следовательно, экспериментальные результаты. в нашем исследовании мы тщательно очищенными мембраны Десцеметова под микроскопом. Для дальнейшего обеспечения чистоты клеток, мы сначала культивировали собранные клетки в 6 см чашку до клеток слияния. только тогда, когда клетки были шестиугольную форму они были использованы в дальнейших экспериментах.Для дальнейшего обоснования выводов ЦИК крупного рогатого скота в пробирке модель культуры, мы использовали эндотелий роговицы модель криоповреждений крысы , принятой в предыдущих исследованиях 20,21. После того, как криоповреждений, в CECs крысы подвергались EnMT во время регенерации, manifeSTED по ядерной транслокации активного бета-катенина, что указывает на активацию Wnt сигнализации / β-катенина сохраняется среди видов в процессе регенерации ЦИК. Кроме того, эта модель полезна при исследовании функции центральноевропейских стран, поскольку низкая функция ЦИК приводит к очевидным отек роговицы. В сочетании с другим оборудованием, таким как ультразвуковой биомикроскопа, переднего сегмента оптической когерентной томографии, и конфокальной микроскопии, толщина роговицы могут быть количественно оценены и, таким образом, отражает функцию ЦИК.
Для того, чтобы стимулировать регенерацию и подавляет центральноевропейских стран EnMT после заживления ран, мы вводили внутрикамерное инъекции bFGF с последующим маримастату инъекции. Лечение значительно снижается степень отека роговицы. Предыдущие исследования использовали местное применение CEC стимулирование роста агентов, таких как ингибитор ROCK, и EnMT-супрессоров агентами, такими как ингибитор Notch 21,22. Тем не менее, проникновение наркотиков в ЦИК лежалэр ограничивается эпителия роговицы и стромы, которые могут влиять на эффективность лечения 23. В отличие от местного применения, внутрикамерное инъекции обеспечивает прямой доступ к эндотелий роговицы путем введения лекарств непосредственно в переднюю камеру. Таким образом, рост-стимулирующий и EnMT подавляющие действие химических веществ могут быть оценены следующие криоповреждений беспристрастно. В нашем исследовании мы провели переднюю камеру парацентез, чтобы понизить внутриглазное давление до внутрикамерной инъекции. Без пункции, резкое увеличение внутриглазного давления вызывает отек роговицы или даже пролапс радужной оболочки глаза через иглу-кишечного тракта. Осторожно сжимая тракт во время вспомогательных средств снятия иглы в герметизация раны и предотвращения внутриглазного инфекции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| trypsin | ThermoFisher Scientific | 12604-013 | |
| Dulbecco’s modified Eagle medium and Ham's F12 medium | ThermoFisher Scientific | 11330 | |
| fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | 26140-079 | |
| dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| human epidermal growth factor | ThermoFisher Scientific | PHG0311 | |
| insulin, transferrin, selenium | ThermoFisher Scientific | 41400-045 | |
| cholera toxin | Sigma | C8052-1MG | |
| gentamicin | ThermoFisher Scientific | 15750-060 | |
| amphotericin B | ThermoFisher Scientific | 15290-026 | |
| paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 111219 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| bovine serum albumin | Sigma | A7906 | |
| marimastat | Sigma | M2699-25MG | |
| anti-active beta-catenin antibody | Millpore | 05-665 | |
| anti-snail antibody | Santa cruz | sc28199 | |
| anti-slug antibody | Santa cruz | sc15391 | |
| goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody | ThermoFisher Scientific | A-11001 | for staining of ABC of bovine CECs |
| goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody | ThermoFisher Scientific | A-11003 | for staining of ABC of rat corneal endothelium |
| goat anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody | ThermoFisher Scientific | A-11008 | for staining of snail and slug of bovine CECs |
| antibody diluent | Genemed Biotechnologies | 10-0001 | |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole | ThermoFisher Scientific | D1306 | |
| mounting medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| laser scanning confocal microscope | ZEISS | LSM510 | |
| xylazine | Bayer | N/A | |
| tiletamine plus zolazepam | Virbac | N/A | veterinary drug |
| proparacaine hydrochloride ophthalmic solution | Alcon | N/A | veterinary drug |
| 0.1% atropine | Wu-Fu Laboratories Co., Ltd | N/A | clinical drug |
| 0.3% gentamicin sulfate | Sinphar Group | N/A | clinical drug |
| basic fibroblast growth factor | ThermoFisher Scientific | PHG0024 | clinical drug |
References
- Maurice, D. M. The location of the fluid pump in the cornea. J Physiol. 221 (1), 43-54 (1972).
- Joyce, N.
- Morishige, N., Sonoda, K. H. Bullous keratopathy as a progressive disease: evidence from clinical and laboratory imaging studies. Cornea. 32, Suppl 1 77-83 (2013).
- Bates, A. K., Cheng, H., Hiorns, R. W. Pseudophakic bullous keratopathy: relationship with endothelial cell density and use of a predictive cell loss model. A preliminary report. Curr Eye Res. 5 (5), 363-366 (1986).
- Wilson, S. E., Lloyd, S. A. Epidermal growth factor and its receptor, basic fibroblast growth factor, transforming growth factor beta-1, and interleukin-1 alpha messenger RNA production in human corneal endothelial cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 32 (10), 2747-2756 (1991).
- Chen, K. H., Harris, D. L., Joyce, N. C. TGF-beta2 in aqueous humor suppresses S-phase entry in cultured corneal endothelial cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 40 (11), 2513-2519 (1999).
- Senoo, T., Obara, Y., Joyce, N. C. EDTA: a promoter of proliferation in human corneal endothelium. Invest Ophthalmol Vis Sci. 41 (10), 2930-2935 (2000).
- Yue, B. Y., Sugar, J., Gilboy, J. E., Elvart, J. L. Growth of human corneal endothelial cells in culture. Invest Ophthalmol Vis Sci. 30 (2), 248-253 (1989).
- Peh, G. S., Beuerman, R. W., Colman, A., Tan, D. T., Mehta, J. S. Human corneal endothelial cell expansion for corneal endothelium transplantation: an overview. Transplantation. 91 (8), 811-819 (2011).
- Zhu, C., Rawe, I., Joyce, N. C. Differential protein expression in human corneal endothelial cells cultured from young and older donors. Mol Vis. 14, 1805-1814 (2008).
- Ko, M. K., Kay, E. P. Regulatory role of FGF-2 on type I collagen expression during endothelial mesenchymal transformation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (12), 4495-4503 (2005).
- Lee, H. T., Kay, E. P. FGF-2 induced reorganization and disruption of actin cytoskeleton through PI 3-kinase, Rho, and Cdc42 in corneal endothelial cells. Mol Vis. 9, 624-634 (2003).
- Pipparelli, A., et al. ROCK Inhibitor Enhances Adhesion and Wound Healing of Human Corneal Endothelial Cells. PloS one. 8 (4), e62095 (2013).
- Roy, O., Leclerc, V. B., Bourget, J. M., Theriault, M., Proulx, S. Understanding the process of corneal endothelial morphological change in vitro. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (2), 1228-1237 (2015).
- Jakobiec, F. A., Bhat, P. Retrocorneal membranes: a comparative immunohistochemical analysis of keratocytic, endothelial, and epithelial origins. Am J Ophthalmol. 150 (2), 230-242 (2010).
- Okumura, N., et al. Involvement of ZEB1 and Snail1 in excessive production of extracellular matrix in Fuchs endothelial corneal dystrophy. Lab Invest. 95 (11), 1291-1304 (2015).
- Okumura, N., et al. Enhancement on primate corneal endothelial cell survival in vitro by a ROCK inhibitor. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (8), 3680-3687 (2009).
- Zhu, Y. T., Chen, H. C., Chen, S. Y., Tseng, S. C. G. Nuclear p120 catenin unlocks mitotic block of contact-inhibited human corneal endothelial monolayers without disrupting adherent junctions. J Cell Sci. 125 (15), 3636-3648 (2012).
- Ho, W. T., et al. Inhibition of Matrix Metalloproteinase Activity Reverses Corneal Endothelial-Mesenchymal Transition. Am J Pathol. 185 (8), 2158-2167 (2015).
- Kay, E. D., Cheung, C. C., Jester, J. V., Nimni, M. E., Smith, R. E. Type I collagen and fibronectin synthesis by retrocorneal fibrous membrane. Invest Ophthalmol Vis Sci. 22 (2), 200-212 (1982).
- Li, C., et al. Notch Signal Regulates Corneal Endothelial-to-Mesenchymal Transition. Am J Pathol. 183 (3), 786-795 (2013).
- Okumura, N., et al. The ROCK Inhibitor Eye Drop Accelerates Corneal Endothelium Wound Healing. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (4), 2493-2502 (2013).
- Mannermaa, E., Vellonen, K. S., Urtti, A. Drug transport in corneal epithelium and blood-retina barrier: emerging role of transporters in ocular pharmacokinetics. Adv Drug Deliv Rev. 58 (11), 1136-1163 (2006).
